CN105075667A - 一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法，涉及寄主工程、菌种工程、侵染工程和出草工程等多个技术特点，将各个技术有效的结合，各步骤准确无误的实施，最终成功培育出在成分、外观等与野生虫草一致的冬虫夏草。其中菌种准备步骤中新增了子实体催生确认步骤，保证分离出合格的菌种，提高生产效率和产量。此外还采用了特定的养虫方式，保证了虫体培育的世代循环。特别是采用该技术人工培育的冬虫夏草与野生冬虫夏草相比，蛋白质组分相似度比例超过95％，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法

技术领域

本发明属于药食用菌培育技术领域，涉及一种冬虫夏草的培育方法。

背景技术

冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.]别名虫草、冬虫草、夏草冬虫。是由冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.寄生在蝙蝠蛾科Hepialidae蝠蛾属Hepialus昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。野生冬虫夏草分布在我国西藏、青海、云南、四川及甘肃等省区3000～5000m的高寒草甸区，且对生境要求极其特殊。在自然条件下，其生活史极其复杂，必须经过相对独立的分生孢子阶段和子囊孢子阶段的转变，其寄主蝙蝠蛾需要5～6年才能完成一个世代，其中85％以上的时间营地下生活，全年具有世代重叠现象。中医认为：冬虫夏草性温而味甘，药用价值极高，具有补肺、益肾、补精髓及诸虚百损、止咳化痰、抗白血病、抗抑郁症、调节免疫系统之功效。

面对环境的破坏、虫草产量减少，人类对虫草需求的增加等问题，人工培育冬虫夏草成了一种趋势，更是大家在科学界探索的目标。由于虫草培育过程中对环境要求很高，通常在高海拔地区进行培育，如何能在日常环境中，特别是低海拔地区培育出在成分、外观等与野生虫草一致的冬虫夏草，目前并没有相关技术报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种冬虫夏草的培育方法，以克服现有技术的不足。

为了实现上述目的，本发明冬虫夏草的培育方法，包括以下步骤：

(1)菌种准备：

挑选完整新鲜野生虫草，用无菌水冲洗过夜后，在洁净工作台剥开虫体部分，勾取里面菌丝培养，依生长情况，培养90-120天后，低温、光照的条件在培养基斜面上长出子实体，选择符合要求的子实体进行纯化扩培，经分子鉴定确定为菌种无误后进行生产发酵扩大；

(2)寄主工程：

1)在野外采集的第一代虫蝙蝠蛾蛹用滤纸保湿培养，羽化为成虫后，经形态鉴定其物种，成虫安排在羽化帐中，羽化帐底部铺腊纸，在蜡纸上放入树枝，以便成虫攀附产卵；产卵后将卵收集，将其放入培养箱中培养，其中采用常规滤纸保湿方法保持卵的湿度，培养温度为12-15℃，培养时间为28-40天；培养结束后用无菌水冲洗干净；

2)待卵孵化后模拟高山草甸环境饲养幼虫，养虫的基质层以草炭土、泥炭土、沙土、蛭石为主，含水量约35-40％；基质层用于模拟高山环境用腐殖土。用于养虫的外部环境为低温高湿环境，温度约为14℃，空间湿度约为50％，卵期和蛹期及成虫饲养空间湿度为90％；每个养虫盒饲养100条虫；

(3)世代循环：

按上述方式饲养后的第二年的3-6月翻开基质，可发现第二代蛹，按雌雄分开饲养，饲养基质层与在前的基质层相同，方便以后进行雌雄配比羽化交尾，养蛹湿度比养虫的湿度大，为60％，空间湿度每天用造雾器喷2次水雾，保持土壤和空间湿度，进行二代虫的饲养，依此方法可进行世代循环；

(4)侵染工程：

采用下述方法中的任意一种：

方法一：用第一步分离确定之菌种进行常规发酵培养，用得到菌丝用300目滤网过滤，将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用100目过滤网过滤，保留滤液作为侵染液，此时的侵染液中含有液体发酵的孢子和菌丝段，拌入养虫基质层第三层沙土层中，利用幼虫食入肠道或者接触表皮气孔达到侵染的目的；

