CN105063040B - 番茄晚疫病菌pcr检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了番茄晚疫病菌PCR检测的引物、试剂盒及方法，所述引物包括上游引物PIF：5'‑GCCATGTCCGGTATTACCAC‑3'和下游引物PIR：5'‑GCTCATCTTCAGACCCTTGG‑3'。使用本发明的PCR检测引物、试剂盒及方法，可在晚疫病菌纯DNA、发病番茄植物组织及带菌的土壤样品中特异性地扩增出片段大小为399bp的扩增产物。本发明具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点，可用于田间番茄晚疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，对番茄晚疫病的及时有效防治具有重要意义。

Description

番茄晚疫病菌PCR检测引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及番茄晚疫病菌特异性PCR检测引物、试剂盒及其检测方法，专用于番茄晚疫病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间番茄晚疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

番茄是全球广泛种植，高消费量的蔬菜作物之一，中国是番茄出口大国，在南北均有大面积栽培。番茄果实营养极为丰富，品种类型较多，既能作为水果生食，也能作蔬菜成为餐桌上的美味佳肴，还能被加工成番茄酱、番茄汁等功能性罐装食品，为消费市场创造了良好的经济效益。随着栽培技术的进步，近年来主要通过保护地栽培模式生产番茄供应市场，优良的生长环境一方面延长了番茄的生长周期，促进了番茄生产，另一方面却滋生番茄病害的发生，破坏番茄植株的生长，威胁番茄的产量及品质甚至在采后储藏期造成危害。其中，由晚疫病菌(Phytophthora infestans)侵染引起的番茄晚疫病是番茄生产上发生最普遍、危害最严重的病害之一；无论在露地还是保护地都造成重大损失，是一种流行性很强的毁灭性病害，一般年份减产20%-30%，严重时可达40%-60%，甚至绝收。番茄晚疫病常与番茄其它病害（如灰霉病、早疫病）混合发生，而且发病初期症状具一定的相似性，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立番茄晚疫病菌快速检测体系，在发病初期或症状显现之前对植株是否携带晚疫病菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。

植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。

随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外已有学者利用rDNA/ITS序列设计特异引物来对植物病原菌进行快速检测、鉴定。然而疫霉属卵菌的分子检测技术研究结果表明，rDNA/ITS在疫霉属的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。目前用于疫霉菌分子检测的靶标基因主要有elicitin 基因、Ras家族相关的Ypt1编码基因、线粒体Cox1和Cox2编码基因以及可能编码储存蛋白的Lpv基因等。

本发明旨在寻找番茄晚疫病菌中新的分子检测靶标基因。β-tubulin是真核生物看家（管家）基因之一，广泛存在于真核生物中，在真核生物进化上非常保守，目前尚无针对该靶标基因进行晚疫病菌分子检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种可快速、准确地检测番茄晚疫病菌的PCR引物、包含该引物的检测试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测番茄晚疫病菌准确性高、特异性强、灵敏性高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1. 番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）PCR检测特异引物的设计

采用疫霉菌β-tubulin基因通用引物Oom(Ph)-Btub-up901 F ：5′-TACGACATTTGCTTCCG-3′ 和Oom-Btub-lo1401 R：5′-CGCTTGAACATCTC CTGG-3′对番茄晚疫病菌β-tubulin基因进行扩增， PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的Oom(Ph)-Btub-up901 F/ Oom-Btub-lo1401 R引物各1.0µL，2.0×10^-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、55℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序得到的番茄晚疫病菌β-tubulin基因序列与GenBank中其它病原菌β-tubulin基因序列进行比对分析，根据差异位点设计出对番茄晚疫病菌具有特异性扩增作用的1对引物，即PCR检测特异引物的序列为：

