CN104911262A - 一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物及快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种降香黄檀黑痣病菌的分子检测引物及其检测方法。采用设计出的一对降香黄檀黑痣病菌特异引物经过巢式PCR扩增，PCR产物扩增分析，琼脂糖凝胶电泳和结果判定。若样本中存在黄檀黑痣菌，在紫外光下琼脂糖凝胶中会出现一条273bp的目的条带，若未出现条带，则代表不存在黄檀黑痣菌。本发明的引物特异性强，可以区分黄檀黑痣菌、禾草黑痣菌、刚竹黑痣菌以及分离自降香黄檀、大果紫檀的其他病原菌及内生真菌；该引物灵敏度高，可检测下限至100ag/μL的黄檀黑痣菌基因组DNA；本发明快速，8小时内即可得到准确的检测结果，而利用传统的病害诊断方法至少需要4天或1周以上。

Description

一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物及快速检测方法

技术领域

本发明属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物及其检测方法，可用于降香黄檀黑痣病的早期诊断和病菌的监测与鉴定。

背景技术

降香黄檀是海南省热带珍贵乡土树种之一，为国家二级保护树种，在我们国家标准的5属8类34种红木中，是仅次于紫檀类的红木。其材质硬重，强度大，干燥不开裂，不变形，结构均匀，是制造名贵家具、工艺品、乐器、雕刻和名贵装饰的上等用材。

随着海南省降香黄檀人工林种植面积不断增加，病虫害问题日益突出。降香黄檀黑痣病是由黄檀黑痣菌引起的，是降香黄檀苗期和幼树期的主要病害。海南省高温高湿的气候特点，使降香黄檀全年遭受黑痣病的侵害，常年发病率达45％～65％，严重时可达80％以上。该菌所致病害会在寄主表面形成黑色凸起的盾片，发病后期盾片覆满整个寄主叶片表面，严重影响植物的光合作用，致使其提前落叶。

黄檀黑痣菌可侵染寄主的叶、枝、茎、荚果等地上部分，病菌主要以菌丝体在病叶或病落叶上越冬，成为次年的初次侵染来源。春末、夏初天气潮湿多雨，病菌开始侵染，在适宜的温湿度条件下，黄檀黑痣菌产生的子囊孢子迅速繁殖，借助风雨迅速传播侵染附近的植株，形成发病中心。发病后期，被侵染的植株，整株叶片和枝条上会覆满大量的黑痣，刚萌发的新叶亦受侵染发病。遇暴雨台风天气，台风造成降香黄檀叶片、果实等损伤，病原菌即从微伤口侵入，且台风期的高温天气加之台风后的暴雨，林间积水严重，加上便于侵入的微伤口导致黑痣病的爆发。

目前，国内学者对降香黄檀黑痣病菌研究涉及的较少，在分子水平的研究更是鲜有报道。传统植物病害诊断方法需要经过病原菌分离、培养、鉴定等过程，耗时长、工作量大，可能会错过病害防治的最佳时期。且由于黑痣属真菌是一类专性寄生的活体营养真菌，即它不能够在培养基上生长，因而不能用组织分离法分离出病原菌，给该病害的准确诊断带来了极大的困难。因此，建立一套结果可靠、易于操作、灵敏度高的黄檀黑痣菌分子检测技术，对病害发生情况进行预报预测，对及时采取有效的防治措施控制病原菌的进一步发生有着非常重要的理论和实际意义。

随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用。由于核糖体基因ITS序列在真菌种间的高度变异和种内的稳定性，为病原物的分子检测提供了理想的靶序列。相较于传统的病害诊断技术，巢式PCR技术在灵敏度、检出率及专一性方面均有了很大的提高，且不需要进行病原菌的分离培养等特点。本文依据rDNA的ITS序列在真菌种内保守性和种间变异性的特点，通过设计针对黄檀黑痣菌特异性引物，结合真菌通用引物ITS4/ITS5对降香黄檀基因组DNA进行巢式PCR扩增，在降香黄檀黑痣病表现出明显症状之前将黄檀黑痣菌快速、准确地检测出来，为该病害的早期诊断和预防提供行之有效的技术方案。

发明内容

针对现有技术中降香黄檀黑痣病菌还没有系统的分子检测方法的现状，本发明提供了一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物以及降香黄檀黑痣病菌的快速检测方法。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物，序列如下：

上游引物：P1:5'-CGAGGTCAGAATCAAACG-3'

下游引物：P2:5'-TGAAGAACGCAGCGAAAT-3'。

一种降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测方法，包括下列步骤：

1)提取降香黄檀叶片基因组DNA；

2)巢式PCR反应：

第一轮PCR反应：以ITS4/ITS5为引物进行第一轮PCR；第二轮PCR反应：以P1/P2为引物进行第二轮PCR反应，

上游引物：P1:5'-CGAGGTCAGAATCAAACG-3'

