CN103875453A - 西藏淡褐色双孢蘑菇菌株及其子实体栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种西藏淡褐色双孢蘑菇菌株及其子实体栽培方法。本发明所提供双孢蘑菇具体为西藏淡褐色双孢蘑菇2094，采自中国西藏林芝地区的野生菌株经过人工驯化后得到，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8308。实验证明，本发明所提供的西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）子实体蛋白质含量和粗纤维含量都较高，碳水化合物含量略低，子实体乙醇提取物具有较强的抗氧化能力。该菌株菌盖主色为淡褐色，菌种播种后萌发较快，从接种到原基发生的时间相对较短。本发明开发了双孢蘑菇新品种，对于保护该物种的种质资源、调整双孢蘑菇品种结构、丰富我国野生双孢蘑菇种质资源库、推进双孢蘑菇菌种的选育和改良等具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种西藏淡褐色双孢蘑菇菌株及其子实体栽培方法。
背景技术
双孢蘑菇[Agaricus bisporus(J.E.Lange)Imbach]是当今世界上栽培面积最广、产量最多的全球性食用菌，也是我国最大宗的出口创汇食用菌之一。它以其丰富的营养、鲜美的口味和提高机体免疫力的作用，非常适合现代人的美食追求。由于双孢蘑菇是欧美发达国家主要栽培与消费食用菌，所以发展双孢蘑菇产业对于推动出口贸易也尤为重要。
双孢蘑菇的人工栽培始于法国路易十四时代，随后在欧洲和北美各国迅速推广。20世纪20年代中期传入中国。目前全世界有超过80个国家和地区栽培双孢蘑菇，中国的双孢蘑菇总产量位居世界前列。然而，目前我国双孢蘑菇的主栽菌株来源比较单一，遗传基础狭窄，可能造成双孢蘑菇菌种的抗逆性和对不良环境适应能力的降低，加速双孢蘑菇菌种的退化，从而不利于双孢蘑菇的栽培生产。
我国现有的双孢蘑菇栽培种质大多是从国外引进的，白色品系居多，鲜有棕色品种，野生的双孢蘑菇种植资源十分缺乏。因此，从我国境内采集得到野生双孢蘑菇菌株，将有利于丰富我国野生双孢蘑菇种质资源库，推进双孢蘑菇菌种的选育和改良，具有极大的开发利用前景。
发明内容
本发明提供了一种西藏淡褐色双孢蘑菇菌株及其子实体栽培方法。
本发明提供的西藏淡褐色双孢蘑菇新菌株是从西藏林芝采集到野生菌新鲜标本，经组织分离培养和驯化而成。该菌株被命名为“双孢蘑菇2094”，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.8308。
所述西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）在作为亲本进行杂交育种中的应用也属于本发明的保护范围。
栽培所述西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）得到的子实体也属于本发明的保护范围。
培养所述西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）得到的菌丝体也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的所述西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）子实体的栽培方法，可包括如下步骤：
（1）母种制备：将所述西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）接种到母种培养基上（一般为试管斜面），22℃–28℃（如24–26℃）避光培养，培养至菌丝长满培养基，得到的菌丝体作为母种；
其中，接种量为每20cm2表面积的所述母种培养基中接入0.2cm×0.2cm面积大小的所述西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的菌丝。
（2）原种制备：将步骤（1）所得的母种转接到原种培养基上，22℃–28℃（如24–26℃）避光培养，空气相对湿度为60%–70%，培养至菌丝长满培养基，得到原种；
其中，接种量为每500mL体积的所述原种培养基中接入3–5个0.5cm×0.5cm面积大小的所述母种的菌种块。
（3）栽培种制备：将步骤（2）所得的原种转接到栽培种培养基上，22℃–28℃（如24–26℃）避光培养，空气相对湿度为60%–70%，培养至菌丝长满培养基，得到栽培种；
其中，接种量为每100mL体积的所述栽培种培养基中接入1mL体积的所述原种。
（4）接种及发菌：将步骤（3）所得的栽培种接入栽培料，22℃–28℃（如24–26℃）避光培养，空气相对湿度为65%–75%；
其中，接种量为每平米栽培面积的所述栽培料接入700–1000mL所述栽培种。
（5）覆土：步骤（4）培养的菌丝长至所述栽培料厚度的3/4时，开始在所述栽培料的料面上覆土，22℃–28℃（如24–26℃）避光培养，空气相对湿度为70%–75%，每天通风1次维持空气中二氧化碳相对浓度0.1%–0.5%（体积分数）；
所述覆土具体为：向所述栽培料上覆盖一层厚度为3–3.5cm的土壤–麦壳混合物；所述土壤–麦壳混合物按照1m3土壤（生黄土或菜园土）掺入25kg麦壳（新鲜无霉变的麦壳）的量混合而成；所述土壤–麦壳混合物的pH为8–8.5，湿度为40%–50%（即土壤–麦壳混合物中水分的质量分数为40–50%）；
（6）出菇管理：步骤（5）培养的菌丝生长到土层表面时，补一层细土，转移至昼夜温差为6–10℃（白天温度为18–25℃，夜晚温度为10–15℃），光照强度为500–800Lux，空气相对湿度为85%–95%，每天通风2–3次使二氧化碳相对浓度为0.05%–0.15%（体积分数）的条件下培养3–5天；
