CN103421900A - 用于检测瓜类蔓枯病的特异性引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测瓜类蔓枯病菌的特异性引物、试剂盒及其分子检测方法，并且验证所述引物具有极高的特异性，利用该组引物及鉴定方法能够快速、准确地鉴定蔓枯病菌，该体系的建立将对瓜类蔓枯病早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，开发出一种能够快速检测瓜类蔓枯病菌的引物序列、试剂盒及其方法。
背景技术
瓜类蔓枯病由真菌子囊菌亚门泻根亚隔孢壳Didymella bryoniae(Auessw.)Rehm.，异名为甜瓜球腔菌Mycosphaerella melonis(Pass.)Chiu et Walker侵染所致，无性阶段病原菌为真菌半知菌亚门西瓜壳二孢Ascochyta citrullina Smith。蔓枯病菌以分生孢子器或子囊壳形态随病残体在土壤中，或附在种子、温室、大棚等表面上越冬、越夏。该病原菌可以侵染西瓜、甜瓜、黄瓜、西葫芦、南瓜、瓠瓜、丝瓜等葫芦科植物，在高温、高湿、通风不良的环境下容易发病，浙江及长江中下游地区春季大棚发病较重。该病流行时可使田间出现大量死藤，严重影响瓜类的产量和品质。
瓜类蔓枯病发病初期的症状与瓜类枯萎病相似，很难从症状上加以区分，并且田间容易造成多种病菌复合侵染，更加加大了病害鉴定的难度，贻误防治时机。而传统的病原菌分离和鉴定来诊断病害的方法时间长、操作繁琐，准确度低，并且难以对潜在的病原菌进行鉴定，因此亟需开发出一种能够准确、快速鉴定蔓枯病菌的分子生物学方法，对瓜类蔓枯病的潜伏期和发病初期就能进行诊断、检测和病原菌鉴定，及时有效地进行病害防治，控制病害的流行，减少经济损失，对田间病害防控具有指导意义。
发明内容
本发明所要解决的首要技术问题是提供检测瓜类蔓枯病的引物序列，该组引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对瓜类蔓枯病进行早期预警和及时防治。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供检测瓜类蔓枯病的试剂盒，该试剂盒内引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对瓜类蔓枯病进行早期预警和防治。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供相关的检测瓜类蔓枯病的方法。
本发明解决上述首要技术问题的技术方案是：一种用于检测瓜类蔓枯病的特异性引物，上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。
本发明解决上述另一个技术问题的技术方案是：一种检测瓜类蔓枯病的试剂盒，该试剂盒包含两条引物，上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。所述试剂盒还可以进一步包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。
本发明解决上述再一个技术问题的技术方案是：一种检测瓜类蔓枯病的方法，提取待测样品DNA作为模板，利用上述引物进行PCR扩增反应，PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在469-bp的DNA条带，则检测样品中含有瓜类蔓枯病菌。
优选，所述的PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），引物各0.2μmoll－1，dNTP0.2μmol l－1,MgCl22mmol l－1,1×缓冲液（上海博彩生产），聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。
优选，所述的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。
研究表明，植物病原真菌的分类鉴定主要依据其营养体和子实体的形态特征，由于形态特征容易受到培养条件和其他因素的影响，给真菌的分类鉴定工作带来困难。而病原真菌的基因组DNA遗传稳定，不易受环境影响，而且在真菌生活史的任何阶段都能获得。真菌的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，简称ITS)在绝大多数的真菌中表现为种内相对一致，种间差异比较明显。因此利用瓜类蔓枯病菌的ITS序列可以对该病原菌进行分子鉴定，用于区别瓜类上其他病原菌。
根据瓜类蔓枯病菌的ITS序列，设计引物Db-F和Db-R，对含有蔓枯病菌DNA的样品进行扩增，可以得到469-bp的条带，对含有其他真菌DNA的样品进行扩增，都不能扩增出任何产物。
与常规的瓜类病害的鉴定技术相比，本发明根据瓜类蔓枯病菌的ITS序列，设计了上述两条特异性引物，能用来快速、准确、便捷地鉴定样品中蔓枯病菌，该鉴定方法为建立病原菌的分子监测和病害的快速诊断技术奠定基础，对植物病害的防治具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明引物特异性检测样品DNA扩增后的凝胶电泳图；
图2为本发明田间病株DNA扩增后的凝胶电泳图。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
