KR20120077691A - 미부화 폐란을 이용한 코디세핀 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부화장에서 발생되는 미부화 폐란에 젖산을 가하여 살균 및 난각을 용해시킨 다음 발효기에 넣고 통기하면서 전배양된 동충하초균을 접종 배양하여 코디세핀을 생산하는 방법에 관한 것이다. 동충하초의 유효성분중 대표적인 코디세핀은 본 발명에 의해 20일간 배양한 배양액에서 약 356mg/ℓ의 양으로 얻어졌다.

Description

미부화 폐란을 이용한 코디세핀 생산방법{A Cordycepin producing method using unhatched egg}

본 발명은 부화되지 않은 폐란에 동충하초균을 접종하고 발효하여 코디세핀을 생산하는 방법에 관한 것으로 더욱 자세하게는 미부화된 폐란의 난각을 젖산으로 녹이고 발효기에서 전배양된 동충하초 균을 접종하고 통기를 조절하여 발효하여 동충하초의 중요한 생리활성물질인 코디세핀(cordycepin)을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

동충하초란 버섯의 일종으로서 자낭균강의 맥각균목 동충하초과에 속하며 전세계적으로 약 800여종이 보고되어 있고 국내에서도 약 70여종이 보고되어 있다. 대부분의 버섯이 식물이나 토양에서 균사체로 영양성장을 하다가 계절적인 원인 등으로 생식생장 단계로 전환하여 자실체를 형성하는 데 비하여 동충하초는 동물성인 곤충, 거미, 절지동물, 균류 또는 고등식물의 종자 등에 침입하여 균사체 성장을 하고 균사체 성장 후에 자실체를 형성하는 특징이 있다. 동충하초란 이름은 한자로 冬蟲夏草이며 겨울에는 벌레이던 것이 여름에는 풀과 같은 자실체를 형성한다는 의미로 동충하초의 생활사에 대한 특징을 단적으로 나타내고 있다.

동충하초는 은상시대에도 극히 희귀한 불노장생의 묘약으로 알려져 있으며 기원전 1,000년부터 기원전 200년까지 왕과 제후의 무덤에서 동충하초와 같은 옥돌이 발견되었다. 진시황과 양귀비가 복용하였다고 하는 동충하초가 문헌으로 나타난 것은 청나라 오의락의 본초종신과 1,082년의 증류본초 일본에도 시대의 본초서 등에 기록되어 있다. 현대에 들어서 동충하초가 국내와 세계에 널리 알려지게 된 것은 1980년대에 노령의 등소평이 건강유지를 위해 복용하였다고 하며 1993년 8월 세계육상선수권대회에서 동충하초를 복용한 중국선수들에게서 많은 기록이 쏟아져 나온 것이 계기가 되었다.

중국에서는 티벳, 청해성, 사천성 등의 고산지대에서 자연적으로 발생하는 박쥐나방 동충하초(Cordyceps sinensis), 번데기동충하초 등이 유명하다. 박쥐나방을 기주로 하는 동충하초의 생산은 티벳트와 네팔 중국의 사천성, 청해성, 운남성 등의 해발 3,000~6,000m의 인적이 드믄 고원지대에서 채취에 의해 생산되며 까다로운 생육조건과 기후의 변화, 남획 등의 원인으로 점차 줄어들어 더욱더 희귀하고 가격이 높아지고 있는 실정이다. 최근에는 중국에서 현대적 기술을 접목하여 동충하초를 중점적으로 육성하고 있다.

국내에서는 잠사곤충연구소의 연구결과로서 눈꽃동충하초(Paecillomyces japonica) 생산기술이 보급되었으며 뒤이어 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 등이 재배, 이용되고 있다.

동충하초가 발생하는 기주는 매우 다종 다양하며 매미, 노린재, 풍뎅이, 개미, 잠자리, 나방, 나비, 먼지벌레, 벌, 거미, 파리 등에서 발견된다. 성재모 등의 연구에 의해 우리나라는 특히 다양한 종류의 동충하초가 발견되고 있다.

