CN101705294A - 用于苜蓿疫霉根腐病菌检测的lamp引物组 - Google Patents
用于苜蓿疫霉根腐病菌检测的lamp引物组 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101705294A CN101705294A CN200910228963A CN200910228963A CN101705294A CN 101705294 A CN101705294 A CN 101705294A CN 200910228963 A CN200910228963 A CN 200910228963A CN 200910228963 A CN200910228963 A CN 200910228963A CN 101705294 A CN101705294 A CN 101705294A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- clover
- lamp
- root rot
- primer
- phytophthora
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
用于检测苜蓿疫霉根腐病菌的LAMP扩增用核酸引物，上述LAMP扩增用核酸引物包含FIP引物、F3引物、BIP引物或B3引物，本发明的LAMP检测体系具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的检测苜蓿疫霉根腐病菌，能满足国家队苜蓿疫霉根腐病菌检测的迫切需要。
Description
技术领域
本发明涉植物保护领域，提供了利用常温扩增技术对苜蓿疫霉根腐病菌的检测，适用于口岸检验检疫机构应用。
背景技术
苜蓿疫霉根腐病菌(Phytophthora medicaginis E.M.Hans.et D.P.Maxwell)属于藻物界、卵菌门、卵菌纲、腐霉目、腐霉科、疫霉属，能寄生苜蓿属植物、鹰嘴豆、猕猴桃、胡萝卜等等，其中紫花苜蓿、鹰嘴豆是其主要的寄主。苜蓿疫霉根腐病菌在各大洲都有分布，范围包括：日本、巴基斯坦、土耳其、希腊、加拿大、美国阿根廷、澳大利亚、南非等。
紫花苜蓿是豆科、苜蓿属多年生草本植物，是我国乃至世界上种植最多的牧草品种.由于其适应性广、产量高、品质好等优点，素有“牧草之王”的美称。苜蓿根腐病是导致紫花苜蓿产量损失的主要病害之一，苜蓿根腐病在紫花苜蓿感病品种导致产量损失68％，，据报道，另外在澳大利亚，鹰嘴豆上发病严重时该病菌导致的产量损失达50％。目前苜蓿根腐病还没有在我国发生的报道。
2007年发布并实施的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将检疫性有害生物由原来的84种增加到435种，其中植物病原真菌124种，而苜蓿疫霉根腐病菌就是其中之一，到目前为止，各口岸对对苜蓿疫霉根腐病菌的检疫还处于无据可依的状态，严重影响到我国外来有害生物防范体系的有效性，因此很有必要对对苜蓿疫霉进行深入研究，尽快建立其检测方法和标准。
PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、无放射性污染、易推广等等突出特点，在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术，在检验检疫领域也获得了广泛应用，建立了多种检疫性有害生物的PCR检测方法，如柑桔黄龙病菌、柑桔溃疡病菌、梨火疫病菌、小麦印度腥黑穗病菌、大豆疫霉、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒等等，Liew et al(1998)报道利用ITS序列差异，建立苜蓿疫霉根腐病菌的PCR检测方法。由于普通PCR需要变温过程及其相应的快速升降温及温度控制，也就需要价格高昂的专用PCR设备，昂贵的仪器设备以及严重的污染问题(假阳性率高)，限制了普通PCR检测方法的推广。
本发明应用LAMP引物恒温扩增技术运用于苜蓿疫霉根腐病菌的快速检测，特异性、灵敏度比普通变温扩增PCR方法更高，同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供用于检测苜蓿疫霉根腐病菌的LAMP引物组。
本发明用于检测苜蓿疫霉根腐病菌的LAMP引物序列为：
F3：5’-AAACCTATCAGCGAAGGC-3’
B3 5’-ATATTGGACATAACGAGCCT-3’
FIP 5’-TCACCATGCATGCGTACTTAGTGGATTTCCTAAGTTCGCACCA-3’
BIP 5’-GTGCAGCGTTGACGTGTTAAACGGAACTTTCGTTTTGGAGGA-3’
用上述引物组队待测样品DNA进行恒温扩展，若结果产生梯状DNA条带，则该样品含有苜蓿疫霉根腐病菌，若扩增结果没有出现条带，则该样品中不含有苜蓿疫霉根腐病菌。
与现有技术相比，本发明的进步在于：检测仪器简单，无需昂贵的PCR仪投入，只需简单的水浴锅即可，降低了实验室投入，适合基层实验室推广。
附图说明
附图1.LAMP引物组恒温扩增结果。泳道为苜蓿疫霉根腐病菌，均能扩增出梯状DNA条带，泳道为对照，而未出现条带。
具体实施方式
LAMP引物设计：
1 TCCAGTACCA ATGTGCTGGA TTTTGAAACC TATCAGCGAA GGCTGTCCCA AAACCAGTAG
F3上游引物
2 GGATTTCCTA AGTTCGCACC AATTAATAGT CAGTACTTTA ACTAAGTACG CATGCATGGT
F2上游引物 F1C下游引物
3 GATTAATACT CGGTGTTGCG AGGACGTGCA GCGTTGACGT GTTAAAACTT CTTCGATGGG
B1C上游引物
4 CTAAACGCGC ACTTCCTCCA AAACGAAAGT TCCGATGGAA GGCTCGTTAT GTCCAATATT
B2下游引物 B3下游引物
5 AACTCCATTT AGAGCTTTGC ATCAATTTGT GGCGATGAAA TGGGTACTAA CTTTATGTCT
F3：AAACCTATCAGCGAAGGC
B3：ATATTGGACATAACGAGCCT
FIP＝F1C+F2：TCACCATGCATGCGTACTTAGTGGATTTCCTAAGTTCGCACCA
BIP＝B1C+B2：GTGCAGCGTTGACGTGTTAAACGGAACTTTCGTTTTGGAGGA
试剂和设备
