CN104099408A

CN104099408A - 一种马铃薯疮痂病菌定性检测的方法

Info

Publication number: CN104099408A
Application number: CN201310128374.7A
Authority: CN
Inventors: 赵伟全; 于秀梅; 郭凤柳; 刘大群; 张汀
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2013-04-15
Filing date: 2013-04-15
Publication date: 2014-10-15

Abstract

本发明公开了马铃薯疮痂病菌致病菌的快速定性分子检测方法，以我国发现的具有代表性的致病菌株CPS-1(S.scabies)、CPS-2(S.galilaeus)、CPS-3(S.acidiscabies)、SHXHZ-3(S.turgidiscabies)为模式菌株，根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）设计引物，筛选疮痂致病链霉菌的通用引物，筛选到的通用引物B1/B2对马铃薯疮痂病致病菌具有特异性。本发明设计的对马铃薯疮痂病致病链霉菌的快速定性检测方法不仅可用于对马铃薯疮痂病菌DNA的检测，还可以直接用于对孢悬液以及马铃薯疮痂病组织和土壤中的马铃薯疮痂病菌的检测，且检测准确，灵敏度高。

Description

一种马铃薯疮痂病菌定性检测的方法

技术领域

本发明属于分子检测方法的发明，特别指马铃薯疮痂病致病菌的分子检测方法的建立。

背景技术

马铃薯疮痂病是由多种植物病原链霉菌引起的经济性病害，随着我国近年来马铃薯生产规模不断扩大，疮痂病的危害也日益严重，目前已成为影响种薯生产的主要障碍之一，有的地区微型薯的发病率可达30%~60%（白晓东，2002）。由于该类病原菌的组成较为复杂，明确不同地区病原菌的存在情况是病害防治工作的首要问题，因此建立快速准确的病原菌检测方法是当前生产的急需。

针对生产中马铃薯疮痂病普遍发生却缺乏病原菌检测方法的实际问题，我们在前期工作中通过对我国马铃薯疮痂病菌进行采集鉴定，获得了大量病原菌菌株（赵伟全，2006）。对病原菌致病因子分析后发现该类病原可产生特有的致病毒素，且该毒素是疮痂病菌侵染过程中的主要致病因子（Goyer C et al，1998；赵伟全，2005）。将毒素合成基因簇进行克隆和分析后，发现该基因簇符合致病岛（pathogenicity island）的特点，包含txtA、txtB、txtC、txtD等多个基因。

基于PCR技术的快速分子检测技术是目前研究的热点，在病原菌的检测方面具有较大的应用潜力。该技术具有快速高效，操作简单，重复性强等优点，并可以同时处理大量样品，满足生产的需要。根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇中的不同基因序列设计引物，通过筛选稳定的特异性引物和优化反应体系，建立病原菌的分子检测方法。该工作有助于快速定性测定从疮痂病斑和土壤中分离到的疮痂病原链霉菌菌株，缩短病原菌的鉴定周期，准确地对马铃薯疮痂病菌进行定性检测，为病害的诊断提供有力依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一对检测马铃薯疮痂病菌的引物B1/B2。

本发明的第二个目的在于提供一种马铃薯疮痂病菌的定性检测方法。

本发明的整体技术构思是：在此研究中我们采用我国存在的四种模式菌株进行了基因组DNA的提取。根据上述致病岛中的不同基因序列设计了4对引物，通过对引物的筛选找到能检测疮痂链霉菌的快速分子检测方法。筛选到引物后，我们也是从疮痂病组织、带菌土壤、非致病菌以及其他非疮痂病菌等方面对引物进行了验证，证明了引物的稳定性以及可用性。

以我国发现的具有代表性的致病菌株CPS-1(S. scabies)、CPS-2(S. galilaeus)、CPS-3(S. acidiscabies)、SHXHZ-3(S. turgidiscabies)为模式菌株，根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）设计引物。然后以模式菌株基因组DNA为模板筛选疮痂致病链霉菌的通用引物。对模式菌株一定量的孢子提取的DNA进行梯度稀释用来测定引物的灵敏度；提取马铃薯疮痂病组织以及带有疮痂病菌的土壤DNA对筛选到的引物进行稳定性验证；提取实验室保存的其他革兰氏阳性菌株的DNA对引物的特异性进行检测。

