CN103798058A - 一种无菌蚕虫草的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无菌蚕虫草的培育方法，步骤如下：（1）将蚕卵经消毒后，在无菌条件下孵育，制得无菌蚕体；（2）将蛹虫草子实体在无菌环境下培养，制得接种菌液；（3）采用无菌注射方式将接种菌液接种于无菌蚕体的尾角、腹足或节间，正常无菌饲养2～3天，将僵化的蚕体除沙后，在黑暗条件下培养，然后感光出草培养，经低温烘干，制得无菌蚕虫草。本发明通过在无菌环境下人工饲育的无菌蚕幼虫栽培北虫草，排除了蚕体本身体内的多种微生物对北虫草生长的影响，较普通桑叶育家蚕幼虫的接种僵化率、出草率高，并且培养出的蚕虫草有效成分更高。

Description

一种无菌蚕虫草的培育方法

技术领域

本发明涉及一种无菌蚕虫草的培育方法，特别涉及一种利用活体无菌蚕幼虫为寄主的蛹虫草子实体及其培育方法，属于食用菌栽培技术领域。

背景技术

蛹虫草Cordyceps militaris(La.:Fr)，又名北冬虫夏草，属于真菌门(Eumycota)，子囊菌亚门(Aseomycotina)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)。是寄生于夜蛾科等蛹体上的不同于冬虫夏草的另一种虫草。

蛹虫草的药用价值：在《新华本草纲目》，《中华药海》中均有记载，它药性作用温和，比其他种类的滋补品更具有广泛的药用和食用性，长期以来是我国药食兼用的高级滋补品，并且一年四季都可食用，对老、少、病、弱、虚者皆宜服用，无任何副作用。现代医药学从药理及临床疗效方面更进一步验证了虫草的医疗保健功能，阐明了其治病强身的机理。

家蚕幼虫体的药用价值很早就被人们所认识。在《齐民要术》、《天工开物》、《神农本草》、《本草纲目》等古代医书中都有家蚕幼虫体入药的记载，其功效为主治小儿疳热、消瘦、消渴（糖尿病）等疾病。现代医药学进一步证明了家蚕幼虫体的药用价值，推动了家蚕幼虫的药用产品开发与临床应用。5龄家蚕幼虫体内含有大量具有重要生理活性的物质，因此五龄第3天的家蚕幼虫冷冻后制成的全蚕粉，是目前开发的较好的家蚕幼虫体保健品。

家蚕是世界上饲养最多的昆虫，利用家蚕幼虫栽培北虫草有着丰富的可利用资源。蚕幼虫较蛹所需时间短，节省劳动力，成本低，利用家蚕幼虫栽培北虫草不仅可取得显著的社会与经济效益，而且也可为蚕业的综合利用开拓一个新领域，推动蚕桑产业，从而带动农村经济的发展，但目前蚕虫草规模化生产困难、僵化率低是影响蚕虫草产业发展的主要障碍。

野生的冬虫夏草不仅资源匮乏，而且人工培育困难，而蛹虫草的人工培育比较成功。目前生产上主要是采用大米和小麦或柞蚕蛹为寄主培养，其营养价值低于以家蚕幼虫为寄主的蚕虫草。

国内已有一些关于蚕虫草栽培技术成果的公开报道。中国专利文献CN102440149A（申请号201110306713.7）名称为“一种利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法”采用活体熟蚕作为寄主，培育出蛹虫草。中国专利文献CN102523912A（申请号201110381394.6）名称为“以家蚕幼虫为寄主的蛹虫草子实体及其培育方法”采用4～5龄家蚕幼虫注射液体菌种培育出蚕虫草。另有少量研究论文报道，如：潘中华(2001)用5龄2～7天桑蚕幼虫培育蚕虫草，接种后在22℃进行培养，僵化率为48％～80％；温鲁等(2004)和朱芬娣等(2005)采用5龄起蚕至5龄2～4天的桑蚕幼虫感染蛹虫草菌种，其僵化率可以达到80％左右。

但上述技术均存在僵化率波动幅度大，平均僵化率低，蚕虫草带有多种其他微生物，不利于后续产品的开发利用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种无菌蚕虫草的培育方法。

本发明技术方案如下：

一种无菌蚕虫草的培育方法，步骤如下：

（1）将蚕卵经消毒后，在无菌条件下孵育至5龄第1～2天，制得无菌蚕体；

（2）将蛹虫草子实体置于消毒液中消毒2～3min，无菌水洗净，取中间部位组织块切片，将组织片接种于固体培养基中，18℃～25℃黑暗培养7～10天；然后感光培养2～4天，将菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，每天在恒温摇床上以200r/min摇1～3小时，继续培养3～7天后得到液体菌种，制得接种菌液；

