CN104365320A - 一种利用青藏高原高寒草甸原生态条件制备冬虫夏草菌种材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用青藏高原高寒草甸原有生态条件制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法。该方法利用青藏高原高寒草甸原有植被及生态条件，建立高寒植物苗培育园，采用适合高原的农业园艺栽培技术进行水肥及光照管理栽培获得高寒植物苗，并将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到高寒植物苗上，通过遮阴网喷雾等方法营造适宜的环境促进冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与活体高寒植物组织共生，共生处理后获得的冬虫夏草菌种材料对钩蝠蛾幼虫的侵染率可达85.9～91.2％。

Description

一种利用青藏高原高寒草甸原生态条件制备冬虫夏草菌种材料的方法

技术领域

本发明涉及一种利用青藏高原高寒草甸原有生态条件制备冬虫夏草菌种材料的方法。

背景技术

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sung，Sung，Hywel-Jones&Spatafora是一种虫生子囊真菌，寄生于鳞翅目Lepidoptera蝠蛾科Hepialidae钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的幼虫，其无性型为中国被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu&Zeng。冬虫夏草寄主钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的一个世代包括卵、幼虫、蛹和成虫四个发育阶段，幼虫营地下隧道式穴居生活，杂食性，喜食圆穗蓼、头花蓼、小大黄和珠芽蓼等高寒植物的幼嫩根茎。

冬虫夏草分布于青藏高原高海拔区域，该区域高寒缺氧，其气温常年具有高山低温的特点。利用青藏高原高寒草甸原有生态环境条件进行原生态冬虫夏草道地药材产业化研究，可有效保持冬虫夏草道地产区的原生态属性，同时也可以最大程度节省能源消耗，达到清洁生产的目的。

目前采用常规冬虫夏草菌种侵染寄主钩蝠蛾昆虫幼虫仍存在侵染率低、耗费时间长等问题。中国发明专利申请(公开号：CN102696555A)公开了一种半野生人工培殖冬虫夏草的方法，中国发明专利申请(公开号：CN102405763A)公开了一种冬虫夏草的培育方法，上述2个专利申请均采用含有中国被毛孢的菌液连续喷洒寄主幼虫体表的方法进行接种侵染；中国发明专利申请(公开号：CN102696392A)公开了天然冬虫夏草的增产方法，其中采用诱集液诱集蝙蝠蛾幼虫后，向幼虫喷洒蝙蝠蛾被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉两种菌种液体种；中国发明专利申请(公开号：CN102106235A)公开了一种全人工培养冬虫夏草的方法，其中采用一端直径小于0.2mm的不锈钢实心针或空心针的针状器具，沾取中国被毛孢菌体和孢子混悬液刺伤寄主幼虫的方法进行接种侵染；中国发明专利申请(公开号：CN102792855A)公开了一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法，采用冬虫夏草菌皮作为菌种材料灌注、或拌入饲料喂食、或注射、或喷淋侵染寄主幼虫。但上述方法存在侵染活性低、或损伤后存活率低、或耗费时间过长、或菌种材料产量有限等问题，是制约原生态冬虫夏草道地药材产业化的关键问题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用高寒草甸原有生态条件制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法。该方法利用青藏高原高寒草甸原有植被及生态条件，通过构建冬虫夏草菌中国被毛孢与活体高寒植物组织的共生体，增大高寒植物组织中国被毛孢的共生量，激活中国被毛孢的侵染活性，得到对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料，达到高效侵染寄主钩蝠蛾幼虫的目的。

发明人研究发现，冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢在自然界中与其适生地中的多种高寒植物的根、茎、叶等组织存在共生现象。进一步的研究发现，经高寒植物组织根、茎、叶等组织共生，共生后要比未共生的冬虫夏草菌的侵染活性高数十至数百倍，基于这一原理发明本方法。

本发明制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法包括：在青藏高原冬虫夏草适生的高寒草甸原有植被及生态环境下，建立高寒植物苗培育园，利用原生态温湿度及光照条件，通过适合高原的农业园艺栽培技术进行水肥管理，栽培并获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物苗；将冬虫夏草菌源接种到培育园栽培的高寒植物苗组织上，根据不同海拔的气候规律情况，利用每年5～11月原生态温湿度条件，遮阴营造适宜的条件，使冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与活体高寒植物共生培育形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料。

