CN102649980A

CN102649980A - 一种巢式pcr法检测叶点霉属真菌的引物组及方法

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Publication number: CN102649980A
Application number: CN2012101573976A
Authority: CN
Inventors: 王兴红; 黄峰; 侯欣; 李红叶
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2032-05-18
Also published as: CN102649980B

Abstract

本发明公开了一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的引物组及方法，该引物组包括四对引物，其中，第一对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；第二对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；第三对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；第四对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。采用本发明的引物组通过巢式PCR法检测柑橘黑斑病相关的叶点霉属真菌，特异性好，可实现四种叶点霉属真菌的同时检测，具有准确可靠、灵敏度高、快速简便的特点。

Description

一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的引物组及方法

技术领域

本发明涉及检疫性病害检验领域，尤其涉及一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的引物组及方法。

背景技术

柑橘黑斑病（Citrus Black Spot，CBS），由柑橘叶点霉菌（Phyllostictacitricarpa，有性态为柑橘球座菌Guignardia citricarpa）引起，主要危害柑橘果实，在果皮上形成病斑导致鲜果的商品性下降。CBS被欧盟列为A1类严禁入境的危险性有害生物名单，也是美国严禁入境的有害生物（EPPO.2009.Guignardia citricarpa.Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 39,318-327），我国、巴西、阿根廷和南非等有柑橘黑斑病发生，出口柑橘到欧盟和美国均受检疫法规的限制，一旦在其进口国口岸被检出有黑斑病的果实，就无条件被退货。因此，作为出口国，首先需对出口的柑橘进行严格的检查，以免遭退货带来的损失。

最近研究发现，我国柑橘存在四种叶点霉属真菌，即柑橘叶点霉菌（P.citricarpa），亚洲柑橘叶点霉菌（P.citriasiana），中国柑橘叶点霉菌（P.citrichinaensis），以及内生菌P.capitalensis，前两者均是柑橘上的重要病原菌，而后两者则是常见的，但无致病性的或只能引起微弱症状的内生菌。欧盟和美国只是对柑橘叶点霉菌（P.citricarpa）实施检疫（EPPO.2009.Guignardia citricarpa.Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 39,318-327）。

传统的黑斑病诊断方法包括症状检查，病菌的显微镜检查，分离培养。采用症状检查时，果实症状易与褐斑病、炭疽病和黑点病混淆；采用显微镜检查时，有些病斑不存在子实体，无法经显微镜检查判断；采用分离培养时，子实体的诱导和分离培养均需7-14d时间，这对需要快速通关的鲜果柑橘的出口来说显然存在严重的缺陷。尽管国外发展了病斑PCR或实时荧光PCR技术用于进口柑橘的检测，但已有的技术仅考虑柑橘叶点霉菌和内生菌P.capitalensis，而无法将柑橘叶点霉菌、亚洲柑橘叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌分开。因此，出口柑橘的黑斑病检疫急需一套将柑橘叶点霉菌和柑橘上其他3种叶点霉菌区分开的准确，灵敏，且快速的检测技术。

巢式PCR（nested PCR）是在普通PCR技术基础上发展的一种PCR技术，该技术已广泛应用于分子生物学研究和医学检验方面。其原理是设计两对引物，第一对PCR引物扩增片段较长，第二对引物结合在第一次PCR扩增产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增片段。其优点是提高了PCR扩增的灵敏度，保障了反应的特异性、准确性。

由于以往发表的文章仅设计了针对于柑橘叶点霉菌P.citricarpa和内生菌P.capitalensis的特异性引物，并没有针对于亚洲柑橘叶点霉菌P.citriasiana的特异性引物，且设计的针对于P.citricarpa的特异性引物无法将柑橘叶点霉菌和亚洲柑橘叶点霉菌区分，本实验室在ITS1区域设计了针对于亚洲柑橘叶点霉菌的特异性引物Pca8/ITS4，该引物特异性好，灵敏度高（Wang X.H.,Chen G.Q.,Huang F.,et al.Phyllosticta speciesassociated with citrus disease in China.Fungal Diversity.2011,52(1):209-224）。

发明内容

本发明提供了一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的引物组，用于柑橘黑斑病相关的四种叶点霉属真菌的同时检测，具有特异性好、准确可靠、灵敏度高、快速简便的特点。