（7）出菇：转移至环境温度为12℃–20℃，空气相对湿度为75%–90%，二氧化碳相对浓度为0.05%–0.15%（体积分数）的条件下培养得到子实体。
在上述方法中，所述母种培养基可为加富PDA培养基、麸皮浸汁培养基或粪草浸汁培养基；
每升所述加富PDA培养基按照如下方法配制得到：将马铃薯150g、麸皮（小麦外皮）50g放入1000mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、蔗糖或葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，加热使之完全溶化，再加水补足至1000mL，灭菌30min，获得1L所述加富PDA培养基。
每升所述麸皮浸汁培养基按照如下方法配制得到：将麸皮100g放入900mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、蔗糖或葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，加热使之完全溶化，再加水补足至1000mL，获得1L所述麸皮浸汁培养基；
每升所述粪草浸汁培养基按照如下方法配制得到：将干粪草100g放入900mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、蔗糖或葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，加热使之完全溶化，再加水补足至1000mL，获得1L所述麸皮浸汁培养基。其中，所述干粪草按照如下方法制备获得：将水、牛粪、秸秆按照质量配比为6：2：1的比例混合后，堆制发酵10天，期间每隔3天翻堆一次，外料内翻，上料下翻，翻堆3次，然后晒干粉碎过筛（筛孔径0.5cm×0.5cm），即得到所述干粪草。其中，牛粪和秸秆的质量按照干重计算。
在上述方法中，所述原种培养基和所述栽培种培养基均由青稞、干粪草（发酵后的干粪草）、石膏粉、生石灰和水混合而成；所述青稞、所述干粪草、所述石膏粉和所述生石灰的质量（干重）配比为85：12：2：1；所述水在所述原种培养基和所述载体种培养基中的质量百分含量均为65%。
其中，所述干粪草按照如下方法制备获得：将水、牛粪、秸秆按照质量配比为6：2：1的比例混合后，堆制发酵10天，期间每隔3天翻堆一次，外料内翻，上料下翻，翻堆3次，然后晒干粉碎过筛（筛孔径0.5cm×0.5cm），即得到所述干粪草。其中，牛粪和秸秆的质量按照干重计算。
进一步，所述栽培料可由如下栽培原料经二次发酵后得到：所述栽培原料由秸秆（如小麦秸秆和/或青稞秸秆）、动物粪便（如干牛粪和/或鸡粪）、过磷酸钙、碳酸氢铵、石膏粉、尿素和生石灰混合而成，pH7.5）、动物；所述秸秆、所述动物粪便、所述过磷酸钙、所述碳酸氢铵、所述石膏粉、所述尿素和所述生石灰的质量（干重）配比为60：35：1：0.5：2：0.5：2。
在本发明中，所述栽培原料具体为如下（a1）–（a5）中任一种：
（a1）栽培原料1：由小麦秸秆、干牛粪、过磷酸钙、碳酸氢铵、石膏粉、尿素和生石灰混合而成，pH7.5–8.0；所述小麦秸秆、所述干牛粪、所述过磷酸钙、所述碳酸氢铵、所述石膏粉、所述尿素和所述生石灰的质量（干重）配比为60：35：1：0.5：2：0.5：2；
（a2）栽培原料2：由小麦秸秆、青稞秸秆、干牛粪、过磷酸钙、碳酸氢铵、石膏粉、尿素和生石灰混合而成，pH7.5–8.0；所述小麦秸秆、所述青稞秸秆、所述干牛粪、所述过磷酸钙、所述碳酸氢铵、所述石膏粉、所述尿素和所述生石灰的质量（干重）配比为30：30：35：1：0.5：2：0.5：2；
（a3）栽培原料3：由小麦秸秆、青稞秸秆、干牛粪、鸡粪、过磷酸钙、碳酸氢铵、石膏粉、尿素和生石灰混合而成，pH7.5–8.0；所述小麦秸秆、所述青稞秸秆、所述干牛粪、所述鸡粪、所述过磷酸钙、所述碳酸氢铵、所述石膏粉、所述尿素和所述生石灰的质量（干重）配比为30：30：15：20：1：0.5：2：0.5：2；
（a4）栽培原料4：由小麦秸秆、青稞秸秆、干牛粪、鸡粪、过磷酸钙、碳酸氢铵、石膏粉、尿素和生石灰混合而成，pH7.5–8.0；所述小麦秸秆、所述青稞秸秆、所述干牛粪、所述鸡粪、所述过磷酸钙、所述碳酸氢铵、所述石膏粉、所述尿素和所述生石灰的质量（干重）配比为30：30：25：10：1：0.5：2：0.5：2；
（a5）栽培原料5：由小麦秸秆、青稞秸秆、鸡粪、过磷酸钙、碳酸氢铵、石膏粉、尿素和生石灰混合而成，pH7.5–8.0；所述小麦秸秆、所述青稞秸秆、所述鸡粪、所述过磷酸钙、所述碳酸氢铵、所述石膏粉、所述尿素和所述生石灰的质量（干重）配比为30：30：35：1：0.5：2：0.5：2。
在本发明中，所述二次发酵分为前发酵和后发酵。所述前发酵为：向所述栽培原料加水至水分质量含量为65%–70%，堆制发酵，监测堆体温度，只要堆体温度达到70℃以上后开始下降时进行一次翻堆，经过3–4次翻堆后，完成所述前发酵。所述后发酵为：将经过所述前发酵的栽培料进行再次发酵，将堆体温度人工升至60℃并保持10h，然后将堆体温度人工降至50℃保持3–4d，自然降温一天后，再将堆体温度人工降至常温（25℃），完成所述后发酵，所述二次发酵即告结束。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述前发酵是将所述栽培原料用水进行预湿（至其含水量约为68%）、混匀后，堆制发酵，建堆规格为高1.0–1.2m，宽1.8–2.2m，在堆体长度方向每隔1m左右在堆体垂直插入直径10cm木杆造通气孔,监测堆体温度，只要堆体温度达到70℃以上开始下降时就进行一次翻堆，翻堆4次后，完成所述前发酵。所述后发酵是将经过前发酵的培养料进行再次发酵，采用人工通蒸汽辅助升温使发酵的料温达到60℃左右并保持10h左右，再通过调节通入蒸汽量，使菇房中层温度在50℃左右保持3–4d（可根据培养料一次发酵腐熟程度灵活掌握），即可停火自然降温一天后，适当通风使菇房内温度降至40℃，之后打开全部风口通风，降至常温进行培养料整床，二次发酵即告结束。经过所述二次发酵的栽培原料应无氨味，无粪臭味，可以看到料面明显的白色放线菌层。
