CN111602556A - 一种高海拔地区培育新疆虫草的方法 - Google Patents
一种高海拔地区培育新疆虫草的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111602556A CN111602556A CN202010489684.1A CN202010489684A CN111602556A CN 111602556 A CN111602556 A CN 111602556A CN 202010489684 A CN202010489684 A CN 202010489684A CN 111602556 A CN111602556 A CN 111602556A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xinjiang
- soil
- plants
- cordyceps sinensis
- cordyceps
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001248610 Ophiocordyceps sinensis Species 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241000330899 Hepialus Species 0.000 claims abstract description 64
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 60
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 84
- 241000190633 Cordyceps Species 0.000 claims description 40
- 241000736199 Paeonia Species 0.000 claims description 32
- 235000006484 Paeonia officinalis Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 241000489523 Veratrum Species 0.000 claims description 13
- 229940057613 veratrum Drugs 0.000 claims description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 9
- 241001299817 Dictamnus Species 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- 241000124033 Salix Species 0.000 claims description 6
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000103926 Chamaenerion angustifolium Species 0.000 claims description 5
- 235000008302 Chamaenerion angustifolium Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000032669 eclosion Effects 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 241000489520 Veratrum album Species 0.000 claims description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 3
- 241000218652 Larix Species 0.000 claims description 3
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000218657 Picea Species 0.000 claims description 3
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 claims description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003864 humus Substances 0.000 claims description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 claims description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 3
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 claims description 3
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 claims description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims 3
- 241001264174 Cordyceps militaris Species 0.000 claims 1
