CN106282386A - 一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法 - Google Patents

一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测和生物技术领域。该特异性引物包括上游引物BCMF：5’‑ATAACTGTTGCTTCGGCGGG‑3’，下游引物BCMR：5’‑CCCAGTGCGAGACGTAAAGT‑3’。所发明的检测引物及检测方法可用于香蕉炭疽病菌纯培养的检测鉴定，也能对香蕉叶片和果实进行检测；本发明检测引物特异性强、灵敏度高，检测方法实用性好，操作简便快捷；本发明能实现香蕉炭疽病潜伏侵染期的检测，还能有效区分香蕉上相似的黑星病、叶斑病，对香蕉炭疽病的早期预警和防控，防治病害的扩散蔓延具有重要意义。

Description

一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法
技术领域
本发明涉及一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及其检测方法，专用于香蕉炭疽病菌的快速分子检测，同时可实现田间香蕉炭疽病菌的潜伏侵染期的诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害检测和生物技术领域。
背景技术
香蕉是世界著名的热带、亚热带水果，其特点是:高热量、低脂肪，富含人体所必须的碳水化合物、蛋白质、矿物质等，其中K的含量为水果之最。世界上有50多个国家生产香蕉，年产销量达4千多万吨，中国年产量在150-190万吨。
香蕉炭疽病(Anthracnose)是一种严重的世界性病害，由芭蕉炭疽菌(Colletotrich mmusae)侵染引起，可为害香蕉植株的地上各部位，以为害果实最重要，叶片上病斑长椭圆形或不规则形，大小不等，边缘褐色稍深，分生孢子盘为黑色小粒状，香蕉生长后期小黑点布满叶片；为害青果时，病斑长椭圆形，黑褐色，上生许多小黑点，为害成熟果实时，黑褐色，有时有圆心轮纹，常中央纵列；为害果柄常引起落果。果实一旦发病，扩展迅速，表现为果皮褐变，果肉逐渐腐烂，严重影响果品价值，不数日便全果烂掉，我国香蕉采后病害以炭疽病发生最普遍，给生产、贮运及销售造成巨大经济损失，严重影响着我国香蕉的北运和出口。
香蕉炭疽病菌侵染香蕉果实有一个重要的特性，即潜伏侵染特性，目前以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，而香蕉炭疽菌潜伏侵染特性使得人们无法通过症状来诊断香蕉果实是否染病及染病的程度，迫切需要一种快速、准确的分子检测方法。
近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，分子生物技术的应用使重要病原真菌的检测、诊断与鉴定上升到新的水平，而实际应用层面及辅助分类鉴定诊断与检测为植物病理学做出了重要贡献。其中PCR（polymerase chain reaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关香蕉炭疽病菌快速分子检测的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中对香蕉炭疽病的检测主要基于症状特征，香蕉炭疽病菌鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以诊断具有潜伏侵染特性的香蕉炭疽病的问题，提供了一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及其检测方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
本发明首先提供了一种香蕉炭疽病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：
上游引物BCMF：5’-ATAACTGTTGCTTCGGCGGG-3’；
下游引物BCMR：5’-CCCAGTGCGAGACGTAAAGT-3’。
所述引物BCMF和BCMR对香蕉炭疽病菌特异性扩增出406bp的产物。
本发明还提供了一种香蕉炭疽病菌的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)从香蕉叶片或香蕉果皮中提取DNA；
用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA；用于检测香蕉植株组织是否存在香蕉炭疽病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA；
(2) 以提取香蕉叶片或香蕉果皮DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃延伸10min；
(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出406bp的产物，则可判定所述的香蕉叶片或香蕉果皮中存在香蕉炭疽病菌，否则所述的香蕉叶片或香蕉果皮中不存在香蕉炭疽病菌。
本发明的积极有益效果在于：
（1）准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对香蕉炭疽病菌具有特异扩增作用的PCR 引物。已经对不同地理来源的香蕉炭疽病菌、携带香蕉炭疽病菌的叶片、携带香蕉炭疽病菌的果实和健康的香蕉组织进行了检测验证，只有香蕉炭疽病菌和携带该病菌的组织中能特异性地扩增出一条406 bp 的电泳条带，说明本发明所设计的引物用于检测香蕉炭疽病菌准确可靠；
（2）特异性强：本发明所设计的引物对香蕉炭疽病菌具有很强的特异性，能够用于区别香蕉炭疽病菌(Colletotrich mmusae)、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)等香蕉上常见的病原菌，从而能有效区分发生在香蕉上症状特征相似的病害；
（3）灵敏度高：本发明将设计的特异引物与ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR 扩增后，对香蕉炭疽病菌的检测灵敏度在DNA 水平上可达到1fg；
（4）适用性广、实用性好：本发明的香蕉炭疽病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的香蕉组织进行检测，可实现香蕉炭疽病菌的潜伏侵染期检测，即在病害显症前进行检测，防治采后香蕉炭疽病的爆发流行。
（5）、操作简便快速：本发明只需进行DNA 提取、PCR 扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明引物对香蕉炭疽病菌特异性扩增电泳图：其中泳道M为2000bp DNAMarker，泳道2、泳道3为香蕉炭疽病菌，泳道4-10分别为：香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)阴性对照。
图2为本发明引物香蕉炭疽病菌的灵敏性检测扩增电泳图：A：普通PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-12分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照；B为巢式PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bp DNAMarker，泳道2-13分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、阴性对照、阳性对照。
图3为本发明香蕉叶片和果实中炭疽病菌检测扩增电泳图，其中泳道M为2000bpDNA Marker，泳道2-10分别为自然发病的香蕉叶片、自然发病的香蕉果实、人工接种发病的香蕉果实、人工接种潜伏期的香蕉果实、健康香蕉叶片、健康的香蕉果实、健康香蕉果柄、阴性对照、阳性对照。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1 分子检测引物设计及香蕉炭疽病菌特异分子检测方法的建立
1.香蕉炭疽病菌基因组DNA的提取：
采用 CTAB 法提取本实验室保存的5株香蕉炭疽病菌的基因组 DNA，具体步骤如下：
(1)取0.1 g菌丝粉于1.5 mL 离心管中，加入900 μL2%CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15 min；
(2)取上清液700μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000 r/min离心10min ；
(3)取上清液500 μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000 r/min离心10min；
(4)取上清液350 μL，加入1/10 体积3 mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000 r/min离心5 min ；
(5)弃去上清液，加入700μL 体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000 r/min离心10sec，晾干，加入50 μL TE缓冲液，-20℃保存备用。
