CN102643903B

CN102643903B - 辣椒疫霉的pcr检测引物、含有该引物的试剂盒及应用

Info

Publication number: CN102643903B
Application number: CN 201210093491
Authority: CN
Inventors: 孙翔; 郭良栋
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2032-03-31
Also published as: CN102643903A

Abstract

本发明提供辣椒疫霉的PCR检测引物，所述引物包括Enl4s和Enl1a（如Seq ID No.1和2所示）。本发明基于辣椒疫霉和其他疫霉菌的Enl和Ypt基因的序列差异，共获得四对可快速检测辣椒疫霉病菌的特异性引物：Enl2s/Enl3a、Enl4s/Enl1a、Ypt2s/Ypt3a和Ypt2s/Ypt5a，其中Enl4s/Enl1a灵敏度最高。在此基础上建立PCR检测体系，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出辣椒疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，可对辣椒疫霉的各种形态的繁殖体如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，对辣椒疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。

Description

辣椒疫霉的PCR检测引物、含有该引物的试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及辣椒疫霉的检测，具体地说，涉及辣椒疫霉的PCR检测引物、含有该引物的试剂盒及应用。

背景技术

植物病原卵菌是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物的毁灭性病害，如致病疫霉（Phytophthora infestans）、辣椒疫霉（P.capsici）、大豆疫霉（P.sojae）、寄生疫霉（P.parasitic）、樟疫霉（P.cinnamomi）及冬生疫霉（P.hibemalis）分别引起马铃薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘的重要疫病，严重年份乃至绝产。该类病菌主要以菌丝体或卵孢子在病残体或土壤中渡过不良环境而作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，再借助雨水或气流进行传播、侵染而导致植物病害。因此，对该类病菌的初侵源或侵染寄主早期进行适时监控，利于控制病害的发生，传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。

辣椒疫霉(P.capsici)是我国常见辣椒病害种类，多在高温高湿的环境下侵染辣椒，如朝天椒(Capsicum annuum)、小米辣(C.frutescens)，造成疫病，而使作物大幅度减产甚至绝收。辣椒疫霉在国内也有侵染香蕉树(Hevea brasiliensis)、木瓜(Chaenomeles sinensis)、胡椒(Pipernigrum)、扁叶香果兰(Vanilla planifolia)等作物的报道，因此开发辣椒疫霉的早期快速检测技术，对相关作物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。

近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，主要利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异性引物来对植物致病菌进行快速检测。然而针对大豆疫霉、致病疫霉、辣椒疫霉、寄生疫霉、冬生疫霉的分子检测技术研究结果表明，部分疫霉种间ITS序列差异很小，分辨度不高。

Enl基因是烯醇化酶（enolase）编码基因，它广泛存在于真核生物中，目前尚无针对该靶基因设计的特异性辣椒疫霉检测引物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测辣椒疫霉的特异性引物及含有该引物的试剂盒。

本发明的另一目的是提供上述引物及试剂盒在检测辣椒疫霉中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种辣椒疫霉（Phytophthoracapsici）的PCR检测引物，其包括：

正向引物Enl4s：5’-TGAAGTTCACGGCCAAGGTG-3’和

反向引物Enl1a：5’-TGAACGTGTCCTCCGTCTCA-3’。

本发明还提供含有上述PCR引物的用于检测辣椒疫霉的试剂盒，其中所述试剂盒包括引物Enl4s和Enl1a。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供上述PCR引物或试剂盒在检测辣椒疫霉中的应用，包括步骤：1）提取样品中的DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应；3）分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有辣椒疫霉。

其中，PCR反应体系以50μl计为：

PCR反应条件为：95℃3分钟；94℃40秒，54℃50秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。

扩增反应结束后，若电泳检测结果出现约200bp的DNA条带，则该样品含有辣椒疫霉病菌。

本发明分析了辣椒疫霉和其他疫霉菌在Enl和Ypt基因序列上的差异，发现了数个高度特异且只存在于辣椒疫霉中的位点，共设计出四对辣椒疫霉特异性引物：Enl2s/Enl3a、Enl4s/Enl1a、Ypt2s/Ypt3a和Ypt2s/Ypt5a，从中选定灵敏性最强的Enl4s/Enl1a引物对，并在此基础上建立了检测辣椒疫霉的PCR体系。四对辣椒疫霉特异性引物的碱基序列如表1所示：

表1本发明涉及的辣椒疫霉特异性引物序列

*W为A或T。

利用上述引物检测辣椒疫霉的方法为：提取待测样品DNA作为模板，进行PCR扩增。其中，PCR扩增程序为95℃预变性3分钟，94℃变性40秒，54℃退火50秒，72℃延伸1分钟，35个循环，最后72℃延伸10分钟。检测扩增产物：取扩增产物，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟在再紫外光下检测结果，如果分别出现约300bp（引物对1）、约200bp（引物对2）、约150bp（引物对3）或约150bp（引物对4）的DNA条带，则表明样品中含有辣椒疫霉病菌。