方法二：利用人工培养冬虫夏草用针刺侵染装置进行针刺侵染，所述进行针刺侵染针筒的外侧壁上设有针头容纳盒，针筒的头部设有针头，针头上包裹硅胶垫，针头露出硅胶垫(5)的长度为1.3-1.6mm，针头的直径为0.15-0.3mm；用发酵液颜色为棕黄色或者黄黑色的发酵菌丝经过300目滤网或者miracloth过滤、将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用两层纱布过滤，收集滤液用低温离心机在4℃下离心30分钟，离心机转速为10000转/分钟。离心后发现离心管底部为菌丝饼状或团状，最上面一层为几乎是纯水，用针头抽取菌丝饼或团之上、纯水层之下的中间层液体，作为针刺侵染液；采用手动的方法，针刺蝙蝠蛾幼虫，针刺时的深度把握，以硅胶垫的头部轻触为准；

(5)人工培养出草：

侵染后幼虫在第二年2月以后会陆续出现僵死虫，翻开基质收集僵虫，表面用75％酒精快速消毒，编号后栽在与除开饲料层养虫环境相同的基质中，湿度约为50％，放在培养箱中，模拟高山环境，昼夜变温，其中采用日光灯照射8-9小时，温度控制在15℃-17℃之间，晚上温度控制在3℃-4℃之间，无日光灯照射，时间为15-16小时，待有微微出草时，每天中午采用波长275-420nm的紫外线照射处理10分钟，培养直至出草到适当高度后取出，即得人工培养的冬虫夏草。

进一步地，其特征在于，所述菌种为中国科学院微生物研究所鉴定编号为(2015)微检字第032号的菌种，所述菌种编号为KD₂B₂01的中国被毛孢菌株，且能经过经低温、光照条件在培养基斜面上长出子实体的菌株。

进一步地，所述基质层的第一层为以草炭土和泥炭土腐殖质较高的腐殖质层，第二层为饲料层，第三层以沙土为主，最下层以蛭石为主；将湿度调节好的各层基质分别放置3个月，此时基质微生物环境稳定，再配制基质层用于幼虫饲养，所述基质层铺设厚度为2-10cm。

进一步地，步骤(5)中日光灯光照强度为8000lx。

进一步地，幼虫的饲料为珠芽蓼、圆穗蓼、胡萝卜和甘露子等混合饲料。

本发明的有益效果：本发明的制备方法适用于在低海拔地区全人工培养冬虫夏草，涉及寄主(即蝙蝠蛾幼虫)工程、菌种工程、侵染工程和出草工程等多个技术特点，将各个技术有效的结合，各步骤准确无误的实施，最终成功培育出在成分、外观等与野生虫草一致的冬虫夏草。其中菌种准备步骤中新增了实体催生确认步骤，保证分离出合格的菌种，提高生产效率和产量。此外还采用了特定的养虫方式，保证了虫体培育的世代循环。特别是采用该技术人工培育的冬虫夏草与野生冬虫夏草相比，蛋白质组分相似度比例超过95％，具有广阔的市场应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

(1)菌种准备：

挑选完整新鲜野生虫草，用无菌水冲洗过夜后，在洁净工作台剥开虫体部分，勾取里面菌丝培养，依生长情况，培养90—120天后在培养基斜面上长出子实体，选择符合要求的子实体进行纯化扩培，经分子鉴定确定为菌种无误后进行生产发酵扩大。所述菌种为所述菌种编号为KD2B201的中国被毛孢菌株。

(2)寄主工程：

1)在野外采集的第一代虫蝙蝠蛾蛹用滤纸保湿培养，羽化为成虫后，经形态鉴定其物种，成虫安排在羽化帐中，羽化帐底部铺腊纸，在蜡纸上放入树枝，以便成虫攀附产卵。产卵后将卵收集，将其放入培养箱中培养，其中采用常规滤纸保湿方法保持卵的湿度，培养温度为13℃，培养时间为35天。培养结束后用无菌水冲洗干净。

2)待卵孵化后模拟高山草甸环境饲养幼虫，幼虫的饲料为珠芽蓼、圆穗蓼、胡萝卜和甘露子等混合饲料。基质层的第一层为以草炭土和泥炭土腐殖质较高的腐殖质层，第二层为饲料层，第三层以沙土为主，最下层以蛭石为主，基质层的含水量约40％；将湿度调节好的各层基质分别放置3个月，此时基质微生物环境稳定，再配制基质层用于幼虫饲养，所述基质层铺设厚度为10cm。用于养虫的外部环境为低温高湿环境，温度约为14℃，空间湿度约为50％，卵期和蛹期及成虫饲养空间湿度为90％。每个养虫盒饲养100条虫。

