CN107586725B - 一种冬虫夏草液体培养基及利用培养基培养冬虫夏草的方法 - Google Patents
一种冬虫夏草液体培养基及利用培养基培养冬虫夏草的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，公开了一种冬虫夏草液体培养基，其按照如下工艺制备而得：取纤维状物质50‑60g，酒糟水解物50‑60g，土豆浸出液70‑80g，葡萄糖30‑40g，硫酸镁2克、链霉素1克、青霉素1克、维生素B1 0.01g，添加到容器中，然后加水定容至1L，调节pH为6.5‑6.8，高压锅内灭菌，温度达到121℃时保压15min，出锅，冷却至室温，即得。本发明还公开了利用上述的液体培养基培养冬虫夏草的方法。本发明培养基配伍合理，成本低廉，栽培的产品质量大大提高。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体的说是涉及一种冬虫夏草液体培养基及利用培养基培养冬虫夏草的方法。
背景技术
冬虫夏草是冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上长出的子座（子实体）及幼虫虫体的复合体，属于可食用的真菌，是我国一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。
蝙蝠蛾幼虫被冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)感染，菌丝充满整个虫体组织，结成坚硬的假菌核，在冬季低温干燥土壤内保持虫形不变达数月之久（冬虫），待夏季温湿适宜时从菌核长出棒状子实体（子座）并露出地面（夏草），因此得名冬虫夏草。野生的冬虫夏草仅生长在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年来过度采挖使其产量下降，其价格与20多年前相比已经上涨了1000多倍。因此，我国科研人员一直在进行利用冬虫夏草菌的无性型人工发酵菌丝和培植子实体来替代野生冬虫夏草的产业化研究（即模拟虫体营养成分做成培养基接种冬虫夏草菌的无性型-中国被毛孢菌丝，形成有性型-子实体），力图让昂贵的冬虫夏草能够走进寻常百姓家。
目前国内许多个人和单位研究和公开冬虫夏草培养基和发酵生产方法，但是，这些技术多采用微生物发酵常用培养基，基本上以蛋、奶、马铃薯作为发酵食源，虽然都是按照微生物学的发酵原理使菌种能够生长，但食源的不同必然造成菌丝体的性质有所差异，而且培养基成本较高，所生产的冬虫夏草发酵产品在化学成分和活性物质与天然冬虫夏草有差异，因而现有技术中培育出的冬虫夏草普遍存在质量差，营养成分含量较低的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种冬虫夏草液体培养基及利用培养基培养冬虫夏草的方法。
本发明解决该技术问题的技术方案是：
一种冬虫夏草液体培养基，其按照如下工艺制备而得：
取纤维状物质50-60g，酒糟水解物50-60g，土豆浸出液70-80g，葡萄糖30-40g，硫酸镁2克、链霉素1克、青霉素1克、维生素B1 0.01g，添加到容器中，然后加水定容至1L，调节pH为6.5-6.8，高压锅内灭菌，温度达到121℃时保压15min，出锅，冷却至室温，即得。
具体地，所述纤维状物质的制备方法包括如下步骤：
将锯末和秸秆粉混合，然后放入浓度为2-3mol/L的NaOH溶液中浸泡3-5h，捞出丝状纤维，放清水中高速搅拌漂洗2-3遍，然后置于60-70℃烘干，得到纤维状物质。
具体地，所述酒糟水解物的制备方法包括如下步骤：将酒糟投入到反应器中，然后添加两倍重量的浓度为5mol/L的盐酸，300rpm搅拌水解2小时，然后添加氨水，调节溶液的pH为6.5-7.0，即得酒糟水解物。
具体地，所述土豆浸出液的制备方法包括如下步骤：将土豆去皮，切成块状，然后添加到两倍重量的蒸馏水中，煮沸30min，自然冷却，然后用纱布过滤，收集滤液，即得土豆浸出液。
本发明还公开了利用上述液体培养基培养冬虫夏草的方法，包括如下步骤：
第一步：冬虫夏草一级母种斜面培养；
第二步：冬虫夏草一级母种斜面的扩大培养获得冬虫夏草二级母种；