进一步，将经过所述二次发酵的栽培原料的含水量要调整到65%（质量分数），pH值调整到7.0–7.5，即得到所述栽培料。
在所述方法中，栽培方式具体可为层架栽培。
所述层架栽培为：层架规格为3–5层，层高0.6m，宽1.5m，底层距离地面0.3m（长度依据需要而定）；所述栽培料平铺于每层床架进行栽培出菇。
所述子实体在食品加工中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的所述西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）是采自中国西藏林芝地区的野生菌株经过人工驯化后得到的。实验证明，所述西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）子实体的蛋白质含量和粗纤维含量都较高，而碳水化合物含量略低。该菌株菌盖主色为淡褐色，菌种播种后萌发较快，从接种到原基发生的时间相对较短。本发明开发了双孢蘑菇新品种，对于保护该物种的种质资源、调整双孢蘑菇品种结构、丰富我国野生双孢蘑菇种质资源库、推进双孢蘑菇菌种的选育和改良等具有重要意义。
保藏说明
建议分类命名：双孢蘑菇
拉丁名：（Agaricus bisporus）
参椐的生物材料：2094
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2013年10月14日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8308
附图说明
图1为西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）菌株试管菌种（母种）。
图2为西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）在麸皮浸汁培养基（左边）和粪草浸汁培养基（右边）平板培养7天后菌丝的生长状况。
图3为西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）菌株的栽培种（709为原始采集编号）。
图4为西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）菌株播种15天后2094菌株的发菌情况。
图5为西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）菌株子实体出菇。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
双孢蘑菇As2796：在本发明中作为西藏浅棕色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8307）的对照品种。As2796为国内广泛栽培的双孢蘑菇杂交种，由福建省轻工业研究所（现为福建省农业科学院食用菌研究所）以荷兰的菌株02和来自法国的菌株8213作亲本，通过杂交筛选而获得的品种。现今，As2796在我国已大面积推广，成为我国栽培量最大的双孢蘑菇品种（王泽生，蘑菇杂交株As2796的种性与栽培技术要点。食用菌，1993.5:8；王泽生，曾伟，双孢蘑菇杂交菌株As2796家系的分子遗传研究。菌物系统，2001.20(2):233–237）。
实施例1、西藏淡褐色双孢蘑菇2094的获得及分类鉴定
本发明菌株（记作2094）是从西藏自治区林芝采集到野生双孢蘑菇新鲜标本，经组织分离、培养和驯化而成。通过对其子实体及菌丝体形态特征的观察，结合细胞核rDNA-ITS测序，对该菌株进行分类鉴定。
一、形态学特性
1、菌丝体形态特性
本发明菌株2094的菌丝浓密旺盛，前期洁白，培养一段时间略带浅褐色。如图1、图2所示。
2、子实体形态特性
本发明菌株2094的子实体形态如图5所示。子实体大小中等，菌盖宽4–8cm，初半球形，后逐渐平展，淡褐色，菌盖边缘均匀分布0.1–0.2cm细小近白色鳞片。菌肉白色，厚，伤后略变淡红色，具蘑菇特有的气味。菌褶粉红色，后变褐色至黑褐色，密，窄，离生，不等长。菌柄长2.5–4cm，粗1.5–3.5cm，白色，光滑，具丝光，近圆柱形，内部松软或中实。菌环单层，白色，膜质，生菌柄中部，易脱落。孢子印深褐色。孢子褐色，椭圆形，光滑。
通过上述形态学鉴定，将本发明菌株2094初步判断为蘑菇属（Agaricus）的物种。
二、分子生物学特性
rDNA-ITS序列作为条形码（Schoch,C.L.et al.Nuclear ribosomal internaltranscribed spacer(ITS)region as a universal DNA barcode marker for Fungi.Proceedingsof the National Academy of Sciences,2012.109:6241–6246），广泛用于真菌物种鉴定。本发明对采集的野生双孢蘑菇子实体，分离得到的本发明菌株2094及其栽培形成的子实体进行DNA提取和rDNA-ITS扩增测序，其测序结果表明三者具有相同的rDNA-ITS序列，如序列表中序列1所示。