下游引物：P2:5'-TGAAGAACGCAGCGAAAT-3'；

3)PCR扩增产物分析

取步骤2)扩增产物，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上成像；

4)结果判定

根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出273bp的产物，即可判断植物组织中存在黄檀黑痣菌。

步骤2)巢式PCR反应第一轮PCR反应：

以ITS4/ITS5为引物进行第一轮PCR，扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，步骤1)制备的降香黄檀叶片总DNA 1μL，10μmol/L上游引物及下游引物各1μL，最后用ddH₂O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

所述的引物ITS4/ITS5序列如下：

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；

ITS5：5'-GGA AGGTAA AAG TCA AGG-3'。

步骤2)巢式PCR反应第二轮PCR反应：

以P1/P2为引物进行第二轮PCR反应，扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL、1μL第一轮PCR扩增产物、10μmol/L引物P1/P2各1μL，最后用ddH₂O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

步骤3)PCR扩增产物分析：取步骤2)扩增产物4μL，用1×TAE作为电泳缓冲液，在1.0％琼脂糖凝胶上，5V/cm电压采用进行电泳检测，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上成像。

步骤3)所述的电泳缓冲液(50×TAE)成分为：Tris242g，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g，加入800ml去离子水，加入57.1ml醋酸，充分搅拌后定容至1L；工作浓度为1×TAE。

本发明设计了一对黄檀黑痣菌特异性引物，并成功建立了一种降香黄檀黑痣病发病早期的快速检测方法。与其他检测方法相比，本发明具有以下优点：

1.采用本发明，可以特异性检测出黄檀黑痣菌。本发明设计的特异性引物可以区分分离自降香黄檀及大果紫檀的病原菌及内生真菌，参见附图1。

2.采用本发明，可以检测出100ag/μL的黄檀黑痣菌DNA，相较于常规的微生物检测方法其灵敏度较高。

3.采用本发明方法检测十分快速，8个小时内就可以检测出降香黄檀是否已经受到黄檀黑痣菌的侵染，该技术的应用对降香黄檀黑痣病的早期检测、提早预防具有十分重要的意义。

附图说明

图1是本发明所设计特异性引物对黄檀黑痣菌总DNA的扩增图谱，

泳道M：2000bp DNA marker，分子量标准从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、273bp、100bp(为天根生化科技公司产品，目录号：MD114-02)；

泳道1-11分别为表1所述采集自9个市县的黄檀黑痣菌：样本B01、B04-B09各提供1份，B02、B03各提供2份(见表1)。

图2是本发明所设计特异性引物对黄檀黑痣菌及其他真菌分离物总DNA的扩增图谱，

泳道M：2000bp DNA marker(为天根生化科技公司产品)，产品描述如上；

泳道1：阴性对照，

泳道2为黄檀黑痣菌，泳道3-8为禾草黑痣菌，泳道9-10为刚竹黑痣菌，泳道11-12胶孢炭疽菌，泳道13为茎点霉，泳道14为B16，泳道15为尖孢镰刀菌，泳道16为甘蓝链格孢菌，泳道17为博宁刺盘孢，泳道18为镰孢菌，泳道19拟盘多毛孢，泳道20为球孢黑孢霉。

图3是本发明所设计特异性引物对黄檀黑痣菌总DNA检测的灵敏度的扩增图谱，

其中，图3-A为采用常规PCR对不同浓度的黄檀黑痣菌总基因组DNA的扩增图谱；

泳道M：2000bp DNA marker(为天根生化科技公司产品)，产品描述如上，

泳道1：阴性对照，

泳道2-12：分别为100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,100ag/μL,10ag/μL黄檀黑痣菌基因组DNA；

图3-B为采用巢式PCR对不同浓度的黄檀黑痣菌总基因组DNA的扩增图谱，

泳道M：2000bp DNA marker(为天根生化科技公司产品)，产品描述如上，

泳道2-12：分别为100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,100ag/μL,10ag/μL黄檀黑痣菌基因组DNA。

图4是本发明所设计特异性引物对采集于林间的降香黄檀样品检测图谱，

泳道M：2000bp DNA marker(为天根生化科技公司产品)，产品描述如上，

泳道1：阴性对照，

泳道2-12：分别为健康(无病斑)降香黄檀叶片组织，

泳道13-24：分别为发病降香黄檀叶片组织。

具体实施方式

实施例1：检测本发明设计的特异引物对黄檀黑痣菌的特异性扩增

1.黑痣病叶样品的制备

参见表1列举的各供试样品及其采集地点。将降香黄檀、白草、狼尾草、鹅观草、刚竹黑痣病病叶样本用75％酒精表面消毒后，使用灭菌剪刀将病叶剪成4×4mm大小的组织块，加液氮进行研磨。黑痣病病叶样品编号：B01～B13。