本发明的具体步骤包括：

1.在海拔2500～5200米的青藏高原冬虫夏草适生地区域的高寒草甸，利用其原有高寒植被植株，以10～20m×10～20m大小为建设单位，建立冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫食料植物的高寒植物苗培育园；采用通常农业园艺规划方法进行分区建垄，垄面大小为50～90cm×450～1920cm，在垄面中间上方高30～100cm处铺设水肥管理管路，垄间设立宽20～30cm深5～10cm的区域便于排水和管理人员行走，培育园四周留下约35～50cm的空区；

2.应用适合高原的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，视当月降水量情况每年5～11月，每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在25～45％左右，每1至2个月在一次喷水中水：尿体积比为100∶5～100∶20浓度加入牛羊尿或人尿；每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥，施放量为干重每平方米约150～250g；

3.利用原生态温湿度及光照条件，促进培育园内原有的高寒植物苗旺盛生长；或者再将培育园以外的钩蝠蛾幼虫食料植物和/或其种子移栽补充到培育园中栽培，或者再将快速扩繁的高寒植物组培苗移栽到培育园中，使之与培育园内原有植被一同旺盛生长获得高寒植物苗；

4.从冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutellasinensis)，通过常规低温发酵法在13±5℃条件下发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物与水体积比1∶100～1∶1000稀释成悬浮液，作为冬虫夏草菌源；或直接采用冬虫夏草的新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液，作为冬虫夏草菌源；

5.将制备冬虫夏草菌源喷淋接种到培育园栽培的高寒植物苗上，每平方米喷施300～500ml菌悬液，连续喷施1～7天，每天喷施1～3次，喷施后遮阴，根据不同海拔的气候规律情况，利用每年5～11月原生态温湿度条件，共生培育7～30天，增大高寒植物组织中中国被毛孢的共生量，激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性；采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成共生体，经分子检验为中国被毛孢后，将共生体组织直接作为具有高侵染活性的菌种材料；亦可是将获得的共生体组织切成5～20mm小段，制备成具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法于2～4℃保存备用。

本发明方法获得的具有高侵染活性的菌种材料可用于高效侵染钩蝠蛾幼虫。使用时，可直接冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，亦可将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫，使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料，从而被高效侵染。在寄主钩蝠蛾幼虫取食接触菌种材料7～15天后，采用显微镜检查及分子生物方法检测钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体，经统计，钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为85.9～91.2％。

本发明所述的采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化所用的分离培养基可以是察氏培养基、或马铃薯培养基、或肉汤培养基、或酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、或高氏一号培养基中的一种。所述的通常发酵方法可以是固体发酵，或是液体发酵，或是固液双相发酵。所述固体发酵可以是大麦、小麦、大米、玉米等常规农作谷物中的一种或多种作为固体培养基。所述液体发酵可以是普通肉汤、或蛋白胨水、或酵母提取物等常规底料中的一种或多种作为液体培养基。所述固液双相发酵可采用深层发酵产生菌丝或芽生孢子后，在固体培养基上再继续发酵的方法，其培养基可以是上述固体发酵培养基和液体发酵培养基中的一种。

本发明所述的高寒植物苗可以是培育园内高寒草甸原有植被，亦可是将采集的高寒植物和/或种子移栽在培育园内；所述高寒植物的种类包括柔软点地梅(Androsacemollis)、东俄洛紫菀(Aster tongolensis)、川滇苔草(Carex schneideri)、膨囊苔草(C.lehmanii)、青绿苔草(C.breviculmis)、黑褐苔草(C.atrofusca)、一岁苔草(C.heterostachya)、萨嘎苔草(C.sagaensis)、舌叶垂头菊(Cremanthodium linguiatum)、裂叶蓝钟花(Cyananthus lobatus)、丽江蓝钟花(C.lichiangensis)、大萼蓝钟花(C.macrocalyx)、发草(Deschampsia caespitosa)、锡金柳叶菜(Epilobium sikkimense)、高山嵩草(Kobresiapygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、线叶嵩草(K.capollifolia)、林芝橐吾(Ligularia nyingchiensis)、聂拉木厚棱芹(Pachypleurum nyalamense)、西藏厚棱芹(P.xizangense)、斑唇马先蒿(Pedicularis longifora)、昌都马先蒿(P.sherriffii)、草甸马先蒿(P.roylei)、西藏糙苏(Phlomis tibetica)、长果车前(Plantago asiatica)、细茎蓼(Polygonum filicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圆穗蓼(P.macrophyllum)、狭叶圆穗蓼(P.macrophyllum)、头花蓼(P.capitatum)、穆坪耳蕨(Polystichum moupinense)、楔叶委陵菜(Potentilla cuneata)、纤细委陵菜(P.gracillima)、多头委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)、杂色钟报春(Primula alpicola)、高原毛茛(Ranunculus tanguticus)、云生毛茛(R.nephelogens)、西藏大黄(Rheum tibeticum)、小大黄(R.pumilum)、尼泊尔酸模(Rumexnepalensis)、双齿风毛菊(Saussurea lavrenkoana)、禾叶风毛菊(S.graminea)、星状凤毛菊(S.stella)、卵叶风毛菊(S.ovatifolia)、钩柱唐松草(Thalictrum uncatum)、高山唐松草(T.alpinun)和长果婆婆娜(Veronica chayuensis)中的一种或多种。

