CN109006000A - 一种鉴定筛选香蕉枯萎病抗耐病种苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法，包括如下几个步骤：步骤A:制备病原基质接种体：将椰糠、玉米粉和水混合均匀，分装在玻璃瓶中高温高压灭菌；步骤B:病原基质的制备从瓶中倒出基质，滚动碾碎，按一定质量比例加入新的育苗介质均匀混合备用，测定基质病原菌孢子浓度维持在105‑106个/g;步骤C：香蕉苗的种植和日常管理；步骤D:病情调查与分级：接种香蕉枯萎病病原菌后开始按照病害评价等级对香蕉苗进行病害等级鉴定，抗耐病品种可延长鉴定时间至3个月后评价，记录香蕉苗的发病率及病情指数，根据发病率和病情指数判断植株抗病能力。直接利用育苗基质加入玉米粉制备病原基质接种体，节省成本，制备过程简单。
Description
技术领域
本发明属于香蕉病害生物防治领域，尤其涉及一种鉴定筛选香蕉枯萎病抗耐病种苗的方法。
背景技术
香蕉枯萎病，又名巴拿马病和黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense，简称Foc)引起的一种维管束坏死的毁灭性香蕉真菌病害和典型的土传病害。该病传播途径广，致病力强，蔓延速度快，感染率高，防治难，植株受感染后死亡率高，被称为“香蕉癌症”。香蕉枯萎病一旦发生就极具毁灭性，对香蕉产业的危害十分严重。此病1874年在澳大利亚被发现，上世纪中叶在巴拿马及南美洲的几个国家大面积爆发，约有43hm2的香蕉园遭毁,使风靡全球的国际贸易香蕉品种大米七(Gros Michel)退出历史舞台，并通过香蕉出口传播到全世界。到上世纪50年代，除了南太平洋、地中海、马来西亚的一些岛屿外，世界其他地方均有香蕉枯萎病的发生。
Foc进入土壤后，在没有香蕉寄主的情况下仍可生存长达30年之久，使得香蕉枯萎病的防治难度极大。目前，香蕉枯萎病的防治办法主要有化学防治、农业防治、生物防治等。尽管做了很多探索，到目前为止仍未找到有效的化学试剂和农业、生物防治方法。抗耐枯萎病香蕉种质的选育是应对香蕉枯萎病的最根本、最有效、最持久的方法。然而，香蕉抗病种质的筛选与鉴定往往需要先对获得的候选抗枯萎病种质进行组培扩繁，之后再进行枯萎病菌接种试验或枯萎病发病蕉园种植试验，最后根据发病情况筛选出抗枯萎病香蕉种质。这种筛选方法需要消耗大量的人力、物力和财力，同时筛选出抗枯萎病香蕉种质的概率也较低，因此建立一种简单、实用、低成本的香蕉种质枯萎病抗性评价方法意义重大。
目前，国内外还未发现严格意义上完全免疫香蕉枯萎病的香芽蕉品种(AAA)，选育出的耐病品种诸如南天黄、宝岛蕉、桂蕉9号、中蕉9号等。香蕉耐病品种并不是不受病原菌侵染，而是能在体内抵御枯萎病病原菌侵染，延缓发病或不表现出发病病征。我国普遍使用的香蕉枯萎病抗病种苗鉴定一般采用以土壤、细砂或营养液作为育苗基质。病原接种大多采用盆栽灌根、浸根后移栽、病原覆盖等方法。
上述盆栽接种方法主要存在以下问题：1、使用土壤或者细砂进行盆栽灌根法和浸根后移栽，为避免土壤微生物的交互作用影响试验结果的准确性，必须事先进行大规模的土壤消毒，操作不便，不利于抗病种苗的大量筛选；2、因香蕉枯萎病是土传病害，目前实际生产并不使用土壤或者细砂作为育苗基质；3、水培方法进行抗病种苗鉴定(CN 102771326A)，需建立香蕉苗水培系统及配置大量营养液，成本高，水培培养并不能真实模拟自然条件下香蕉根部正常生长环境，病原菌接触培养液后，大量繁殖，浓度不能控制，因此影响试验结果的准确性。4、病菌盆栽灌根、浸根移栽及覆盖接种时常会出现感病香蕉品种植株不发病的状况，原因可能是营养条件及环境条件影响下，病原菌在育苗介质中分布不均，接种浓度不能持续保持稳定。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法，包括如下几个步骤：
