CN105256060B - 一种金线莲炭疽病菌pcr检测引物及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金线莲炭疽病菌PCR检测引物及其检测方法，主要采用设计了一对金线莲炭疽病菌的特异引物（CF1：5’‑CGGAGGATAACCAAACTCTG‑3’和CR1：5’‑CGAGACGTAAAGTTACTACGC‑3’），经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在金线莲炭疽病菌纯DNA、带菌的植株中特异性地扩增出片段长度为326bp的特异扩增产物。所发明的特异分子检测引物及其用法可用于生产实践中金线莲炭疽病菌感染的植株中炭疽病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于药用植物种植中病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为金线莲炭疽病菌引起的病害的防治提供可靠的理论和技术支撑。

Description

一种金线莲炭疽病菌PCR检测引物及其检测方法
技术领域
本发明金线莲炭疽菌PCR检测引物及其检测方法，专用于金线莲炭疽菌高灵敏度快速PCR检测，克服了传统的培养鉴定方法繁杂且准确性低的缺点，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。
背景技术
金线莲又名花叶开唇兰，也有人将其称为金丝草和金线入骨消等，具有很高的药用价值，如清热凉血、袪风利湿、强心利尿、固肾、平肝等功效。作为近年来备受推崇的保健药材，商家对此开发出了不少相关产品，受到消费者的广泛喜爱，但野生金线莲对生长环境的要求苛刻，加上人工的过度采挖，已面临灭绝的境地，目前，人工栽培是解决上述问题的最佳方法。在福建地区，金线莲的栽培技术也十分成熟，但金线莲的病害问题也日益凸显。最近，在福建省多个金线莲种植大棚中出现了金线莲移栽后疑似炭疽病病样，发病面积大，传染速度快，严重影响到金线莲的产量和品质。通过对病样采集、病菌分离鉴定，柯赫法则验证，最终确定金线莲炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。胶孢炭疽菌是炭疽菌属(Colletotrichum Corda.)中有着最多种类的一个种，胶孢炭疽菌菌丝最适宜生长的温度为28℃，分生孢子产生及萌发的最适温度为28℃至32℃，相对湿度为85％。
对于金线莲炭疽病的传统鉴定方法是通过对已经分离并纯化的菌株进行培养，观察，完成形态上的鉴定工作。同时，将病原菌回接到金线莲植株中，进行致病性的验证。最后，对照已有的分类资料确定引起金线莲炭疽病的病原菌的分类和地位。该法作为最基本的病原菌鉴定方法在一直以来被广泛使用，有着很强的实用性。但是不可否认，传统方法在形态学特征鉴定上对专业人员要求高，而且受人为因素和环境的影响，对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，十分耗时，无法达到快速检验的要求。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）技术的出现使分子生物学水平上的检测成为可能。并且，随着技术的进步，PCR技术在植物检疫中表现出了很好的应用前景。本试验利用对真菌rDNA-ITS序列的PCR扩增，获得ITS区域的特定序列，从而完成分子水平上的植物病原真菌的鉴定工作，是病原菌检测的有效且快捷的途径。
鉴于以上原因，我们利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增金线莲炭疽病菌的转录间隔区并进行克隆测序，通过序列比对，设计出一对金线莲炭疽病菌特异性引物，用于早期发病植株的高灵敏度快速分子检测，建立金线莲炭疽病菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系。此技术可应用于金线莲炭疽病菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中金线莲炭疽病菌的传统检测方法对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，且十分耗时，无法达到快速检验的问题，提供金线莲炭疽病菌的特异PCR检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的金线莲炭疽病菌的PCR检测诊断的方法。该方法可用于带菌植株的高灵敏度快速分子检测，此技术对于金线莲炭疽病菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。
实现本发明的目的包括下列步骤：
1．根据金线莲炭疽病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，设计了对金线莲炭疽病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，特异分子检测引物的序列为：
上游引物CF1:5’- CGGAGGATAACCAAACTCTG -3’
下游引物CR1:5’- CGAGACGTAAAGTTACTACGC -3’
2．金线莲炭疽病菌特异分子检测体系的建立
（1）金线莲炭疽病菌用PDA液体培养基培养，收集菌丝，冷冻干燥后备用，金线莲炭疽病菌DNA的提取根据DNA提取试剂盒的说明书操作。
（2）PCR扩增：PCR反应体系20.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix10.0μL，引物CR1、CF1各5 μM，模板DNA50-100 μg，d.d.H2O 补足20.0μL。PCR反应条件为: 95℃预变性5min，95℃变性30 sec ，65℃退火30 sec ，72℃延伸30 sec ，共35个循环，72 ℃延伸10 min。
①当用于植株中存在金线莲炭疽菌时，采用NaoH快速裂解法提取金线莲炭疽菌的DNA，按如下的PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行PCR扩增：PCR反应体系20.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix10.0μL，引物CR1、CF1各5 μM，模板DNA50-100 μg，d.d.H2O 补足20.0μL。PCR反应条件为: 95℃预变性5min，95℃变性30 sec ，65℃退火30 sec ，72℃延伸30 sec ，共35个循环，72 ℃延伸10 min。
②然后取5μLPCR产物于2.0%琼脂糖凝胶（含0.5 µg/mL EB）电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产物的大小判定结果。
③如果能特异性地扩增出326bp产物时，即可判断所述的植株样品中存在金线莲炭疽菌；否则所述的植株样品中不存在金线莲炭疽菌。