一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的引物组，包括四对引物：

第一对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

第二对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

第三对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

第四对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的四对引物的上游引物通过如下方法设计获得：通过比较柑橘上四种叶点霉属真菌代表菌株的ITS1和18S区域序列，设计出针对柑橘叶点霉菌、中国柑橘叶点霉菌和内生菌P.capitalensis的特异性上游引物Pc1，Pcc1和Pct4；结合本实验室已发表的针对亚洲柑橘叶点霉菌的特异性上游引物Pca8（Wang et al.,2011），以及真菌的通用下游引物ITS4（White,T.J.,Bruns,T.,Lee,S.and Taylor,J.Amplification and direct sequencing offungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In:PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications.Academic Press,San Diego,U.S.A.1990,315-322.），获得针对柑橘叶点霉菌、中国柑橘叶点霉菌、内生菌P.capitalensis和亚洲柑橘叶点霉菌的引物对：Pc1/ITS4，Pcc1/ITS4，Pct4/ITS4和Pca8/ITS4。

所述的四对引物的合成方法可以采用常规操作方法。

本发明提供了一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的方法，包括：

（1）提取待测菌的DNA；

（2）以提取的DNA为模板，利用真菌通用引物ITS4/ITS5进行第一轮PCR扩增；

（3）将第一轮PCR扩增得到的产物稀释50-100倍，以稀释后的产物为模板，利用上述四对引物进行第二轮PCR扩增；

（4）将第二轮PCR扩增产物进行凝胶电泳分离、染色，根据扩增条带判定待测菌的种类。

步骤（1）中，所述待测菌的DNA可以从待测菌的纯培养菌丝或柑橘上的疑似病斑中提取。

步骤（2）中，所述的真菌通用引物的上游引物ITS4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物ITS5的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。引物ITS4/ITS5可以扩增18S rRNA 3′端的部分区域，第一个核糖体转录间隔区ITS1，5.8S rRNA，第二个核糖体转录间隔区ITS2，以及28S rRNA 5′端的部分区域。

所述的真菌通用引物ITS4/ITS5在第一轮PCR扩增反应体系中的终浓度优选为0.2-0.3mmol/L；更优选为0.25mmol/L。合适的引物浓度能提高第一轮PCR扩增效率。

进一步优选地，第一轮PCR扩增反应体系为：模板DNA10-50ng，引物ITS4/ITS5(浓度5mmol/L)各1μL，10×PCR buffer(含Mg²⁺)2μL、dNTP（10mmol/L）0.4μL,Taq酶（5U/μL）0.2μL，双蒸水补足至20μL，混匀。

所述的第一轮PCR扩增的反应条件优选为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环；最后72℃延伸10min。该退火温度可扩增出所有真菌的内部转录间隔区(ITS)。

步骤（3）中，模板DNA经第一轮PCR扩增，得到的扩增产物浓度较高，直接以其作为模板进行第二轮扩增容易产生非特异性条带，将其稀释50-100倍，能有效减少第二轮扩增中非特异性产物的形成，提高扩增效率和检测结果的准确性。

优选地，所述的四对引物在第二轮PCR扩增反应体系中的终浓度分别为：

更优选地，所述的四对引物在第二轮PCR扩增反应体系中的终浓度分别为：

引物浓度过高易引起模板与引物错配，PCR反应的特异性下降，同时形成引物二聚体的几率增大；引物浓度过低，引物与模板的结合率降低，PCR产物减少；当引物组合终浓度如上所述时第二轮PCR扩增效率最高。

进一步优选地，第二轮PCR扩增反应体系为：在20μL反应体系中加入引物Pc1/ITS4、Pcc1/ITS4、Pct4/ITS4（浓度均为5mmol/L）各0.6μL，Pca8/ITS4（浓度为5mmol/L）1.5μL，10×PCR buffer(含Mg²⁺)2μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.4μL，稀释后的PCR产物1μL，双蒸水补足20μL，混匀。

所述的第二轮PCR扩增的反应条件优选为：94℃预变性3min;94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环;最后72℃延伸10min。当引物退火温度为60℃，引物的特异性最好。