步骤A:制备病原基质接种体：将椰糠、玉米粉和水混合均匀，分装在玻璃瓶中高温高压灭菌；无菌条件下接种在PDA培养基培养香蕉枯萎病病原菌饼，培养箱中暗培养，取样，进行镜检，结合梯度稀释法，测定基质病原菌孢子浓度能达到106-108个/g，依据实际用量进行分瓶取用，剩余可继续培养3-5个月，基质病原菌孢子浓度能维持105-106个/g；
步骤B:病原基质的制备从瓶中倒出基质，滚动碾碎，按实际用量10-100倍质量比加入新的育苗介质均匀混合备用，调节病原基质枯萎病孢子浓度用于抗耐病种苗鉴选试验，试验过程，取样镜检，结合梯度稀释法，测定基质病原菌孢子浓度维持在105-106个/g；
步骤C：香蕉苗的种植和日常管理：选取叶龄为5-12叶期，株高为8-35cm的健康组培香蕉苗，种植于装有病土基质的营养杯中，置于温度为20-32℃、光照的环境中进行观察；
步骤D:病情调查与分级：接种香蕉枯萎病病原菌后开始按照病害评价等级对香蕉苗进行病害等级鉴定，抗耐病品种可延长鉴定时间至3个月后评价，记录香蕉苗的发病率及病情指数，根据发病率和病情指数判断植株抗病能力。
现有技术中，上述盆栽接种方法主要存在以下问题：1、使用土壤或者细砂进行盆栽灌根法和浸根后移栽，为避免土壤微生物的交互作用影响试验结果的准确性，必须事先进行大规模的土壤消毒，操作不便，不利于抗病种苗的大量筛选；2、因香蕉枯萎病是土传病害，目前实际生产并不使用土壤或者细砂作为育苗基质；3、水培方法进行抗病种苗鉴定(CN102771326 A)，需建立香蕉苗水培系统及配置大量营养液，成本高，水培培养并不能真实模拟自然条件下香蕉根部正常生长环境，病原菌接触培养液后，大量繁殖，浓度不能控制，因此影响试验结果的准确性。4、病菌盆栽灌根、浸根移栽及覆盖接种时常会出现感病香蕉品种植株不发病的状况，原因可能是营养条件及环境条件影响下，病原菌在育苗介质中分布不均，接种浓度不能持续保持稳定。
因此，本发明提供一种鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法。利用商品性椰糠等香蕉育苗常用介质，加入营养物质，接种香蕉枯萎病病原菌，制备浓度高且稳定的接种病原基质，按一定比例，通过混合稀释制备大量病原基质，应用于抗病种苗的大量筛选。本发明能长时间保证病原菌在基质中的稳定浓度及均匀分布，无需人工伤根、灌根接种病原菌，最大程度的模拟健康种苗在杯苗期及移栽到带病大田土壤中受病菌侵染的情况，提高鉴选香蕉抗性种苗的效率及准确度。
优选的，所述步骤A中，将椰糠：玉米粉：水按重量比5-8:1:1混合均匀。
优选的，所述步骤A中，无菌条件下接种在PDA培养基培养了5-7d的香蕉枯萎病病原菌饼，26-28℃培养箱中暗培养14-21d。
优选的，所述步骤C中，选取叶龄为5-12叶期，株高为8-35cm的健康组培香蕉苗，种植于装有病土基质的营养杯中，置于温度为20-32℃、自然光照的环境中进行观察。
优选的，所述步骤D中，一个半月后开始按照病害评价等级对香蕉苗进行病害等级鉴定，抗耐病品种可延长鉴定时间至3个月后评价，记录香蕉苗的发病率及病情指数，根据发病率和病情指数判断植株抗病能力。
优选的，所述步骤D中，病情分级方法：
0级:健康；
1级:叶片黃化，假茎纵裂，维管束褐化小于1/3，球茎褐化小于1/3；
2级:维管束褐化大于1/3，球茎褐化大于1/3；
3级:维管束褐化大于2/3，球茎褐化大于2/3；
其中，满足各级标准条件中的其中一项，即鉴定为该级病害：
N＝n1+n2+n3+……。
优选的，所述香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)，包括4号生理小种(Foc4)、1号生理小种(Foc1)、2号生理小种或大蕉枯萎病菌。
本发明带来了如下效果：
1.直接利用育苗基质加入玉米粉制备病原基质接种体，节省成本，制备过程简单。
2.制备的病原基质比较于病土重量轻，取用方便。
3.可根据需要制备各梯度孢子浓度的病原基质，且孢子浓度可定量，能长时间保持稳定且均匀分布，必要时制备的病原基质可重复使用。
4.无需人工伤根、灌根接种病原菌，最大程度的模拟健康种苗在杯苗期及移栽到带病大田土壤中受病菌侵染的情况(香蕉枯萎病是土传病害)，提高鉴选香蕉抗性种苗的效率及准确度。