동충하초를 생산하는 방법은 누에에 동충하초 균을 접종하여 감염시키고 누에가 고치를 형성한 뒤에 동충하초 균이 성장하여 자실체를 형성하도록 하는 방법, 번데기에 직접 균사를 접종하여 배양하는 방법이 있고 현미와 쌀겨 등의 영양성분에 동충하초 균을 접종하여 배양하는 방법 등이 시행되고 있다. 그러나 이러한 방법들은 누에와 번데기를 이용하는 경우에는 누에를 키우고 관리하는 데 시간과 노력이 많이 걸리며 성공률도 높지 않았다. 더구나 식생활이 개선되면서 번데기, 누에와 같은 식품들이 일부의 사람들에게는 기피 식품이 되어 일반적으로 보급되기에 한계가 있는 실정이다.

국내에서의 동충하초 생산은 주로 누에와 누에의 번데기를 이용하여 생산하며 누에가 성장하여 5령의 누에가 되기까지 약 25일이 소요되고 동충하초 균을 접종하여 동충하초가 되기까지는 약 60일 정도의 긴 시간이 소요된다.

누에는 뽕잎만을 먹으며 누에가 먹는 뽕잎과 생육환경에서 농약은 물론이고 유해한 약품 유해한 가스가 있으면 누에는 금방 죽어버리므로 누에를 키우기 위해서는 깊은 산속이나 청정지역이어야 한다. 누에 사육은 매우 까다로우며 누에의 알이 깨어날 때와 어린누에가 자랄 때 특히 주의하여야 한다. 어린 누에에게는 뽕잎을 잘게 잘라주고 누에의 급격한 성장에 따라 먹는 뽕잎의 양이 많아지므로 들에서 뽕을 수확하고 나르고 먹이로 공급하기가 쉽지 않으며 봄과 가을에 두 번을 생산할 수 있다.

동충하초는 자연산인 경우(중국 박쥐나방 동충하초 4,300만원/kg)는 물론이고 국내에서 재배되는 인공산이라고 하더라도 대단히 고가(제주밀리타리스동충하초 150g 120,000원)일 수 밖에 없다.

한편, 계란은 2008년에 1인당 계란 소비량이 11kg에 이르며 국내의 하루 유통량은 2,500만개에 이를 정도로 많은 양이 이용되고 있으며 시중에서 구입하기가 용이하다. 계란 한 개는 한 마리의 병아리가 될 정도로 모든 영양소가 골고루 함유된 완전한 영양식품임에도 불구하고 가격이 대단히 저렴(180원~700원/개)하다.

이러한 계란에 동충하초의 약리성분이 첨가된다면 사람들의 건강을 유지하는 데 매우 유용할 것이다.

일반적으로 동충하초의 약리성분은 코디세핀(Cordycepin), 코디세핀다당류(Cordycepic polysaccharides), 코디세핀산(Cordycepic acid, Mannitol), 아미노산, 비타민 전구체 등으로 알려져 있다. 동충하초의 주요 약리 기능은 자양강장기능, 면역증강작용, 자연치유럭 증대, 항암기능, 마약중독해독기능, 운동능력향상기능, 염증억제기능, 동맥경화 호전기능, 당뇨 호전기능, 호흡 개선 기능, 신장 개선 기능, 정력 증강 기능고혈압 혈압상승 억제 기능 등의 작용이 있다고 알려져 있다.

2010년 3월 농업관측센터의 발표 자료에 의하면 육계의 생산량은 연간 66,036만마리에 이르며 부화율을 70%로 산정하면 육계용 계란은 연간 112,251만개가 생산되고 이중 30% 정도인 33,000만여개의 부화부산물인 폐란이 발생한다. 이것을 개당 60g으로 계산하면 연간 폐란의 발생량은 20만205톤에 이른다. 이것은 불법적으로 수거되어 제빵원료로 사용되다가 사회적으로 물의를 빚은 사례가 있었다. 폐란은 식용으로 사용하는 것이 불가하고 농장에서 폐기되어 폐기물 처리비를 지불하면서 퇴비로 이용되고 있는 실정이다. 그러나 난각을 제외한 계란의 수분함량은 약 74%에 이르기 때문에 폐기물로서도 그다지 환영받지는 못하고 있다.