步骤（4）中，所述的凝胶电泳可以采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物的分离效果较好；所述的染色可以采用EB染色。

根据扩增条带判定待测菌的种类时，具体可以通过如下方法：四种菌的标准菌和待测菌同时进行巢式PCR扩增，将待测菌的扩增条带与标准菌的扩增条带比较，根据条带大小及位置判定待测菌的种类。

本发明采用的巢式PCR法为巢式多重PCR法，即第二轮PCR扩增体系中加入四对引物（针对基因组的不同位点），各引物对能独立地扩增出种的特异性产物。该方法操作快捷、简单，可避免倒换样品时造成的模板污染和时间浪费，更利于实际检验。

本发明根据柑橘上四种叶点霉属真菌的ITS1及18S区域序列的差异，设计了针对每个种的特异性上游引物，结合共同的下游引物ITS4，获得了四对特异性引物。利用这四对特异性引物结合真菌通用引物，通过果皮病斑总DNA提取方法和PCR扩增条件优化，获得了一种能在同一个反应管里、5小时内对果面疑似黑斑病病斑或培养菌落菌种种类进行判定的巢式PCR检测鉴定技术。

本发明的各对引物特异性高，利用该引物组在一个PCR反应体系中即可检测出来自柑橘的叶点霉属真菌的种类；与传统的检测技术相比，本发明方法具有准确性高、灵敏度高、快速便捷、易于操作等特点，适合于进出口检疫部门、出口企业和科研单位的使用。采用本发明方法，能有效提高欧盟等国家对携带柑橘叶点霉菌果实的检疫效率，缩短货物在港口停留时间，并降低由于长时间滞留、待检而造成的损失，同时还能根据疑似培养物或病斑的叶点霉属真菌种类进行后续防疫。

附图说明

图1为本发明引物序列设计图。

图2为本发明柑橘叶点霉菌引物（Pc1/ITS4）特异性验证试验的凝胶电泳图；其中，M：100bp Plus II DNALadder；1-4：柑橘叶点霉菌；5-8：P.capitalensis；9-12：亚洲柑橘叶点霉菌；13-16：中国柑橘叶点霉菌。

图3为本发明P.capitalensis引物（Pct4/ITS4）特异性验证试验的凝胶电泳图；其中，M：100bp Plus II DNALadder；1-4：P.capitalensis；5-8：柑橘叶点霉菌；9-12：亚洲柑橘叶点霉菌；13-16：中国柑橘叶点霉菌。

图4为本发明中国柑橘叶点霉菌引物（Pcc1/ITS4）特异性验证试验的凝胶电泳图；其中，M：100bp Plus II DNA Ladder；1-4：中国柑橘叶点霉菌；5-8：P.capitalensis；9-12：亚洲柑橘叶点霉菌；13-16：柑橘叶点霉菌。

图5为本发明巢式PCR检测柑橘四种叶点霉菌的电泳图谱；其中，M：100bp Plus II DNA Ladder；1：四种标准菌同时存在；2-5：分别为四种标准菌；6-12：待测样品。

具体实施方式

实施例

1、菌株类型

柑橘上四种叶点霉属真菌柑橘叶点霉菌（P.citricarpa）、叶点霉属内生菌P.capitalensis、亚洲柑橘叶点霉菌（P.citriasiana）和中国柑橘叶点霉菌（P.citrichinaensis）的菌株均经过形态学和测序证实。保藏于浙江大学生物技术研究所李红叶教授实验室和中国科学研究院微生物研究所菌种保存中心，菌种向公众开放。且上述菌株均为实验材料，无特异性要求。

2、待测样品及DNA提取

用刀片切下待测病果的病斑2-3个（6-8mg）（尽量除去健康的白皮层），刮取从发病果实分离获得的纯培养物的菌丝，提取DNA，具体方法如下：

A.将上述获得的病斑或菌丝（约50-200mg）置于2mL Eppendorf管中，加800μLSLS裂解液（200mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，200mmol/L NaCl，2g/100ml N-月桂酰肌氨酸钠，pH 8.0），用无菌牙签充分搅拌分散菌丝，病斑加液氮研磨，55℃水浴10-30min，其间振荡混匀2-3次，13200r/min离心10min；