5.既适合快速筛选又适合长时间鉴选观察香蕉抗耐病品种植株耐受病原菌侵染的过程。
附图说明
图1是本发明病原基质接种体。
图2是本发明香蕉抗耐病品种鉴选试验。从左到右分别为：Williams感病、桂蕉9号中抗、GCTCV-119高抗。
具体实施方式
下面结合对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：
实施例1
1.制备病原基质接种体
使用市面常用香蕉育苗基质(主要为椰糠)，按一定质量比加入玉米粉和水，即椰糠：玉米粉：水＝5:1:1。混合均匀，分装在底面直径6.5cm，高9.0cm的玻璃瓶中，盖上盖子，121℃，20分钟高温高压灭菌两次。无菌条件下接种在PDA培养基培养了5d的香蕉枯萎病病原菌饼，28℃培养箱中暗培养14-21d，取样，进行镜检，结合梯度稀释法，测定基质病原菌孢子浓度能达到106-108个/g，依据实际用量进行分瓶取用，剩余可继续培养3个月，基质病原菌孢子浓度能维持105-106个/g。
2.病原基质的制备
从瓶中倒出基质，利用玻璃瓶滚动碾碎，按10-100倍比例加入新的育苗介质均匀混合备用，调节病原基质枯萎病孢子浓度为106个/g(根据需要可制备各梯度孢子浓度)用于抗耐病种苗鉴选试验，试验过程，取样镜检，结合梯度稀释法，测定基质病原菌孢子浓度维持在105-106个/g。如有剩余未使用的病原基质，用塑料袋封口，加水适度保持湿度，放置3-6个月，病原孢子浓度最终能稳定在104个/g，可继续用作后续鉴选试验。
所述香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)，包括4号生理小种(Foc4)、1号生理小种(Foc1)、2号生理小种或大蕉枯萎病菌等。
3.香蕉苗的种植和日常管理
选取叶龄为5-12叶期，株高为8-35cm的健康组培香蕉苗，种植于装有病土基质的营养杯中，置于温度为20-32℃、光照的环境中进行观察，光照提供方式可为自然光或人造光，按照日常管理要求，基质中添加缓释复合肥供给植株生长需要，过程中记录植株的生长情况。
4.病情调查与分级
接种香蕉枯萎病病原菌大约一个半月后开始按照病害评价等级对香蕉苗进行病害等级鉴定，抗耐病品种可延长鉴定时间至3个月后评价，记录香蕉苗的发病率及病情指数，根据发病率和病情指数判断植株抗病能力。
病情分级方法：
0級:健康。
1級:叶片黃化，假茎纵裂，维管束褐化小于1/3，球茎褐化小于1/3。
2級:维管束褐化大于1/3，球茎褐化大于1/3。
3級:维管束褐化大于2/3，球茎褐化大于2/3。
注：满足各级标准条件中的其中一项，即鉴定为该级病害。
N＝n1+n2+n3+……
实施例2
本发明一种鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法，对威廉斯B6(感病品种)、桂蕉9号(中抗品种)、GCTCV-119(高抗品种)3个不同抗性的香蕉品种的抗病性鉴定，并与田间病害评价进行对照。
1.准备病原菌。基于前期的致病力检测试验，采用致病力较强的供试致病菌株尖孢镰孢菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)。4号生理小种菌株接种于无菌马铃薯固体培养基中(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，121℃高温灭菌20min)，在温度为25-28℃，恒温条件下培养5-7天，打菌饼备用。
2.选取叶龄为5-6叶期，株高约10cm的健康组培香蕉苗。
3.制备病原基质接种体，按质量比椰糠：玉米粉：水＝5:1:1，制备600g香蕉培养基质，分装在底面直径6.5cm，高9.0cm的玻璃瓶中，盖上盖子，121℃高温灭菌20min，重复灭菌两次，无菌条件下每瓶接种Foc4菌饼两个，28℃培养箱中暗培养21d，镜检结合梯度稀释测定法测定病菌孢子浓度为1.2x107个/g。
