CN108018374A - 用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒 - Google Patents

用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒 Download PDF

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CN108018374A CN201711489329.9A CN201711489329A CN108018374A CN 108018374 A CN108018374 A CN 108018374A CN 201711489329 A CN201711489329 A CN 201711489329A CN 108018374 A CN108018374 A CN 108018374A
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范飞
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Abstract

本发明提供一种用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒。该试剂盒中包括引物组合，所述引物组合为引物组I、引物组II、和/或引物组III；引物组I由Tub‑F3、Tub‑B3、Tub‑FIP‑E198A和Tub‑BIP组成；引物组II由Tub‑F3、Tub‑B3、Tub‑FIP‑E198V和Tub‑BIP组成；引物组III由Tub‑F3、Tub‑B3、Tub‑FIP‑E198K和Tub‑BIP组成。本发明提供了一种基于分子水平的方便、灵敏、结果判断直观且可在田间操作的灰葡萄孢抗药性检测方法，可以保证基层技术员在田间，两小时内获得客观、可靠的检测结果。

Description

用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒
技术领域
本发明涉及植物病原菌抗药性检测领域，更具体地，涉及用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的引物组合及其试剂盒。
背景技术
由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是果蔬上一种非常普遍的病害，且危害十分严重，给果蔬生产造成了巨大的损失。目前防治该病害仍然主要依赖于杀菌剂。苯并咪唑类杀菌剂是生产上现在使用较多的一类杀菌剂。但由于其大量使用，灰葡萄孢已对其产生了抗药性，而该药的防治效果也随之大幅度下降。对抗性菌株进行研究发现，抗性菌株的β-微管蛋白基因的第198位密码子发生了点突变，使原先的谷氨酸被丙氨酸、缬氨酸或赖氨酸替代(E198A/V/K)。
若在喷药前就能明确田间是否已产生了抗性菌株，就可以准确制定杀菌剂喷施计划，以提高防治效果。目前比较常用的检测方法包括两种，即以菌丝生长抑制为基础的传统的菌落直径法和基于目标基因的PCR技术。传统的菌落直径法需要采集田间菌株，进行单孢分离，然后在添加一系列浓度的杀菌剂培养基上进行培养，检测杀菌剂对菌丝生长的抑制效应。抗性菌株的β-微管蛋白基因的E198A/V/K点突变是田间大多数病原菌对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的原因。有研究在此基础上设计相应引物，通过扩增片段长度或者测序结果可以对灰葡萄孢的抗药性进行定性检测。
传统的菌丝对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，要求严格的无菌操作，难以在早期就发现抗药性菌株的存在。基于PCR技术的检测方法，所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，不适合在田间或者地方市县等农业部门推广。
发明内容
为了克服现有技术检测周期长，工作量大，需要无菌条件，及PCR技术对仪器和人员技术要求高的缺陷，本发明的第一个目的，提供了一种用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的引物组合，所述引物组合为引物组I、引物组II、和/或引物组III。
其中，所述引物组I由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198A和Tub-BIP组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。
外引物：
Tub-F3：GCAACTCTCTCTGTCCATCAA，如SEQ ID NO.1所示；
Tub-B3：CCAACTTTCGGAGATCTGAGT，如SEQ ID NO.2所示。
内引物：
Tub-FIP-E198A：
GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCACAATTGGTTGAGAACTCTGATGC，如SEQ ID NO.3所示；
Tub-BIP：
TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCG-AAGTTGACCAGGGAAACGG，如SEQ ID NO.4所示。