（3）采用无菌注射方式将步骤（2）制得的接种菌液接种于步骤（1）制得的无菌蚕体的尾角、腹足或节间，每条无菌蚕体的接种量为0.09～0.11mL，经16～20℃无菌晾干45～80min，正常无菌饲养2～3天，将僵化的蚕体除沙后，在黑暗条件下，保持湿度80%～90%，温度18～25℃，培养6～8天，然后感光出草培养25～35天，经100℃以下的低温烘干1～3h，制得无菌蚕虫草。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的消毒，为将蚕卵在用纱布包裹，在75%（体积百分比）的乙醇溶液中浸泡1～2分钟，转入2%～4%（体积百分比）甲醛溶液浸8～10分钟，再转入无水乙醇浸渍1～2分钟，转入无菌隔离器中自然晾干。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的蚕卵为催青至点青期的家蚕卵。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的无菌条件下孵育为在无菌条件下孵化蚕卵后，在无菌环境中饲养，饲喂经灭菌后的饲料。其他饲养条件同普通家蚕饲养条件。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的消毒液为质量浓度为0.1%的氯化汞溶液。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的组织片厚度为0.1mm。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的菌丝为橘黄色。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的固体培养基，每升组分如下：

土豆200g煮水20分钟取滤液，琼脂20g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的液体菌种培养基，每升组分如下：

葡萄糖20g，蛋白胨30g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的接种菌液的菌丝浓度为0.2～0.8mg/ml。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的注射方式为采用针头直径≤0.3mm（8号以下）的针头注射。

有益效果

1、本发明通过在无菌环境下人工饲育的无菌蚕幼虫栽培北虫草，排除了蚕体本身体内的多种微生物对北虫草生长的影响，较普通桑叶育家蚕幼虫的接种僵化率、出草率高，并且培养出的蚕虫草有效成分更高。

2、本发明培育出的无菌蚕虫草由于不含有其他杂菌，避免了杂菌的污染，为食品、保健品和药品提供了更为安全的原料。

3、本发明采用了人工饲料饲育无菌蚕幼虫，解决了蛹虫草栽培时间与养蚕季节之间的矛盾，降低了成本，可以工厂化、规模化栽培无菌蛹虫草。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物原料来源

蛹虫草购自山东高青和润丝绸有限公司。

蚕卵为普通市售产品，购自山东广通蚕种集团有限公司。

实施例中所述固体培养基，每升组分如下：

土豆200g煮水20分钟取滤液，琼脂20g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。

实施例中所述液体菌种培养基，每升组分如下：

葡萄糖20g，蛋白胨30g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。

实施例1

一种无菌蚕虫草的培育方法，步骤如下：

（1）将催青至点青期的蚕卵在用纱布包裹，在75%（体积百分比）的乙醇溶液中浸泡1分钟，转入4%（体积百分比）甲醛溶液浸8分钟，再转入无水乙醇浸渍1分钟，转入无菌隔离器中自然晾干，并在隔离器内继续催青至孵化；

在无菌隔离器内饲养家蚕幼虫，无菌隔离器采用YDG透明塑料薄膜隔离器（100×60×60cm），该隔离器由塑料薄膜室、高效过滤器和送风系统部分组成；使用前要检查是否有漏气情况存在，并清洗干净，用4%（体积百分比）的甲醛溶液喷雾灭菌，经12小时通风，吹干至无甲醛气味后使用；饲育温度1～3龄29℃，4、5龄25℃。给饵次数为1～3龄1回，4、5龄各1回；

采用经过高压灭菌的人工饲料由配套的隔离仓通过传递窗送入隔离器中，饲养家蚕幼虫直至5龄第1天，在整个养蚕过程中要严格按照无菌操作标准进行，保证饲养的家蚕无菌，制得无菌蚕体；

（2）将蛹虫草子实体置入0.1%（质量百分比）氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min摇1小时，制得接种菌液，菌丝干重为0.5mg/ml；

（3）取步骤（1）发育至5龄第1天的无菌蚕体，采用无菌注射方法将步骤（2）的接种菌液接种于无菌蚕体的血液中，注射部位为节间，注射的针头为直径0.3mm的8号针头，每条无菌蚕体接种0.1mL接种菌液，接种后经18℃无菌晾干60min，晾干蚕体的血液后再饲喂，第3天开始死亡及僵化，将僵化的蚕体除沙后，在黑暗条件下，保持湿度90%，温度25℃，培养6天，蚕体表面长满白色菌丝，然后在25℃条件下，感光出草培养25天，经80℃的低温烘干3h，制得无菌蚕虫草。以上所有操作都要在无菌条件下进行。