4.制备病原基质并分装，依据实际病原基质用量，取用病原接种体利用玻璃瓶滚动碾碎，加入新椰糠介质混合均匀，调整基质病原孢子浓度为1.2x106个/g。将混合好的病原基质装入底径10cm的育苗杯中，每杯用量约为200g。
5.选取威廉斯B6(感病品种，重病地发病率90％以上)、桂蕉9号(中抗品种，重病地发病率20-40％)、GCTCV-119(高抗品种，重病地发病率5％左右)3个不同抗性的香蕉品种，种植于装有病原基质的营养杯中，加入少量缓释肥。置于温度为25-28℃、自然光或人工光照的环境中种植并观察发病情况，种植一个半月后开始调查发病率及病情指数。每个品种接种组培香蕉苗30株，做3次重复实验。鉴定结果如表1所示：
表1不同香蕉品种杯苗的抗病性评价
注：数值后不同字母表示差异达0.05显著水平。
综上所述，本发明一种快速鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法通过对比3个不同抗性品种的平均病情指数与田间病害评价结果一致，准确地区分香蕉枯萎病病原菌的感病与抗病品种，并为大量筛选香蕉枯萎病抗病种苗提供了一个良好依据。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法，其特征在于，包括如下几个步骤：
步骤A:制备病原基质接种体：将椰糠、玉米粉和水混合均匀，分装在玻璃瓶中高温高压灭菌；无菌条件下接种在PDA培养基培养香蕉枯萎病病原菌饼，培养箱中暗培养，取样，进行镜检，结合梯度稀释法，测定基质病原菌孢子浓度能达到106-108个/g，依据实际用量进行分瓶取用，剩余可继续培养至基质病原菌孢子浓度能维持105-106个/g；
步骤B:病原基质的制备从瓶中倒出基质，滚动碾碎，按10-100倍的质量比加入新的育苗介质均匀混合备用，调节病原基质枯萎病孢子浓度用于抗耐病种苗鉴选试验，试验过程，取样镜检，结合梯度稀释法，测定基质病原菌孢子浓度维持在105-106个/g；
步骤C：香蕉苗的种植和日常管理：选取叶龄为5-12叶期，株高为8-35cm的健康组培香蕉苗，种植于装有病土基质的营养杯中，置于温度为20-32℃、光照的环境中进行观察；
步骤D:病情调查与分级：接种香蕉枯萎病病原菌后开始按照病害评价等级对香蕉苗进行病害等级鉴定，抗耐病品种可延长鉴定时间至3个月后评价，记录香蕉苗的发病率及病情指数，根据发病率和病情指数判断植株抗病能力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征于，所述步骤A中，将椰糠：玉米粉：水按重量比5-8:1:1混合均匀。
3.如权利要求1所述的方法，其特征于，所述步骤A中，无菌条件下接种在PDA培养基培养了5d的香蕉枯萎病病原菌饼，26-28℃培养箱中暗培养14-21d。
4.如权利要求1所述的方法，其特征于，所述步骤C中，选取叶龄为5-12叶期，株高为8-35cm的健康组培香蕉苗，种植于装有病土基质的营养杯中，置于温度为20-32℃、自然光照的环境中进行观察。
5.如权利要求1所述的方法，其特征于，所述步骤D中，大约一个半月后开始按照病害评价等级对香蕉苗进行病害等级鉴定，抗耐病品种可延长鉴定时间至3个月后评价，记录香蕉苗的发病率及病情指数，根据发病率和病情指数判断植株抗病能力。
6.如权利要求1所述的方法，其特征于，所述步骤D中，病情分级方法：
0级:健康；
1级:叶片黃化，假茎纵裂，维管束褐化小于1/3，球茎褐化小于1/3；
2级:维管束褐化大于1/3，球茎褐化大于1/3；
3级:维管束褐化大于2/3，球茎褐化大于2/3；
注：满足各级标准条件中的其中一项，即鉴定为该级病害：
N＝n1+n2+n3+……。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)，包括4号生理小种(Foc4)、1号生理小种(Foc1)、2号生理小种或大蕉枯萎病菌。
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