其中，所述引物组II由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198V和Tub-BIP组成，所述Tub-FIP-E198V的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
外引物：
Tub-F3：GCAACTCTCTCTGTCCATCAA，如SEQ ID NO.1所示；
Tub-B3：CCAACTTTCGGAGATCTGAGT，如SEQ ID NO.2所示。
内引物：
Tub-FIP-E198V：
GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCACAATTGGTTGAGAACTCTGAGGT，如SEQ ID NO.5所示；
Tub-BIP：
TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCG-AAGTTGACCAGGGAAACGG，如SEQ ID NO.4所示。
其中，所述引物组III由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198K和Tub-BIP组成，所述Tub-FIP-E198K的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
外引物：
Tub-F3：GCAACTCTCTCTGTCCATCAA，如SEQ ID NO.1所示；
Tub-B3：CCAACTTTCGGAGATCTGAGT，如SEQ ID NO.2所示。
内引物：
Tub-FIP-E198K：
GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCACAATTGGTTGAGAACTCTGTCA，如SEQ ID NO.6所示；
Tub-BIP：
TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCG-AAGTTGACCAGGGAAACGG，如SEQ ID NO.4所示。
使用上述引物组合可以检测出灰葡萄孢是否对抗苯咪唑类杀菌剂具有抗药性。
其中，使用引物组I可以检测出灰葡萄孢是否因E198A突变导致其对苯咪唑类杀菌剂具有抗药性。使用引物组II可以检测出灰葡萄孢是否因E198V突变导致其对苯咪唑类杀菌剂具有抗药性。使用引物组III可以检测出灰葡萄孢是否因E198K突变导致其对苯咪唑类杀菌剂具有抗药性。
其中，因E198A突变导致菌株对苯咪唑类杀菌剂具有抗药性的菌株称为E198A型抗性菌株。因E198V突变导致菌株对苯咪唑类杀菌剂具有抗药性的菌株称为E198V型抗性菌株。因E198K突变导致菌株对苯咪唑类杀菌剂具有抗药性的菌株称为E198K型抗性菌株，
本发明提供的引物组合可以使得灰葡萄孢的抗药性检测更加方便和灵敏。
本发明第二个目的，还提供了含有上述引物组合的试剂盒。
其中，试剂盒中还包括：Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgSO4溶液和甜菜碱溶液。
进一步地，该试剂盒中还可以包括10×TE buffer和/或10000×SYBR Green I染料。
本发明第三个目的，还提供了含有上述引物组合或试剂盒在检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性中的应用。
在本发明一个优选实施方式中，该应用包括如下步骤：
1)提取待测灰葡萄孢的基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增；
3)分析步骤2)得到的扩增产物。
其中，步骤1)中使用10×TE裂解液提取待测灰葡萄孢的基因组DNA。具体可以为：挑取米粒大小的待测灰葡萄孢的菌丝于50μL10×TE裂解液中，沸水煮后得到待测灰葡萄孢的基因组DNA。沸水煮优选2分钟。
使用本发明的特异性引物来检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性时，只需使用简单的裂解液和步骤来提取DNA。该方法简单易学、省时省力，而且所提取得到的DNA完全满足LAMP检测需求。
其中，步骤2)中环介导等温扩增的反应总体积为25μL，反应体系为：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4溶液，1mM dNTPs，所述内引物各为1.2mM，所述外引物各为0.4mM，0.8M甜菜碱和1μL所述基因组DNA模板。
具体可以为：步骤2)中环介导等温扩增的反应总体积为25μL，反应体系为：4U BstDNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4溶液，1mM dNTPs，1.2mM Tub-BIP，1.2mMTub-FIP-E198A或Tub-FIP-E198V或Tub-FIP-E198K，0.4mM Tub-F3，0.4mM Tub-B3，0.8M甜菜碱和1μL所述基因组DNA模板。
其中，步骤2)中环介导等温扩增的条件为：63℃60min，85℃10min。具体地，是先在63℃下恒温60min后再在85℃下恒温10min。