- 241000984759 Paeonia sinjiangensis Species 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 230000019617 pupation Effects 0.000 claims 1
- 238000005201 scrubbing Methods 0.000 claims 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 241000205407 Polygonum Species 0.000 description 5
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 4
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 4
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 3
- 241000123968 Paeonia anomala Species 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 241001061264 Astragalus Species 0.000 description 2
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 2
- 244000182625 Dictamnus albus Species 0.000 description 2
- 240000001745 Rheum palmatum Species 0.000 description 2
- 235000008090 Rheum palmatum Nutrition 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 2
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 2
- 230000035929 gnawing Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- IBSREHMXUMOFBB-JFUDTMANSA-N 5u8924t11h Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O3)C=C[C@H](C)[C@@H](C(C)C)O4)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 IBSREHMXUMOFBB-JFUDTMANSA-N 0.000 description 1
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 1
- 241001105161 Aconitum leucostomum Species 0.000 description 1
- 241000057414 Ahamus yunnanensis Species 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 240000005250 Chrysanthemum indicum Species 0.000 description 1
- 235000018274 Cunila origanoides Nutrition 0.000 description 1
- 235000014866 Dictamnus albus Nutrition 0.000 description 1
- 241000130660 Hepialidae Species 0.000 description 1
- 244000236658 Paeonia lactiflora Species 0.000 description 1
- 235000008598 Paeonia lactiflora Nutrition 0.000 description 1
- 241001474977 Palla Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000500439 Plutella Species 0.000 description 1
- 244000228295 Polygonum viviparum Species 0.000 description 1
- 235000012804 Polygonum viviparum Nutrition 0.000 description 1
- 241000208422 Rhododendron Species 0.000 description 1
- 241000133134 Saussurea Species 0.000 description 1
- 241001145025 Saussurea involucrata Species 0.000 description 1
- 241000220156 Saxifraga Species 0.000 description 1
- 240000001949 Taraxacum officinale Species 0.000 description 1
- 235000006754 Taraxacum officinale Nutrition 0.000 description 1
- 235000005187 Taraxacum officinale ssp. officinale Nutrition 0.000 description 1
