CN102586469B - 用于检测辣椒疫霉的lamp引物及含有该引物的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的LAMP引物及含有该引物的试剂盒，所述引物包括FIP和BIP以及F3和B3(如Seq ID No.1-4所示)。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于辣椒疫霉病菌的快速检测，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测出辣椒疫霉。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，可对辣椒疫霉的各种形态的繁殖体如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，对辣椒疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

Description

用于检测辣椒疫霉的LAMP引物及含有该引物的试剂盒
技术领域
本发明涉及辣椒疫霉的检测，具体地说，涉及用于检测辣椒疫霉的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。
背景技术
植物病原卵菌是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物的毁灭性病害，如致病疫霉（Phytophthora infestans）、辣椒疫霉（P.capsici）、大豆疫霉（P.sojae）、寄生疫霉（P.parasitic）、樟疫霉（P.cinnamomi）及冬生疫霉（P.hibemalis）分别引起马铃薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘的重要疫病，严重年份乃至绝产。该类病菌主要以菌丝体或卵孢子在病残体或土壤中渡过不良环境而作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，再借助雨水或气流进行传播、侵染而导致植物病害。因此，对该类病菌的初侵源或侵染寄主早期进行适时监控，利于控制病害的发生，传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。
辣椒疫霉(P.capsici)是我国常见辣椒病害种类，多在高温高湿的环境下侵染辣椒，如朝天椒(Capsicum annuum)、小米辣(C.frutescens)，造成疫病，而使作物大幅度减产甚至绝收。辣椒疫霉在国内也有侵染香蕉树(Hevea brasiliensis)、木瓜(Chaenomeles sinensis)、胡椒(Pipernigrum)、扁叶香果兰(Vanilla planifolia)等作物的报道，因此开发辣椒疫霉的早期快速检测技术，对相关作物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。
近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，主要利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异性引物来对植物致病菌进行快速检测。ITS+5.8S区域由编码真核细胞rRNA5.8S亚基的基因和该基因两侧的转录间序列(InterTranscribedSpacer,ITS)组成，由于ITS+5.8S区域具有较高的变异速率，因此常被用于真菌种水平的鉴定和分子系统学研究。
目前大多采用常规PCR方法进行植物病原菌检测，对仪器设备（如PCR仪、凝胶成像系统）要求高，投入大，给技术的基层推广造成了极大障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种便于基层推广使用的，用于检测辣椒疫霉的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的LAMP引物组，其包括：
外侧正向引物F3：5’-AACGCATATTGCACTTCCG-3’；
外侧反向引物B3：5’-GCCTCCACAACCAGCAAG-3’；以及
内侧正向引物FIP：5’-CATCCTCCACCGACTACACGGCCTGGGAGTATGCCTGTATCAG-3’；
内侧反向引物BIP：5’-TGTTGTCCTTCGGGTCGACTGTACCACGCTTTTCGAGCAA-3’。
本发明还提供含有上述LAMP引物组的用于检测辣椒疫霉的试剂盒，其中所述试剂盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。
前述试剂盒中还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明进一步提供上述LAMP引物组或试剂盒在检测辣椒疫霉中的应用，包括步骤：1）提取样品中的DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应；3）分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有辣椒疫霉。
其中，LAMP-PCR反应体系以25μl计为：
Figure GDA00003171732700031
LAMP-PCR反应条件为：65℃60分钟，80℃2分钟，冰上终止反应。
用上述引物组对待测样品DNA进行恒温扩增，若电泳检测结果出现梯状DNA条带，则该样品含有辣椒疫霉病菌，若没有扩增出条带，则该样品中不含辣椒疫霉病菌。
本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于辣椒疫霉病菌的快速检测，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测出辣椒疫霉。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，可对辣椒疫霉的各种形态的繁殖体如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，对辣椒疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
附图说明
图1为本发明LAMP引物组恒温扩增结果；其中，1-6为辣椒疫霉病菌，C为辣椒DNA样品，7-15分别为致病疫霉、黄瓜疫霉、大豆疫霉、恶疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、镰刀菌，NC为阴性对照。