(3)世代循环：

按上述方式饲养后的第二年的3-6月翻开基质，可发现第二代蛹，按雌雄分开饲养，饲养基质层与在前的基质层相同，方便以后进行雌雄配比羽化交尾，养蛹湿度比养虫的湿度大，为60％，空间湿度每天用造雾器喷2次水雾，保持土壤和空间湿度，进行二代虫的饲养，依此方法可进行世代循环。

(4)侵染工程：

用第一步分离确定之菌种进行常规发酵培养，用得到菌丝用300目或者miracloth滤网过滤，将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用两层纱布过滤，保留滤液作为侵染液，此时的侵染液中含有液体发酵的孢子和菌丝段，拌入养虫基质层第三层沙土层中，利用幼虫食入肠道或者接触表皮气孔达到侵染的目的；

(5)人工培养出草：

侵染后幼虫在第二年2月以后会陆续出现僵死虫，翻开基质收集僵虫，表面用75％酒精快速消毒，编号后栽在与除开饲料层养虫环境相同的基质中，湿度约为50％，放在培养箱中，模拟高山环境，昼夜变温，其中采用日光灯照射8小时，温度控制在15℃之间，晚上温度控制在4℃之间，无日光灯照射，时间为16小时，待有微微出草时，每天中午采用波长275-420nm的紫外线照射处理10分钟，培养直至出草到适当高度后取出，即得人工培养的冬虫夏草。

采用该技术人工培育的冬虫夏草与野生冬虫夏草相比，蛋白质组分相似度比例超过95％。

实施例2

(1)菌种准备：

与实施例1相同。

(2)寄主工程：

1)在野外采集的第一代虫蝙蝠蛾蛹用滤纸保湿培养，羽化为成虫后，经形态鉴定其物种，成虫安排在羽化帐中，羽化帐底部铺腊纸，在蜡纸上放入树枝，以便成虫攀附产卵。产卵后将卵收集，将其放入培养箱中培养，其中采用常规滤纸保湿方法保持卵的湿度，培养温度为12℃，培养时间为30天。培养结束后用无菌水冲洗干净。

2)待卵孵化后模拟高山草甸环境饲养幼虫，养虫的基质层以草炭土、泥炭土、沙土、蛭石为主，含水量约35％；基质层用于模拟高山环境用腐殖土。用于养虫的外部环境为低温高湿环境，温度约为14℃，空间湿度约为50％，卵期和蛹期及成虫饲养空间湿度为90％。每个养虫盒饲养100条虫。

(3)世代循环：

按上述方式饲养后的第二年的3-6月翻开基质，可发现第二代蛹，按雌雄分开饲养，饲养基质层与在前的基质层相同，方便以后进行雌雄配比羽化交尾，养蛹湿度比养虫的湿度大，为60％，空间湿度每天用造雾器喷2次水雾，保持土壤和空间湿度，进行二代虫的饲养，依此方法可进行世代循环。

(4)侵染工程：

利用人工培养冬虫夏草用针刺侵染装置进行针刺侵染，所述进行针刺侵染针筒的外侧壁上设有针头容纳盒，针筒的头部设有针头，针头上包裹硅胶垫，针头露出硅胶垫(5)的长度为1.3-1.6mm，针头的直径为0.15-0.3mm。用发酵液颜色为棕黄色或者黄黑色的发酵菌丝经过300目滤网或者miracloth过滤、将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用两层纱布过滤，收集滤液用低温离心机在4℃下离心30分钟，离心机转速为10000转/分钟。离心后发现离心管底部为菌丝饼状或团状，最上面一层为几乎是纯水，用针头抽取菌丝饼或团之上，纯水层之下的中间层液体，作为针刺侵染液；采用手动的方法，针刺蝙蝠蛾幼虫，针刺时的深度把握，以硅胶垫的头部轻触为准。

(5)人工培养出草：

侵染后幼虫在第二年2月以后会陆续出现僵死虫，翻开基质收集僵虫，表面用75％酒精快速消毒，编号后栽在与除开饲料层养虫环境相同的基质中，湿度约为50％，放在培养箱中，模拟高山环境，昼夜变温，其中采用日光灯照射9小时，温度控制在17℃之间，晚上温度控制在3℃之间，无日光灯照射，时间为15小时，待有微微出草时，每天中午采用波长275-420nm的紫外线照射处理10分钟，培养直至出草到适当高度后取出，即得人工培养的冬虫夏草。

采用该技术人工培育的冬虫夏草与野生冬虫夏草相比，蛋白质组分相似度比例超过95％。

以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明之精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于本申请专利范围中。