본 발명자는 난각을 포함하지 않은 계란의 화학적 조성분은 수분 72.5%, 조단백질 13.3%, 지질류 11.6%, 당류 1.5%, 회분 1.1% 이며 동충하초의 소재로 일반적으로 사용되는 번데기의 성분은 수분 59.4%, 단백질 22.2%, 지질 13.3%, 당질 1.9%, 회분 13% 으로 계란이 동충하초가 배양되기에 적당한 소재라고 판단되며 폐기물로서 버려지는 계란을 수거하여 기능성이 우수한 코디세핀(cordycepin) 소재의 제품으로 개발한다면 폐기물도 줄이고 매우 높은 부가가치의 제품으로 개발하는 것으로 매우 바람직한 것이다.

폐란이 아닌 계란을 이용한 동충하초의 생산은 계란을 분할하여 내용물을 비이커에 넣고 눈꽃동충하초를 배양하고 자실체를 생육시켜 생산한 계란을 이용한 눈꽃동충하초 재배방법(특허 제10-0411703호)이 등록된 바 있다.

계란은 닭의 자궁에서 통달걀이 형성되어 총배설강으로 산란이 일어나며 계란이 총배설강을 지나는 동안 계란의 난각은 오염이 되며 이때, 닭의 총배설강을 오염시키는 균들은 마이크로코사이(Micrococci), 엔테로코사이(Enterococci), 콜리-에어로게네스(Coli-aerogenes) 등이다. 난각에서 검출되는 미생물은 개당 10⁵ 개 정도이며 그 종류는 마이크로코커스(Micrococcus), 스태필로코커스(Staphylococcus), 아트로박터(Arthrobacter), 바실러스(Bacillus), 사르시나(Sarcina), 슈도모나스(Pseudomonas), 아크로모박터(Achromobacter), 에셔리시아(Escherichia), 에어로박터(Aerobacter) 등이다.

폐란에 동충하초균을 접종하기 위해서는 난을 분할하여 난각을 분리하고 내용물만을 사용하는 것은 할란기를 사용하여 난각과 내용물을 분리하여야 하는 데 이 과정에서 계란의 내용물이 오염될 가능성이 매우 높다. 오염을 줄이기 위한 방법으로 계란의 표면을 오존수, 차아염소산나트륨, 70% 에탄올을 이용하여 계란 표면의 미생물을 살균하는 방법과 할란 공정을 크린룸에서 수행하는 방법이 있지만, 설치비용이 많이 들면서도 여전히 완벽하게 오염을 막을 수 없었다.

또한, 폐란은 열처리할 경우에는 난의 단백질이 열변을 일으켜 젤이 되어 교반과 통기작용을 불가능하게 하므로 계란을 이용한 배양에 있어서 통상의 스팀이나 열을 가한 살균은 적합하지 않다. 뿐만 아니라, 계란을 통기 배양하면 계란의 난백에 포함된 성분으로 인해 다량의 거품이 발생하며 이것은 발효 중에 거품이 외부로 넘치게 되어 내용물이 모두 빠져나가고 오염을 일으키는 부작용이 있다.

따라서, 본 발명은 폐란을 동충하초의 기주로 이용함에 있어서 문제가 되는 효율적인 살균 방법을 개발하여 폐란을 이용하여 고가의 동충하초 유래의 코디세핀을 다량 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 쓰임새 없이 폐기되는 미부화 폐란을 활용하여 이를 동충하초 배양에 이용하는 방법을 연구하였다. 이때 문제가 되는 폐란을 효율적으로 살균하고 폐란의 높은 칼슘 성분을 유지하면서 동충하초를 배양하기 위하여 오랜 기간 연구한 결과, 젖산을 이용하여 난각을 살균함은 물론, 난각을 분리 제거하는 방법으로 계란의 성분을 고화시키지 않고 동충하초 균을 배양하여 코디세핀을 생산하는 방법을 완성하게 되었다. 이와 같은 연구의 결과, 당뇨병의 치료, 혈관재협착방지, 항바이러스, 비만치료, 정장작용, 염증치료 등의 효능이 알려져 있는 동충하초 유래의 코디세핀을 폐란에서 효율적으로 대량 배양, 생산할 수 있게 되었다.