表1各供试样品采集地点及分子检测结果

“+”表示可以检测到273bp的目的条带，“-”表示不能检测到273bp的目的条带。

2.对照菌株样品的制备

(1)将采集到的降香黄檀、大果紫檀病叶样品(B14、B15、B18～B20)，使用灭菌的剪刀剪取典型病斑的病健交界处，剪成4mm×4mm大小的小块，先于75％酒精中浸8～10s后，再于0.1％升汞溶液中消毒30s，使用灭菌蒸馏水洗涤3～4次，用灭菌的滤纸吸干组织块表面水分后，接种于PDA培养基上，25℃条件下培养。5d后，从组织块边缘挑取小块菌落至PDA培养基上，25℃条件下培养5d后，在体式显微镜下挑取单菌丝至新鲜PDA上，5d后将菌株转至斜面培养基上4℃保存。保存菌株编号：B14、B15、B18～B20，表1。

(2)内生真菌的分离培养：取健康的降香黄檀、大果紫檀叶片，剪成大小为4mm×4mm的小块后，余下步骤同1，均采用组织块分离法进行内生真菌的分离纯化，最后将纯化后的菌株转至斜面培养基上4℃保存。保存菌株编号：B16、B17、B21、B22，表1。

3.降香黄檀叶片基因组DNA的提取

将降香黄檀叶片用75％酒精表面消毒后，使用灭菌剪刀将叶片剪成4×4mm大小的组织块，用液氮将其研磨至粉末状后，移至已灭菌的2mL Eppendorf管中。在Eppendorf管中加入700μL的2×CTAB抽提液(2×CTAB：20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl，1.4mol/L NaCl，PH值为8.0)，确保两者混匀。混匀后，加入50μL蛋白酶K，在干式恒温金属浴中37℃温育30min，再放入60℃水浴锅中，期间每隔10min颠倒混匀一次。1h后，12000g离心8min后取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀后，12000g离心15min，移取上清液至新的Eppendorf管中。再加入等体积氯仿/异戊醇，充分混匀。同上条件再离心15min后，取上清，加入与上清液等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L的NaAc(pH5.2)，上下颠倒混匀，待出现沉淀后放置于-20℃低温冰箱中过夜。过夜后取出，同上条件离心2min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀两次，用小枪头尽量去除残留乙醇，放至于超净工作台中风干。确保离心管内无残留乙醇后，加入30μL TE缓冲液(含RNase 50μg/mL)溶解沉淀，得到降香黄檀叶片总DNA，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/μL，-20℃保存。

4.对照菌株基因组DNA提取

用灭菌的解剖刀刮取对照菌株(B14～B22)的菌丝体(注意不要刮到培养基)，转移至已灭菌的2mL Eppendorf管中，加入0.2g石英砂，使用研磨器充分研磨菌丝体，余下DNA提取步骤同3，均使用改良后的CTAB法提取。编号见表1。

5.黄檀黑痣菌的特异检测

PCR反应体系25μL，包括2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，100ng模板DNA 1μL，10μmol/LP1/P2各1μL，用ddH₂O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

6.检测结果

如图1所示。所设计的特异性引物仅能从供试的11个P.dalbergiicola的DNA中特异地扩增出一条长约273bp的条带，而其他18个供试DNA均无扩增条带，表明该引物具有很强的特异性，见图2。

实施例2：引物对黄檀黑痣菌的灵敏性检测

1.DNA浓度稀释

提取的黄檀黑痣菌基因组DNA，通过紫外光分光光度计测定浓度后，将黄檀黑痣菌基因组DNA，从100ng/μL的浓度开始，逐步按10倍数量级向下稀释至10ag/μL。

2.特异性引物的灵敏性检测

第一轮PCR反应：以ITS4/ITS5为引物进行第一轮PCR，扩增反应体系为：2×Taq PCRMasterMix 12.5μL，步骤1)制备的降香黄檀叶片总DNA 1μL，10μmol/L ITS4/ITS5各1μL，最后用ddH₂O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