- 241000330910 Thitarodes jialangensis Species 0.000 description 1
- 241001170744 Veratrum nigrum Species 0.000 description 1
- 229950008167 abamectin Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000006533 astragalus Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- XAMUDJHXFNRLCY-UHFFFAOYSA-N phenthoate Chemical compound CCOC(=O)C(SP(=S)(OC)OC)C1=CC=CC=C1 XAMUDJHXFNRLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004233 talus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G18/00—Cultivation of mushrooms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G22/00—Cultivation of specific crops or plants not otherwise provided for
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Mushroom Cultivation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高海拔地区培育新疆虫草的方法，包括以下步骤：步骤1、培育用地的选择：选择海拔在1000‑2500m，远离牲畜、鼠患和蚂蚁巢，有原生草皮覆盖，周围有新疆落叶松、云杉、桦树、山杨分布的林下，空气相对湿度为50‑90%；步骤2、食源植物的移栽与管理：将所选地的原生草皮揭起备用，注意少破坏草皮根系并带上根系层附着的土壤，将土壤深翻，清除杂物，同时清除土栖昆虫；步骤3、阿尔泰蝠蛾的接种和繁育：阿尔泰蝠蛾在野外两到三年完成一个世代；步骤4.新疆虫草菌的人工培养与接种；步骤5、新疆虫草的采收。本发明在培育过程中无任何有毒和对环境造成污染的成分，培育出的虫草具有环境友好、绿色环保无添加的优点。
Description
技术领域
本发明属于虫草培育技术领域，涉及一种高海拔地区培育新疆虫草的方法。
背景技术
新疆虫草，又称新疆冬虫夏草、新疆黑槌虫草、细虫草、阿尔泰虫草等，为新疆产珍贵药材，是新疆虫草菌Ophiocordyceps gracilis侵染其寄主昆虫——阿尔泰蝠蛾Hepialus altaicola后形成的虫菌复合体，分布海拔范围为1000m-2500m。新疆虫草菌，属子囊菌门Ascmycotina，肉座菌目Hypocreales，虫草菌科Cordycipitaceae，线虫草属Ophiocordyceps，与冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis隶属于同一个属。因为阿尔泰蝠蛾仅分布于新疆的阿尔泰山，为新疆特有种昆虫，所以新疆虫草主产于新疆阿尔泰山。新疆虫草为新疆传统的哈萨克民族药，其成分和主要功效与冬虫夏草基本相同，已列入新疆维吾尔自治区药品标准(赵恒和屈新兰，2000)。
冬虫夏草的采收季一般只有一个月左右，随后虫草的营养会被子座耗尽而丧失药用价值，但新疆虫草由于很少产生子座，加之新疆环境干燥，新疆虫草菌可以在土中存在3-5y不腐烂，因此可以3y集中采收一次较为方便。但是，由于新疆虫草很少有长出地表的子座，一般不足1％，所以不能针对性地进行采挖，只能刨地约40cm，因此对生态环境破坏很大，很有必要开展其野外人工繁育。
以往对于阿尔泰蝠蛾取食植物的报道较少，且不够准确，我们数年的野外研究结果显示阿尔泰蝠蛾不同于其他蝠蛾科昆虫，未发现它取食珠芽蓼Polygonum viviparum、圆穗蓼Polygonum sphaerostachyum、小大黄Rheum pumilum、黄芪Astragalus spp.、金露梅Potentilla fruticosa等植物，它主要取食新疆芍药Paeonia sinjiangensis、柳兰Chamaenerion angustifolium、新疆白鲜Dictamnus angustifolius、新疆藜芦Veratrumlobelianum、新疆猪牙花Erythronium sibiricum、阿尔泰牡丹草Gymnospermium altaicum等，这些植物大多为新疆特有植物，它虽然能，但很少取食已报道(赵恒等，1999)的Paeoniaanomala(文中称阿尔泰赤芍，实为块根芍药)。赵恒等(1999，赤芍园的营造和虫草培育技术)报道利用Paeonia anomala(文中称阿尔泰赤芍，实为块根芍药)培育新疆虫草的技术，与我们野外调查研究的结果不一致，阿尔泰蝠蛾幼虫很少取食Paeonia anomala，不足新疆芍药等植物下的1％(n>2000)，幼虫的采食痕也很浅，并且明显瘦弱许多。故通过种植Paeonia anomala培育新疆虫草的技术，我们认为有欠缺，因为我们野外调查的结果显示在该植物下很少有新疆虫草生成。但是在新疆芍药、新疆藜芦、柳兰和新疆白鲜等植物下的虫草分布较多。刘昕等(申请日2006-07-17，申请号200610036510.X，一种高寒生境蝠蛾属昆虫的繁育方法)培育蝠蛾(文中提到阿尔泰蝠蛾)所用的植物为珠芽蓼Polygonumviviparum、冰川蓼Polygonum glaciale、圆穗蓼Polygonum sphaerostachyum、绵头雪莲花Saussurea laniceps、小大黄Rheum pumilum、金露梅Potentilla fruticosa、地垫柳Salixspp.、杜鹃Rhododendron spp.、黄芪Astragalus spp.、虎耳草Saxifraga spp.等，均不是阿尔泰蝠蛾的食物，它们或者在新疆没有分布(如冰川蓼、绵头雪莲花、圆穗蓼等)，或者有分布也不被阿尔泰蝠蛾所取食(如珠芽蓼等)。同时，未发现在这些植物下有新疆虫草分布。