Claims (5)

1.一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种准备：

挑选完整新鲜野生虫草，用无菌水冲洗过夜后，在洁净工作台剥开虫体部分，勾取里面菌丝培养，依生长情况，培养90-120天后，低温、光照的条件在培养基斜面上长出子实体，选择符合要求的子实体进行纯化扩培，经分子鉴定确定为菌种无误后进行生产发酵扩大；

(2)寄主工程：

1)在野外采集的第一代虫蝙蝠蛾蛹用滤纸保湿培养，羽化为成虫后，经形态鉴定其物种，成虫安排在羽化帐中，羽化帐底部铺腊纸，在蜡纸上放入树枝，以便成虫攀附产卵；产卵后将卵收集，将其放入培养箱中培养，其中采用常规滤纸保湿方法保持卵的湿度，培养温度为12-15℃，培养时间为28-40天；培养结束后用无菌水冲洗干净；

2)待卵孵化后模拟高山草甸环境饲养幼虫，养虫的基质层以草炭土、泥炭土、沙土、蛭石为主，含水量约35-40％；基质层用于模拟高山环境用腐殖土。用于养虫的外部环境为低温高湿环境，温度约为14℃，空间湿度约为50％，卵期和蛹期及成虫饲养空间湿度为90％；每个养虫盒饲养100条虫；

(3)世代循环：

按上述方式饲养后的第二年的3-6月翻开基质，可发现第二代蛹，按雌雄分开饲养，饲养基质层与在前的基质层相同，方便以后进行雌雄配比羽化交尾，养蛹湿度比养虫的湿度大，为60％，空间湿度每天用造雾器喷2次水雾，保持土壤和空间湿度，进行二代虫的饲养，依此方法可进行世代循环；

(4)侵染工程：

采用下述方法中的任意一种：

方法一：用第一步分离确定之菌种进行常规发酵培养，用得到菌丝用300目滤网过滤，将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用100目过滤网过滤，保留滤液作为侵染液，此时的侵染液中含有液体发酵的孢子和菌丝段，拌入养虫基质层第三层沙土层中，利用幼虫食入肠道或者接触表皮气孔达到侵染的目的；

方法二：利用人工培养冬虫夏草用针刺侵染装置进行针刺侵染，所述进行针刺侵染针筒的外侧壁上设有针头容纳盒，针筒的头部设有针头，针头上包裹硅胶垫，针头露出硅胶垫(5)的长度为1.3-1.6mm，针头的直径为0.15-0.3mm；用发酵液颜色为棕黄色或者黄黑色的发酵菌丝经过300目滤网或者miracloth过滤、将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用两层纱布过滤，收集滤液用低温离心机在4℃下离心30分钟，离心机转速为10000转/分钟。离心后发现离心管底部为菌丝饼状或团状，最上面一层为几乎是纯水，用针头抽取菌丝饼或团之上、纯水层之下的中间层液体，作为针刺侵染液；采用手动的方法，针刺蝙蝠蛾幼虫，针刺时的深度把握，以硅胶垫的头部轻触为准；

(5)人工培养出草：

侵染后幼虫在第二年2月以后会陆续出现僵死虫，翻开基质收集僵虫，表面用75％酒精快速消毒，编号后栽在与除开饲料层养虫环境相同的基质中，湿度约为50％，放在培养箱中，模拟高山环境，昼夜变温，其中采用日光灯照射8-9小时，温度控制在15℃-17℃之间，晚上温度控制在3℃-4℃之间，无日光灯照射，时间为15-16小时，待有微微出草时，每天中午采用波长275-420nm的紫外线照射处理10分钟，培养直至出草到适当高度后取出，即得人工培养的冬虫夏草。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种为中国科学院微生物研究所鉴定编号为(2015)微检字第032号的菌种，所述菌种编号为KD₂B₂01的中国被毛孢菌株，且能经过经低温、光照条件在培养基斜面上长出子实体的菌株。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基质层的第一层为以草炭土和泥炭土腐殖质较高的腐殖质层，第二层为饲料层，第三层以沙土为主，最下层以蛭石为主；将湿度调节好的各层基质分别放置3个月，此时基质微生物环境稳定，再配制基质层用于幼虫饲养，所述基质层铺设厚度为2-10cm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中日光灯光照强度为8000lx。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，幼虫的饲料为珠芽蓼、圆穗蓼、胡萝卜和甘露子的混合饲料。