上游引物PIF：5'- GCCATGTCCGGTATTACCAC -3'，

下游引物PIR：5'- GCTCATCTTCAGACCCTTGG -3'；

对番茄晚疫病菌特异性扩增出399bp的产物。

2. 番茄晚疫病菌PCR检测试剂盒

在已设计好PCR检测引物的基础上，根据PCR扩增所需要试剂，研制出了番茄晚疫病菌PCR检测专用试剂盒，所述试剂盒包含以下试剂：重量浓度≥99%的超纯水，2×Taq PCRMaster Mix，10 µmol/L的PIF/PIR引物，100 ng/µL的番茄晚疫病菌阳性对照DNA，2000 bpDNA marker。

3. 番茄晚疫病菌特异分子检测方法的建立

（1）提取待测样品（病原菌纯培养物、带菌植物组织或土壤）基因组DNA。

用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r.min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r.min^-1离心9min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r.min^-1离心5 min；取上清液350µL，加入1/10体积3 mol.L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r.min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至25 ng/µL待用；

用于检测番茄植株组织是否存在番茄晚疫病菌时，采用NaOH快速裂解法提取番茄植株组织基因组DNA，具体过程如下：向1.0 mg番茄植株组织（叶、果实和茎杆）中加入0.5mol/L NaOH 30 µL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）495µL混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；

用于检测土壤中是否存在番茄晚疫病菌时，采用土壤DNA提取法提取土壤中总微生物基因组DNA，具体过程如下：取已过200目筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500 µL重量浓度为0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12,000 rpm离心15 min，取上清液加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10µg/mL蛋白酶K，55℃水浴60min，水浴结束后，加入1/2体积的7.5MNH₄AC溶液，上下颠倒混匀，12,000 rpm离心15 min，吸上清液加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀20min以上，沉淀结束后，12,000 rpm离心10 min，倾掉上清液，用体积浓度为70%乙醇洗涤沉淀，室温凉干，每份样品所提DNA用20 µl TE（或无菌超纯水）溶解，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用PIF/PIR这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PIF/PIR引物各1.0µL，2.0×10^-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

（3）取5.0 µL步骤（2）的PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电泳分离后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出399bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在番茄晚疫病菌。

本发明的显著优点

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：

1.特异性强、准确性高：本发明根据看家（管家）基因β-tubulin基因在不同病原菌之间的差异，发现了数个高度变异且只存在于番茄晚疫病菌中的位点，设计出了对番茄晚疫病菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的番茄晚疫病菌和具晚疫病症状的番茄叶片组织进行了测试验证，只有番茄晚疫病菌和晚疫病发病叶片中能特异性地扩增出一条399bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。

2.灵敏度高：番茄晚疫病菌的分离比较困难，该病原菌生长速度较慢，在分离中易被其它病原菌污染，只有发病症状典型的新鲜样本才能成功分离到该病原菌。而本发明将设计的特异引物与疫霉属β-tubulin基因通用引物【Oom(Ph)-Btub-up901 F /Oom-Btub-lo1401 R】联合起来进行巢式PCR扩增，对番茄晚疫病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测提高了10000倍；

3.实用性好：本发明基于番茄晚疫病菌和其它病原菌β-tubulin基因的序列差异，设计出可快速检测番茄晚疫病菌的特异性引物，并在此基础上研制的PCR检测试剂盒和检测方法。利用本发明可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境中快速、准确和灵敏性地检测出番茄晚疫病菌，可对番茄晚疫病菌不同形态的繁殖体如菌丝、孢子囊、游动孢子和卵孢子等进行检测，对番茄晚疫病疫情的早期预警、疫病区的病原监测等方面具有重要意义。

附图说明

图1为本发明所述引物对番茄晚疫病菌的特异PCR扩增电泳图，图中：泳道M为2000bp DNA Marker，泳道1-4为番茄晚疫病菌，泳道5为番茄早疫病菌，泳道6为恶疫霉菌，泳道7为辣椒疫霉菌，泳道8为阴性对照。

图2为本发明对番茄晚疫病菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道1为100ng，泳道2为10 ng，泳道3为1 ng，泳道4为100 pg，泳道5为10 pg，泳道6为1 pg，泳道7为100 fg，泳道8为10 fg，泳道9为 1 fg，泳道10为阴性对照。