另外，上述现有技术中，使用了毒鼠磷、阿维菌素、植物复合肥、细胞分裂素等毒性或者非环境友好型产品，容易影响生态环境，容易导致蝠蛾体内有毒药或者化学药品的残留，进而影响后续虫草的品质，甚至对消费者的健康产生不良影响。
由于之前对其野外食源植物知之甚少，加之对野外新疆虫草菌研究的欠缺，目前尚缺乏在高海拔地区培育新疆虫草的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种高海拔地区培育新疆虫草的方法。
其具体技术方案为：
一种高海拔地区培育新疆虫草的方法，包括以下步骤：
步骤1、培育用地的选择：
在秋季下雪前或者春季融化后，选择海拔在1000-2500m，远离牲畜、鼠患和蚂蚁巢，有原生草皮覆盖，周围有新疆落叶松、云杉、桦树、山杨等分布的林下、林间空地或近山顶的草甸，降水充足、排水良好，空气相对湿度为50-90％，坡向以半阳半阴、或者阴坡为主，坡度为10-60度，地势平坦，土壤为黑色或者黑褐色颗粒状的腐殖土、土层深厚、pH为5.5-7.5、含水量为15-40％，离水源较近，便于灌溉；
步骤2、食源植物的移栽与管理：
将所选地的原生草皮揭起备用，注意少破坏草皮根系并带上根系层附着的土壤，将土壤深翻50cm，清除碎石块等杂物，同时清除蛴螬、步甲等土栖昆虫。从山上其他区域采集新疆芍药Paeonia sinjiangensis，柳兰Chamaenerion angustifolium，新疆白鲜Dictamnus angustifolius，新疆藜芦Veratrum lobelianum等植物的根茎，连带原地土壤一起装入塑料桶(d＝35cm,h＝30cm)中，注意不要破坏植株的幼根和芽。将食源植物连带原生地土壤移栽至虫草培育用地。株距50-80cm，覆土之后，将先前揭起的原生草皮覆盖在上面，轻轻踏平，注意将食源植物的芽略露出地面，以便植物后续能够正常生长。然后，浇透水，使土壤含水量在31-42％之间。由于所用植物为移栽植株，保留了完整的根系和芽，同时带有原生地土壤，食源植物全部存活(n>40)。
步骤3、阿尔泰蝠蛾的接种和繁育：
前三年，将野外采集和室内饲养得到的阿尔泰蝠蛾幼虫埋入食源植物根系附近，注意只打开草皮根系即可，任由幼虫爬入其适生土层，不可埋入幼虫后用力践踏土壤，以免幼虫受伤、死亡。也可将交配后成虫所产的卵，培养至卵色变黑后轻轻撒于食源植物根际的草皮根系间，由于蝠蛾卵没有粘性，可自由滑落接触土壤，这样一则可利用湿润土壤为卵保湿，利于其孵化，二则可使幼虫在孵化后选择适生环境。第一年以接种大龄幼虫为主，其后，任由阿尔泰蝠蛾幼虫在此取食，化蛹、羽化、交配产卵、孵化幼虫，完成其生活史。第三年后不再人工补充虫源。阿尔泰蝠蛾一般在野外两到三年完成一个世代。
步骤4.新疆虫草菌的人工培养与接种：
将野外采集的新鲜的新疆虫草，清除表面泥土和菌索，用含75％乙醇的酒精棉擦洗虫草表面，然后在0.1％氯化汞溶液中消毒4min，无菌水冲洗后，再用灭菌后的滤纸吸干水分，之后，用灭菌后的剪刀，剪成约0.5cm的小段，接种于固体培养基上。在15-20℃、16L:8D、40-70RH条件下培养两个月。
在无菌条件下，取固体培养基上的菌丝体，进行分子鉴定。方法如下：利用基因组提取试剂盒(康为，CW0552),按照说明书提取其基因组后，利用ITS通用引物(上游序列如SEQ ID NO:1所示，下游序列如SEQ ID NO:2所示)进行PCR后(变温程序:94℃预变性2min，94℃变性45s，55-57℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min)，对PCR产物进行测序(上海生工)，将测序所得序列与网上基因数据库中的新疆虫草菌Ophiocordycepsgracilis序列进行比对鉴定。
将分子鉴定正确的新疆虫草菌菌落，转移至液体培养基中，在15-20℃、100-180r/min、40-70RH条件下培养两个月。
然后，将液体培养基当做接种菌液，按照每株食源植物100mL/次，用注射器接种于植株根系四周的土壤上，在移栽植物第二年后，每年重复接种菌液2-3次。
步骤5、新疆虫草的采收：
在移栽食源植物五年后的春天，于雪化后，掀起草皮，挖掘土壤深度达50cm，观察发现，在新疆芍药、新疆藜芦、柳兰和新疆白鲜的植物根下皆有幼虫生活和新疆虫草产出。各植物根上，有明显啃食痕迹，虽未明显影响植株的分根生长和存活，但幼虫数量多的植株下，根部被破坏更严重；同时在土壤中和草皮层可见有蛹羽化后剩余的蛹壳，显示有成虫正常羽化；并且在土层中发现了大量1-3龄的一年生低龄幼虫，这些都说明阿尔泰蝠蛾已能在此正常繁衍。
进一步，步骤1中，所述培育用地有原生新疆芍药、新疆藜芦、柳兰、新疆白鲜等分布的区域，作为虫草培育用地。
进一步，步骤四中，所述固体培养基的配方是：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、蛋白胨15g/L、MgSO4·7H2O 0.07g/L、KH2PO4 0.7g/L、琼脂18g/L，所述液体培养基的配方是：葡萄糖20g/L、玉米粉40g/L、蛋白胨15g/L、MgSO4·7H2O 0.07g/L、KH2PO4 0.7g/L。