水浴锅，引物由上海英俊生物技术有限公司合成，Bst DNA聚合酶购自NEB，甜菜碱(Betaine)、DNTPmix购置Sigma，，
标本来源
本发明说采用的苜蓿疫霉根腐病菌3个株系、大豆疫霉、马铃薯绯腐疫霉等购自ATCC，恶疫霉、烟草疫霉、苎麻疫霉见下表：
实施例1、苜蓿疫霉根腐病菌LAMP引物检测方法
DNA提取：50mg左右菌丝，用Qiagen Dneasy Plant Mini Kit试剂盒提取DNA。
反应体系：每反应的混合液总体积为25μl
10*ThermoPol Buffer 2.5μl
10mM DNTPmix 1μl
5M Betaine 5μl
10μM FIP 2μl
10μM BIP 2μl
10μM F3 0.5μl
10μM B3 0.5μl
8U/μl Bst酶 1μl
DD H2O 10μl
模板DNA 0.5μl
25μl
反应程序：反应混合液95℃水浴锅2min，然后放置于冰上，每管添加1μlBst酶，65℃水浴锅反应1h。
结果：5、13、14样品为苜蓿疫霉根腐病菌，均能出现梯状特异性条带，结果表明本发明引物对的特异性强，对其它同属其它真菌如大豆疫霉、苎麻疫霉、恶疫霉、马铃薯绯腐疫霉、辣椒疫霉、马铃薯晚疫霉、烟草疫霉等等没有非特异性条带出现。
序列表
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
AAACCTATCAGCGAAGGC 18
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ATATTGGACATAACGAGCCT 20
<210>1
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
TCACCATGCATGCGTACTTAGTGGATTTCCTAAGTTCGCACCA 43
<210>1
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GTGCAGCGTTGACGTGTTAAACGGAACTTTCGTTTTGGAGGA 42
Claims (1)
1.一种用于苜蓿疫霉根腐病菌检测的LAMP引物组，其特征在于，序列为：
Forward Outer F3 AAACCTATCAGCGAAGGC
Reverse Outer B3 ATATTGGACATAACGAGCCT
Forward Inner FIP TCACCATGCATGCGTACTTAGTGGATTTCCTAAGTTCGCACCA
Reverse Inner BIP GTGCAGCGTTGACGTGTTAAACGGAACTTTCGTTTTGGAGGA
用该LAMP引物组对待测样品进行DNA扩增，如果结果产生特异梯状谱带，则该样品含有苜蓿疫霉根腐病菌，如果结果没有出现特异梯状谱带，则样品中不含有苜蓿疫霉根腐病菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910228963A CN101705294A (zh) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | 用于苜蓿疫霉根腐病菌检测的lamp引物组 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910228963A CN101705294A (zh) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | 用于苜蓿疫霉根腐病菌检测的lamp引物组 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101705294A true CN101705294A (zh) | 2010-05-12 |
Family
ID=42375546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910228963A Pending CN101705294A (zh) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | 用于苜蓿疫霉根腐病菌检测的lamp引物组 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101705294A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102051415A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-11 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 用于苜蓿疫霉根腐病菌常温快速检测的lamp引物组 |
| CN102094085A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-06-15 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种磷酸甘露糖异构酶等温扩增检测试剂盒 |
| CN102586469A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-07-18 | 中国科学院微生物研究所 | 用于检测辣椒疫霉的lamp引物及含有该引物的试剂盒 |
| CN103773865A (zh) * | 2014-01-15 | 2014-05-07 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种烟草疫霉菌lamp引物及其快速检测方法 |
-
2009
- 2009-12-04 CN CN200910228963A patent/CN101705294A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102051415A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-11 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 用于苜蓿疫霉根腐病菌常温快速检测的lamp引物组 |
| CN102094085A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-06-15 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种磷酸甘露糖异构酶等温扩增检测试剂盒 |