该序列与GenBank中经过研究定名为双孢蘑菇（Agaricus bisporus）的rDNA-ITS序列，如AF465403（Callac,P.et al.A novelhomothallic variety of Agaricus bisporus comprises rare tetrasporic isolates from Europe.Mycologia,2003.95:222–231.）、AF432886（Challen,M.P.et al.A phylogeneticreconstruction and emendation of Agaricus section Duploannulatae.Mycologia,2003.95:61–73.）和JN234841、JN234843（Avin,F.A.et al.Molecular classification and phylogeneticrelationships of selected edible Basidiomycetes species.Molecular biology reports,2012.39:7355-7364.）进行比对分析，仅有一个碱基的差异，其同源相似性接近100%。
鉴于上述形态特征及rDNA-ITS序列的分类鉴定研究，确定本发明菌株2094为双孢蘑菇（Agaricus bisporus），隶属于担子菌门（Basidiomycota）、蘑菇纲（Agaricomycetes）、蘑菇目（Agaricales）、蘑菇科（Agaricaceae）、蘑菇属（Agaricus）。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.8308。
实施例2、西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）子实体的人工栽培
一、栽培流程
西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的栽培流程具体如下：母种制备→原种制备→栽培种制备→接种及发菌→覆土→出菇管理→出菇→采收。
（1）母种的制备：将组织分离得到的西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的稀疏菌丝，接种到母种培养基上，其接种量为每20cm2表面积的母种培养基中接入0.2cm×0.2cm面积大小的菌丝，一定温度下避光培养，培养至菌丝长满培养基，得到的菌丝体作为母种。
（2）原种的制备：将步骤（1）所得的母种转接到原种培养基上，其接种量为每500mL体积的原种培养基中均匀接入3–5个0.5cm×0.5cm面积大小的母种的菌种块，一定温度下避光培养，空气相对湿度为60%–70%，培养至菌丝长满培养基，得到原种。
（3）栽培种的制备：将步骤（2）所得的原种转接到栽培种培养基上，其接种量为菌种与培养基体积比1:100，一定温度下避光培养，空气相对湿度为60%–70%，培养至菌丝长满培养基，得到栽培种。
（4）接种及发菌：将步骤（3）所得的栽培种接入栽培料，其接入比例为每平米栽培面积的所述栽培料接入700–1000mL所述栽培种，一定温度下避光培养，空气相对湿度为65%–75%。
（5）覆土：步骤（4）培养的菌丝长至所述栽培料厚度的3/4时，向所述栽培料上覆盖一层厚度为3–3.5cm的土壤–麦壳混合物，一定温度下避光培养，空气相对湿度为70%–75%，每天通风1次使空气中二氧化碳相对浓度0.1%–0.5%（体积分数）；
所述土壤–麦壳混合物按照1m3土壤（生黄土或菜园土）掺入25kg麦壳（新鲜无霉变的麦壳）的量混合而成；所述土壤–麦壳混合物的pH为8–8.5，湿度为40%–50%（即土壤–麦壳混合物中水分的质量分数为40–50%）。
（6）出菇管理：步骤（5）培养的菌丝生长到土层表面时，补一层细土，开始降温，维持昼夜6–10℃的温差刺激（白天温度为18–25℃，夜晚温度为10–15℃），以及光照强度为500–800Lux、的弱光刺激，空气相对湿度为85%–95%，每天通风2–3次使二氧化碳相对浓度下降至0.05%–0.15%（体积分数），培养3–5天。
（7）出菇：发现大量蘑菇原基后，转移至环境温度为12℃–20℃，空气相对湿度为75%–90%，二氧化碳相对浓度为0.05%–0.15%（体积分数）的条件下培养。
（8）采收：待子实体长至八成熟，菌盖尚未完全展开，即可采收第一潮菇。采摘后进行清理残留菇根、补土菇穴，待菌丝恢复后重新上述操作进行出菇，采收下一潮菇。
二、条件优化
本发明的发明人分别对栽培过程中的如下因素进行了优化：培养温度、母种培养基、原种培养基、栽培种平培养基和栽培料。
1、培养温度的确定
将组织分离得到的西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的稀疏菌丝，通过打孔的方式，按照直径为0.5cm的接种块量，接种于PDA培养基（配方见下文）上，放在不同的温度（22℃、24℃、26℃、28℃）下避光培养，培养过程中测定菌丝的生长速度，并观察菌丝的生长情况。
其中，菌丝平均生长速度测定：培养2–3d后，记录菌丝位置（A），3–5d后记录菌丝位置（B），用直尺测量A与B之间的距离，除以两位置之间的天数即为菌丝的日平均生长速度。
实验重复三次，定量数据结果取平均值。
结果如表1所示，可见西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）在24℃条件下，菌丝生长速度较快，菌丝较粗壮。
表1不同温度下菌丝生长速度的测定结果（单位：cm/d）
| 温度 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 |
| 22℃ | 0.120 | 0.130 | 0.128 | 0.126±0.005b |
| 24℃ | 0.158 | 0.145 | 0.150 | 0.151±0.007a |