进一步，采收虫草后，将幼虫按原处放回，覆土，覆盖草皮，在秋天抽样观察时，发现依然有新疆虫草产生，说明虫草在此已经定植，可以在以后的时间里也继续不断产出。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明在培育过程中采用纯天然植物进行培育，中间无任何有毒和对环境造成污染的成分，培育出的虫草具有环境友好、绿色环保无添加的优点；本发明的培育方法充分利用海拔地区野外的有利条件并结合人工培养，具有节约成本的特点，适合推广应用。
附图说明
图1.在固体培养基上的新疆虫草菌形态，图1A,顶面观；图1B,底面观；
图2.阿尔泰蝠蛾幼虫在新疆芍药Paeonia sinjiangensis根下取食分布图；图2A图为蝠蛾幼虫在新疆芍药根部分布的生态图,图2B为图2A中虚线所对应位置的放大图；
图3.新疆虫草的生成生境示意图；
图4.新疆芍药Paeonia sinjiangensis的四季状态图；
图5.阿尔泰蝠蛾幼虫取食的新疆芍药Paeonia sinjiangensis根部图；
图6.阿尔泰蝠蛾幼虫及其在新疆藜芦Veratrum lobelianum根部分布图；
图7.阿尔泰蝠蛾幼虫取食柳兰Chamaenerion angustifolium根部的图像；
图8.阿尔泰蝠蛾幼虫及其取食的新疆白鲜Dictamnus angustifolius根部图像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
一种高海拔地区培育新疆虫草的方法，包括以下步骤：
步骤1、培育用地的选择：
在秋季下雪前或者春季融化后，选择海拔在1000-2500m，远离牲畜、鼠患和蚂蚁巢，有原生草皮覆盖，周围有新疆落叶松、云杉、桦树、山杨等分布的林下、林间空地或近山顶的草甸，降水充足、排水良好，空气相对湿度为50-90％，坡向以半阳半阴、或者阴坡为主，坡度为10-60度，地势平坦，土壤为黑色或者黑褐色颗粒状的腐殖土、土层深厚、pH为5.5-7.5、含水量为15-40％，离水源较近，便于灌溉，最好有原生新疆芍药、新疆藜芦、柳兰、新疆白鲜等分布的区域，作为虫草培育用地。
步骤2、食源植物的移栽与管理：
将所选地的原生草皮揭起备用，注意少破坏草皮根系并带上根系层附着的土壤，将土壤深翻50cm，清除碎石块等杂物，同时清除蛴螬、步甲等土栖昆虫。从山上其他区域采集新疆芍药Paeonia sinjiangensis，柳兰Chamaenerion angustifolium，新疆白鲜Dictamnus angustifolius，新疆藜芦Veratrum lobelianum等植物的根茎，连带原地土壤一起装入塑料桶(d＝35cm,h＝30cm)中，注意不要破坏植株的幼根和芽。将食源植物连带原生地土壤移栽至虫草培育用地。株距50-80cm，覆土之后，将先前揭起的原生草皮覆盖在上面，轻轻踏平，注意将食源植物的芽略露出地面，以便植物后续能够正常生长。然后，浇透水，使土壤含水量在31-42％之间。由于所用植物为移栽植株，保留了完整的根系和芽，同时带有原生地土壤，食源植物全部存活(n>40)。
步骤3、阿尔泰蝠蛾的接种和繁育：
前三年，将野外采集和室内饲养得到的阿尔泰蝠蛾幼虫埋入食源植物根系附近，注意只打开草皮根系即可，任由幼虫爬入其适生土层，不可埋入幼虫后用力践踏土壤，以免幼虫受伤、死亡。也可将交配后成虫所产的卵，培养至卵色变黑后轻轻撒于食源植物根际的草皮根系间，由于蝠蛾卵没有粘性，可自由滑落接触土壤，这样一则可利用湿润土壤为卵保湿，利于其孵化，二则可使幼虫在孵化后选择适生环境。第一年以接种大龄幼虫为主，其后，任由阿尔泰蝠蛾幼虫在此取食，化蛹、羽化、交配产卵、孵化幼虫，完成其生活史。第三年后不再人工补充虫源。阿尔泰蝠蛾一般在野外两到三年完成一个世代。
步骤4.新疆虫草菌的人工培养与接种：
将野外采集的新鲜的新疆虫草，清除表面泥土和菌索，用含75％乙醇的酒精棉擦洗虫草表面，然后在0.1％氯化汞溶液中消毒4min，无菌水冲洗后，再用灭菌后的滤纸吸干水分，之后，用灭菌后的剪刀，剪成约0.5cm的小段，接种于固体培养基上。固体培养基的配方是：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L(去皮、切碎、煮沸30min、纱布过滤取上清)、蛋白胨15g/L、MgSO4·7H2O 0.07g/L、KH2PO4 0.7g/L、琼脂18g/L。在15-20℃、16L:8D、40-70RH条件下培养两个月。
在无菌条件下，取固体培养基上的菌丝体，进行分子鉴定。方法如下：利用基因组提取试剂盒(康为，CW0552),按照说明书提取其基因组后，利用ITS通用引物(上游序列为：TCCTCCGCTTATTGATATGC，下游序列为：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)进行PCR后(变温程序:94℃预变性2min，94℃变性45s，55-57℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min)，对PCR产物进行测序(上海生工)，将测序所得序列与网上基因数据库中的新疆虫草菌Ophiocordyceps gracilis序列进行比对鉴定。
将分子鉴定正确的新疆虫草菌菌落，转移至液体培养基中，液体培养基的配方是：葡萄糖20g/L、玉米粉40g/L、蛋白胨15g/L、MgSO4·7H2O 0.07g/L、KH2PO4 0.7g/L。在15-20℃、100-180r/min、40-70RH条件下培养两个月。