본 발명은

a) 조류의 미부화 폐란에 젖산을 가하여 난각을 용해시키고 살균하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 얻어진 살균된 폐란에 동충하초 전배양액을 접종하고 통기량 0.1~0.5vvm으로 교반하면서 배양하는 단계;를 포함하는 미부화 폐란을 이용한 코디세핀 생산방법에 관한 것이다.

미부화 폐란에 젖산을 가하는 방법은 살균방법으로서 매우 효율적이고, 난각을 깨뜨려 제거하지 않고도 난각의 칼슘 성분을 배양액에 함유시킬 수 있기 때문에 매우 유용하다.

또, 동충하초 배양 단계에서는 통기량을 주의 깊게 조절하여야 하며, 바람직한 통기량은 0.1~0.5vvm이다. 지나친 통기량은 거품을 과량 발생시켜서 배양액을 넘치게 하거나 오염에 이르게 하므로 바람직하지 않고, 통기량이 너무 적으면 원활한 배양이 일어나지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 b) 단계 이후 코디세핀을 정제하는 단계;가 부가되는 것을 특징으로 하는 코디세핀 생산방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 b)의 배양 단계는 5~30일 동안 수행함을 특징으로 한다. 5일 미만으로 배양하면 코디세핀이 충분히 생성되지 않으며, 30일 이상인 경우 비경제적이다.

또한, 본 발명은 상기 동충하초가 코디셉스 밀리타리스인 것을 특징으로 한다. 본 발명자의 실험 결과 코디셉스 밀리타리스는 다른 종류의 동충하초에 비하여 폐란에서의 배양에 적합하고, 코디세핀을 다량 수득할 수 있었다.

본 발명의 방법에 의하면, 배양 조건이 까다로운 동충하초를 간단한 방법으로 살균할 수 있어, 폐란을 배지로 하여 생산함으로써 동충하초 생산비용을 획기적으로 절감할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 다양한 생리활성을 나타내는 동충하초 및 코디세핀을 저렴하게 생산할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 의하면 동충하초에 포함된 유용 성분인 코디세핀 또한 대량으로 생산 가능하므로, 이를 의약품, 동물의약품, 사료, 화장품 등의 소재로 이용할 수 있다.

도 1은 20일간 동충하초를 배양한 폐란을 전처리하여 100배 희석하여 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 1: 동충하초 전배양

동충하초 균을 배양하기 위하여 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)를 사용하였다. 200㎖의 증류수를 500㎖ 삼각 플라스크에 넣고 2.4g의 PDB(Photato Dextrose Broth, Difco)와 1.4g의 한천을 넣어 10분간 교반한 다음, 면전으로 마개를 하고 오토클레이브에서 121℃로 15분간 멸균하였다. 크린벤치 내에서 멸균한 PDA 배지 약 20㎖를 직경 90mm의 페트리 디쉬에 분주하여 완전히 식혔다.