图2为本发明LAMP引物组恒温扩增反应体系浑浊度目测效果；其中，管1-6为辣椒疫霉病菌，管C为辣椒DNA样品，管7-15分别为致病疫霉、黄瓜疫霉、大豆疫霉、恶疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、镰刀菌，管NC为阴性对照。
图3为LAMP引物组恒温扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，1-7分别代表DNA样品经101、104、108、109、1010、1011及1012倍稀释。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或Draper等（Blackwell科学出版社，1988），郑小波（疫霉菌及其研究技术，中国农业出版社，1997）中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1 用于检测辣椒疫霉的LAMP引物组的合成
根据辣椒疫霉（P.capsici）ITS+5.8S区域的基因序列，设计用于检测辣椒疫霉的LAMP引物组，其包括：
外侧正向引物F3：5’-AACGCATATTGCACTTCCG-3’；
外侧反向引物B3：5’-GCCTCCACAACCAGCAAG-3’；
内侧正向引物FIP：5’-CATCCTCCACCGACTACACGGCCTGGGAGTATGCCTGTATCAG-3’；
内侧反向引物BIP：5’-TGTTGTCCTTCGGGTCGACTGTACCACGCTTTTCGAGCAA-3’。
引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。
实施例2 利用LAMP引物组检测辣椒疫霉的特异性分析
1.1试剂和设备：
水浴锅，LAMP-PCR试剂盒购自日本荣研公司。
1.2样本来源：
本实施例中采用的辣椒疫霉病菌六个株系、致病疫霉、黄瓜疫霉、大豆疫霉、恶疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、镰刀菌等（表1）保存于中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室和中国农业大学刘西莉教授实验室，部分病菌由山东农业大学张修国教授实验室惠赠。
表1 用于LAMP-PCR检测的样本来源
Figure GDA00003171732700051
1.3DNA提取：
参照Wang等（Nucleic Acids Research,1993,21:4153-4154）中描述的NaOH法，略加修改提取植物组织DNA：向1mg植物组织中加入0.5mol/L NaOH10μl，充分研磨后转至1.5mL离心管中，10,000rpm离心5分钟，取5μl上清液加入0.1mmol/L Tris（pH8.0）495μl，于-20℃保存备用。提取健康辣椒的茎、果实、叶片的混合DNA为对照。
供试疫霉菌和腐霉菌在燕麦平板培养基上于25℃培养5-7天，供试真菌在PDA平板培养基上于25℃培养5-7天，用CTAB法提取菌丝DNA，于-20℃保存备用。
1.4LAMP-PCR反应
反应体系（25μl）：
LAMP-PCR反应条件为：65℃60分钟，80℃2分钟，冰上终止反应。
1.5结果：
对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果如图1所示，泳道1-6为辣椒疫霉病菌样品，均能扩增出梯状条带，而同属其他种、腐霉属菌种和镰刀菌等不产生条带。图2为LAMP引物组恒温扩增反应体系浑浊度目测效果，管1-6为辣椒疫霉病菌，反应体系出现浑浊，管C、管7-15及管NC为对照，反应体系清澈透明。其中，管7-15为疫霉属的其他种、腐霉属菌种和镰刀菌，管C为辣椒DNA样品，管NC为阴性对照。该结果表明本发明引物组的特异性强。
实施例3 利用LAMP引物组检测辣椒疫霉的灵敏度分析
1.1DNA样品浓度：
用NanoVue（通用电气公司）检测实施例2中提取的辣椒疫霉样品的DNA浓度，为104.5μg/ml。
1.2LAMP引物组灵敏度检测：
将DNA样品进行10倍梯度稀释，取101、104、108、109、1010、1011及1012倍稀释的DNA样品进行LAMP恒温扩增反应。反应体系及反应条件同实施例2。
1.3结果：
对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果如图3所示，LAMP能够检测出稀释109倍的DNA样品。当DNA样品稀释至1010倍以上时，则无法确保检出。因此，本引物组的灵敏度可达104.5fg/ml，即可检出样品中约0.2fg的辣椒疫霉DNA。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000149572090000011

Claims (7)

1.用于检测辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的LAMP引物组，其特征在于，其包括：
外侧正向引物F3：5’-AACGCATATTGCACTTCCG-3’；
外侧反向引物B3：5’-GCCTCCACAACCAGCAAG-3；’以及
内侧正向引物FIP：5’-CATCCTCCACCGACTACACGGCCTGGGAGTATGCCTGTATCAG-3’；
内侧反向引物BIP：5’-TGTTGTCCTTCGGGTCGACTGTACCACGCTTTTCGAGCAA-3’。
2.含有权利要求1所述LAMP引物组的用于检测辣椒疫霉的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求1所述LAMP引物组或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测辣椒疫霉中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样品中的DNA；
2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应；
3）分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，LAMP-PCR反应条件为：65℃60分钟，80℃2分钟，冰上终止反应。
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