本发明的研究方法包括：

A、各菌株基因组DNA的提取和引物的设计；

B、引物的筛选；

C、引物的灵敏度、稳定性及特异性检测。

设计的全部引物序列见下表：

表1 本研究设计的引物序列

步骤A是参照《Practical Streptomyces Genetics》中的方法提取模式菌株的基因组DNA，其他菌株的基因组采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取。根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）设计四对特异行引物A1/A2、B1/B2、C1/C2、D1/D2。用设计的引物对模式菌株的基因组DNA进行扩增。25μLPCR反应体系为：模板DNA 1000 ng， Taq10 酶1 U，100 μmol·L^-1的上、下游引物各0.5 μL，10 mmol·L^-1的dNTP 0.5μL，2×GC bufferⅡ缓冲液12.5 μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 μL；PCR反应程序为：先95℃ 5 min；然后95℃ 30s，62℃ 50s，72℃ 1 min，共30个循环；最后72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体pGM-T载体上，并转化到大肠杆菌DH5α上，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取3个阳性克隆进行测序，在国际基因库（GenBank）上进行序列分析，验证所得片段并选取效果最好的扩增片段作为检测探针，B1/B2扩增的目的片段测序结果稳定正确。

步骤B是根据步骤A中PCR的测序结果，对引物B1/B2的灵敏度进行检测。用平板计数法对病原菌的孢子数进行定量。将燕麦固体培养基（OMA）上培养10 d的疮痂病菌孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行10¹，10²…10¹⁰倍梯度稀释，取稀释好的孢悬液50μL涂布于燕麦固体培养基，生长7 d后进行平皿计数，算出样品的孢子总数。提取一定量菌株孢子的基因组DNA，将所提取的孢悬液DNA稀释成一样的浓度后进行10¹，10²，4×10²，8×10²，10³，4×10³， 6×10³，8×10³，10⁴，2×10⁴，4×10⁴，8×10⁴，10⁵倍不同梯度稀释，用筛选到的引物对不同浓度的疮痂病原菌孢悬液DNA进行PCR扩增，确定最低检测浓度，并根据孢悬液和孢悬液DNA的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值，该体系对CPS-3孢悬液DNA的检测灵敏度是10pg/μl，同样的检测方法得出，对CPS-1孢悬液DNA的检测灵敏度是10pg/μl，对CPS-2孢悬液DNA的检测灵敏度是10pg/μl，对SHXHZ-3的检测灵敏度同样是10pg/μl。

步骤C是对步骤A和B获得的引物进行几方面的检测：

对前期鉴定的4个疮痂病原链霉菌、4个非致病链霉菌以及4个其他菌株进行基因组DNA提取，利用本研究筛选的反应体系进行引物特异性检测，所得PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳检测，在疮痂病原链霉菌中得到了目的片段，在非致病链霉菌和其他菌株中都没有得到目的片段，结果验证了引物的特异性。

取温室试验中接菌发病的薯块，以及采自黑龙江、辽宁发病田块的疮痂病薯以及健康的薯块，切取一定量的病、健组织，用CTAB法提取基因组DNA，用筛选到的引物对所提基因组DNA进行PCR扩增，检测到体系非常稳定性；

采集不同马铃薯疮痂病发病地块的土壤样品及无病地块健康薯块周围的土壤，每土壤样品称取5 g加至装有5 ml无菌水的离心管中进行漩涡振荡10 min，静置待土壤颗粒沉淀后，取上清液离心富集菌体后，用CTAB法提取土壤样品的总基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增检测体系的稳定性。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明利用普通PCR方法筛选到了检测马铃薯疮痂病致病菌株的通用引物B1/B2。此引物对疮痂病菌检测的稳定性强，灵敏度高。应用此引物建立了马铃薯疮痂病菌的定性检测方法，该工作有助于快速区分从病斑和土壤中分离到的疮痂病原链霉菌菌株，缩短病原菌的鉴定周期，为病害的诊断提供有力依据，同时对马铃薯疮痂病的预防有较高的实际应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是对四种模式菌株CPS-1(S. scabies)、CPS-2(S. galilaeus)、CPS-3(S. acidiscabies)、SHXHZ-3(S. turgidiscabies)的PCR扩增结果；