| CN102586469A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-07-18 | 中国科学院微生物研究所 | 用于检测辣椒疫霉的lamp引物及含有该引物的试剂盒 |
| CN102586469B (zh) * | 2012-03-31 | 2013-10-23 | 中国科学院微生物研究所 | 用于检测辣椒疫霉的lamp引物及含有该引物的试剂盒 |
| CN103773865A (zh) * | 2014-01-15 | 2014-05-07 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种烟草疫霉菌lamp引物及其快速检测方法 |
| CN103773865B (zh) * | 2014-01-15 | 2015-05-20 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种烟草疫霉菌lamp引物及其快速检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Samad et al. | Shared and host‐specific microbiome diversity and functioning of grapevine and accompanying weed plants | |
| Krüger et al. | DNA‐based species level detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all arbuscular mycorrhizal fungi | |
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| Rivas et al. | A two primers random amplified polymorphic DNA procedure to obtain polymerase chain reaction fingerprints of bacterial species | |
| Strayer-Scherer et al. | Recombinase polymerase amplification assay for field detection of tomato bacterial spot pathogens | |
| CN104774955B (zh) | 一种葡萄座腔菌的检测方法 | |
| Li et al. | Specific and sensitive detection of Phytophthora nicotianae by nested PCR and loop‐mediated isothermal amplification assays | |
| Shime–Hattori et al. | A rapid and simple PCR method for identifying isolates of the genus Azospirillum within populations of rhizosphere bacteria | |
| Shen et al. | Development of a loop‐mediated isothermal amplification assay for rapid and sensitive detection of Sporisorium scitamineum in sugarcane | |
| CN101705294A (zh) | 用于苜蓿疫霉根腐病菌检测的lamp引物组 | |
| CN110951898A (zh) | 克罗诺杆菌属内4个种的特异性新分子靶标及其快速检测方法 | |
| CN111154900B (zh) | 铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 | |
| CN102634580B (zh) | 同时检测多种致病菌的检测用引物及检测方法 | |
| CN102051416B (zh) | 用于转基因玉米品系mir604常温检测的lamp引物组 | |
| CN107236812B (zh) | 用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN102051415A (zh) | 用于苜蓿疫霉根腐病菌常温快速检测的lamp引物组 | |
| WO2016112179A1 (en) | Methods and kits for detecting fungus and bacteria in cannabis | |
| CN108018374A (zh) | 用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒 | |
| CN103667530A (zh) | 一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法 | |
| CN103173530A (zh) | 松材线虫lamp特异性检测方法 | |
| Gadkar et al. | Evaluation of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) to rapidly detect arbuscular mycorrhizal fungi | |
| KR101509071B1 (ko) | 마이크로시스티스속 균주의 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 마이크로시스티스속 균주의 탐지방법 | |
| CN101235411A (zh) | 一种利用环介导等温扩增技术检测豚鼠气单胞菌的试剂盒 | |
| CN109735635A (zh) | 一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法 | |
| CN101705293B (zh) | 大豆疫霉pcr检测特异引物对 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100512 |