| 26℃ | 0.148 | 0.152 | 0.141 | 0.147±0.006a |
| 28℃ | 0.111 | 0.131 | 0.118 | 0.120±0.010b |
注：同一栏内相同的字母表示多重检验没有显著性差异（P=0.05）。
2、母种培养基的确定
将西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）菌种通过打孔的方式，直径为0.5cm的接种块量，接种于不同的母种培养基（配方见下文）上，放在24℃恒温培养箱中避光连续培养，培养过程中测定菌落直径，计算菌丝生长速度。其中菌丝生长速度的测定方法同步骤一。
供试的母种培养基为如下四种：
第一种：麸皮浸汁培养基
原料：麸皮（小麦外皮）（干重）100g，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，水1000mL。
配制方法：将麸皮100g放入900mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，加热使之完全溶化，再加水补足至1000mL，pH7.5–8.0，灭菌30min。
第二种：粪草浸汁培养基
原料：干粪草100g，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，水1000mL。其中，所述干粪草按照如下方法制备获得：将水、牛粪、秸秆按照质量配比为6：2：1的比例混合后，堆制发酵10天，期间每隔3天翻堆一次，外料内翻，上料下翻，翻堆3次，然后晒干粉碎过筛（筛孔径0.5cm×0.5cm），即得到所述干粪草。其中，牛粪和秸秆的质量按照干重计算。
配制方法：将干粪草100g放入900mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，加热使之完全溶化，再加水补足至1000mL，pH7.5–8.0，灭菌30min。
第三种：PDA综合培养基
原料：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，水1000mL。
配制方法：将马铃薯200g放入900mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，加热使之完全溶化，再加水补足至1000mL，pH7.5–8.0，灭菌30min。
第四种：加富PDA培养基
原料：马铃薯150g，麸皮50g，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，水1000mL。
配制方法：将马铃薯150g、麸皮50g放入1000mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，加热使之完全溶化，再加水补足至1000mL，pH7.5–8.0，灭菌30min。
实验重复三次，定量数据结果取平均值。
结果显示，西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）在加富PDA培养基中，生长旺盛，菌丝萌发和生长速度较快，表现出较好的生长状况。菌丝生长速度的测定结果如表2所示。图2为西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）在麸皮浸汁培养基（左边）和粪草浸汁培养基（右边）平板培养7天后菌丝的生长状况。
表2不同母种培养基中菌丝生长速度的测定结果（单位：cm/d）
| 母种培养基 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 |
| 麸皮浸汁培养基 | 0.236 | 0.214 | 0.231 | 0.227±0.012a |
| 粪草浸汁培养基 | 0.222 | 0.217 | 0.206 | 0.215±0.008a |
| PDA综合培养基 | 0.152 | 0.141 | 0.157 | 0.150±0.008b |
| 加富PDA培养基 | 0.235 | 0.221 | 0.237 | 0.231±0.009a |
注：同一栏内相同的字母表示多重检验没有显著性差异（P=0.05）。
3、原种培养基和栽培培养基的确定
（1）原种培养基的确定
将相同条件下培养的同一批次的西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的母种，按照4个直径0.5cm的接种块的接种量，接种于装有不同原种培养基（配方见下文）500mL培养瓶中，放在24℃恒温培养箱中避光连续培养，空气相对湿度为60%–70%，观察统计菌丝萌发时间以及菌丝长满瓶时间。
供试的原种培养基为如下六种：
配方1：麦粒85份，发酵干粪草12份，石膏粉2份、生石灰1份；
配方2：青稞85份，发酵后的干粪草12份，石膏粉2份、生石灰1份；
配方3：麦粒97份，石膏粉2份、生石灰1份；
配方4：发酵干粪草97份，石膏粉2份、生石灰1份；
配方5：麦粒85份，棉籽壳12份，石膏粉2份、生石灰1份；
配方6：棉籽壳97份，石膏粉2份、生石灰1份。
以上六个配方中各物质的份数均为重量份数（干重）。在以上各配方的基础上加水调湿至水分质量份数为65%，即得到供试的六种原种培养基。
其中，所述发酵干粪草按照如下方法制备获得：将水、牛粪、秸秆按照质量配比为6：2：1的比例混合后，堆制发酵10天，期间每隔3天翻堆一次，外料内翻，上料下翻，翻堆3次，然后晒干粉碎过筛（筛孔径0.5cm×0.5cm），即得到所述干粪草。其中，牛粪和秸秆的质量按照干重计算。
生石灰和石膏粉为青海省互助昆仑石膏矿产制品厂生产。
实验重复三次，定量数据结果取平均值。