其中，步骤3)可以为：在步骤2)所得扩增产物中加入10000×SYBR Green I染料，观察颜色反应，得出结果。10000×SYBR Green I染料的加入量优选为0.2μL。若产生荧光绿色，则表示该待测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂产生了抗药性，该待测灰葡萄孢为抗性菌株；若不变色为棕褐色，则表示该待测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂未产生抗药性，该待测灰葡萄孢为敏感菌株。
在另一个优选实施方式中，步骤3)也可以为：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无扩增产物。若通过琼脂糖凝胶电泳检测到梯状条带的扩增产物，则表示该待测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂产生了抗药性，该待测灰葡萄孢为抗性菌株；若通过琼脂糖凝胶电泳未检测到梯状条带的扩增产物，则表示该待测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂未产生抗药性，该待测灰葡萄孢为敏感菌株。
若为E198A/V型抗性菌株，即用相应引物检测后，加入染料以后呈荧光绿色，表明不可以再使用苯并咪唑类杀菌剂进行防治，可以使用杀菌剂乙霉威进行防治；若为E198K型抗性菌株，即用相应引物检测后，加入染料以后呈荧光绿色，表明不可以再使用苯并咪唑类杀菌剂进行防治，也不可以使用杀菌剂乙霉威进行防治。若不为抗性菌株，加入染料后呈棕褐色，表明可以继续使用苯并咪唑类杀菌剂进行防治。
本发明提供的用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的引物组合以及相应的试剂盒与现有其他技术相比，具有如下优点和积极效果：
1、本发明在已知灰葡萄孢抗苯并咪唑类杀菌剂分子机理的研究基础上，根据E198A/V/K点突变，应用环介导恒温扩增技术，使检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性不需要昂贵的PCR仪器，在田间条件下就能快速、准确检测大量样本，使在喷施杀菌剂前快速检测田间病原菌是否已经产生抗药性成为可能。
2、本发明提供可以特异性针对灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂抗性产生的E198A/V/K点突变的三组引物，及其高效准确便捷的检测试剂盒及扩增条件。应用该试剂盒可在两小时内从菌丝中快速、简便、准确、灵敏的检测出对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的灰葡萄孢，检测速度比传统的检测方法和普通分子检测方法更简单、高效。
3、本发明提供的检测方法步骤简单易操作，不需要PCR仪等实验室高级仪器，这对于基层植保站和田间操作的工作有重要意义。使用特异性引物和环介导恒温扩增反应，可以达到很高的准确率和灵敏度，可以在两小时内完成对田间样本的检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中使用引物组III对16个灰葡萄孢菌株DNA的扩增产物进行SYBR Green I染色后的对照图；
图2为本发明实施例1中使用引物组I对16个灰葡萄孢菌株DNA的扩增产物进行SYBR Green I染色后的对照图；
图3为本发明实施例1中使用引物组II对16个灰葡萄孢菌株DNA的扩增产物进行SYBR Green I染色后的对照图；
图4为本发明实施例2中使用引物组III对16个灰葡萄孢菌株DNA的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后的电泳图谱；
图5为本发明实施例2中使用引物组I对16个灰葡萄孢菌株DNA的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后的电泳图谱；
图6为本发明实施例2中使用引物组II对16个灰葡萄孢菌株DNA的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后的电泳图谱。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
实施例1
(1)挑取米粒大小待测灰葡萄孢菌丝于50μL 10×TE裂解液中，沸水煮2分钟，得到DNA模板；
(2)按照反应体系配制溶液，所述反应体系(25μL)：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4，1mM dNTPs，内引物各为1.2mM，外引物各为0.4mM，0.8M甜菜碱，1μL步骤(1)中DNA模板；反应条件：先在63℃下恒温60min后再在85℃下恒温10min；
(3)在所得扩增产物中加入0.2μL 10000×SYBR Green I染料，观察颜色反应，得出结果。
使用上述方法对16个待测灰葡萄孢进行检测分析，编号依次为1-16，其中编号17为蒸馏水对照。其中，该方法中所使用的引物组III，即内引物为Tub-FIP-E198K和Tub-BIP，各1.2mM，外引物为Tub-F3和Tub-B3，各0.4mM。结果如图1所示，编号为1-4中出现了肉眼清晰可分辨的荧光绿色，证明编号1-4代表E198K抗性菌株，其它不变色的5-16不是E198K抗性菌株。该检测方法具有很高的准确性，准确性可高达100％，可有效地实现灰葡萄孢是否对苯并咪唑类杀菌剂具有抗药性的检测。