图2是对PCR扩增体系退火温度的筛选，即优化反应条件；

图3是对孢悬液的平板计数法结果展示；

图4是B1/B2对菌株孢子DNA最低检测阈值；

图5是对引物B1/B2稳定性及特异性的检测。

具体实施方式

依据上述的整体研究思路具体的研究方法包括：

1、各菌株基因组DNA的提取和引物的设计；

2、引物的筛选；

3、引物的灵敏度、稳定性及特异性检测。

1、参照《Practical Streptomyces Genetics》中的方法提取模式菌株的基因组DNA，其他菌株的基因组采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取。根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）设计四对特异行引物A1/A2、B1/B2、C1/C2、D1/D2。用设计的引物对模式菌株的基因组DNA进行扩增。25μLPCR反应体系为：模板DNA 1000 ng， Taq10 酶1 U，100 μmol·L^-1的上、下游引物各0.5 μL，10 mmol·L^-1的dNTP 0.5μL，2×GC bufferⅡ缓冲液12.5 μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 μL；PCR反应程序为：先95℃ 5 min；然后95℃ 30s，62℃ 50s，72℃ 1 min，共30个循环；最后72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体pGM-T载体上，并转化到大肠杆菌DH5α上，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取3个阳性克隆进行测序，在国际核酸数据库（GenBank）上进行序列分析，验证所得片段并选取效果最好的扩增片段作为检测探针，B1/B2扩增的目的片段测序结果稳定正确。

2、是根据步骤1中PCR的测序结果，对引物B1/B2的灵敏度进行检测。用平板计数法对病原菌的孢子数进行定量。将燕麦固体培养基（OMA）上培养10 d的疮痂病菌孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行10¹，10²…10¹⁰倍梯度稀释，取稀释好的孢悬液50μL涂布于燕麦固体培养基，生长7 d后进行平皿计数，算出样品的孢子总数。提取一定量菌株孢子的基因组DNA，将所提取的孢悬液DNA稀释成一样的浓度后进行10¹，10²，4×10²，8×10²，10³，4×10³， 6×10³，8×10³，10⁴，2×10⁴，4×10⁴，8×10⁴，10⁵倍不同梯度稀释，用筛选到的引物对不同浓度的疮痂病原菌孢悬液DNA进行PCR扩增，确定最低检测浓度，并根据孢悬液和孢悬液DNA的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值，该体系对CPS-3孢悬液DNA的检测灵敏度是10pg/μl，同样的检测方法得出，对CPS-1孢悬液DNA的检测灵敏度是10pg/μl，对CPS-2孢悬液DNA的检测灵敏度是10pg/μl，对SHXHZ-3的检测灵敏度同样是10pg/μl。