结果显示，西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）在配方1和配方2对应的原种培养基（命名为麦粒粪草培养基和青稞粪草培养基）中，萌发时间较早（表3）、菌丝生长速度较快、菌丝粗壮、生长状况较好。而在配方6全棉籽壳培养基上菌丝生长速度较慢。菌丝萌发时间及满瓶时间的测定结果如表3所示。
表3不同原种培养基中菌丝萌发时间及满瓶时间测定结果
| 原种培养基 | 萌发时间（单位：h） | 满瓶时间（单位：d） |
| 配方1 | 20 | 28 |
| 配方2 | 20 | 28 |
| 配方3 | 24 | 30 |
| 配方4 | 30 | 32 |
| 配方5 | 24 | 30 |
| 配方6 | 48 | 60 |
（2）栽培种培养基的确定
将相同条件下培养的同一批次的西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的原种，按照10g/袋的接种量，接种于装有不同栽培种培养基（配方见下文）的聚丙烯高温培养袋（规格为14cm×28cm×0.005cm）中，放在24℃恒温培养箱中避光连续培养，空气相对湿度为60%–70%，测定菌丝萌发时间及满袋时间，并记录生长状况。
供试的栽培种培养基与步骤1中供试的原种培养基相同。
实验重复三次，定量数据结果取平均值。结果显示，西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）在配方2对应的栽培种培养基（命名为青稞粪草培养基）中，萌发时间早、菌丝生长速度快、菌丝粗壮、生长状况较好（图3）。而在配方5对应的麦粒棉籽壳培养基上菌丝生长状况较差。在配方6全棉籽壳培养基上菌丝基本未生长。菌丝生长速度的测定结果如表4所示。
表4不同栽培种培养基中菌丝萌发时间及满瓶时间测定结果
| 栽培种培养基 | 萌发时间（单位：h） | 满瓶时间（单位：d） |
| 配方1 | 12 | 21 |
| 配方2 | 10 | 20 |
| 配方3 | 16 | 22 |
| 配方4 | 20 | 24 |
| 配方5 | 16 | 22 |
| 配方6 | 28 | 30 |
4、栽培料的确定
将相同条件下培养的同一批次的西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的栽培种，接种于不同栽培料（配方见下文），接种比例为每平米栽培料接入800mL的栽培种，于22–26℃避光连续培养，空气相对湿度为65%–75%，测定子实体单产量和生物学效率。
所述子实体单产量是指平均每平米栽培面积上所采收新鲜子实体的总重量，常用单位：Kg/m2。生物学效率是指食用菌鲜重与所用的培养料干重（栽培原料）之比，常用百分数表示，如100kg干培养料生产了80kg新鲜食用菌，则这种食用菌的生物学效率为80%。
供试的栽培料为五种：五种不同配方的栽培原料经过二次发酵后得到五种栽培料。
五种不同配方的栽培原料如下：
配方1：小麦秸秆60份，干牛粪35份，过磷酸钙1份，碳酸氢铵0.5份，石膏粉2份，尿素0.5份，生石灰2份，调节pH7.5–8.0；
配方2：小麦秸秆30份，青稞秸秆30份，干牛粪35份，过磷酸钙1份，碳酸氢铵0.5份，石膏粉2份，尿素0.5份，生石灰2份，调节pH7.5–8.0；
配方3：小麦秸秆30份，青稞秸秆30份，干牛粪15份，鸡粪20份，过磷酸钙1份，碳酸氢铵0.5份，石膏粉2份，尿素0.5份，生石灰2份，调节pH7.5–8.0；
配方4：小麦秸秆30份，青稞秸秆30份，干牛粪25份，鸡粪10份，过磷酸钙1份，碳酸氢铵0.5份，石膏粉2份，尿素0.5份，生石灰2份，调节pH7.5–8.0；
配方5：小麦秸秆30份，青稞秸秆30份，鸡粪35份，过磷酸钙1份，碳酸氢铵0.5份，石膏粉2份，尿素0.5份，生石灰2份，调节pH7.5–8.0。
以上五种不同配方的栽培原料中各物质的份数均为重量份数（干重）。其中，小麦秸秆和青稞秸秆长度20–40cm为宜；过磷酸钙、碳酸氢铵和尿素为甘肃金昌化工(集团)有限责任公司产品；石膏粉和生石灰为甘肃省景泰县石膏粉厂产品。
将以上五种栽培原料经过二次发酵从而获得五种对应的栽培料。具体如下：
所述二次发酵分为前发酵和后发酵两个阶段。所述前发酵是将所述栽培原料用水进行预湿（至其含水量约为68%）、混匀后，堆制发酵，建堆规格为高1.0–1.2m，宽1.8–2.2m，在堆体长度方向每隔1m左右在堆体垂直插入直径10cm木杆造通气孔,监测堆体温度，只要堆体温度达到70℃以上开始下降时就进行一次翻堆，翻堆4次后，完成所述前发酵。所述后发酵是将经过前发酵的培养料进行再次发酵，采用人工通蒸汽辅助升温使发酵的料温达到60℃左右并保持10h左右，再通过调节通入蒸汽量，使菇房中层温度在50℃左右保持3–4d（可根据培养料一次发酵腐熟程度灵活掌握），即可停火自然降温一天后，适当通风使菇房内温度降至40℃，之后打开全部风口通风，降至常温进行培养料整床，二次发酵即告结束。经过所述二次发酵的栽培原料应无氨味，无粪臭味，可以看到料面明显的白色放线菌层。
进一步，将经过所述二次发酵的栽培原料的含水量要调整到65%（质量分数），pH值调整到7.0–7.5，即得到所述栽培料。
依据实例2所述的栽培流程将西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）接种于不同栽培料，然后进行发菌、覆土、出菇及采收，最后计算子实体单产量和生物学效率。栽培方式为床栽具体如下：床架为1层，距离地面0.3m，宽1.5m，长度5m。培养料平铺于床面进行播种出菇。
实验重复三次，定量数据结果取平均值。