第三步：冬虫夏草液体菌种的培养： 将冬虫夏草二级母种转接到所述液体培养基中，接种后放到恒温箱里在25℃，恒温培养3天，然后转移到磁力搅拌机上在25℃振荡培养20天，得冬虫夏草液体菌种；
第四步：冬虫夏草的栽培。
进一步地，
所述方法包括如下步骤：
第一步、冬虫夏草一级母种斜面培养：
(1)、培养基配方： 玉米200克、小麦200克、磷酸二氢钾4克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、蛋白胨20克、链霉素1克、青霉素1克，琼脂20克、维生素B1 0.01g、水1000毫升；
(2)、配制方法： 将洗净玉米、小麦，加水1000毫升，大火烧开小火煮沸40分钟，用纱布滤去玉米跟小麦的残渣，取汁液于锅中加入磷酸二氢钾4克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、蛋白胨20克、链霉素1克、青霉素1克，琼脂20克、维生素B1 0.01g并搅拌均匀，继续加热至琼脂完全溶化，趁热迅速分装试管，试管规格采用16厘米长×口径16毫米，每个试管装培养基的量与试管的体积比是1：5，装完后塞上硅胶塞，然后把试管每10支扎成一捆，用报纸包好，外层用聚丙烯塑料布包好放入高压锅灭菌，加热到压力达到0.5Kg/m2时，开排气阀，排出冷空气，使指针回到0点，然后关上排气阀继续加热至121℃时保压40分钟出锅，并趁热把试管摆成斜面，冷却后得固体试管斜面备用；
(3)、菌种分离培养： 将新鲜健壮子座饱满含有孢子粉的青海玉树野生冬虫夏草清洗后用70%乙醇溶液对其进行消毒处理，再用无菌水清除其表面的乙醇，冬虫夏草表面消毒处理后，用无菌刀片切去冬虫夏草子座的外层，用接种刀切取其内部组织1立方毫米的小块迅速移接到试管斜面上，并迅速塞上硅胶塞，然后放入25℃的恒温箱中培养12天即得冬虫夏草一级母种斜面；
第二步、冬虫夏草二级母种斜面的扩大培养： 将分离的一级母种斜面试管再进行扩大培养，得二级母种斜面试管，二级母种斜面试管的培养基与一级母种斜面试管的培养基相同，移接时严格无菌操作，一支一级母种斜面试管移接30-50支二级母种斜面试管，接种完毕后放入25℃的恒温箱中培养10天即得冬虫夏草二级母种；
第三步、冬虫夏草液体菌种的培养：
转接过程是将冬虫夏草二级母种转接到所述液体培养基中，接种后放到恒温箱里在25℃，恒温培养3天，待液体菌种培养液面上的母种块长到直径为2cm的菌块时，就将盐水瓶转移到磁力搅拌机上在25℃振荡培养20天，得冬虫夏草液体菌种；
第四步、冬虫夏草的栽培。
本发明研究的出发点以及取得的有益效果主要包括以下几个部分：
研究表明，冬虫夏草液体培养基培养获得菌液直接用于感染蝙蝠虫，其对所生产的冬虫夏草发酵产品在化学成分和活性物质影响较大，如何配置适合冬虫夏草的液体培养基，是需要解决的技术问题。
本发明对废弃物进行了处理，使得氮、磷、钾、钙、镁等得到有效利用；本发明将木屑和秸秆制备成纤维状物质，成为培养基的骨架，比表面积大，菌株附着性能好，增大了与加入其他养料的嵌合力，提高了菌株对养料的吸收率；酒糟属于废弃物，其含有大量的蛋白质，脂肪，糖以及维生素等，但是菌株利用率较低，通过生化处理后，提高了各养分的浸出率，菌株利用率大大提高；土豆浸出汁中含有菌体生长所需的碳源、氮源以及微量元素；本发明培养基组分采用多种废弃物物料，成本低廉，实现了变废为宝，提高了工业附加值，企业利润大大提高；本发明培养基各原料配伍合理，更加适合菌体生长，培养获得的虫草各方面性能指标优于现有技术。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种冬虫夏草子实体及其制备方法进行详细说明。
实施例1
一种冬虫夏草液体培养基，其按照如下工艺制备而得：：
1）将锯末和秸秆粉混合，然后放入浓度为2mol/L的NaOH溶液中浸泡5h，捞出丝状纤维，放清水中高速搅拌漂洗2遍，然后置于60℃烘干，得到纤维状物质；
2）将酒糟投入到反应器中，然后添加两倍重量的浓度为5mol/L的盐酸，300rpm搅拌水解2小时，然后添加氨水，调节溶液的pH为6.8，即得酒糟水解物；