2.香蕉炭疽病菌ITS序列测定：
以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 为引物对提取香蕉炭疽病菌的DNA 进行PCR 扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara 大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10min；所得PCR产物送大连宝生物工程有限公司测序。
3.香蕉炭疽病菌特异分子检测引物的设计：
根据香蕉炭疽病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，用Clustal X软件将测序得到的5株香蕉炭疽病菌的ITS 序列与GenBank 中Colletotrichum属不同种的ITS序列、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae) ITS序列、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae) ITS序列、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae) ITS序列、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum) ITS序列、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum) ITS序列、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae) ITS序列进行同源性分析和差异位点比较，用Primer Primer5软件设计了对香蕉炭疽病菌具有特异性扩增作用的一对PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特异分子检测引物的序列为：
上游引物BCMF：5’-ATAACTGTTGCTTCGGCGGG-3’；
下游引物BCMR：5’-CCCAGTGCGAGACGTAAAGT-3’
4.香蕉炭疽病菌快速分子检测方法的建立：
(1)从香蕉叶片或香蕉果皮中提取DNA:
①用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA;
②用于检测香蕉植株组织是否存在香蕉炭疽病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA，具体步骤如下：
a.称取待检测的植物组织0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，将组织充分磨碎成糊；
b.将糊状组织转入1.5 mL 离心管中，12000r/min 离心6 min，取上清液5 μL ；
c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均匀，取1.0μL 作为PCR模板进行扩增；
(2) 以提取香蕉叶片或香蕉果皮DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃延伸10min；
(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出406bp的产物，则可判定所述的香蕉叶片或香蕉果皮中存在香蕉炭疽病菌，否则所述的香蕉叶片或香蕉果皮中不存在香蕉炭疽病菌。
实施例2 香蕉炭疽病菌特异性扩增
1.采用CTAB 法提取2株香蕉炭疽病菌、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)的基因组DNA。
2. 以提取供试菌的DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。
3.特异性扩增结果
如图1所示，2株香蕉炭疽病菌可以特异性扩增出406bp的条带，而香蕉焦腐病菌(Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)和阴性对照均无扩增条带，表明本发明的分子检测引物可以将香蕉炭疽病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于香蕉炭疽病菌的特异性扩增。
实施例3本发明引物对香蕉炭疽病菌的灵敏性检测
1.采用CTAB 法提取香蕉炭疽病菌的基因组DNA；
2.将提取的香蕉炭疽病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
3. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。
4. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行巢式PCR扩增：
（1）第一轮PCR 扩增：以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 为外引物对配制的成系列浓度DNA 进行第一轮PCR 扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara 大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10min；
（2）第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增的产物为模板，以BCMF/BCMR为引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共30个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。
5.检测结果
如图2所示，以本发明引物BCMF/BCMR为引物进行常规PCR时，在25μL反应体系中，10pg的香蕉炭疽病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10pg（图2-A）；而进一步以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 为外引物扩增的产物为模板，以本发明引物BCMF/BCMR为引物进行第二轮扩增时，在25μL反应体系中，1fg的香蕉炭疽病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到1fg(图2-B)。
实施例4香蕉植株中香蕉炭疽病菌的检测
1.采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA。
2. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。
3. 检测结果
如图3所示，自然发病的香蕉叶片、自然发病香蕉果实、人工接种发病的香蕉叶片、人工接种处于侵染期的香蕉果实、阳性对照中均可产生406bp左右的可视条带，而健康香蕉叶片、健康的香蕉果实、健康香蕉果柄、阴性对照均无任何条带出现，表明本发明引物和检测方法还可用于田间香蕉植株中香蕉炭疽病菌的检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ataactgttg cttcggcggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccagtgcga gacgtaaagt 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgtaggga acctgcgg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (4)

1. 一种香蕉炭疽病菌分子检测引物，其特征在于：引物的核苷酸序列为：
上游引物BCMF：5’-ATAACTGTTGCTTCGGCGGG-3’
下游引物BCMR：5’-CCCAGTGCGAGACGTAAAGT-3’。
2.根据权利要求1所述香蕉炭疽病菌分子检测引物，其特征在于，所述上游引物BCMF和下游引物BCMR对香蕉炭疽病菌特异性扩增出406bp的产物。
3.一种香蕉炭疽病菌的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取香蕉叶片或香蕉果皮的DNA；
(2) 以提取的香蕉叶片或香蕉果皮DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的权利要求1所述的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃延伸10min；
(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出406bp的产物，则可判定香蕉叶片或香蕉果皮存在香蕉炭疽病菌。
4.如权利要求1所述的香蕉炭疽病菌分子检测引物在检测香蕉炭疽病菌中的应用。
CN201610900828.1A 2016-10-17 2016-10-17 一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法 Pending CN106282386A (zh)

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