实施例2

一种无菌蚕虫草的培育方法，步骤如下：

（1）将催青至点青期的蚕卵在用纱布包裹，在75%（体积百分比）的乙醇溶液中浸泡2分钟，转入2%（体积百分比）甲醛溶液浸10分钟，再转入无水乙醇浸渍2分钟，转入无菌隔离器中自然晾干，并在隔离器内继续催青至孵化；

在万级净化标准蚕室内饲养家蚕幼虫，蚕室建设采用屏障系统万级净化标准，全复合夹芯彩钢板结构，分小蚕饲育室、4龄饲育室、5龄饲育室及操作室兼饲料冷却室，另配有更衣室、淋浴室、风淋室、出口缓冲室、辅助用房等，室内各角均为铝合金圆弧线镶嵌，以减少尘埃粒子的滞留。空气净化处理经过初效、中效、高效过滤器三级过滤，在空气净化级别上采用万级净化标准，送风形式为垂直乱流，顶送风，侧回风，为保证送风射流分布合理，流线均匀，小蚕室、4、5龄蚕室均设有回风立柱。更衣室、淋浴室、风淋室、出口缓冲室采用亚屏障系统10万级净化标准。万级净化标准蚕室换气量设计为35次/h，10万级净化标准附属室换气量为25次/h；

无菌蚕室在使用中还必须定期采用药物消毒。在养蚕过程中，除必需的操作外，一般不随便进入无菌室，把带入污染的机会减少到最低程度。人员入室前先经淋浴，更换无菌工作服，再经风浴后才能入内。收蚁、换饵等操作均在无菌室内进行，室内温湿度均为自动控制，稚蚕期密闭饲育，5龄蚕期饲育盒交叉错开，以利排湿，饲育温度1～3龄29℃，4、5龄25℃，给饵次数为1～3龄1回，4、5龄各1回；

采用经过高压灭菌的人工饲料饲养家蚕幼虫直至5龄第2天，在整个养蚕过程中要严格按照无菌操作标准进行，保证饲养的家蚕无菌，制得无菌蚕体；

（2）将蛹虫草子实体置入0.1%（质量百分比）氯化汞溶液中消毒2min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于18℃黑暗培养10天；然后感光培养2天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于18℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min摇3小时，制得接种菌液，菌丝干重为0.6mg/ml；

（3）取步骤（1）发育至5龄第2天的无菌蚕体，采用无菌注射方法将步骤（2）的接种菌液接种于无菌蚕体的血液中，注射部位为腹足，注射的针头为直径0.3mm的8号针头，每条无菌蚕体接种0.9mL接种菌液，接种后经20℃无菌晾干45min，晾干蚕体的血液后再饲喂，第3天开始死亡及僵化，将僵化的蚕体除沙后，在黑暗条件下，保持湿度80%，温度18℃，培养8天，蚕体表面长满白色菌丝，然后在20℃条件下，感光出草培养30天，经100℃的低温烘干1h，制得无菌蚕虫草。以上所有操作都要在无菌条件下进行。

对比例1

（1）将蚕种催青至至孵化，在普通蚕室内饲养家蚕幼虫，饲育温度1～3龄29℃，4、5龄25℃。给饵次数为1～3龄1回，4、5龄各1回；

（2）将蛹虫草子实体置入0.1%（质量百分比）氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min摇1小时，制得接种菌液，菌丝干重为0.5mg/ml；

（3）取步骤（1）发育至5龄第1天的蚕体，采用注射方法将步骤（2）的接种菌液接种于蚕体的血液中，注射部位为节间，注射的针头为直径0.3mm的8号针头，每条蚕体接种0.1mL接种菌液，接种后经18℃晾干60min，晾干蚕体的血液后再饲喂，第3天开始死亡及僵化，将僵化的蚕体除沙后，在黑暗条件下，保持湿度90%，温度25℃，培养6天，蚕体表面长满白色菌丝，然后在25℃条件下，感光出草培养25天，经80℃的低温烘干3h，制得普通蚕虫草。家蚕饲养及接种等均在自然环境下进行。

