CN107815504A - 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法 - Google Patents
一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107815504A CN107815504A CN201711235825.1A CN201711235825A CN107815504A CN 107815504 A CN107815504 A CN 107815504A CN 201711235825 A CN201711235825 A CN 201711235825A CN 107815504 A CN107815504 A CN 107815504A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peach
- anthracnose
- primer
- detection
- mediated isothermal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法,专用于桃炭疽病菌的特异性检测,属于农作物病害检测和生物技术领域。本发明设计了一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物,包括外引物F3和B3,以及内引物FIP和BIP,序列见SEQ ID NO.1‑4。基于该引物建立的桃炭疽病菌检测方法,经过环介导等温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测,可观察到绿色荧光或出现环介导等温扩增特征性的梯形条带。所发明的环介导等温扩增检测引物及其检测方法能在生产实践中实现桃炭疽病菌的快速、灵敏、准确检测,同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定,为桃炭疽病的早期预警和防控提供可靠的技术和理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法,专用于桃炭疽病菌的快速分子检测,同时可实现田间桃炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测和鉴定,属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。
背景技术
桃属于蔷薇科李属落叶果树,我国是世界桃的起源中心。桃子素有“寿桃”、“仙桃”的美称,因其肉质鲜美,又被成为“天下第一果”。桃肉含蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、钙、磷、铁、胡萝卜素、维生素B1、糖分等,是我国重要的水果之一。
桃炭疽病(Peach anthracnose)是桃树『Prunus persica(L.)Batsch]栽培上一种重要的病害,主要为害桃树枝梢、嫩叶及幼果,可导致果实腐烂、早落。在幼果初期发病时,果面呈褐色水渍状斑,以后随果实膨大病斑也扩大,红褐色,呈圆形或椭圆形,并明显凹陷。果实近成熟时发病,果面病斑显著凹陷,呈明显的同心环,潮湿时同心环上会出现桔红色小粒点,病斑逐渐扩大,乃至整个果实。新梢被感染后,出现暗褐色略凹陷的椭圆形病斑。桃炭疽病病原菌无性世代为盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioids Penz),属半知菌亚门。该病原菌主要在桃树病枯枝和僵果上越冬。翌年春,病组织上产生的孢子借风雨传播到枝条、叶片和果实上,引起初次侵染。该病为害时期长,影响整个生长期。桃炭疽病初发期是病害防治的最佳时期,而在其病害初发期与桃褐腐病症状相似,以症状为基础的病害常规诊断技术,需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤,耗时长、效率低、准确性差,难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行,难以满足桃炭疽病诊断的实际需要。因此,建立一种快速、灵敏的检测方法用于桃炭疽病的早期诊断,为病害的最佳防治时期提供技术支撑,同时防治病害的传播具有重要意义。
近年来,分子生物学技术发展迅速,随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用,一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径, PCR(polymerasechain reaction)技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断,但其需要昂贵的仪器设备,难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增,30 min -60 min内实现109-1010倍的扩增,具有很高的灵敏性和特异性,且操作简便,检测结果可肉眼判断。相比PCR技术,环介导等温扩增技术全程恒温反应,无需PCR仪,且扩增量大、灵敏度高。目前环介导等温扩增检测已成功应用于人畜病原物、食品安全、环境安全及多种植物病原物检测的报道,但目前有关桃炭疽病菌环介导等温扩增检测的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中对桃炭疽病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低,PCR检测需要依靠扩增仪等设备的问题,提供了一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。
为实现上述目的,本发明采取了以下技术方案:
1. 桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物的设计
根据桃炭疽病菌核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对桃炭疽病菌具有特异扩增作用的环介导等温扩增检测引物,包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP),其核苷酸序列分别为:
F3:5’-CATGCCTGTTCGAGCGTC-3’;
B3:5’-GTTCAGCGGGTATTCCTACC-3’;
FIP: 5’-ACCTTTAAGGGCCCACGTGTGATTTCAACCCTCAAGCACCG-3’;
BIP: 5’-TAACGTCTCGCACTGGGATTCGTGATCCGAGGTCAACCTGTA-3’。
2. 建立桃炭疽病菌环介导等温扩增检测方法,包括以下步骤:
(1)从待检测样品中提取DNA;