然后，将液体培养基当做接种菌液，按照每株食源植物100mL/次，用注射器接种于植株根系四周的土壤上，在移栽植物第二年后，每年重复接种菌液2-3次。
步骤5、新疆虫草的采收：
在移栽食源植物五年后的春天，于雪化后，掀起草皮，挖掘土壤深度达50cm，观察发现，在新疆芍药、新疆藜芦、柳兰和新疆白鲜的植物根下皆有幼虫生活和新疆虫草产出。各植物根上，有明显啃食痕迹，虽未明显影响植株的分根生长和存活，但幼虫数量多的植株下，根部被破坏更严重；同时在土壤中和草皮层可见有蛹羽化后剩余的蛹壳，显示有成虫正常羽化；并且在土层中发现了大量1-3龄的一年生低龄幼虫，这些都说明阿尔泰蝠蛾已能在此正常繁衍。具体数据参见表1。
虽然在新疆芍药、新疆藜芦、柳兰和新疆白鲜下的幼虫和新疆虫草的平均数目依次递减，但仅有新疆芍药下的虫草数显著多于新疆白鲜，其他各食源植物之间差异不显著。说明这些植物均是阿尔泰蝠蛾的良好植物，可能由于新疆芍药、新疆藜芦、柳兰和新疆白鲜根的肉质化程度有依次降低的趋势，造就了它们的差异性；另外，即使同一种植物，每个植株之间幼虫和虫草的分布数据差异很大，造成了各种植物相应的数据变异范围很大，例如新疆芍药下的幼虫分布范围涵盖从每平米10头到每平米186头，最小值和最大值之间差了一个数量级，这可能与阿尔泰蝠蛾产卵相对集中，不均匀分布有关。
采收虫草后，将幼虫按原处放回，覆土，覆盖草皮，在秋天抽样观察时，发现依然有新疆虫草产生，说明虫草在此已经定植，可以在以后的时间里也继续不断产出。
表1阿尔泰蝠蛾幼虫和新疆虫草在移栽各种食源植物五年后的分布情况。
备注：该数据为移栽植物五年后的统计结果，表中不同字母之间代表差异显著，具有相同字母代表差异不显著。只有新疆芍药和新疆白鲜之间，在幼虫数目上差异显著(p＝0.0461，Unpairedttest，twotailed，t＝2.188，df＝14；数据在分析之前进行了Ln数据转换)之外，其他数据之间无显著性差异。
此处所列食源植物为新疆芍药Paeonia sinjiangensis，柳兰Chamaenerionangustifolium，新疆白鲜Dictamnus angustifolius，新疆藜芦Veratrum lobelianum，但也可以是新疆猪牙花Erythronium sibiricum，乌头Aconitum leucostomum，阿尔泰牡丹草Gymnospermium altaicum，胡萝卜Daucus carota，药用蒲公英Taraxacum officinale等的一种或者多种。此处所列为食源植物的移栽，因为移栽已经长成的植物来饲养阿尔泰蝠蛾，能比较快捷地培养新疆虫草，但也可以通过播种种子等方式进行栽培各种食源植物。这些食源植物可以是野生的植物，也可以是胡萝卜等能在野外存活并能为阿尔泰蝠蛾所取食的植物。
另外，本发明所饲养的为阿尔泰蝠蛾，但是稍变换食源植物或者菌种，也可以用于碌曲蝠蛾、虫草蝠蛾、白蛾蝠蛾、白马蝠蛾、美丽蝠蛾、东隅蝠蛾、贡嘎蝠蛾、甲郎蝠蛾、金沙蝠蛾、康定蝠蛾、康姬蝠蛾、察隅蝠蛾、察里蝠蛾、小金蝠蛾、拉脊蝠蛾、云南蝠蛾、玉树蝠蛾、蒲氏钩蝠蛾、棒蝠蛾、贵德蝠蛾、斜脉蝠蛾、德钦蝠蛾、玉龙蝠蛾等昆虫的野外繁育以及相他虫草菌的培养。
图1.在固体培养基上的新疆虫草菌形态，图1A,顶面观；图1B,底面观；
图2.阿尔泰蝠蛾幼虫在新疆芍药Paeonia sinjiangensis根下取食分布图；图2A图为蝠蛾幼虫在新疆芍药根部分布的生态图,图2B为图2A中虚线所对应位置的放大，图中箭头所指为幼虫的头部，阿尔泰蝠蛾幼虫在新疆芍药的根部取食，头部朝上，尾端朝下；
图3.新疆虫草的生成生境示意图；插图所示为新疆芍药根部的局部放大，新疆虫草生成与新疆芍药根部附近；
图4.新疆芍药Paeonia sinjiangensis的四季状态图，左图，春天，可见花蕾；中图上，夏天，开花；右图，秋天，结实；中图下，冬天，以芽和根越冬；
图5.阿尔泰蝠蛾幼虫取食的新疆芍药Paeonia sinjiangensis根部图；图中标尺右侧为幼虫在芍药根上的取食痕；
图6.阿尔泰蝠蛾幼虫及其在新疆藜芦Veratrum lobelianum根部分布图；图中的右上角插图所示为从另一个角度所拍的新疆藜芦根部采食痕,箭头所指为幼虫因取食而切断的藜芦根系；
图7.阿尔泰蝠蛾幼虫取食柳兰Chamaenerion angustifolium根部的图像；幼虫在柳兰根系上随着取食的深入,逐渐钻入柳兰根部；
图8.阿尔泰蝠蛾幼虫及其取食的新疆白鲜Dictamnus angustifolius根部图像；图中下部为阿尔泰蝠蛾幼虫,上部为新疆白鲜根,可见两块明显的取食痕。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种高海拔地区培育新疆虫草的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、培育用地的选择：
在秋季下雪前或者春季融化后，选择海拔在1000-2500m，远离牲畜、鼠患和蚂蚁巢，有原生草皮覆盖，周围有新疆落叶松、云杉、桦树、山杨分布的林下、林间空地或近山顶的草甸，降水充足、排水良好，空气相对湿度为50-90%，坡向以半阳半阴、或者阴坡为主，坡度为10-60度，地势平坦，土壤为黑色或者黑褐色颗粒状的腐殖土、土层深厚、pH为5.5-7.5、含水量为15-40%；
步骤2、食源植物的移栽与管理：