对比例2

（1）将催青至点青期的蚕卵在用纱布包裹，在75%（体积百分比）的乙醇溶液中浸泡1分钟，转入4%（体积百分比）甲醛溶液浸8分钟，再转入无水乙醇浸渍1分钟，转入无菌隔离器中自然晾干，并在隔离器内继续催青至孵化；

在无菌隔离器内饲养家蚕幼虫，无菌隔离器采用YDG透明塑料薄膜隔离器（100×60×60cm），该隔离器由塑料薄膜室、高效过滤器和送风系统部分组成；使用前要检查是否有漏气情况存在，并清洗干净，用4%（体积百分比）的甲醛溶液喷雾灭菌，经12小时通风，吹干至无甲醛气味后使用；饲育温度1～3龄29℃，4、5龄25℃。给饵次数为1～3龄1回，4、5龄各1回；

采用经过高压灭菌的人工饲料由配套的隔离仓通过传递窗送入隔离器中，饲养家蚕幼虫直至5龄第5天，在整个养蚕过程中要严格按照无菌操作标准进行，保证饲养的家蚕无菌，制得无菌蚕体；

（2）将蛹虫草子实体置入0.1%（质量百分比）氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min摇1小时，制得接种菌液，菌丝干重为0.5mg/ml；

（3）取步骤（1）发育至5龄第5天的无菌蚕体，采用无菌注射方法将步骤（2）的接种菌液接种于无菌蚕体的血液中，注射部位为节间，注射的针头为直径0.3mm的8号针头，每条无菌蚕体接种0.1mL接种菌液，接种后经18℃无菌晾干60min，3天后将僵化的蚕体除沙后，在黑暗条件下，保持湿度90%，温度25℃，培养6天，蚕体表面长满白色菌丝，然后在25℃条件下，感光出草培养25天，经80℃的低温烘干3h，制得无菌蚕虫草。以上所有操作都要在无菌条件下进行。

对比例3

（1）将催青至点青期的蚕卵在用纱布包裹，在75%（体积百分比）的乙醇溶液中浸泡1分钟，转入4%（体积百分比）甲醛溶液浸8分钟，再转入无水乙醇浸渍1分钟，转入无菌隔离器中自然晾干，并在隔离器内继续催青至孵化；

在无菌隔离器内饲养家蚕幼虫，无菌隔离器采用YDG透明塑料薄膜隔离器（100×60×60cm），该隔离器由塑料薄膜室、高效过滤器和送风系统部分组成；使用前要检查是否有漏气情况存在，并清洗干净，用4%（体积百分比）的甲醛溶液喷雾灭菌，经12小时通风，吹干至无甲醛气味后使用；饲育温度1～3龄29℃，4、5龄25℃。给饵次数为1～3龄1回，4、5龄各1回；

采用经过高压灭菌的人工饲料由配套的隔离仓通过传递窗送入隔离器中，饲养家蚕幼虫直至熟蚕，在整个养蚕过程中要严格按照无菌操作标准进行，保证饲养的家蚕无菌，制得无菌熟蚕（5龄第7、8天）；

（2）将蛹虫草子实体置入0.1%（质量百分比）氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min摇1小时，制得接种菌液，菌丝干重为0.5mg/ml；

（3）取步骤（1）发育至熟蚕的无菌蚕体，采用无菌注射方法将步骤（2）的接种菌液接种于无菌蚕体的血液中，注射部位为节间，注射的针头为直径0.3mm的8号针头，每条无菌蚕体接种0.1mL接种菌液，接种后经18℃无菌晾干60min，僵化后在黑暗条件下，保持湿度90%，温度25℃，培养6天至表面长满白色菌丝后在25℃条件下，感光出草培养25天，经80℃的低温烘干3h，制得无菌蚕虫草。以上所有操作都要在无菌条件下进行。

对比例4

（1）将催青至点青期的蚕卵在用纱布包裹，在75%（体积百分比）的乙醇溶液中浸泡1分钟，转入4%（体积百分比）甲醛溶液浸8分钟，再转入无水乙醇浸渍1分钟，转入无菌隔离器中自然晾干，并在隔离器内继续催青至孵化；

在无菌隔离器内饲养家蚕幼虫，无菌隔离器采用YDG透明塑料薄膜隔离器（100×60×60cm），该隔离器由塑料薄膜室、高效过滤器和送风系统部分组成；使用前要检查是否有漏气情况存在，并清洗干净，用4%（体积百分比）的甲醛溶液喷雾灭菌，经12小时通风，吹干至无甲醛气味后使用；饲育温度1～3龄29℃，4、5龄25℃。给饵次数为1～3龄1回，4、5龄各1回；