本发明所述的冬虫夏草寄主钩蝠蛾包括曲线钩蝠蛾T.fusconebulosa(De Geer，1778)(Hepialus)comb.n.、赭褐钩蝠蛾T.gallicus(Lederer，1852)(Hepialus)comb.n.、白线钩蝠蛾T.nubifer(Lederer，1853)(Hepialus)comb.n.、德氏钩蝠蛾T.davidi(Poujade，1886)(Hepialus)comb.n.、虫草钩蝠蛾Thitarodes armoricanus(Oberthür，1909)(Hepialus)、斜脉钩蝠蛾T.oblifurcus(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、樟木钩蝠蛾T.zhangmoensis(Chu etWang，1985)(Hepialus)、康姬钩蝠蛾T.kangdingroides(Chu etWang，1985)(Hepialus)、康定钩蝠蛾T.kangdingensis(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、德钦钩蝠蛾T.deqingensis(Liang，1988)(Hepialus)、白马钩蝠蛾T.baimaensis(Liang，1988)(Hepialus)、梅里钩蝠蛾T.meiliensis(Liang，1988)(Hepialus)、贡嘎钩蝠蛾T.gonggaensis(Fu et Huang，1991)(Hepialus)、人支钩蝠蛾T.renzhiensis(Yang，1991)(Hepialus)、芒康钩蝠蛾T.markamensis(Yang et al.，1992)(Hepialus)、草地钩蝠蛾T.pratensis(Yang et al.，1992)(Hepialus)、锈色钩蝠蛾T.ferrugineus(Yang et al.，1993)(Hepialus)、金沙钩蝠蛾T.jinshaensis(Yang，1993)(Hepialus)、白纹钩蝠蛾T.albipictus(Yang，1993)(Hepialus)、甲郎钩蝠蛾T.jialangensis(Yang，1994)(Hepialus)、察里钩蝠蛾T.zaliensis(Yang，1994)(Hepialus)、中支钩蝠蛾T.zhongzhiensis(Liang，1995)(Hepialus)、叶日钩蝠蛾T.yeriensis(Liang，1995)(Hepialus)、美丽钩蝠蛾T.callinivalis(Liang，1995)(Hepialus)、里塘钩蝠蛾T.litangensis(Liang，1995)(Hepialus)、循化钩蝠蛾T.xunhuaensis(Yang et Yang，1995)(Hepialus)、白带钩蝠蛾T.cingulatus(Yang et Zhang，1995)(Hepialus)、巴青钩蝠蛾T.baqingensis(Yang et Jiang，1995)(Hepialus)、当雄钩蝠蛾T.damxungensis(Yang，1995)(Hepialus)、玉树钩蝠蛾T.yushuensis(Wang et al.，1995)(Hepialus)、宽兜钩蝠蛾T.latitegumenus(Shen et al.，1997)(Hepialus)comb.n.、双带钩蝠蛾T.bibelteus(Shen et al.，1997)(Hepialus)comb.n.、拉脊蝠蛾T.lagii(Yan，2001)(Hepialus)comb.n.、比如钩蝠蛾T.biruens(Fu，2002)(Hepialus)comb.n.、海南钩蝠蛾T.hainanensis(Chu et Wang，2004)(Hepialus)comb.n.、纳木钩蝠蛾T.namensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、日喀则钩蝠蛾T.xigazeensis(Chu etal.，2004)(Hepialus)comb.n.、永胜钩蝠蛾T.yongshengensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、定结钩蝠蛾T.dinggyeensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、南木林钩蝠蛾T.nanmlinensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、亚东钩蝠蛾T.yadongensis(Chu etal.，2004)(Hepialus)comb.n.、蒲氏钩蝠蛾T.pui(Zhang et al.，2007)(Hepialus)comb.n.、小金钩蝠蛾T.xiaojinensis(Tu et al.，2009)(Hepialus)comb.n.、色季拉钩蝠蛾T.sejilaensis(Zou et al.，2011)、加查钩蝠蛾T.jiachaensis(Zou et al.，2011)中的一种或多种。