用于检测病原菌纯培养物时,采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA;用于检测桃植株组织是否存在桃炭疽病菌时,采用NaOH 快速裂解法提取桃植株组织基因组DNA。
(2) 以提取待测样品DNA为模板进行环介导等温扩增检测:环介导等温扩增反应体系25 μL,反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3,1.6 mmol/L的FIP和BIP,Bst DNA聚合酶为8 U,DNA模板50~100 ng,12.5 uL的环介导等温扩增反应混合液(40 mM Tris-HCl,20 mM(NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6 mol/L 甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2% Trion X-100),用无菌的超纯水补足25 uL。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60 min,85℃灭活5-10 min。
(3)环介导等温扩增反应结果测定:采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法:待反应结束后,在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,橙色或橘黄色判断为阴性。所述的琼脂糖凝胶电泳法:取2.0 uL 环介导等温扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,如出现梯形条带判断为阳性,没有出现条带则判断为阴性。
本发明的有益效果在于:
(1)特异性强、准确性高:本发明是根据真菌核糖体转录间隔区(rDNA-ITS)序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点,选取了6个特定区域设计了对桃炭疽病菌具有特异扩增作用的4条环介导等温扩增引物。已经对不同地理来源的桃炭疽病菌、桃褐腐病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、香蕉冠腐病菌、大豆炭疽病菌、李树葡萄座腔菌、携带桃炭疽病菌的植物组织和健康的桃组织进行了检测验证,只有桃炭疽病菌和携带该病菌的组织呈现阳性,说明本发明所设计的引物及检测方法用于检测桃炭疽病菌准确可靠,能有效区分发生在桃上症状特征相似的病害;
(2)灵敏度高:环介导等温扩增对桃炭疽病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达100fg,具有很高的灵敏度;
(3)适用性广、实用性好:本发明的桃炭疽病菌的检测方法,不仅能对病菌菌丝体进行检测,也能对感病的桃组织进行检测,可实现桃炭疽病菌的早期检测,即在病害显症前进行检测,防止病害的爆发流行。
(4)操作简便快速:环介导等温扩增是在等温条件下进行,只需一个恒温水浴锅即可,结果可视化,一般整个检测过程可在1.5小时内完成,操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明环介导等温扩增检测方法对桃炭疽病菌的特异性检测结果:上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果,下图为可视化显色结果,其中泳道M为2000bp DNA Marker,泳道2为阳性对照、泳道3-5为桃炭疽病菌,泳道6-11分别为:桃褐腐病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、香蕉冠腐病菌、大豆炭疽病菌、李树葡萄座腔菌、阴性对照;其中可视化显色结果中2-5显示绿色荧光,其他不显示。
图2为本发明环介导等温扩增检测方法对桃炭疽病菌的灵敏性检测结果:上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果,下图为可视化显色结果,其中泳道M为2000bp DNA Marker,泳道2-11的模板DNA浓度分别为:100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、阴性对照、阳性对照;其中可视化显色结果中2-8、11显示绿色荧光,其他不显示。
图3为本发明环介导等温扩增检测方法对桃发病组织实用性检测结果,上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果,下图为可视化显色结果,其中泳道M为2000bp DNA Marker,泳道2-7分别为桃炭疽病菌、桃炭疽病自然发病的桃组织、人工接种桃炭疽病菌发病的桃组织、健康桃组织、阳性对照、阴性对照,其中可视化显色结果中2-4、6显示绿色荧光,其他不显示。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1桃炭疽病菌环介导等温扩增引物设计
根据桃炭疽病菌核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对桃炭疽病菌具有特异扩增作用的环介导等温扩增检测引物,包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP),其核苷酸序列分别为:
F3:5’-CATGCCTGTTCGAGCGTC-3’;
B3:5’-GTTCAGCGGGTATTCCTACC-3’;
FIP: 5’-ACCTTTAAGGGCCCACGTGTGATTTCAACCCTCAAGCACCG-3’;
BIP: 5’-TAACGTCTCGCACTGGGATTCGTGATCCGAGGTCAACCTGTA-3’。
实施例2桃炭疽病菌环介导等温扩增检测方法的建立
1.待测样品DNA的提取:
①用于检测病原菌纯培养物时,采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA,具体步骤如下:
(1)取0.1 g菌丝粉于1.5 mL 离心管中,加入900 μL2wt.%CTAB提取液,使用振荡器振荡混匀,60℃水浴60 min,室温条件下,12000r/min离心15 min;
(2)取上清液700 μL,加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(各体积比为25:24:1),温和摇动,室温条件下,8000 r/min离心10 min;
(3)取上清液500 μL,加入等体积氯仿再抽提一次,室温条件下,8000 r/min离心10min;
(4)取上清液350 μL,加入1/10 体积3 mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇,-20℃沉淀60min,4℃条件下,8000 r/min离心5 min ;