图3为本发明对发病组织及带菌土壤的检测结果图，图中泳道M为2000bp DNAMarker，泳道1为阳性对照，泳道2-3为番茄晚疫病发病叶片，泳道4为番茄晚疫病发病严重的田间土样，泳道5为健康的番茄叶片，泳道6为新开发的未发生番茄晚疫的田间土样，泳道7为经高压灭菌的土样，泳道8为阴性对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：PCR检测引物的设计及引物对番茄晚疫病菌的特异性扩增

1.引物的设计与合成

本发明的关键性技术是番茄晚疫病菌高效特异性PCR检测引物的设计。为了获得番茄晚疫病菌的特异PCR检测引物序列，以来源于我国福建、广西、云南和黑龙江等不同省份的32株番茄晚疫病菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r.min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r.min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r.min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol.L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r.min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µLTE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至25 ng/µL待用。以疫霉菌β-tubulin基因通用引物Oom(Ph)-Btub-up901 F ：5′-TACGACATTTGCTTCCG-3′ 和Oom-Btub-lo1401 R：5′-CGCTTGAACATCTC CTGG-3′对番茄晚疫病菌β-tubulin基因进行扩增， PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的Oom(Ph)-Btub-up901 F/ Oom-Btub-lo1401 R引物各1.0µL，2.0×10^-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、55℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序得到的番茄晚疫病菌β-tubulin基因序列与GenBank中其它病原菌β- tubulin基因序列进行比对分析，根据差异位点设计出对番茄晚疫病菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：上游引物PIF：5'- GCCATGTCCGGTATTACCAC -3'，下游引物PIR：5'- GCTCATCTTCAGACCCTTGG -3'；引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。

2.引物特异性PCR验证

在已设计特异引物的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立了番茄晚疫病菌检测方法，以供试的番茄晚疫病菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，对特异性引物（上游引物PIF：5'- GCCATGTCCGGTATTACCAC -3'，下游引物PIR：5'-GCTCATCTTCAGACCCTTGG -3'）的特异性进行验证。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCRMaster Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PIF/PIR引物各1.0µL，2.0×10^-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45S、72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。取5 µL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小对番茄晚疫病菌特异性引物的特异性进行验证。

3.引物特异性验证结果

PCR扩增结果表明，引物PIF/PIR只能特异性地从供试的番茄晚疫病菌DNA中扩增出大小约为399bp的条带（图1），而其它疫霉菌、病原真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将番茄晚疫病菌与其它疫霉菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于番茄晚疫病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：引物对番茄晚疫病菌基因组DNA的灵敏度检测

1.常规PCR扩增

用无菌超纯水对番茄晚疫病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。使用本发明所述引物PIF/PIR对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，评估该引物对病菌基因组DNA检测的灵敏性，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PIF/PIR引物各1.0µL，2.0×10^-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10min。

巢式PCR扩增

用无菌超纯水对番茄晚疫病基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。以疫霉菌β-tubulin基因通用引物Oom(Ph)-Btub-up901 F ：5′-TACGACATTTGCTTCCG-3′ 和Oom-Btub-lo1401 R：5′-CGCTTGAACATCTC CTGG-3′为外引物，本发明所述的特异引物PIF/PIR为内引物对番茄晚疫病菌不同系列浓度的基因组DNA进行巢式PCR扩增，评估本发明所述引物PIF/PIR通过巢式PCR对番茄晚疫病菌基因组DNA检测的灵敏性，第一轮PCR扩增：以疫霉菌β-tubulin基因通用引物Oom(Ph)-Btub-up901 F ：5′-TACGACATTTGCTTCCG-3′和Oom-Btub-lo1401 R：5′-CGCTTGAACATCTC CTGG-3′作为第一轮反应引物对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×TaqPCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的Oom(Ph)-Btub-up901F/Oom-Btub-lo1401 R引物各1.0µL，2.0×10^-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、55℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。第二轮PCR扩增：待第一轮PCR扩增结果后，取1.0 μl 第一轮PCR产物为模板与引物PIF/PIR组合进行巢式PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCRMaster Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PIF/PIR引物各1.0µL，2.0×10^-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