所用PCR反应体系以总体积50μL计为：模板DNA约100ng，20mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgCl2，20mM Tris-HCl，pH8.4，200μM dNTPs，正向引物和反向引物各15pmol，Taq DNA聚合酶2.5U，余量为灭菌去离子水。

本发明基于辣椒疫霉和其他疫霉菌的Enl和Ypt基因的序列差异，设计出可快速检测辣椒疫霉病菌的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出辣椒疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，可对辣椒疫霉的各种形态的繁殖体如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，对辣椒疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。

附图说明

图1为利用本发明引物Enl4s/Enl1a进行PCR扩增的结果；其中，1-6为辣椒疫霉病菌，C为辣椒DNA样品，7-16分别为致病疫霉、黄瓜疫霉、大豆疫霉、恶疫霉、荔枝疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、镰刀菌，NC为阴性对照，M为100bp DNA Marker。

图2为引物Enl4s/Enl1a的PCR扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，1-10分别代表DNA样品经10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹及10¹⁰倍稀释，NC为阴性对照，M为100bp DNA Marker。

图3为利用本发明引物Enl2s/Enl3a进行PCR扩增的结果；其中，1-6为辣椒疫霉病菌，C为辣椒DNA样品，7-16分别为致病疫霉、黄瓜疫霉、大豆疫霉、恶疫霉、荔枝疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、镰刀菌，NC为阴性对照，M为100bp DNA Marker。

图4为引物Enl2s/Enl3a的PCR扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，1-10分别代表DNA样品经10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹及10¹⁰倍稀释，NC为阴性对照，M为100bp DNA Marker。

图5为利用本发明引物Ypt2s/Ypt3a进行PCR扩增的结果；其中，1-6为辣椒疫霉病菌，C为辣椒DNA样品，7-16分别为致病疫霉、黄瓜疫霉、大豆疫霉、恶疫霉、荔枝疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、镰刀菌，NC为阴性对照，M为100bp DNA Marker。

图6为引物Ypt2s/Ypt3a的PCR扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，1-10分别代表DNA样品经10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹及10¹⁰倍稀释，NC为阴性对照，M为100bp DNA Marker。

图7为利用本发明引物Ypt2s/Ypt5a进行PCR扩增的结果；其中，1-6为辣椒疫霉病菌，C为辣椒DNA样品，7-16分别为致病疫霉、黄瓜疫霉、大豆疫霉、恶疫霉、荔枝疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、镰刀菌，NC为阴性对照，M为100bp DNA Marker。

图8为引物Ypt2s/Ypt5a的PCR扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，1-10分别代表DNA样品经10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹及10¹⁰倍稀释，NC为阴性对照，M为100bp DNA Marker。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或Draper等（Blackwell科学出版社，1988），郑小波（疫霉菌及其研究技术，中国农业出版社，1997）中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1用于检测辣椒疫霉的PCR引物的合成

从GenBank数据库中选取辣椒疫霉和其他疫霉的Enl和Ypt基因序列，所涉及序列如表2所示：

表2本发明所涉及的Enl和Ypt基因序列

利用DNAMAN等生物学软件对上述Enl和Ypt基因序列进行比对分析，设计位于Enl和Ypt基因上的辣椒疫霉特异性引物，共获得四对特异性引物，序列如表1所示：

表1本发明涉及的辣椒疫霉特异性引物序列

*W为A或T。

引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。

实施例2利用PCR引物Enl4s/Enl1a检测辣椒疫霉的特异性和灵敏度分析

1.1样本来源：

本实施例中采用的辣椒疫霉病菌六个株系、致病疫霉、黄瓜疫霉、大豆疫霉、恶疫霉、荔枝疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、镰刀菌等（表3）保存于中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室和中国农业大学刘西莉教授实验室，部分病菌由山东农业大学张修国教授实验室惠赠。

表3用于PCR检测的样本来源

1.2DNA提取：

参照Wang等（Nucleic Acids Research,1993,21:4153-4154）中描述的NaOH法，略加修改提取植物组织DNA：向1mg植物组织中加入0.5mol/L NaOH10μl，充分研磨后转至1.5mL离心管中，10,000rpm离心5分钟，取5μl上清液加入0.1mmol/L Tris（pH8.0）495μl，于-20℃保存备用。提取健康辣椒的茎、果实、叶片的混合DNA为对照。

供试疫霉菌和腐霉菌在燕麦平板培养基上于25℃培养5-7天，供试真菌在PDA平板培养基上于25℃培养5-7天，用CTAB法提取菌丝DNA，于-20℃保存备用。

1.3样品DNA的梯度稀释：

用NanoVue（通用电气公司）检测上述提取的辣椒疫霉样品的DNA浓度，为104.5μg/ml。将DNA样品进行10倍梯度稀释，共稀释10次，最高稀释至10¹⁰倍，于-20℃保存备用。