结果显示，五种栽培料均能获得较高的生物学效率和子实体单产量，配方3对应的栽培料稍好于其他几个配方。具体结果详见表5。另外，将西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）接种于栽培料（配方3）15天后，菌丝的吃料情况如图4所示，出菇阶段子实体照片如图5所示。
表5不同栽培料的出菇情况
| 栽培料 | 平均单产量（Kg/m2） | 生物学效率（%） |
| 配方1 | 9.2±0.1c | 30.7±0.4c |
| 配方2 | 9.3±0.2c | 30.8±0.8c |
| 配方3 | 11.2±0.5a | 37.4±1.6a |
| 配方4 | 10.4±0.1b | 34.8±0.3b |
| 配方5 | 8.7±0.1d | 29.0±0.3d |
注：同一栏内相同的字母表示多重检验没有显著性差异（P=0.05）。
综合以上结果，优化后各条件如下：培养温度为24℃；母种培养基为加富PDA培养基；原种培养基和栽培培养基均为青稞粪草培养基；栽培料为实施例2步骤二4中配方3对应的栽培料。
实施例3、西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）与现有As2796的比较分析
本实施例从菌株基本性状，子实体营养成分、子实体乙醇提取物的抗氧化能力三个方面，对本发明所提供的西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）和现有的栽培种双孢蘑菇（Agaricus bisporus）As2796进行了比较分析。
采用实施例2步骤二中优化后条件，参照实施例2步骤一中所述的栽培流程，同时分别栽培西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）与现有双孢蘑菇（Agaricusbisporus）As2796。对两菌株的基本性状（所涉及的指标详见表6）、子实体营养成分（所涉及的指标详见表7），以及子实体乙醇提取物的抗氧化能力进行测定。
其中，菌株基本性状的测定参照国际植物新品种保护联盟（UPOV）指南TG/259/1（Guidelines for the conduct of tests for distinctness,uniformity and stability—Agaricusmushroom）的标准进行对比。
子实体营养成分的测定具体如下：从栽培得到的两种菌的子实体中随机取样，委托谱尼测试公司（Pony Testing International Group）进行主要营养成分的测定。蛋白质的测定依据GB5009.5–2010的方法；脂肪的测定依据GB/T5009.6–2003的方法；粗纤维的测定依据GB/T5009.10–2003的方法；灰分的测定依据GB5009.4–2010的方法；碳水化合物等的测定依据保健食品检验与评价技术规范2003年版的方法进行测定。
子实体乙醇提取物的抗氧化能力的测定具体如下：
样品提取物制备：将新鲜的双孢蘑菇子实体55℃烘干至恒重，然后粉碎过60目筛，得到双孢蘑菇子实体干粉，放于密封的瓶中保存备用。然后准确称取不同双孢蘑菇样品（子实体干粉）4g，分别加入100mL80％（体积分数）的乙醇提取剂，在室温（25℃左右）130rpm的摇床上提取24h，用滤纸过滤取滤液，滤渣再用对应的溶液进行复提，然后合并两次滤液；滤渣进行烘干称重，滤液在40℃下旋转蒸发浓缩得浓缩液，用对应的溶液用80％（体积分数）的乙醇稀释定容待测。提取物浓度=子实体干粉重量/提取溶剂体积。
还原能力采用铁氰化钾还原法进行测定。具体如下：1.0mL不同样品提取物的溶液（浓度为2.5mg/mL或5.0mg/mL）和2.5mL的磷酸缓冲液（50mM，pH7.0）和2.5mL浓度为1g/100ml的铁氰化钾水溶液混合，然后在50℃下保温20min。迅速冷却后再加入2.5mL三氯乙酸（溶剂为水，体积分数10%），3000rpm离心10min。最后，吸取1.25mL上清液和1.25mL蒸馏水和0.25mLFeCl3（0.1%，w/v）混合均匀，静置10min。在700nm下测OD。吸光度值越大表明还原力越强。
DPPH自由基的清除测定。具体如下：200μl不同样品提取物的溶液（浓度为2.5mg/mL或5.0mg/mL）加入3.8mL的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（溶剂为无水乙醇，浓度为0.01mM/L），充分摇匀后在室温下避光放置24h，在517nm处测吸光值。对照用提取溶剂代替样品液。
DPPH清除能力（%）=[1－(A1－A2)/A0]×100，其中，A0为对照的吸光值（样品溶剂+DPPH）；A1为样品的吸光值（不同样品+DPPH）；A2为空白的吸光度（不同样品+DPPH溶剂）。
Vc作为抗氧化剂对照。
结果显示，同现有优质栽培品种As2796相比，西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCCNo.8308）品种的特点是：菌丝生长较快，菌株转接10天左右菌落会有一定色素产生，培养基会逐渐变为浅褐色；子实体菇柄近白色，菌盖主色淡褐色，仅有周边分布着极小的近白色鳞片，菌盖纵切面呈近圆形；菌柄性状为上粗下细，长度较短，一般菌盖直径与菌柄直径的比值基于3/1–4/1（详见表6）。子实体主要营养成分的测定结果显示：西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）子实体中，蛋白质50.1%、脂肪2.76%、粗纤维6.8%、灰分7.8%、碳水化合物29.7%、粗多糖（以葡聚糖计）0.61mg/g。与同条件栽培的双孢蘑菇As2796菌株子实体相比较，蛋白质含量和粗纤维含量都较高（详见表7），而且子实体乙醇提取物的抗氧化能力（还原能力和DPPH清除能力）也显著高于双孢蘑菇As2796（表8）。