常规PCR和巢式PCR灵敏度比较结果表明，当以本发明所述引物PIF/PIR进行常规PCR扩增时，反应灵敏度可以达到100 pg DNA 25μl^-1反应体系（图2中的a）。进一步以疫霉菌β-tubulin基因通用引物Oom(Ph)-Btub-up901 F/ Oom-Btub-lo1401 R进行第一轮扩增得到的PCR产物作为模板，以PIF/PIR作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增，从电泳图可以看出套式PCR的特异性扩增条带比常规PCR要亮得多，能够使原来看不到条带的的样品（10pg、1pg、100fg、10fg/25μl反应体系）产生可见条带(图2中的b)，灵敏度达到10fg DNA 25μl^-1反应体系，比常规PCR提高10000倍左右。

实施例3：发病叶片中番茄晚疫病菌的检测

发病叶片基因组DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向1.0mg发病叶片组织中加入0.5 mol/L NaOH 30 µL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）495µL混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。PCR扩增检测：利用本发明所述引物PIF/PIR进行PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PIF/PIR引物各1.0µL，2.0×10^-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。结果检测：取PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖电泳分离，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约399bp的产物，即可判断发病叶片中存在番茄晚疫病菌。检测结果（图3）表明，番茄晚疫病发病症状典型的叶片中均可检测出晚疫病菌，而健康叶片及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术可用于番茄植株中晚疫病菌的快速分子检测。

实施例4：土壤样品中番茄晚疫病菌的检测

土壤样品中总微生物基因组DNA的提取：采用土壤DNA提取法提取土壤中总微生物基因组DNA，具体过程如下：取已过200目筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500 µL重量浓度为0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12,000 rpm离心15 min，取上清液加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10µg/mL蛋白酶K，55℃水浴60min，水浴结束后，加入1/2体积的7.5M NH₄AC溶液，上下颠倒混匀，12,000 rpm离心15 min，吸上清液加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀20min以上，沉淀结束后，12,000 rpm离心10 min，倾掉上清液，用体积浓度为70%乙醇洗涤沉淀，室温凉干，每份样品所提DNA用20 µl TE（或无菌超纯水）溶解，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。PCR扩增检测：利用本发明所述引物PIF/PIR进行PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PIF/PIR引物各1.0µL，1.0 µL DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为：95 ℃预变性5min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。结果检测：取PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖电泳分离，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约399bp的产物，即可判断土壤样品中存在番茄晚疫病菌。检测结果（图3）表明，番茄晚疫病发病严重的田块土壤样品中可检测出番茄晚疫病菌，而高压灭菌的土壤样品及阴性对照则无特异性条带出现，说明本发明特异引物可用于土壤样品中番茄晚疫病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 番茄晚疫病菌PCR检测引物、试剂盒及检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccatgtccg gtattaccac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctcatcttc agacccttgg 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacgacattt gcttccg 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcttgaaca tctcctgg 18

Claims (5)

1.番茄晚疫病菌PCR检测引物，其特征在于：所述引物序列为：

上游引物PIF：5'- GCCATGTCCGGTATTACCAC -3'，

下游引物PIR：5'- GCTCATCTTCAGACCCTTGG -3'；

对番茄晚疫病菌特异性扩增出399bp的产物。

2.一种如权利要求1所述引物在番茄晚疫病菌PCR检测试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包含如下试剂：重量浓度≥99%的超纯水，2×Taq PCR Master Mix，10 µmol/L的PIF和PIR引物，100 ng/µL的番茄晚疫病菌阳性对照DNA，2000 bp DNA marker。

4.一种如权利要求1所述引物用于番茄晚疫病菌PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板进PCR反应，PCR扩增的条件为：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，10 µmol/L PIF和PIR引物各1.0µL， DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；

（3）取5.0 µL步骤（2）的PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电泳分离后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，能特异性地扩增出399bp的产物，即判断所述的检测样品中存在番茄晚疫病菌。

5.如权利要求1所述的引物在田间番茄晚疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定上的应用。