B.取上清液750μL于1.5mL Eppendorf管中，加入等体积氯仿和异戊醇（体积比24:1）的混合溶剂抽提DNA，13200r/min离心10min；

C.取上清液于新的1.5mL Eppendorf管中，加2倍体积无水乙醇混合混匀，-20℃静置10min后，于4℃，13200r/min离心4min，沉淀DNA；

D.用70%无水乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温放置自然干燥5-10min，溶于40μL TE溶液（pH 8.0），-20℃保存备用。

3、引物设计

通过比较柑橘上四种叶点霉属真菌代表菌株的ITS1和18S区域序列，设计出针对柑橘叶点霉菌、中国柑橘叶点霉菌和内生菌P.capitalensis的特异性上游引物Pc1，Pcc1和Pct4，并利用软件Primer Premier 5.0检验所设计的引物，同时获得引物的退火温度。设计图见图1。

然后结合本实验室已发表的针对亚洲柑橘叶点霉菌的特异性上游引物Pca8（Wang et al.,2011），以及真菌的通用下游引物ITS4（White et al.,1990），获得针对柑橘叶点霉菌、中国柑橘叶点霉菌、内生菌P.capitalensis和亚洲柑橘叶点霉菌的引物对：Pc1/ITS4，Pcc1/ITS4，Pct4/ITS4和Pca8/ITS4，具体引物序列见表1。预期扩增的片段大小见表1。

表1检测柑橘叶点霉菌、中国柑橘叶点霉菌、P.capitalensis和亚洲柑橘叶点霉菌的引物

真菌通用引物中，上游引物ITS4序列见表1，下游引物ITS5的序列为5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′（SEQ ID NO.6）。

4、引物合成

按照表1的引物序列以及真菌通用引物序列，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，也可以委托其他任何商业公司合成。

5、引物特异性的验证

将上游引物Pc1、Pcc1和Pct4与下游引物ITS4构成引物对Pc1/ITS4、Pcc1/ITS4和Pct4/ITS4，分别与验证DNA质量和PCR体系的引物ACT-512F/ACT-783R（ACT-512F:5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′;ACT-783R:5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′）（扩增actin基因的部分区域。如果扩增结果为阳性说明PCR体系没问题；如果是阴性，可能是DNA质量和PCR反应体系存在问题）结合，用经测序鉴定的已知种标准菌株DNA为对照进行PCR反应。

PCR反应体系为：20μL体系中，模板DNA 10-50ng，5mmol/L引物各1μL，10×PCR buffer(含Mg²⁺)2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μLTaq酶0.2μL，双蒸水补足至20μL。

PCR反应参数为：94℃,3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，34个循环；72℃10min，4℃保存。

PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测引物的特异性，引物特异性检测结果参见图2-4。由图2知，引物Pc1/ITS4只能从柑橘叶点霉菌菌丝DNA或感染的病果病斑DNA中扩增出条带；由图3知，引物Pct4/ITS4只能从P.capitalensis菌丝DNA或携带该菌的果皮提取的DNA中扩增出条带；由图4知，引物Pcc1/ITS4只能从中国柑橘叶点霉菌的菌丝DNA或携带该菌的果皮提取的DNA中扩增出条带。而且PCR产物条带均单一、清晰可辨，表明该三对引物能够用于后续多重PCR法鉴定菌株。

上游引物Pca8与下游引物ITS4构成的引物对Pca8/ITS4的特异性检测结果已经在Wang等的文章中公布（Wang et al.,2011），检测结果表明该对引物能够用于后续多重PCR法鉴定菌株。

6、巢式多重PCR检测柑橘四种叶点霉菌技术

（1）获得柑橘上四种叶点霉属真菌柑橘叶点霉菌(P.citricarpa)、叶点霉属内生菌P.capitalensis、亚洲柑橘叶点霉菌(P.citriasiana)和中国柑橘叶点霉菌(P.citrichinaensis)的标准菌株（浙江大学李红叶教授实验室或中国科学院微生物研究所菌种保存中心），培养菌丝，提取基因组DNA备用。