本发明的关键性技术是金线莲炭疽病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了获得金线莲炭疽菌的特异引物序列，本发明27株金线莲炭疽菌和其它21种真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA。
经对27株金线莲炭疽病菌和其它21种真菌的特异性进行PCR验证：PCR反应体系20.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix10.0μL，引物CR1、CF1各5 μM，模板DNA50-100 μg，d.d.H2O 补足20.0μL。PCR反应条件为: 95℃预变性5min，95℃变性30 sec ，65℃退火30sec ，72℃延伸30 sec ，共35个循环，72 ℃延伸10 min。此特异引物在所有27株金线莲炭疽病菌中特异性地扩增出326bp的产物，而在其它21种真菌未获得任何扩增产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植株中金线莲炭疽菌快速可靠的检测和鉴定。
本发明有益效果：本发明方法适用于植株中金线莲炭疽菌的快速稳定的检测和鉴定，对于药用植物种植中金线莲炭疽菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1、特异性强：本发明检测方法是利用核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性设计金线莲炭疽菌特异引物进行检测。已经对27株金线莲炭疽病菌和其它21种真菌进行验证，结果具有很强的特异性；
2、实用性好：本发明所设计出的一对特异性引物，可用于带金线莲炭疽病菌的植株的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌植株中存在的金线莲炭疽病菌进行快速稳定的检测和鉴定的需求；
3、操作简便快速：应用本发明方法，对带金线莲炭疽病菌的植株进行病菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果。一般整个检测过程可在数小时内完成。
附图说明
图1为本发明所要检测的金线莲炭疽病菌的特异PCR扩增图。
图中：M为DL2000 DNA Marker，泳道1为阴性对照，泳道2-6分别为从不同发病金线莲菌株中分离出的病原菌，泳道7-14为8种其它真菌。
图2为本发明金线莲炭疽病菌的灵敏性检测扩增结果图。
图中：M为DL2000 DNA Marker ，各泳道的DNA浓度为：泳道1为112ng/μL，泳道2为11.2ng/μL，泳道3为11.2×10-1ng/μL，泳道4为11.2×10-2ng/μL，泳道5为11.2×10-3ng/μL，泳道6为11.2×10-4ng/μL，泳道7为11.2×10-5ng/μL，泳道8为阴性对照。
图3为本发明在金线莲组织样品上的检测结果图。
图中：M为DL2000 DNA Marker，泳道1为阴性对照，泳道2-10采集的金线莲样品提取的DNA。
具体实施方式
本发明的技术内容包括金线莲炭疽病菌的特异检测引物，所设计的引物及其序列为：CF1（5’- CGGAGGATAACCAAACTCTG -3’）和CR1（5’- CGAGACGTAAAGTTACTACGC -3’）。利用该引物可从金线莲炭疽菌上特异扩增出326bp的产物。
实施例1：引物对金线莲炭疽病菌的特异性扩增
1．金线莲炭疽病菌的特异检测
PCR反应体系20.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix10.0μL，引物CR1、CF1各5 μM，模板DNA50-100 μg，d.d.H2O 补足20.0μL。PCR反应条件为: 95℃预变性5min，95℃变性30sec ，65℃退火30 sec ，72℃延伸30 sec ，共35个循环，72 ℃延伸10 min。
2．检测结果
检测的特异性：除了金线莲炭疽菌DNA可特异地扩增出326 bp的产物外，检测了其它21种不同真菌DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性。
实施例2：引物对金线莲炭疽菌的灵敏度检测
1．DNA浓度稀释：提取的金线莲炭疽菌基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，采用系列浓度稀释。
2．金线莲炭疽菌的灵敏度检测
PCR反应体系20.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix10.0μL，引物CR1、CF1各5 μM，模板DNA50-100 μg，d.d.H2O 补足20.0μL。PCR反应条件为: 95℃预变性5min，95℃变性30sec ，65℃退火30 sec ，72℃延伸30 sec ，共35个循环，72 ℃延伸10 min。
3．检测结果：在20.0μL反应体系中，金线莲炭疽菌基因组DNA可获得明显扩增条带，检测灵敏度可达11.2×10-5ng/μL。
实施例3：发病植株样品中金线莲炭疽菌的检测。
1．样品采集：金线莲植物组织样品采自福建省福州市永泰县金线莲生产基地。
2．DNA提取及检测
发病植物组织采用NaoH快速裂解法提取DNA，按上述方法进行PCR扩增，PCR反应体系20.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix10.0μL，引物CR1、CF1各5 μM，模板DNA50-100 μg，d.d.H2O 补足20.0μL。PCR反应条件为: 95℃预变性5min，95℃变性30 sec ，65℃退火30sec ，72℃延伸30 sec ，共35个循环，72 ℃延伸10 min。
3．检测结果
结果见图3，如果能特异性地扩增出326bp产物时，即可判断所述的样品中存在金线莲炭疽菌；否则所述的样品中不存在金线莲炭疽菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种金线莲炭疽病菌PCR检测引物及其检测方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggaggataa ccaaactctg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgagacgtaa agttactacg c 21

Claims (1)

1.金线莲炭疽病菌PCR检测引物在金线莲植物种植中病害的早期诊断和病菌的监测鉴定上的应用, 引物序列为：
上游引物CF1:5’- CGGAGGATAACCAAACTCTG -3’；
下游引物CR1:5’- CGAGACGTAAAGTTACTACGC -3’；
上述引物CF1/ CR1对金线莲炭疽菌特异性PCR扩增出326bp的产物。
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