(5)弃去上清液,加入700μL 体积浓度为70%冰乙醇,轻摇10 sec,4℃条件下,8000 r/min离心10 sec,晾干,加入50 μL TE缓冲液,-20℃保存备用。
②用于检测桃植株组织是否存在桃炭疽病菌时,采用NaOH 快速裂解法提取桃植株组织基因组DNA,具体步骤如下:
a.称取待检测的植物组织0.1 g,加入0.5 mol/L NaOH 30 μL,将组织充分磨碎成糊;
b.将糊状组织转入1.5 mL 离心管中,12000r/min 离心6 min,取上清液5 μl;
c.上清液中加入495 μL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH=8.0),混合均匀,取1.0 μL作为PCR模板进行扩增;
2.以提取待测样品DNA为模板进行环介导等温扩增:环介导等温扩增反应体系25 μL,反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3,1.6 mmol/L的FIP和BIP,Bst DNA聚合酶为8 U,DNA模板50~100 ng,12.5 uL的环介导等温扩增反应混合液(40 mM Tris-HCl,20 mM(NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6mol/L 甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2% Trion X-100),用无菌的超纯水补足25 uL。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60 min,85℃灭活5-10min。
3. 环介导等温扩增反应结果测定:采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法:待环介导等温扩增反应结束后,在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,存在桃炭疽病菌;橙色或橘黄色判断为阴性,不存在桃炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法:取2.0 uL 环介导等温扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,如出现梯形条带判断为阳性,存在桃炭疽病菌;没有出现条带则判断为阴性,不存在桃炭疽病菌。
实施例3桃炭疽病菌环介导等温扩增检测特异性测定
1.采用CTAB 法提取3株桃炭疽病菌、桃褐腐病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、香蕉冠腐病菌、大豆炭疽病菌、李树葡萄座腔菌的基因组DNA。
2. 以提取供试菌的DNA为模板进行环介导等温扩增:环介导等温扩增反应体系25μL,反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3,1.6 mmol/L的FIP和BIP,Bst DNA聚合酶为8U,DNA模板50~100 ng,12.5 uL的环介导等温扩增反应混合液(40 mM Tris-HCl,20 mM(NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6 mol/L 甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2% Trion X-100),用无菌的超纯水补足25 uL。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60 min,85℃灭活5-10 min。
3. 环介导等温扩增反应结果测定:采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法:待扩增反应结束后,在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,存在桃炭疽病菌;橙色或橘黄色判断为阴性,不存在桃炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法:取2.0 uL 环介导等温扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,如出现梯形条带判断为阳性,存在桃炭疽病菌;没有出现条带则判断为阴性,不存在桃炭疽病菌。
4.特异性验证结果
如图1所示,3株桃炭疽病菌显色结果可观察到绿色荧光,琼脂糖凝胶电泳出现环介导等温扩增特征性梯形条带,而供试其它作物病原菌和阴性对照显色结果为橙色,琼脂糖凝胶电泳未出现环介导等温扩增特征性梯形条带,表明本发明的环介导等温扩增引物可以将桃炭疽病菌与其他病原菌区分开来,具有很强的特异性,本发明的检测方法可用于桃炭疽病菌的特异性检测和鉴定。
实施例4桃炭疽病菌环介导等温扩增检测灵敏性测定
1.采用CTAB 法提取桃炭疽病菌的基因组DNA;
2.将提取的桃炭疽病菌的基因组DNA,经分光光度计测定浓度后,用无菌超纯水稀释,配制成系列浓度,备用;
3. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规环介导等温扩增:环介导等温扩增反应体系25 μL,反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3,1.6 mmol/L的FIP和BIP,Bst DNA聚合酶为8U,DNA模板50~100 ng,12.5uL的环介导等温扩增反应混合液(40 mM Tris-HCl,20 mM(NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6 mol/L 甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2% Trion X-100),用无菌的超纯水补足25 uL。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60 min,85℃灭活5-10 min。
4. 环介导等温扩增反应结果测定:采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法:待扩增反应结束后,在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,存在桃炭疽病菌;橙色或橘黄色判断为阴性,不存在桃炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法:取2.0 uL 环介导等温扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,如出现梯形条带判断为阳性,存在桃炭疽病菌;没有出现条带则判断为阴性,不存在桃炭疽病菌。