3、是对筛选到的引物B1/B2进行几方面的检测：

B1/B2扩增序列测序结果：

TTCTGGGAGGCCGGGGAGGTTGTGTGCGGGACCGTGCAGCAGGTGGACCTTCTCCCGCAGCACCGGGTCGACGTCCACCTTCTTGCCGAGTGTCTCGATCACCTCGGCGGAGAAGTCGGTGGCCCAGTACGCCTCGCAGTCACCGGCGAGGCGGGACAGCAGCAGCCCGGTGCCCACGCCGATCTCCAGTACCCGGCGCGGTCGCAGGGCACGGATGCTGTCGACCGTGGCGTCCCGCCAGGCTTGCATCTGAGGCACGGGAATGGGCTCGCCGTCGTAGGTGCTGTTCCAGCCGCTGAAGTCCTCCCCCAGGGGGAGCGCTCCCACTGCGCTGTAGACCTCGTCGTAGAGCCGTTGCCATTCCTCGACGTGCTCCGAGGTGGTGTCGTCGGCCTGCCGCACGGCCGGGTGGTCCGGCACGACATAGGCGACGAGCCTCTGGTCTCCCGGAGTGTCCTCCCGGACCACCACCGCGGCCTGCGCGACCTCGGGATGGTCGCGCAGCACGGCTTCGACCTCGCCGGGCTCCACTCGGAAACCCCGTATCTTCGCCTGGTCGTCGACCCGGCCCACGAACTCCAGTTGCCCGTCGTCACGCACCCTCACCCGGTCGCCGGTCCGGTACATCCGCTCGCCGGGCGTCCCGAAGGGGTCGGCCACGAACCGCTCGGCGGTCAGCGCGGGCCGCCCCAGGTACCCGCGGGCCAGCCCCGCTCCGGCGATGTGGATCTCTCCGACCGCTCCCGGCGGTACCGGCCGGAGCCGCTCGTCGAGGACGTGGATGCGGGTGTCCGAGAGCGGACGGCCGATGGGCGGGATGCCTGCCCCGGCCAACGGTCCGCTCATGGTCGCGGAGACGGTCGATTCGGTCGGTCCGTACGCGTTCACCAGCAGCCGGCCCGGCGACCAGCGGCGCACCAGCTCGCTGTTGCAGGCCTCGCCCACATTGACGACGGTGGCCCCGGCGGGCAGAGCGCCGTCCGGCAGGGCGGCGAGCGTGGAGGCCGGCAGGGTGAAGTGGGTGATGCCCTCCTCGGCGGCGAGCGCACTGAACTCCGGTCCGGGCAGGAGCCGTTCACGCGGTGCGACCACCAGCGTGGCGCCAGTGAGCAAGGCCATCGACACGTCCCAGAAGGCGCCGTCGAAACTCGGCGAGGAAAAGAGCAGCAACCGGCTGGACGGCCCGATCCCCAGGTCCCGCGCATGGCTGCCCACCAGGCTGGCGATGCCGTGGTGGGTGAGGACCACTCCTTTGGGAGTACCGGTGGAACCCGAGGTGTAGATGACATAGGCCGGATGCCGGGTCCGGAGCGGGGCGCCGCGTTCGTCGTCCGCCACATCCGCCGCGGAGCAGTCGGCCAGGGTCCGTACGACGGCCGGGTCGTCCAGCACCACCGTGCGGGAGGCCGCCTCGGCCGGCAGCTCGGGCTCGATGTCACTCCTGGTCAGAACCAGCAGGGGAGCGGCGTC。

序列表

Claims

1.马铃薯疮痂致病菌株通用引物的筛选方法，其特征在于：根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）设计引物，以不同马铃薯疮痂病致病菌株CPS-1(S. scabies)、CPS-2(S. galilaeus)、CPS-3(S. acidiscabies)、SHXHZ-3(S. turgidiscabies)基因组DNA为模板，进行PCR扩增，筛选并获得通用检测引物B1/B2。

2.根据权利要求1所述的方法，采用的扩增反应条件特征在于：所述的PCR反应体系为模板DNA 1000 ng，Taq10 酶1 U，100 μmol · L^-1的上、下游引物各0.5 μL，10 mmol · L^-1的dNTP 0.5μL，2×GC bufferⅡ缓冲液12.5μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 μL；PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性 30s，62℃退火 50s，72℃延伸 1 min，共30个循环；最后72℃延伸 10 min，4℃保存。

3.根据权利要求2所述的方法对引物的灵敏度进行检测，其特征在于用平板计数法对病原菌的孢子数进行定量；将燕麦固体培养基上培养10 d的疮痂病菌孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行10¹，10²…10¹⁰倍梯度稀释，取稀释好的孢悬液50μL涂布于燕麦固体培养基上，生长7 d后进行平皿计数，计算出样品的孢子总数；提取一定量菌株孢子的基因组DNA，将所提取的孢悬液DNA稀释成一样的浓度后进行10¹，10²，4×10²，8×10²，10³，4×10³， 6×10³，8×10³，10⁴，2×10⁴，4×10⁴，8×10⁴，10⁵倍不同梯度稀释，用筛选到的引物对不同浓度的疮痂病原菌孢悬液DNA进行PCR扩增，确定最低检测浓度，并根据孢悬液和孢悬液DNA的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值。

4.根据权利要求2、3所述的方法对样品进行检测，其特征在于：经CTAB法提取样品的基因组后，该方法可对致病菌株、非致病菌株进行有效鉴别，也可对病薯组织、带菌土壤进行有效定性检测。