使用上述方法对16个待测灰葡萄孢进行检测分析，编号依次为1-16，其中编号17为蒸馏水对照。其中，该方法中所使用的引物组I，即内引物为Tub-FIP-E198A和Tub-BIP，各1.2mM，外引物为Tub-F3和Tub-B3，各0.4mM。结果如图2所示，编号为1-4中出现了肉眼清晰可分辨的荧光绿色，证明编号1-4代表E198A抗性菌株，其它不变色的5-16不是E198A抗性菌株。
使用上述方法对16个待测灰葡萄孢进行检测分析，编号依次为1-16，其中编号17为蒸馏水对照。其中，该方法中所使用的引物组II，即内引物为Tub-FIP-E198V和Tub-BIP，各1.2mM，外引物为Tub-F3和Tub-B3，各0.4mM。结果如图3所示，编号为1-4中出现了肉眼清晰可分辨的荧光绿色，证明编号1-4代表E198V抗性菌株，5-16不是E198V抗性菌株。
该检测方法具有很高的准确性，准确性可高达100％，可有效地实现灰葡萄孢是否对苯并咪唑类杀菌剂具有抗药性的检测。
实施例2
(1)挑取米粒大小待测灰葡萄孢菌丝于50μL 10×TE裂解液中，沸水煮2分钟，得到DNA模板；
(2)按照反应体系配制溶液，所述反应体系(25μL)：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4，1mM dNTPs，1.2mM Tub-BIP，1.2mM Tub-FIP-E198A或Tub-FIP-E198V或Tub-FIP-E198K，0.4mM Tub-F3，0.4mM Tub-B3，0.8M甜菜碱，1μL步骤(1)中DNA模板；反应条件：先在63℃下恒温60min后再在85℃下恒温10min；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无扩增产物。
使用上述方法对16个待测灰葡萄孢进行检测分析，编号依次为1-16，其中编号17为蒸馏水对照，M代表Marker。其中，该方法中所使用的引物组III，即内引物为Tub-FIP-E198K和Tub-BIP，各1.2mM，外引物为Tub-F3和Tub-B3，各0.4mM。结果如图4所示，编号为1-4中能检测到梯状条带的扩增产物，证明编号1-4灰葡萄孢为E198K抗性菌株，其它未检测到梯状条带的5-16灰葡萄孢不是E198K抗性菌株。
使用上述方法对16个待测灰葡萄孢进行检测分析，编号依次为1-16，其中编号17为蒸馏水对照，M代表Marker。其中，该方法中所使用的引物组I，即内引物为Tub-FIP-E198A和Tub-BIP，各1.2mM，外引物为Tub-F3和Tub-B3，各0.4mM。结果如图5所示，编号为1-4中能检测到梯状条带的扩增产物，证明编号1-4灰葡萄孢为E198A抗性菌株，其它未检测到梯状条带的5-16灰葡萄孢不是E198A抗性菌株。
使用上述方法对16个待测灰葡萄孢进行检测分析，编号依次为1-16，其中编号17为蒸馏水对照，M代表Marker。其中，该方法中所使用的引物组II，即内引物为Tub-FIP-E198V和Tub-BIP，各1.2mM，外引物为Tub-F3和Tub-B3，各0.4mM。结果如图6所示，编号为1-4中能检测到梯状条带的扩增产物，证明编号1-4灰葡萄孢为E198V抗性菌株，其它未检测到梯状条带的5-16灰葡萄孢不是E198V抗性菌株。
该检测方法具有很高的准确性，准确性可高达100％，可有效地实现灰葡萄孢是否对苯并咪唑类杀菌剂具有抗药性的检测。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒
<130> KHP171117462.0
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Tub-F3
<400> 1
gcaactctct ctgtccatca a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Tub-B3
<400> 2
ccaactttcg gagatctgag t 21
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> Tub-FIP-E198A
<400> 3
ggttgctgag cttcaaggtt ctcacaattg gttgagaact ctgatgc 47
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Tub-BIP
<400> 4
tcttaaccac ttggtttccg ccgaagttga ccagggaaac gg 42
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> Tub-FIP-E198V
<400> 5
ggttgctgag cttcaaggtt ctcacaattg gttgagaact ctgaggt 47
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> Tub-FIP-E198K
<400> 6
ggttgctgag cttcaaggtt ctcacaattg gttgagaact ctgtca 46