5.检测结果
如图2所示,显色结果可观察到绿色荧光,琼脂糖凝胶电泳出现环介导等温扩增特征性的梯形带,检测灵敏度可达100 fg。
实施例5发病桃植株中桃炭疽病菌的环介导等温扩增检测
1. 采用CTAB 法提取桃炭疽病菌基因组DNA;采用NaOH 快速裂解法提取桃植株组织基因组DNA。
2. 以提取供试样品的DNA为模板进行环介导等温扩增:环介导等温扩增反应体系25 μL,反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3,1.6 mmol/L的FIP和BIP,Bst DNA聚合酶为8 U,DNA模板50~100 ng,12.5 uL的环介导等温扩增反应混合液(40 mM Tris-HCl,20 mM(NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6 mol/L 甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2% Trion X-100),用无菌的超纯水补足25 uL。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60 min,85℃灭活5-10 min。
3. 环介导等温扩增反应结果测定:采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法:待扩增反应结束后,在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,存在桃炭疽病菌;橙色或橘黄色判断为阴性,不存在桃炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法:取2.0 uL 环介导等温扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,如出现梯形条带判断为阳性,存在桃炭疽病菌;没有出现条带则判断为阴性,不存在桃炭疽病菌。
4. 检测结果
如图3所示,桃炭疽病菌、桃炭疽病自然发病的桃组织、人工接种桃炭疽病菌发病的桃组织、阳性对照显色结果可观察到绿色荧光,琼脂糖凝胶电泳出现环介导等温扩增特征性的梯形带,而健康桃组织、阴性对照显色结果为橙色,琼脂糖凝胶电泳未出现环介导等温扩增特征性的梯形带,表明本发明环介导等温扩增引物和检测方法还可用于田间桃炭疽病发病植株的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catgcctgtt cgagcgtc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttcagcggg tattcctacc 20
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acctttaagg gcccacgtgt gatttcaacc ctcaagcacc g 41
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taacgtctcg cactgggatt cgtgatccga ggtcaacctg ta 42
Claims (4)
1.一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物,其特征在于:所述的桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成,各引物的核苷酸序列为:
F3:5’-CATGCCTGTTCGAGCGTC-3’;
B3:5’-GTTCAGCGGGTATTCCTACC-3’;
FIP: 5’-ACCTTTAAGGGCCCACGTGTGATTTCAACCCTCAAGCACCG-3’;
BIP: 5’-TAACGTCTCGCACTGGGATTCGTGATCCGAGGTCAACCTGTA-3’。
2.一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测方法,其特征在于:利用权利要求1所述的桃炭疽病菌环介导等温扩增引物进行扩增反应,反应体系为25 uL,反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3,1.6 mmol/L的FIP和BIP,Bst DNA聚合酶为8 U,DNA模板50~100 ng,12.5 uL的环介导等温扩增反应混合液,用无菌的超纯水补足25 uL;反应条件为63-65℃温育45-60min,85℃灭活5-10 min;所述环介导等温扩增反应混合液含40 mM Tris-HCl,20 mM(NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6mol/L 甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2% Trion X-100。
3.根据权利要求2所述的一种桃炭疽病菌的环介导等温扩增检测方法,其特征在于:待扩增反应结束后,在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green I 1.0 uL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,橙色或橘黄色判断为阴性,或采用琼脂糖凝胶电泳法判断检测结果,取2.0 uL 环介导等温扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,出现梯形条带判断为阳性,没有出现梯形条带则判断为阴性。
4.如权利要求1所述的一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物在桃炭疽病的早期诊断和病菌监测和鉴定中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711235825.1A CN107815504A (zh) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711235825.1A CN107815504A (zh) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107815504A true CN107815504A (zh) | 2018-03-20 |
Family
ID=61606561