具体实施方式

实施例一

1.在青藏高原海拔4300米的冬虫夏草适生地区域的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，保留原有草甸植被，以10m×10m为一个单位建设培育园，培育园内规划建设成8个90cm×900cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄面上方高100cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，垄间挖开宽、深分别为25cm×5cm的区域便于排水及管理人员行走，培植园四周分别留下约50cm的工作区。

2.每年5～11月视当月降水量情况，每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在38％左右，在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶5浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约250g。

3.将培育园附近珠芽蓼(Polygonum viviparum)、大萼委陵菜(Potentilla conferta)、杂色钟报春(Primula alpicola)、大萼蓝钟花(Cyananthus macrocalyx)、舌叶垂头菊(Cremanthodium linguiatum)、锡金柳叶菜(Epilobium sikkimense)等植物苗及种子移栽至培育园内，使之与培育园内原有植被一同旺盛生长获得高寒植物苗。

4.从培育园附近冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规马铃薯培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经大麦固态培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，将发酵获得的菌团用搅拌器均匀打碎，并按发酵物重量与水体积比1∶1000进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径2mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源。

5.每年5～11月，选择白天温度不超过18℃，晚上温度不低于4℃的阴云天气，将制备的冬虫夏草菌源利用灌溉管路或加压喷枪均匀喷淋接种到培育园高寒植物苗上，每平方米喷入450ml悬浮液，1天内分早中晚3次喷施，喷施后用黑色遮阴网遮阴共生培育7天后，采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体，经分子检验菌丝为中国被毛孢后，可直接作为具有高侵染活性的菌种材料。

6.选择白天温度不超过20℃，晚上温度不低于0℃的阴云天气，在中午气温较高时寄主蒲氏钩蝠蛾(Thitarodes pui)幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，每平方米约控释50头，使蒲氏钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，14天后将蒲氏钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测蒲氏钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，蒲氏钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为86.7％。

实施例二

1.在青藏高原海拔4600米的冬虫夏草适生地区域的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，保留原有草甸植被，以20m×20m为一个单位建设培育园，培育园内规划建设成19个75cm×1920cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄面上方80cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，用于喷施水肥管理，垄间挖开宽、深分别为27.5cm×10cm的区域便于排水及管理人员行走，培植园四周分别留下约40cm的工作区。

2.每年5～11月视当月降水量情况每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在45％左右，在第一次喷水中加入水：尿体积比为100∶20浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约150g。

3.利用原生态温湿度及光照条件，促进培育园内原有的柔软点地梅(Androsace mollis)、纤细委陵菜(Potentilla gracillima)、狭叶圆穗蓼(Polygonum macrophyllum)和萨嘎苔草(Carex sagaensis)等植物旺盛生长；同时在高寒草甸采集上述植物的幼苗及种子，通过离体组织快速繁殖技术获得组培苗，并将组培苗移栽至垄内，促进其旺盛生长获得高寒植物苗。

4.在每年6～10月在培育园附近的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草子囊孢子，直接稀释制成悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有1000个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

5.每年6～10月，选择白天温度不超过18℃，晚上温度不低于4℃，将制备的冬虫夏草菌源，喷淋接种到高寒植物苗上，每平方米喷淋350ml菌悬液，连续喷施7天，每天1次，午后喷施，喷施后用黑色遮阴网遮阴共生培育30天后，采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物组培组织缠绕形成大量共生体，经分子检验菌丝为中国被毛孢后，可直接作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料。

6.选择白天温度不超过18℃，晚上温度不低于0℃，在中午气温较高时寄主色季拉钩蝠蛾(Thitarodes sejilaensis)幼虫投置到冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，每平方米约控释100头，使色季拉钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，15天后将色季拉钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测色季拉钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，色季拉钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为89.3％。

实施例三

1.在青藏高原海拔3700米的冬虫夏草适生地区域的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，保留原有草甸植被，以20m×10m为一个单位建设培育园，培育园内规划建设成19个75cm×920cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄面上方50cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，用于喷施水肥管理，垄间挖开宽、深分别为27cm×10cm的区域便于排水及管理人员行走，培植园四周分别留下约45cm的工作区。