Claims (10)

1.用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的引物组合，所述引物组合为引物组I、引物组II、和/或引物组III；
所述引物组I由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198A和Tub-BIP组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；
所述引物组II由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198V和Tub-BIP组成，所述Tub-FIP-E198V的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述引物组III由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198K和Tub-BIP组成，所述Tub-FIP-E198K的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgSO4溶液和甜菜碱溶液。
4.权利要求1所述的引物组合或权利要求2或3所述的试剂盒在检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取待测灰葡萄孢的基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增；
3)分析步骤2)得到的扩增产物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中环介导等温扩增的反应总体积为25μL，反应体系为：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4溶液，1mM dNTPs，所述内引物各为1.2mM，所述外引物各为0.4mM，0.8M甜菜碱和1μL所述基因组DNA。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤2)中环介导等温扩增的条件为：63℃60min，85℃10min。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的应用，其特征在于，步骤1)中使用10×TE裂解液提取待测灰葡萄孢的基因组DNA。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的应用，其特征在于，步骤3)具体为：
向步骤2)得到的扩增产物中加入SYBR Green I染料后观察颜色反应；
或，对步骤2)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用适用于田间检测。
CN201711489329.9A 2017-12-29 2017-12-29 用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒 Pending CN108018374A (zh)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666754A (zh) * 2018-11-26 2019-04-23 中国农业科学院植物保护研究所 葡萄霜霉病菌对羧酸酰胺类杀菌剂抗药性的Taqman-MGB检测方法
CN111893204A (zh) * 2020-08-14 2020-11-06 岭南师范学院 一种检测高抗苯并咪唑类杀菌剂基因型e198a的草坪币斑病菌的引物、试剂盒及方法
CN114250313A (zh) * 2020-09-22 2022-03-29 中国农业科学院植物保护研究所 一种检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性的组合物及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293971A (zh) * 2014-11-04 2015-01-21 南京农业大学 一种基于lamp技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法
CN105154432A (zh) * 2015-09-17 2015-12-16 北京工业大学 一种用于扩增灰葡萄孢菌四个基因的方法及其多重pcr引物组

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293971A (zh) * 2014-11-04 2015-01-21 南京农业大学 一种基于lamp技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法
CN105154432A (zh) * 2015-09-17 2015-12-16 北京工业大学 一种用于扩增灰葡萄孢菌四个基因的方法及其多重pcr引物组

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C K MYRESIOTIS等: "Resistance of Botrytis cinerea Isolates from Vegetable Crops to Anilinopyrimidine, Phenylpyrrole, Hydroxyanilide, Benzimidazole, and Dicarboximide Fungicides", 《PLANT DISEASE》 *
吴文君: "《农药学原理》", 31 August 2000, 中国农业出版社 *
李红霞: "四种植物病原真菌对多菌灵的抗药性分子遗传机制及其检测技术的研究", 《中国优秀博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666754A (zh) * 2018-11-26 2019-04-23 中国农业科学院植物保护研究所 葡萄霜霉病菌对羧酸酰胺类杀菌剂抗药性的Taqman-MGB检测方法
CN111893204A (zh) * 2020-08-14 2020-11-06 岭南师范学院 一种检测高抗苯并咪唑类杀菌剂基因型e198a的草坪币斑病菌的引物、试剂盒及方法
CN114250313A (zh) * 2020-09-22 2022-03-29 中国农业科学院植物保护研究所 一种检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性的组合物及方法

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