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201711235825.1A Pending CN107815504A (zh) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107815504A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113789406A (zh) * | 2021-09-26 | 2021-12-14 | 海南大学 | 可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法 |
CN114703310A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-07-05 | 福建农业职业技术学院 | 桃褐腐病菌lamp检测引物及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106244720A (zh) * | 2016-10-12 | 2016-12-21 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种桃炭疽病菌分子检测引物及检测方法 |
CN106755339A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 黄瓜炭疽病菌lamp检测引物及其应用 |
-
2017
- 2017-11-30 CN CN201711235825.1A patent/CN107815504A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106244720A (zh) * | 2016-10-12 | 2016-12-21 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种桃炭疽病菌分子检测引物及检测方法 |
CN106755339A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 黄瓜炭疽病菌lamp检测引物及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
HIROSHI KATOH等: "Rapid detection of Colletotrichum gloeosporioides in infected strawberry plants using loop-mediated isothermal amplification", 《JOURNAL OF GENERAL PLANT PATHOLOGY》 * |
曾丹丹等: "基于环介导等温扩增技术检测黄淮地区大豆主栽品种种子携带的病原菌", 《南京农业大学学报》 * |
邵秀玲等: "《植物病原生物现代检测技术及应用》", 31 October 2015, 中国质检出版社 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113789406A (zh) * | 2021-09-26 | 2021-12-14 | 海南大学 | 可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法 |
CN114703310A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-07-05 | 福建农业职业技术学院 | 桃褐腐病菌lamp检测引物及其应用 |
CN114703310B (zh) * | 2022-01-17 | 2024-03-26 | 福建农业职业技术学院 | 桃褐腐病菌lamp检测引物及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106434993B (zh) | 用于检测黄瓜枯萎病菌的lamp引物组合物及其应用 | |
CN107815505A (zh) | 一种香蕉炭疽病菌lamp检测引物组及其检测方法 | |
CN107699634A (zh) | 一种芦笋茎枯病菌lamp检测引物组及其检测方法 | |
CN108220474A (zh) | 一种禾谷镰刀菌的lamp检测引物及其应用 | |
CN105256060B (zh) | 一种金线莲炭疽病菌pcr检测引物及其检测方法 | |
CN104313128B (zh) | 基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物 | |
CN109280715A (zh) | 一种检测花生黑腐病菌的lamp引物组及其快速检测方法和试剂盒 | |
CN107815504A (zh) | 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法 | |
CN106755339B (zh) | 黄瓜炭疽病菌lamp检测引物及其应用 | |
CN108220475A (zh) | 基于rpa技术的樱桃灰霉病菌检测方法及检测专用引物 | |
CN106381341A (zh) | 一种芋疫霉菌巢式pcr检测引物及其应用 | |
CN107723381A (zh) | 香蕉冠腐病菌lamp检测引物及其检测方法 | |
CN108546772A (zh) | 玉米大斑病菌lamp检测引物及其快速检测方法和应用 | |
CN106636378B (zh) | 用于检测番茄晚疫病菌的lamp引物组合物和应用 | |
CN111850155A (zh) | 特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用 | |
CN106282386A (zh) | 一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法 | |
KR101883851B1 (ko) | 수박의 덩굴마름병 진단용 마커 유전자 및 이의 용도 | |
CN112322768A (zh) | 一种沙棘枝干枯萎病诊断及病原菌的快速rpa检测方法 | |
CN101701258B (zh) | 菜豆的pcr鉴定用引物及pcr鉴定方法 | |
CN104195254B (zh) | 基于环介导等温扩增技术检测木贼镰孢菌的方法和引物组合物 | |
CN105755122A (zh) | 一种甘薯蔓割病菌分子检测引物及快速检测方法 | |
CN106399529B (zh) | 一种香蕉黑星病菌分子检测引物及检测方法 | |
CN110144386A (zh) | 用于检测pole基因突变的引物、探针及试剂盒 | |
CN106434990B (zh) | 一种苜蓿疫霉菌巢式pcr检测方法 | |
CN105219868A (zh) | 金线莲炭疽病lamp检测引物及其可视化检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180320 |