以ITS4/ITS5为引物对黄檀黑痣菌进行PCR扩增得到的片段序列如下，方框内的碱基为引物。

TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTACTCTTATCTGATTCGAGGTCAAGAATCAAACGTCTTGTGGTAGAAAGATTCTGCTGGAAGAGTCATATGATCGTTCTCTTCAAACAACACCTTTCTGCCAAATGGATTTGACAAGCTACGATAATCGTAGACCTGCAACACAAGCCGAGCTTGAGGGAGAGAAATGACGCTCGAACAGATATGCCTGCTAGCATGCTAGCAGGCGCAATGTGCGTTCAAAAACTCGATGTCTCACTAAGCCTTGCAATTCACATTATTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCTAGAGCCAAGAGATCCATTGATAAAGGTTTTCATAAGTTAACCAACATACAAATTACATTTATAGATTGTACAACCATTGGCAAGCCAGAGCTTGCCAACGCAACGAATACAGGTTCACAGTGAGGTTGAGGTAAAAACCACATGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCC

第二轮PCR反应：以P1/P2为引物进行第二轮PCR反应，扩增反应体系为：2×Taq PCRMasterMix 12.5μL、1μL第一轮PCR扩增产物、10μmol/L引物P1/P2各1μL，最后用ddH₂O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。电泳检测扩增产物。

3.检测结果：如图3-A所示，在25μL的反应体系中，利用引物P1/P2进行常规PCR扩增，可从含有1pg的基因组DNA中扩增出一条长约273bp的条带，而先后利用ITS4/ITS5和P1/P2进行巢式PCR，可以稳定地检测到100ag的基因组DNA。这与单独使用特异性引物扩增相比，使检测灵敏度提高了10⁴倍。

实施例3：降香黄檀发病组织中的黄檀黑痣菌的检测

1.样品采集

从海南省国营澄迈林场采集降香黄檀叶片的发病组织及健康组织共23份样品，利用巢式PCR进行检测。

2.DNA提取及检测

采用发明内容中步骤2所述的植物组织DNA提取方法，按上述实施的方法进行巢式PCR扩增，PCR反应体系25μL，巢式PCR反应体系以引物ITS4/ITS5作为第一轮反应引物，取1μL第一轮PCR反应产物作为模板，结合黄檀黑痣菌特异性引物进行第二轮PCR扩增，反应程序及检测方法同发明内容中所述。

3.检测结果

结果见图4，利用巢式PCR能从12个发病组织(泳道13～24)中稳定的扩增出一条约为273bp的特异性条带，而11个健康植物组织(泳道2～12)中也有6个扩增出条带，说明该健康植物组织已受到黄檀黑痣菌的侵染，暂未表现出明显的症状。对扩增出条带的泳道进行切胶回收测序，测序结果表明它们的碱基序列一致，且与黄檀黑痣菌的序列完全相同，则可排除假阳性结果。

本实施例总计需要时间＝1h 30min(提取DNA)+2h 30min(第一轮PCR)+2h 30min(第二轮PCR)+1h 30min(电泳+成像)＝8hours。

Claims (6)

1.一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物，其特征在于，序列如下：

上游引物：P1:5'-CGAGGTCAGAATCAAACG-3'

下游引物：P2:5'-TGAAGAACGCAGCGAAAT-3'。

2.一种降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)提取降香黄檀叶片基因组DNA；

2)巢式PCR反应：

第一轮PCR反应：以ITS4/ITS5为引物进行第一轮PCR；第二轮PCR反应：以P1/P2为引物进行第二轮PCR反应，

上游引物：P1:5'-CGAGGTCAGAATCAAACG-3'

下游引物：P2:5'-TGAAGAACGCAGCGAAAT-3'；

3)PCR扩增产物分析

取步骤2)扩增产物，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上成像；

4)结果判定

根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出273bp的产物，即可判断植物组织中存在黄檀黑痣菌。

3.根据权利要求2所述的降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测方法，其特征在于，

步骤2)巢式PCR反应第一轮PCR反应：

以ITS4/ITS5为引物进行第一轮PCR，扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，步骤1)制备的降香黄檀叶片总DNA1μL，10μmol/L上游引物及下游引物各1μL，最后用ddH₂O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

4.根据权利要求2或3所述的降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测方法，其特征在于，

所述的引物ITS4/ITS5序列如下：

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；

ITS5：5'-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3'。

5.根据权利要求2所述的降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测方法，其特征在于，

步骤2)巢式PCR反应第二轮PCR反应：

以P1/P2为引物进行第二轮PCR反应，扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL、1μL第一轮PCR扩增产物、10μmol/L引物P1/P2各1μL，最后用ddH₂O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求2所述的降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测方法，其特征在于，

步骤3)PCR扩增产物分析：取步骤2)扩增产物4μL，用1×TAE作为电泳缓冲液，在1.0％琼脂糖凝胶上，5V/cm电压采用进行电泳检测，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上成像。