2.每年5～11月视当月降水量情况每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在35％左右，在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶10浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约175g。

3.利用原生态温湿度及光照条件，促进培育园内原有的珠芽蓼(Polygonum viviparum)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentilla multifiaa)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodium hastioides)、头花蓼(Polygonummacrophytum)等植物旺盛生长。

4.在每年5～9月在培育园附近的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草子囊孢子，直接稀释制成悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有100个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

5.每年5～9月，选择白天温度不超过18℃，晚上温度不低于4℃，将制备的冬虫夏草菌源，喷淋接种到高寒植物苗上，每平方米喷淋500ml菌悬液，连续喷施5天，每天1次，午后喷施，喷施后用黑色遮阴网遮阴共生培育20天后，采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物组培组织缠绕形成大量共生体，经分子检验菌丝为中国被毛孢后，可直接作为具有高侵染活性的菌种材料。

6.选择白天温度不超过18℃，晚上温度不低于0℃，在中午气温较高时寄主虫草钩蝠蛾(Thitarodes armoricanus)幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，每平方米约控释100头，使虫草钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，12天后将虫草钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测虫草钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，虫草钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为85.9％。

实施例四

1.在青藏高原海拔5200米的冬虫夏草适生地区域的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，保留原有草甸植被，以15m×10m为一个培育园建设单位，培育园内规划建设2排50cm×450cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄面上方30cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，用于喷施水肥管理，垄间挖开宽、深分别为20cm×5cm的区域便于排水及管理人员行走，培植园四周及排间分别留下约35cm的工作区。

2.每年5～11月视当月降水量情况每个月喷淋水一至四次，使深度为15cm的土壤含水量保持在25％左右，在第一次喷水中加入水：尿体积比为100∶13浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约200g。

3.采集培育园附近的圆穗蓼(Polygonum macrophyrum)、珠芽蓼(Polygonum viviparum)、高山唐松草(Thactriun alpinun)、矮火绒草(Leontopodium alpinumm)、委陵菜(Potentillaanserine)、高山嵩草(Kobrasiapygmaea)、黑褐苔草(Carexa trofusca)等植物的种子收集后撒入培育园内，利用原生态温湿度及光照条件，并使之旺盛生长。

4.从青海玉树地区的冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规肉汤培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经通常普通肉汤液体培养基在13±5℃发酵25天，然后置于小麦为底物的固体培养基上再继续发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得菌团用搅拌器均匀打碎，按发酵物重量与水体积比1∶500进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径1.5mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源；

5.每年7～9月，选择白天温度不超过18℃，晚上温度不低于4℃，将制备的冬虫夏草菌源均匀喷淋接种到培育园高寒植物苗上，每平方米喷入300ml菌悬液，喷完后用黑色遮阴网遮阴，连续喷施3天，每天喷施2次，早晚各一次，遮阴共生培育15天后，采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体；经分子检验菌丝为中国被毛孢后，将共生体地上部分割回，将共生体组织切成5～20mm小段，制备成具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法存放于2℃，保存备用；

6.将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主比如钩蝠蛾(Thitarodes biruens)幼虫，每头投入5g高侵染活性菌种材料，使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料，7天后将比如钩蝠蛾幼虫从饲养盒中挖出，采用显微镜检查及分子生物方法检测比如钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，比如钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为91.2％。

实施例五

1.在青藏高原海拔2500米的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，以10m×20m为一个单位建设培育园，将培育园内原有草甸植被除去并将土壤平整，在培育园内规划建设成8个90cm×1900cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄面上方75cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，用于喷施水肥管理，垄间挖开宽、深分别为30cm×8cm的区域便于排水及管理人员行走，培植园四周分别留下约50cm的工作区。

2.每年5～11月视当月降水量情况每个月喷淋水一至四次，使土壤15cm深处的含水量保持在33％左右，每月在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶15浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约210g。

3.采集高山嵩草(Kobresia pygmaea)、一岁苔草(Carex heterostachya)、珠芽蓼(Polygonum viviparum)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodium hastioides)、头花蓼(Polygonum macrophytum)等植物及种子移栽至培育园中，利用原生态温湿度及光照条件，并使之旺盛生长获得高寒植物苗。

4.从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规察氏培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，经通常蛋白胨水液体培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，最后按发酵液与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