직경 10mm의 콜크보러를 사용하여 분양받은 동충하초 균의 균사체 덩이를 분리한 다음, 상기 PDA 배지 표면에 접종하여 25℃에서 20일간 배양하였다. 20일간의 배양 후에 균사는 중심으로부터 76mm의 성장을 보였다. 500㎖ 삼각 플라스크에 100㎖의 PDB 배지를 넣고 면전한 다음, 121℃에서 15분간 멸균하였다. 상기 PDA 페트리 디쉬에서 배양된 균사체를 콜크보러로 3개의 배양된 덩어리로 분리하고 이것을 멸균한 삼각플라스크 내의 배지에 접종하여 25℃에서 20일간 진탕 배양하였다. 20일간 진탕배양한 후에 균사체가 펠렛을 형성하여 다량의 균체가 자란 것이 확인된 다음, 배양액을 크린벤치 내에서 호모게나이저를 사용하여 20,000rpm에서 2분간 배양된 균사체를 균질하게 분쇄하고 접종원으로 사용하였다. 이때 사용한 용기와 커터는 사전에 121℃에서 살균하여 준비하였다.

실시예 2: 폐란에서 동충하초 배양

부화장에서 발생한 미부화된 폐란 40개를 5리터 배양기에 넣고 90% 젖산을 가하여 60℃에서 2시간 동안 침지시켜 계란이 고화되지 않도록 난각을 녹인 다음, 난각이 녹은 젖산을 제거한다. 삼각플라스크에서 20일간 배양한 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 전배양액 100㎖를 취하여 접종하였다. 접종한 후 통기량을 0.2~0.5vvm으로 조절하여 교반하면서 25℃에서 20일간 배양하였다.

실시예 3: 분석

배양 후, 배양액 내의 코디세핀(cordycepin) 함량을 측정하기 위하여 배양액 60g을 호모게나이저 컵에 넣고 200㎖의 증류수를 첨가한 다음, 20,000rpm에서 2분간 균질화하고 95℃에서 6시간 동안 열처리한 다음, 800㎖의 99% 에탄올을 가하여 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이것을 6,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하여 여과지(Whatman No.2)를 사용하여 여과한 다음, 60℃에서 감압농축하였다. 여기에 다시 물을 가하여 녹인 다음, 0.45㎛의 필터로 여과하였고 용액을 1㎖로 조정하여 HPLC로 분석하였다. 비교를 위한 코디세핀(cordycepin) 표준품으로는 Sigma-Aldrich Chemical의 C3394를 사용하였다. 컬럼은 μbondapak C18(300㎜ L X 3.9㎜ ID, Waters), 탐지기(Detecter)는 UV 탐지기(260nm, Waters), 유동상(Mobile phase)은 0.1% TFA: 아세토나이트릴(Acetonitrile) (9:1), 속도(Flow rate)는 0.5㎖/min 이었다.

도 1은 20일간 동충하초를 배양한 폐란을 동일한 방법으로 전처리하여 100배 희석하여 분석한 결과이며 이 결과에 따르면 동충하초 계란 한 개당 약 17.8mg의 코디세핀이 함유되어 있으며, 배양액을 기준으로 하면 356㎎/ℓ의 코디세핀을 생산하였다.

또한, 여러 기관에서 수행한 코디세핀 생산 데이타를 비교한 것을 아래 표 1에 나타내었다.

연구자	기 관	함 량	방 법	년 도
안성구 (본 출원인)	올팡	17.8mg/60g/폐란 356mg/l	20일 폐란	2010
김진만	동국대학교	820mg/l	25일 액체배양	2007
한길전	예산군농업기술센터	325mg%	60일 번데기	2007
조성준	동국대학교	421mg/l	30일 액체배양	2005
서인현	충남대학교	39mg/l	5일 액체배양	2004

Claims (4)

1. a) 조류의 미부화 폐란에 젖산을 가하여 난각을 용해시키고 살균하는 단계;
   b) 상기 a) 단계에서 얻어진 살균된 폐란에 전배양액을 접종하고 통기량 0.1~0.5vvm으로 교반하면서 배양하는 단계;를 포함하는 미부화 폐란을 이용한 코디세핀 생산방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   b) 단계 이후 코디세핀을 정제하는 단계;가 부가되는 것을 특징으로 하는 코디세핀 생산방법.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   b) 단계는 5~30일 동안 수행함을 특징으로 하는 코디세핀 생산방법.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 동충하초는 코디셉스 밀리타리스임을 특징으로 하는 코디세핀 생산방법.

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