菌株选用
3个寄主分别为西瓜、甜瓜、黄瓜的蔓枯病菌(Didymella bryoniae)，编号为DB-1、DB-2和DB-3，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(F.solani)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、稻瘟病菌(Magnaprothe grisea)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。
上述菌株均保藏于宁波市农科院蔬菜研究所，也可以通过病原真菌分离纯化方法从瓜类等病株中获得。
DNA提取
本发明中瓜类蔓枯病菌和其他病原真菌均采用简便快速的菌丝DNA提取办法，具体操作步骤如下：
用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约100mg，置于1.5-mL Eppendorf管中，加500μLDNA提取裂解液（0.2mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA，0.02mol/L NaCl，1%SDS），用电钻充分研磨，振荡混匀，室温静止10min；13200r/min4℃，离心5min；取上清液约400μL于新的1.5-mL Eppendorf管中，加750μL无水乙醇，混和混匀，13200r/min4℃，离心5min，弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，室温放置干燥5-10min，溶于30μL TE缓冲液(pH8.0)，-20℃保存备用。
本发明中田间病株DNA提取方法：剪取病组织约100mg，置于1.5-mL Eppendorf管中，加500μL抽提液（2%聚乙烯吡咯烷酮和DNA提取裂解液混合物），其他步骤参照菌丝DNA提取办法，将提取后的DNA溶液用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒（上海生工生产）过柱纯化，-20℃保存备用。
引物合成
根据瓜类蔓枯病菌ITS序列，设计正向引物Db-F和反向引物Db-R。
上述引物的具体序列与序列表中序列对应关系如下表1所示：
表1、本发明中所有的PCR引物序列
上述序列的引物由上海博彩合成。
引物特异性验证
以提取的瓜类蔓枯病菌和其它7种真菌的DNA为模板，用种特异性引物Db-F和Db-R进行常规PCR反应，每个反应均有一个阴性对照（以无菌水作为模板）。
PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），两条引物各0.2μmol l－1，dNTP0.2μmol l－1,MgCl22mmol l－1,1×缓冲液（上海博彩生产），聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。
PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。
从电泳照片上看（如图1所示），用Db-F和Db-R引物组扩增的PCR产物中，3个西瓜、甜瓜和黄瓜上侵染的蔓枯病菌的DNA均能扩增到469-bp的DNA条带，而其它病原真菌没有扩增到任何条带。说明该组种特异性引物能够鉴定瓜类蔓枯病菌。
田间病株检测
将田间采集的茎部发病的甜瓜病株提取DNA，提取方法参照病株DNA提取。提取的DNA利用Db-F和Db-R进行常规PCR反应，每个反应均有一个阴性对照（以无菌水作为模板）和阳性对照（蔓枯病菌菌丝DNA）。PCR反应的扩增体系和反应条件如上所述。如图2所示，病株5和蔓枯病菌菌丝DNA阳性对照均能扩增到469-bp的DNA条带，说明病株被蔓枯病菌侵染，病株1，2，3扩增不到任何条带，说明病株是由除蔓枯病菌外的致病菌引起的。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种用于检测瓜类蔓枯病的特异性引物，其特征在于：上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。
2.一种用于检测瓜类蔓枯病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。
4.一种用于检测瓜类蔓枯病的方法，其特征在于：采用权利要求2或3所述的试剂盒对待测样品进行检测。
5.一种用于检测瓜类蔓枯病的方法，其特征在于：提取待测样品DNA作为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增反应，PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在469-bp的DNA条带，则检测样品中含有瓜类蔓枯病菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），引物各0.2μmol l－1，dNTP0.2μmol l－1,MgCl22mmol l－1,1×缓冲液，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。
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