实验重复三次，定量数据结果取平均值。
表6不同品种双孢蘑菇基本性状比较
表7不同品种双孢蘑菇子实体主要营养成分的比较
| 指标 | 不同菌株 |
| As2796 | 2094 | |
| 蛋白质 | 48.9% | 50.1% |
| 脂肪 | 2.5% | 2.76% |
| 粗纤维 | 5.7% | 6.8% |
| 灰分 | 7.6% | 7.8% |
| 碳水化合物 | 32.4% | 29.7% |
注：表中%均表示质量百分含量。
表8不同品种双孢蘑菇子实体乙醇提取物的抗氧化能力
另外，本发明的发明人还对西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的子实体进行了毒理测定，并进行了风味评价。如下：
A.毒理测定
毒理测定采用生、熟子实体喂食小鼠、鸡、鸭等动物，初步判断无毒可食用。
B.风味
西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）子实体鲜菇清香，菇柄菇盖均可食用，爆炒煮熟后菇柄脆嫩、菇盖爽滑，烘干后具有一定香味，煲汤味道鲜美。
本发明所提供的西藏淡褐色双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）的子实体可以直接鲜销，不易褐变，菇品淡褐色，卖相较好，口感上乘；也可加工成罐头或烘干远销外地。该菌还可以作为与其他双孢蘑菇品种杂交的一种优质的种质资源。
Claims (9)
1.双孢蘑菇2094，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8308。
2.权利要求1所述双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）在作为亲本进行杂交育种中的应用。
3.栽培权利要求1所述双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）得到的子实体。
4.培养权利要求1所述双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）得到的菌丝体。
5.权利要求3所述子实体的栽培方法，包括如下步骤：
（1）母种制备：将权利要求1所述双孢蘑菇2094（CGMCC No.8308）接种到母种培养基上，22℃–28℃避光培养，培养至菌丝长满培养基，得到的菌丝体作为母种；
（2）原种制备：将步骤（1）所得的母种转接到原种培养基上，22℃–28℃避光培养，空气相对湿度为60%–70%，培养至菌丝长满培养基，得到原种；
（3）栽培种制备：将步骤（2）所得的原种转接到栽培种培养基上，22℃–28℃避光培养，空气相对湿度为60%–70%，培养至菌丝长满培养基，得到栽培种；
（4）接种及发菌：将步骤（3）所得的栽培种接入栽培料，22℃–28℃避光培养，空气相对湿度为65%–75%；
（5）覆土：步骤（4）培养的菌丝长至所述栽培料厚度的3/4时，开始在所述栽培料的料面上覆土，22℃–26℃避光培养，空气相对湿度为70%–75%；
（6）出菇管理：步骤（5）的菌丝生长到土层表面时，转移至昼夜温差为6–10℃，光照强度为200–1000Lux，空气相对湿度为85%–95%的条件下培养3–5天；
（7）出菇：转移至环境温度为12℃–20℃，空气相对湿度为75%–90%，空气中二氧化碳相对浓度为0.05%–0.15%的条件下培养得到子实体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述母种培养基为加富PDA培养基、麸皮浸汁培养基或粪草浸汁培养基；
每升所述加富PDA培养基按照如下方法配制得到：将马铃薯150g、麸皮50g放入1000mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、蔗糖或葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，再加水补足至1000mL，获得1L所述加富PDA培养基；
每升所述麸皮浸汁培养基按照如下方法配制得到：将麸皮100g放入900mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、蔗糖或葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，再加水补足至1000mL，获得1L所述麸皮浸汁培养基；
每升所述粪草浸汁培养基按照如下方法配制得到：将干粪草100g放入900mL水中煮沸10min，取滤液加入琼脂20g、蔗糖或葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B110mg，再加水补足至1000mL，获得1L所述麸皮浸汁培养基。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述原种培养基和所述栽培种培养基均由青稞、干粪草、石膏粉、生石灰和水混合而成；所述青稞、所述干粪草、所述石膏粉和所述生石灰的质量配比为85：12：2：1；所述水在所述原种培养基和所述栽培种培养基中的质量百分含量均为65%。
8.根据权利要求5–7中任一所述的方法，其特征在于：所述栽培料由栽培原料经二次发酵后得到；所述栽培原料由秸秆、动物粪便、过磷酸钙、碳酸氢铵、石膏粉、尿素和生石灰混合而成；所述秸秆、所述动物粪便、所述过磷酸钙、所述碳酸氢铵、所述石膏粉、所述尿素和所述生石灰的质量配比为60：35：1：0.5：2：0.5：2。
9.权利要求3所述子实体在食品加工中的应用。
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