3）将土豆去皮，切成块状，然后添加到两倍重量的蒸馏水中，煮沸30min，自然冷却，然后用纱布过滤，收集滤液，即得土豆浸出液；
4）取步骤1）所得纤维状物质50g，步骤2）所得酒糟水解物50g，土豆浸出液70g，葡萄糖30g，硫酸镁2克、链霉素1克、青霉素1克、维生素B10.01g，添加到容器中，然后加水定容至1L，调节pH为6.5，高压锅内灭菌，温度达到121℃时保压15min，出锅，冷却至室温，即得。
实施例2
一种冬虫夏草液体培养基，其按照如下工艺制备而得：：
1）将锯末和秸秆粉混合，然后放入浓度为3mol/L的NaOH溶液中浸泡3h，捞出丝状纤维，放清水中高速搅拌漂洗3遍，然后置于70℃烘干，得到纤维状物质；
2）将酒糟投入到反应器中，然后添加两倍重量的浓度为5mol/L的盐酸，300rpm搅拌水解2小时，然后添加氨水，调节溶液的pH为6.6，即得酒糟水解物；
3）将土豆去皮，切成块状，然后添加到两倍重量的蒸馏水中，煮沸30min，自然冷却，然后用纱布过滤，收集滤液，即得土豆浸出液；
4）取步骤1）所得纤维状物质60g，步骤2）所得酒糟水解物60g，土豆浸出液80g，葡萄糖40g，硫酸镁2克、链霉素1克、青霉素1克、维生素B10.01g，添加到容器中，然后加水定容至1L，调节pH为6.6，高压锅内灭菌，温度达到121℃时保压15min，出锅，冷却至室温，即得。
实施例3
采用实施例1的液体培养基来培养冬虫夏草，包括如下步骤：
第一步、冬虫夏草一级母种斜面培养：
(1)、培养基配方： 玉米200克、小麦200克、磷酸二氢钾4克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、蛋白胨20克、链霉素1克、青霉素1克，琼脂20克、维生素B1 0.01g、水1000毫升；
(2)、配制方法： 将洗净玉米、小麦加水1000毫升，大火烧开小火煮沸40分钟，用纱布滤去玉米跟小麦的残渣，取汁液于锅中加入磷酸二氢钾4克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、蛋白胨20克、链霉素1克、青霉素1克，琼脂20克、维生素B1 0.01g并搅拌均匀，继续加热至琼脂完全溶化，趁热迅速分装试管，试管规格采用16厘米长×口径16毫米，每个试管装培养基的量与试管的体积比是1：5，装完后塞上硅胶塞，然后把试管每10支扎成一捆，用报纸包好，外层用聚丙烯塑料布包好放入高压锅灭菌，加热到压力达到0.5Kg/m2时，开排气阀，排出冷空气，使指针回到0点，然后关上排气阀继续加热至121℃时保压40分钟出锅，并趁热把试管摆成斜面，冷却后得固体试管斜面备用；
(3)、菌种分离培养： 将新鲜健壮子座饱满含有孢子粉的青海玉树野生冬虫夏草清洗后用70%乙醇溶液对其进行消毒处理，再用无菌水清除其表面的乙醇，冬虫夏草表面消毒处理后，用无菌刀片切去冬虫夏草子座的外层，用接种刀切取其内部组织1立方毫米的小块迅速移接到试管斜面上，并迅速塞上硅胶塞，然后放入25℃的恒温箱中培养12天即得冬虫夏草一级母种斜面；
第二步、冬虫夏草二级母种斜面的扩大培养： 将分离的一级母种斜面试管再进行扩大培养，得二级母种斜面试管，二级母种斜面试管的培养基与一级母种斜面试管的培养基相同，移接时严格无菌操作，一支一级母种斜面试管移接30-50支二级母种斜面试管，接种完毕后放入25℃的恒温箱中培养10天即得冬虫夏草二级母种；
第三步、冬虫夏草液体菌种的培养：
转接过程是将冬虫夏草二级母种转接到液体培养基中，接种后放到恒温箱里在25℃，恒温培养3天，待液体菌种培养液面上的母种块长到直径为2cm的菌块时，就将盐水瓶转移到磁力搅拌机上在25℃振荡培养20天，得冬虫夏草液体菌种；
第四步、冬虫夏草的栽培：
(1)、栽培场地的选择： 要选择背风向阳、地高阔、周围环境清洁、无污染源、有清洁水源、排水方便的地建饲养室和栽培棚，方位坐北朝南，饲养室要和栽培棚连在一起，便于管理；
(2)、蝠蛾虫分为黑体蝙蝠蛾幼虫、黄头蝙蝠蛾幼虫、红头蝙蝠幼虫。