将所选地的原生草皮揭起备用，注意少破坏草皮根系并带上根系层附着的土壤，将土壤深翻50cm，清除杂物，同时清除土栖昆虫；从山上其他区域采集新疆芍药Paeoniasinjiangensis，柳兰Chamaenerion angustifolium，新疆白鲜Dictamnus angustifolius，新疆藜芦Veratrum lobelianum植物的根茎，连带原地土壤一起装入塑料桶中，注意不要破坏植株的幼根和芽；将食源植物连带原生地土壤移栽至虫草培育用地；株距50-80cm，覆土之后，将先前揭起的原生草皮覆盖在上面，轻轻踏平，注意将食源植物的芽略露出地面，以便植物后续能够正常生长；然后，浇透水，使土壤含水量在31-42%之间；所用植物为移栽植株，保留了完整的根系和芽，同时带有原生地土壤，食源植物全部存活；
步骤3、阿尔泰蝠蛾的接种和繁育：
前三年，将野外采集和室内饲养得到的阿尔泰蝠蛾幼虫埋入食源植物根系附近，注意只打开草皮根系，任由幼虫爬入其适生土层，不能埋入幼虫后用力践踏土壤，或者将交配后成虫所产的卵，培养至卵色变黑后轻轻撒于食源植物根际的草皮根系间，第一年以接种大龄幼虫为主，其后，任由阿尔泰蝠蛾幼虫在此取食，化蛹、羽化、交配产卵、孵化幼虫，完成其生活史；第三年后不再人工补充虫源；阿尔泰蝠蛾在野外两到三年完成一个世代；
步骤4.新疆虫草菌的人工培养与接种：
将野外采集的新鲜的新疆虫草，清除表面泥土和菌索，用含75％乙醇的酒精棉擦洗虫草表面，然后在0.1％氯化汞溶液中消毒4min，无菌水冲洗后，再用灭菌后的滤纸吸干水分，之后，用灭菌后的剪刀，剪成0.5cm的小段，接种于固体培养基上；在15-20℃、16L:8D、40-70RH条件下培养两个月；
在无菌条件下，取固体培养基上的菌丝体，进行分子鉴定；方法如下：利用基因组提取试剂盒康为，CW0552,按照说明书提取其基因组后，利用ITS通用引物进行PCR，其中，ITS通用引物的上游序列如SEQ ID NO:1所示，ITS通用引物的下游序列如SEQ ID NO:2所示，对PCR产物进行测序，将测序所得序列与网上基因数据库中的新疆虫草菌Ophiocordycepsgracilis序列进行比对鉴定；
将分子鉴定正确的新疆虫草菌菌落，转移至液体培养基中，在15-20℃、100-180r/min、40-70RH条件下培养两个月；
然后，将液体培养基当做接种菌液，按照每株食源植物100mL/次，用注射器接种于植株根系四周的土壤上，在移栽植物第二年后，每年重复接种菌液2-3次；
步骤5、新疆虫草的采收：
在移栽食源植物五年后的春天，于雪化后，掀起草皮，挖掘土壤深度达50cm，观察发现，在新疆芍药、新疆藜芦、柳兰和新疆白鲜的植物根下皆有幼虫生活和新疆虫草产出。
2.根据权利要求1所述的高海拔地区培育新疆虫草的方法，其特征在于，步骤1中，所述培育用地有原生新疆芍药、新疆藜芦、柳兰、新疆白鲜分布的区域，作为虫草培育用地。
3. 根据权利要求1所述的高海拔地区培育新疆虫草的方法，其特征在于，步骤4中，所述固体培养基的配方是：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、蛋白胨15g/L、MgSO4·7H2O 0.07g/L、KH2PO4 0.7g/L、琼脂18g/L，所述液体培养基的配方是：葡萄糖20g/L、玉米粉40g/L、蛋白胨15g/L、MgSO4·7H2O 0.07g/L、KH2PO4 0.7g/L。
4.根据权利要求1所述的高海拔地区培育新疆虫草的方法，其特征在于，步骤4中，PCR过程中的变温程序:94℃预变性2min，94℃变性45s，55-57℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。
5.根据权利要求1所述的高海拔地区培育新疆虫草的方法，其特征在于，采收虫草后，将幼虫按原处放回，覆土，覆盖草皮，在秋天抽样观察时，发现依然有新疆虫草产生，说明虫草在此已经定植，能在以后的时间里也继续不断产出。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010489684.1A CN111602556A (zh) | 2020-06-02 | 2020-06-02 | 一种高海拔地区培育新疆虫草的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010489684.1A CN111602556A (zh) | 2020-06-02 | 2020-06-02 | 一种高海拔地区培育新疆虫草的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111602556A true CN111602556A (zh) | 2020-09-01 |
Family
ID=72198814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010489684.1A Pending CN111602556A (zh) | 2020-06-02 | 2020-06-02 | 一种高海拔地区培育新疆虫草的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111602556A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1948456A (zh) * | 2006-11-08 | 2007-04-18 | 中山大学 | 一种提高青藏高原冬虫夏草产量的方法 |
| CN104365320A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-02-25 | 中山大学 | 一种利用青藏高原高寒草甸原生态条件制备冬虫夏草菌种材料的方法 |
| CN104381011A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-03-04 | 中山大学 | 一种冬虫夏草菌种材料的制备及侵染钩蝠蛾幼虫的方法 |