采用经过高压灭菌的人工饲料由配套的隔离仓通过传递窗送入隔离器中，饲养家蚕幼虫直至吐丝、结茧，在整个养蚕过程及化蛹过程中要严格按照无菌操作标准进行，制得无菌蚕蛹；

（2）将蛹虫草子实体置入0.1%（质量百分比）氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min摇1小时，制得接种菌液，菌丝干重为0.5mg/ml；

（3）取步骤（1）的无菌蚕蛹，采用无菌注射方法将步骤（2）的接种菌液接种于无菌蚕蛹体内，注射部位为节间，注射的针头为直径0.3mm的8号针头，每个无菌蚕蛹接种0.1mL接种菌液，接种后经18℃无菌晾干60min，僵化后在黑暗条件下，保持湿度90%，温度25℃，培养6天直至蛹体表面长出子实体原基，然后在25℃条件下，感光出草培养25天，经80℃的低温烘干3h，制得无菌蛹虫草。以上所有操作都要在无菌条件下进行。

试验例

检测方法参见“高效液相色谱法测定虫草中虫草素和腺苷含量的研究”，《山东蚕业》2009第2期中所述方法，检测实施例1～2及对比例1～4的相关数据。

僵化率、出草率检测方法按本领域惯用方法即可。结果如表1所示。

表1

	虫草素(mg/g)	虫草腺苷(mg/g)	僵化率(%)	出草率(%)	是否有杂菌
						实施例1	15.78±0.0005	4.7±0.0009	100%	99.16%	无
实施例2	15.58±0.0005	4.5±0.0009	100%	99.28%	无
						对比例1	12.09±0.0006	3.1±0.0008	90.08%	86.73%	有
对比例2	5.78±0.0006	1.63±0.0005	100%	99.13%	无
						对比例3	2.10±0.0007	0.16±0.00016	98%	95.11%	无
对比例4	1.68±0.0006	0.11±0.00011	99%	96.23%	无

结果分析

由表1的结果可以看出，在无菌环境下培育的蚕虫草其僵化率、出草率均高于自然环境下培育的蚕虫草，主要原因在于减少了其它杂菌的干扰，同样，虫草素和虫草腺苷的含量也高于对比例1，可能是由于在没有其它杂菌的干扰下，蚕体内的生物转化效率更高所致。在无菌环境下，采用5龄第1～2天的家蚕幼虫培育的蚕虫草的虫草素和虫草腺苷的含量高于5龄第5天、熟蚕和蚕蛹，可能是昆虫在不同发育阶段体内营养物质的不同所致。

Claims (8)

1.一种无菌蚕虫草的培育方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将蚕卵经消毒后，在无菌条件下孵育至5龄第1～2天，制得无菌蚕体；

（2）将蛹虫草子实体置于消毒液中消毒2～3min，无菌水洗净，取中间部位组织块切片，将组织片接种于固体培养基中，18℃～25℃黑暗培养7～10天；然后感光培养2～4天，将菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，每天在恒温摇床上以200r/min摇1～3小时，继续培养3～7天后得到液体菌种，制得接种菌液；

（3）采用无菌注射方式将步骤（2）制得的接种菌液接种于步骤（1）制得的无菌蚕体的尾角、腹足或节间，每条无菌蚕体的接种量为0.09～0.11mL，经16～20℃无菌晾干45～80min，正常无菌饲养2～3天，将僵化的蚕体除沙后，在黑暗条件下，保持湿度80%～90%，温度18～25℃，培养6～8天，然后感光出草培养25～35天，经100℃以下的低温烘干1～3h，制得无菌蚕虫草。

2.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（1）中的消毒，为将蚕卵在用纱布包裹，在75%（体积百分比）的乙醇溶液中浸泡1～2分钟，转入2%～4%（体积百分比）甲醛溶液浸8～10分钟，再转入无水乙醇浸渍1～2分钟，转入无菌隔离器中自然晾干。

3.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（1）中的蚕卵为催青至点青期的家蚕卵。

4.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（1）中的无菌条件下孵育为在无菌条件下孵化蚕卵后，在无菌环境中饲养，饲喂经灭菌后的饲料。

5.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（2）中的消毒液为质量浓度为0.1%的氯化汞溶液。

6.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（2）中的组织片厚度为0.1mm。

7.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（2）中的接种菌液的菌丝浓度为0.2～0.8mg/ml。

8.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（3）中的注射方式为采用针头直径≤0.3mm的针头注射。