饲养方法一样： 饲养蝙蝠蛾虫要在无菌饲养室饲养，要求：饲养室的温度是25℃，湿度是70-90％，并保持黑暗，蝙蝠蛾虫的食物是麸皮50克、紫薯粉10克、黑豆粉25克、蔗糖5克、黑芝麻粉20克按比例配制的混合饲料，每天根据蝙蝠蛾虫食量大小适当的加入胡萝卜、人参果补充水分；定期喂食玛卡跟黑枸杞，以增加药用成分。饲养室要定期灭菌、消毒、搞好清洁卫生，饲养160天后蝙蝠蛾虫既产二代蝙蝠幼虫，二代蝙蝠幼虫生长30天即为2龄蝙蝠幼虫；
(3)、冬虫夏草的栽培： 栽培棚要选择通气性能良好的土地建立温室大棚，温室大棚坐北朝南，要用玻璃窗，采用罐头瓶培养冬虫夏草：
①、装料：
300瓶配方：麦麸7.5千克、稻糠7.5千克、石灰150克、链霉素10克，水14千克拌匀后装瓶。然后放入高压锅高温消毒灭菌2小时。
②、接种：把培养好的冬虫夏草液体菌种喷洒到2龄蝙蝠幼虫上，然后接入栽培瓶中，24小时后就可以看到菌丝生长；
③、接种后的管理：接种后要注意观察菌丝生长情况，并要防止蚁、蟑螂的危害，及时挑出感染杂菌的瓶子。接种后1个月内调节室温为15℃，空气相对湿度为55％，1.5个月内，调节温度在18℃，空气湿度65％，1个半月以后，幼虫头部萌发子实体时，调节温度在28℃，湿度为75％，每天开门窗通风2小时，以利于虫草子实体的生长发育，再经1.5个月后，子座长到11厘米高，粗2毫米棍棒状，颜色为黄褐色，即成熟，便可采收。
实施例4
采用实施例3的方法，验证本发明液体培养基的培养效果：
设置对照组：其中，对照组1：玉米250克、蛋白胨25克、酵母粉2.5克、磷酸二氢钾2.5克、维生素B15片、链霉素2.5克、硫酸镁1克、葡萄糖40克、水2500毫升（专利201010297099.8）； 对照组2：不添加纤维状物质，其余同实施例1；对照组3：不添加酒糟水解物，其余同实施例1；对照组4：不添加土豆浸出液，其余同实施例1。
检测标准：按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T2116-2012，虫草制品中虫草素和腺苷的测定)测定虫草素和腺苷的含量，按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定方法)测定虫草多糖的含量，采用比色法测定虫草酸的含量，具体检测结果如表1所示：
表1
| 组别 | 虫草素 | 腺苷 | 虫草多糖 | 虫草酸 |
| 实施例1 | 7.68 | 0.16 | 9.27 | 10.89 |
| 对照组1 | 6.79 | 0.13 | 7.68 | 8.51 |
| 对照组2 | 5.17 | 0.09 | 6.45 | 7.16 |
| 对照组3 | 5.36 | 0.11 | 5.94 | 6.85 |
| 对照组4 | 6.57 | 0.12 | 6.28 | 6.33 |
结论：如表1所示，本发明培养基配伍合理，在栽培的冬虫夏草产品虫草素、腺苷、虫草多糖以及虫草酸等活性成分含量高于现有技术用的培养基，也明显高于对照组2-4，产品质量大大提高，而且本发明培养基成本低廉，可以降低成本。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.一种冬虫夏草液体培养基，其按照如下工艺制备而得：
取纤维状物质50-60g，酒糟水解物50-60g，土豆浸出液70-80g，葡萄糖30-40g，硫酸镁2克，链霉素1克，青霉素1克，维生素B1 0.01g，添加到容器中，然后加水定容至1L，调节pH为6.5-6.8，高压锅内灭菌，温度达到121℃时保压15min，出锅，冷却至室温，即得;
所述纤维状物质的制备方法包括如下步骤：
将锯末和秸秆粉混合，然后放入浓度为2-3mol/L的NaOH溶液中浸泡3-5h，捞出丝状纤维，放清水中高速搅拌漂洗2-3遍，然后置于60-70℃烘干，得到纤维状物质；
所述酒糟水解物的制备方法包括如下步骤：将酒糟投入到反应器中，然后添加两倍重量的浓度为5mol/L的盐酸，300rpm搅拌水解2小时，然后添加氨水，调节溶液的pH为6.5-7.0，即得酒糟水解物；
所述土豆浸出液的制备方法包括如下步骤：将土豆去皮，切成块状，然后添加到两倍重量的蒸馏水中，煮沸30min，自然冷却，然后用纱布过滤，收集滤液，即得土豆浸出液。
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