（2）分别以四种标准菌株DNA和待测菌株的DNA为模板(10-50ng)，利用真菌通用引物ITS4/ITS5进行第一轮的PCR扩增。

PCR反应体系：模板DNA10-50ng，引物ITS4/ITS5(浓度5mmol/L)各1μL，10×PCR buffer(含Mg²⁺)2μL、dNTP（10mmol/L）0.4μL,Taq酶（5U/μL）0.2μL，双蒸水补足至20μL，混匀，置常规PCR扩增仪。

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环；最后72℃延伸10min。

（3）将第一轮PCR扩增得到的产物稀释50-100倍，以稀释后的产物为模板，同时加入表1中的4条上游引物和共同下游引物ITS4进行第二轮PCR扩增。

PCR反应体系：在20μL反应体系中加入引物Pc1/ITS4、Pcc1/ITS4、Pct4/ITS4（浓度均为5mmol/L）各0.6μL，Pca8/ITS4（浓度为5mmol/L）1.5μL，10×PCR buffer(含Mg²⁺)2μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.4μL，稀释后的PCR产物1μL，双蒸水补足20μL，混匀，置常规PCR扩增仪扩增。

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环；最后72℃延伸10min。

（4）PCR产物使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，经EB染色后，观察产物条带（见图5）。

图5为以本实施例的4对引物以及优化的PCR体系，对柑橘上四种叶点霉属真菌的菌丝DNA或病斑DNA为模板进行巢式多重PCR技术扩增后得到的产物的电泳图谱。泳道M:100bp Plus II DNA Ladder；泳道1为柑橘上四种叶点霉菌同时存在时的扩增图谱；泳道2，3，4和5分别为亚洲柑橘叶点霉菌，内生菌P.capitalensis，中国柑橘叶点霉菌和柑橘叶点霉菌的标准DNA为模板所扩增产物的电泳图谱；泳道6-12为待测样品的扩增图谱。

由图5可知，柑橘叶点霉菌、内生菌P.capitalensis、亚洲柑橘叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的标准菌株所获得的扩增条带分别为593bp，551bp，488bp和706bp。当待测样品中获得条带大小与柑橘叶点霉菌一致（593bp），该样品可判断为柑橘叶点霉菌；当待测样品的条带大小与叶点霉属内生菌一致（551bp），样品可判断为叶点霉属内生菌；当待测样品的条带大小与亚洲柑橘叶点霉菌一致（488bp），样品可判断为亚洲柑橘叶点霉菌；当待测样品的条带大小与中国柑橘叶点霉菌一致（706bp），样品可判断为中国柑橘叶点霉菌；当4条条带同时出现时，可判断待测样品同时存在四种叶点霉属真菌，如图5中的泳道1。以此类推，可判断病斑是否存在双重感染和三重感染，或待测样品是否存在2种或3种叶点霉属真菌。

通过与已知菌的扩增条带比较，可以将样品6和10鉴定为柑橘叶点霉菌，样品7和9鉴定为P.capitalensis，样品11鉴定为中国柑橘叶点霉菌，样品8和12鉴定为亚洲柑橘叶点霉菌。

为了进一步验证巢式多重PCR检测样品的可靠性，回收上述待测菌株的目的条带，进行测序，通过序列比对发现待测样品6和10的序列与柑橘叶点霉菌序列相似性为100%，样品7和9的序列与P.capitalensis序列的相似性为100%，样品11的序列与中国柑橘叶点霉菌序列的相似性为100%，样品8和12的序列与亚洲柑橘叶点霉菌序列的相似性为100%。进一步证明本文提供的巢式多重PCR检测结果准确可靠。

Claims

1.一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的引物组，其特征在于，包括四对引物：

2.一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的方法，包括：

（1）提取待测菌的DNA；

（3）将第一轮PCR扩增得到的产物稀释50-100倍，以稀释后的产物为模板，利用权利要求1所述的四对引物进行第二轮PCR扩增；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的真菌通用引物ITS4/ITS5在第一轮PCR扩增反应体系中的终浓度为0.2-0.3mmol/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的真菌通用引物ITS4/ITS5在第一轮PCR扩增反应体系中的终浓度为0.25mmol/L。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的第一轮PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环；最后72℃延伸10min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的四对引物在第二轮PCR扩增反应体系中的终浓度分别为：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的四对引物在第二轮PCR扩增反应体系中的终浓度分别为：

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的第二轮PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min;94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环；最后72℃延伸10min。