1.4PCR反应

反应体系（50μl）：

1.5结果：

取扩增产物5μL，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果，如果出现约200bp的条带，则证明所检病原为辣椒疫霉。电泳检测结果如图1所示，泳道1-6为辣椒疫霉病菌样品，均能扩增出约200bp的DNA条带，而同属其他种、腐霉属菌种和镰刀菌等未出现条带。上述结果表明引物Enl4s/Enl1a的特异性强。

分别以上述十个浓度梯度稀释的DNA样品为模板进行PCR扩增反应。PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上。结果如图2所示，当稀释至10⁵倍时，条带不明显。因此，该引物对的灵敏度可达10.45ng/ml，即可检出样品中约10.45pg的辣椒疫霉DNA，检测灵敏度最高。

实施例3利用PCR引物Enl2s/Enl3a检测辣椒疫霉的特异性和灵敏度分析

PCR反应使用的引物为Enl2s和Enl3a，PCR扩增程序和扩增产物检测方法同实施例2，引物的特异性和灵敏度分析方法同实施例2。

扩增反应结束后，在1%的琼脂糖凝胶上对扩增产物进行电泳检测。如果出现约300bp的条带，则证明所检病原为辣椒疫霉。电泳检测结果如图3所示，泳道1-6为辣椒疫霉病菌样品，均能扩增出约300bp的DNA条带，而同属其他种、腐霉属菌种和镰刀菌等未出现条带。上述结果表明引物Enl2s和Enl3a的特异性强。

分别以十个浓度梯度稀释的DNA样品为模板进行PCR扩增反应。结果如图4所示，当稀释至10³倍时，条带不明显。因此，该引物对的灵敏度可达104.5ng/ml，即可检出样品中约0.1ng的辣椒疫霉DNA。

实施例4利用PCR引物Ypt2s/Ypt3a检测辣椒疫霉的特异性和灵敏度分析

PCR反应使用的引物为Ypt2s和Ypt3a，PCR扩增程序和扩增产物检测方法同实施例2，引物的特异性和灵敏度分析方法同实施例2。

扩增反应结束后，在1%的琼脂糖凝胶上对扩增产物进行电泳检测。如果出现约150bp的条带，则证明所检病原为辣椒疫霉。电泳检测结果如图5所示，泳道1-6为辣椒疫霉病菌样品，均能扩增出约150bp的DNA条带，而同属其他种、腐霉属菌种和镰刀菌等未出现条带。上述结果表明引物Enl2s和Enl3a的特异性强。

分别以十个浓度梯度稀释的DNA样品为模板进行PCR扩增反应。结果如图6所示，当稀释至10³倍时，条带不明显。因此，该引物对的灵敏度可达104.5ng/ml，即可检出样品中约0.1ng的辣椒疫霉DNA。

实施例5利用PCR引物Ypt2s/Ypt5a检测辣椒疫霉的特异性和灵敏度分析

PCR反应使用的引物为Ypt2s和Ypt5a，PCR扩增程序和扩增产物检测方法同实施例2，引物的特异性和灵敏度分析方法同实施例2。

扩增反应结束后，在1%的琼脂糖凝胶上对扩增产物进行电泳检测。如果出现约150bp的条带，则证明所检病原为辣椒疫霉。电泳检测结果如图7所示，泳道1-6为辣椒疫霉病菌样品，均能扩增出约150bp的DNA条带，而同属其他种、腐霉属菌种和镰刀菌等未出现条带。上述结果表明引物Enl2s和Enl3a的特异性强。

分别以十个浓度梯度稀释的DNA样品为模板进行PCR扩增反应。结果如图8所示，当稀释至10³倍时，条带不明显。因此，该引物对的灵敏度可达104.5ng/ml，即可检出样品中约0.1ng的辣椒疫霉DNA。

利用实施例2～5中的PCR反应体系，可对不同辣椒疫霉染病样品进行定性分子检测，应用该方法可准确预测大田辣椒疫霉消长动态和疫情发展趋势，便于及时确定病害最佳防控时期，如根据对土壤中卵孢子检测的有无、含量及繁殖速度，适时处理土壤，阻断源头病菌的繁殖与蔓延，达到高效治理辣椒疫霉病害的目的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的PCR检测引物，其特征在于，其包括：

正向引物Enl4s：5’-TGAAGTTCACGGCCAAGGTG-3’和

反向引物Enl1a：5’-TGAACGTGTCCTCCGTCTCA-3’。

2.含有权利要求1所述引物的用于检测辣椒疫霉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物Enl4s和Enl1a。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测辣椒疫霉中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以50μl计为：

8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为：95℃3分钟；94℃40秒，54℃50秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。