5.每年9～10月，选择白天温度不超过20℃，晚上温度不低于4℃的阴云天气，将制备的冬虫夏草菌源，利用灌溉管路或加压喷枪均匀喷淋接种到培育园高寒植物苗上，每平方米喷入400ml悬浮液，连续喷施4天，每天喷施2次，早晚各1次，喷完后用黑色遮阴网遮阴共生培育25天后，采用显微镜检查冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成共生体，经分子检验菌丝为中国被毛孢后，将获得的共生体组织切成5～20mm小段，制备成具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法存放于4℃，保存备用。

6.将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，每头幼虫投放5～10克，使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为90.8％。

实施例六(反向例)

1.在青藏高原海拔2500米的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，以10m×20m为一个单位建设培育园，将培育园内原有草甸植被除去并将土壤平整，在培育园内规划建设成8个90cm×1900cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄中间高75cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，用于喷施水肥管理，垄间挖开宽、深分别为30cm×8cm的区域便于排水及管理人员行走，培植园四周分别留下约50cm的工作区。

2.每年5～11月视当月降水量情况每个月喷淋水一至四次，使土壤15cm深处的含水量保持在33％左右，每月在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶15浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约210g，采集高山嵩草(Kobresia pygmaea)、一岁苔草(Carex heterostachya)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentilla multifida)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodium hastioides)、头花蓼(Polygonum macrophytum)等植物及种子移栽至培育园中，并使之旺盛生长获得高寒植物苗。

3.从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规察氏培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，经通常蛋白胨水液体培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，最后按发酵液与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

4.将获得的高寒植物苗地上及地下部分组织切成5～20mm小段作为钩蝠蛾幼虫的饲料，同时将冬虫夏草菌源喷淋到高寒植物饲料表面或喷淋到替代饲料如胡萝卜表面，直接投喂冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，每头幼虫投放5～10克，使寄主幼虫取食并充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率只有29.4％。

实施例七(反向例)

1.从西藏那曲冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规马铃薯培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经大麦固态培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，并按发酵物重量与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径2mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源；

2.将制备的冬虫夏草菌源直接喷淋到冬虫夏草寄主比如钩蝠蛾Thitarodes biruens幼虫，使寄主幼虫充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，中国被毛孢侵染比如钩蝠蛾幼虫的侵染率只有21.7％。

实施例八(反向例)

1.在每年的6～8月在青海玉树的冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草子囊孢子，直接稀释制成悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有1000个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

2.将冬虫夏草菌源直接喷淋到冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，使寄主幼虫充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被冬虫夏草子囊孢子的侵染率只有10.8％。

Claims (5)

1.一种利用青藏高原高寒草甸原有生态条件制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法，该方法包括：在青藏高原冬虫夏草适生的高寒草甸原有植被及生态环境下，建立高寒植物苗培育园，利用原生态温湿度及光照条件，通过适合高原的农业园艺栽培技术进行水肥管理，栽培并获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物苗；将冬虫夏草菌源接种到培育园栽培的高寒植物苗组织上，利用每年5～11月原生态温湿度条件，遮阴使冬虫夏草菌中国被毛孢与活体高寒植物共生培育，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述的高寒植物苗培育园是在海拔2500～5200米的青藏高原冬虫夏草适生地区域的高寒草甸，利用其原有高寒植被植株，以10～20m×10～20m大小为建设单位，建立的冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫食料植物的高寒植物苗培育园；培育园内采用通常农业园艺规划方法进行分区建垄，垄面大小为50～90cm×450～1920cm，在垄面中间上方高30～100cm处铺设水肥管理管路，垄间设立宽20～30cm深5～10cm的区域便于排水和管理人员行走，培育园四周留下约35～50cm的空区。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的通过适合高原的农业园艺栽培技术进行水肥管理是：每年5～11月，每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在25～45％左右，每1至2个月在一次喷水中按水：尿体积比为100∶5～100∶20浓度加入牛羊尿或人尿；每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥，施放为干重每平方米150～250g。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述的冬虫夏草菌源的制备方法是：从冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutellasinensis)，通过常规低温发酵法发酵，并进一步按发酵物与水体积比1∶100～1∶1000稀释成悬浮液，作为冬虫夏草菌源；或直接采用冬虫夏草的新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

5.按照权利要求1或2或4所述的方法，其特征是所述的将冬虫夏草菌源接种到植物组织上的接种及共生培育的方法是：将制备的冬虫夏草菌源喷淋接种到培育园栽培的高寒植物苗上，每平方米喷施300～500ml菌悬液，连续喷施1～7天，每天喷施1～3次，共生培育的时间为7～30天，温湿度条件为当地青藏高原5～11月自然温湿度值，共生培育时遮阴培育。