| CN105075667A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-11-25 | 四川藏宝虫草生物科技有限公司 | 一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法 |
| CN105660172A (zh) * | 2016-01-07 | 2016-06-15 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种高寒地区可持续高产野生冬虫夏草的方法 |
-
2020
- 2020-06-02 CN CN202010489684.1A patent/CN111602556A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1948456A (zh) * | 2006-11-08 | 2007-04-18 | 中山大学 | 一种提高青藏高原冬虫夏草产量的方法 |
| CN104365320A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-02-25 | 中山大学 | 一种利用青藏高原高寒草甸原生态条件制备冬虫夏草菌种材料的方法 |
| CN104381011A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-03-04 | 中山大学 | 一种冬虫夏草菌种材料的制备及侵染钩蝠蛾幼虫的方法 |
| CN105075667A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-11-25 | 四川藏宝虫草生物科技有限公司 | 一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法 |
| CN105660172A (zh) * | 2016-01-07 | 2016-06-15 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种高寒地区可持续高产野生冬虫夏草的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 黄罗东等: "细虫草资源研究现状及开发利用进展", 《食用菌学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109220465B (zh) | 一种花椒树的栽培及修剪方法 | |
| CN102939857B (zh) | 一种野生干巴菌生态扩繁方法 | |
| CN101669430B (zh) | 暗褐网柄牛肝菌半人工栽培方法 | |
| CN1316867C (zh) | 一种何首乌的规范化种植方法 | |
| CN103988745A (zh) | 澳洲坚果育种方法 | |
| CN105052665A (zh) | 一种良种金槐大苗的培育方法 | |
| CN101715754A (zh) | 应用无土培育大麦苗饲养灰飞虱的方法 | |
| CN104322264A (zh) | 一种菊花的无公害种植方法 | |
| CN103004454A (zh) | 白蚁系列鸡枞菌的纯人工栽培方法 | |
| CN104082003B (zh) | 一种金樱子快速无性繁殖方法 | |
| CN110235731A (zh) | 一种利用红薯对田间喜旱莲子草进行替代控制的方法 | |
| CN104396503A (zh) | 草莓组培苗夏季驯化过渡方法 | |
| CN108323397B (zh) | 一种红根野蚕豆人工种植的方法 | |
| CN105660190A (zh) | 灵芝与林蛙互补共生立体栽培养殖方法 | |
| CN109294930A (zh) | 一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法 | |
| CN111527986B (zh) | 利用油茶枝条制作紫灵芝木段菌棒在油茶林下种植的方法 | |
| Pratt et al. | Plant-related factors influence the effectiveness of Neoseiulus fallacis (Acari: Phytoseiidae), a biological control agent of spider mites on landscape ornamental plants | |
| CN108770593B (zh) | 一种紫丁香蘑菌株及其子实体栽培方法 | |
| CN102301885A (zh) | 一种淡水盆栽桐花树的方法 | |
| CN103069980B (zh) | 白花除虫菊的栽培方法 | |
| CN111602556A (zh) | 一种高海拔地区培育新疆虫草的方法 | |
| CN105900685A (zh) | 一种猪苓蕨苔混栽方法 | |
| CN113557912A (zh) | 一种箭叶淫羊藿与经济林木套种的方法 | |
| KR101980827B1 (ko) | 신품종 향 두릅나무 | |
| CN111972232A (zh) | 一种双收藜麦种植方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200901 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |