CN104365319B - 一种利用高寒植物培育大棚制备冬虫夏草菌种材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用高寒植物培育大棚制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法。该方法利用在青藏高原建立高寒植物培育大棚，通过人工或自动化控制大棚开关及喷淋水雾来控制大棚内温湿度，应用适合高原大棚的农业园艺栽培技术获得高寒植物苗，将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到大棚栽培的高寒植物苗上，通过营造适应的环境促进冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与活体高寒植物组织共生，增大中国被毛孢在高寒植物组织中的共生量，共生处理后的冬虫夏草菌种材料对钩蝠蛾幼虫的侵染率可达90.8～94.9％。

Description

一种利用高寒植物培育大棚制备冬虫夏草菌种材料的方法

技术领域

本发明涉及一种利用高寒植物培育大棚制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法。

背景技术

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sung，Sung，Hywel-Jones&Spatafora是一种虫生子囊真菌，寄生于鳞翅目Lepidoptera蝠蛾科Hepialidae钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的幼虫，其无性型为中国被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu&Zeng。冬虫夏草寄主钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的一个世代包括卵、幼虫、蛹和成虫四个发育阶段，幼虫营地下隧道式穴居生活，杂食性，喜食圆穗蓼、头花蓼、小大黄和珠芽蓼等高寒植物的幼嫩根茎。

冬虫夏草分布于青藏高原高海拔区域，其生长范围局限，产量也极为有限。它是青藏高原特色名贵滋补中药材，具有重要的药用和经济价值。由于冬虫夏草的形成过程中仍有许多关键问题尚不清楚，中国被毛孢侵染钩蝠蛾昆虫的侵染活性较弱，原生态冬虫夏草道地药材的产业化迄今仍存在许多障碍难题。

冬虫夏草所生长的青藏高原高海拔高寒生境，其主要地理环境特点是冻土期长、昼夜温差大、日照强烈、氧气含量低。冬虫夏草寄主钩蝠蛾的食料高寒植物存在着有效生长期短、生长发育繁殖缓慢等问题。通过在青藏高原建造自动化控制或人工控制的高原大棚，已是现代化高原农业生产的重要手段，通过大棚技术可以有效增加高寒植物的生长期和有效积温，显著促进高寒植物的生长发育与繁殖，同时可节约大量的人力物力成本，有效提高生产力和生产效率。

目前采用常规冬虫夏草菌种侵染寄主钩蝠蛾昆虫幼虫还存在侵染率低、耗费时间长等问题。中国发明专利申请(公开号：CN102696555A)公开了一种半野生人工培殖冬虫夏草的方法，中国发明专利申请(公开号：CN102405763A)公开了一种冬虫夏草的培育方法，上述2个专利申请均采用含有中国被毛孢的菌液连续喷洒寄主幼虫体表的方法进行接种侵染；中国发明专利申请(公开号：CN102696392A)公开了天然冬虫夏草的增产方法，其中采用诱集液诱集蝙蝠蛾幼虫后，向幼虫喷洒蝙蝠蛾被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉两种菌种液体种；中国发明专利申请(公开号：CN102106235A)公开了一种全人工培养冬虫夏草的方法，其中采用一端直径小于0.2mm的不锈钢实心针或空心针的针状器具，沾取中国被毛孢菌体和孢子混悬液刺伤寄主幼虫的方法进行接种侵染；中国发明专利申请(公开号：CN102792855A)公开了一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法，采用冬虫夏草菌皮作为菌种材料灌注、或拌入饲料喂食、或注射、或喷淋侵染寄主幼虫。但上述方法存在侵染活性低、或损伤后存活率低、或耗费时间过长、或菌种材料产量有限等问题，是制约原生态冬虫夏草道地药材产业化的关键问题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用高寒植物培育大棚制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法。该方法利用在青藏高原建立冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫食料植物的高寒植物苗培育大棚，通过构建冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与活体高寒植物组织的共生体，促进中国被毛孢与高寒植物组织共生，激活中国被毛孢的侵染活性，得到对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料，达到高效侵染寄主钩蝠蛾幼虫的目的。

发明人在通过分子探针跟踪检测研究发现，冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢在自然界中与其适生地中的多种高寒植物的根、茎、叶等组织存在共生现象。进一步的研究发现，经高寒植物组织根、茎、叶等组织共生，共生后比未共生的中国被毛孢的侵染活性高数十至数百倍，基于这一原理发明本方法。

本发明利用高寒植物培育大棚制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法包括：在青藏高原环境下建立高寒植物培育大棚，利用大棚营造合适的温湿度及光照条件，通过适合高原大棚的农业园艺栽培技术进行水肥管理，栽培并获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物苗；将冬虫夏草菌源接种到培育大棚栽培的高寒植物苗组织上，利用大棚营造适宜的温湿度及光照条件，使冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与活体高寒植物共生培育，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料。

本发明的具体步骤包括：

1.在海拔2800～5200米的青藏高原高寒草甸，保留原有高寒草甸植被或将草甸开垦平整，以长10～20m×宽7.5～15m大小为建设单位，用薄膜或阳光板或玻璃等透明材料搭建顶棚及四周可控开关的大棚，采用通常农业园艺规划方法在大棚内进行分区建垄，垄面大小为50～90cm×450～1920cm，在垄面上方高30～100cm处铺设水肥管理管路，垄间设立宽20～30cm深5～10cm的区域便于排水和管理人员行走，培育大棚四周留下约35～50cm的空区。

2.应用适合高原大棚的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，根据天气空气湿度及土壤湿度条件每个月喷淋水一至六次，使15cm深度的土壤含水量保持在25～35％左右，每1至2个月在一次喷水中按体积比100∶5～100∶20浓度加入牛羊尿或人尿；每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥，施放量为干重每平方米约150～250g。

3.通过人工或自动化控制大棚四周及顶部透明材料的开关，同时通过调节棚外辅助层(遮阴网或保温被)的开关以及喷雾装置调节大棚内温度，使棚内最高气温不超过22℃，空气湿度为55～100％，利用原生态光照条件栽培大棚内保留的原有高寒植物苗，或是将冬虫夏草适生地的钩蝠蛾幼虫食料高寒植物移栽入棚，或是将高寒植物种子播入大棚中栽培，或是将快速扩繁的高寒植物组培苗移栽入大棚中，并使之旺盛生长获得高寒植物苗。

4.从青海玉树或西藏那曲等冬虫夏草主产区或培育大棚附近的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，通过常规低温发酵法在13±5℃条件下发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物质量与水体积比1∶100～1∶1000稀释成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源；或直接采用冬虫夏草的新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液，作为冬虫夏草菌源；

5.选择外界气温日间温度不超过18℃，夜间温度不低于4℃的月份时段，将制备的冬虫夏草菌源喷淋接种到培育大棚栽培的高寒植物苗上，每平方米喷施100～300ml菌悬液，连续喷施2～5天，每天喷施1～3次，喷施后遮阴，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部的开关以调节大棚内温度在13±5℃，温度超过18℃时，通过喷雾装置喷水雾通风降温，空气湿度65～95％，共生培育7～30天，促进中国被毛孢与高寒植物组织共生。

6.采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成共生体，经分子检验菌丝为中国被毛孢后，可直接作为具有高侵染活性的菌种材料；亦可是将获得的共生体组织切成5～20mm小段，制备成具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法存放于2～4℃，保存备用。

本发明方法获得的具有高侵染活性的菌种材料可用于高效侵染钩蝠蛾幼虫。使用时，可直接冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫投置到冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，亦可将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫，使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料。在寄主钩蝠蛾幼虫取食接触菌种材料3～15天后，采用显微镜检查及分子生物方法检测钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体，经统计，钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为90.8～94.9％。

本发明所述的采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化所用的分离培养基可以是察氏培养基、或马铃薯培养基、或肉汤培养基、或酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、或高氏一号培养基中的一种。所述的通常发酵方法可以是固体发酵，或是液体发酵，或是固液双相发酵。所述固体发酵可以是大麦、小麦、大米、玉米等常规农作谷物中的一种或多种作为固体培养基。所述液体发酵可以是普通肉汤、或蛋白胨水、或酵母提取物等常规底料中的一种或多种作为液体培养基。所述固液双相发酵可采用深层发酵产生菌丝或芽生孢子后，在固体培养基上再继续发酵的方法，其培养基可以是上述固体发酵培养基和液体发酵培养基中的各一种。

本发明所述的高寒植物苗可以是大棚内原有高寒草甸植被，亦可是将采集的高寒植物和/或种子移栽在大棚内；所述高寒植物的种类包括柔软点地梅(Androsace mollis)、东俄洛紫菀(Aster tongolensis)、川滇苔草(Carex schneideri)、膨囊苔草(C.lehmanii)、青绿苔草(C.breviculmis)、黑褐苔草(C.atrofusca)、一岁苔草(C.heterostachya)、萨嘎苔草(C.sagaensis)、舌叶垂头菊(Cremanthodium linguiatum)、裂叶蓝钟花(Cyananthuslobatus)、丽江蓝钟花(C.lichiangensis)、大萼蓝钟花(C.macrocalyx)、发草(Deschampsiacaespitosa)、锡金柳叶菜(Epilobium sikkimense)、高山嵩草(Kobresia pygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、线叶嵩草(K.capollifolia)、林芝橐吾(Ligularia nyingchiensis)、聂拉木厚棱芹(Pachypleurumnyalamense)、西藏厚棱芹(P.xizangense)、斑唇马先蒿(Pedicularis longifora)、昌都马先蒿(P.sherriffii)、草甸马先蒿(P.roylei)、西藏糙苏(Phlomis tibetica)、长果车前(Plantago asiatica)、细茎蓼(Polygonum filicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圆穗蓼(P.macrophyllum)、狭叶圆穗蓼(P.macrophyllum)、头花蓼(P.capitatum)、穆坪耳蕨(Polystichum moupinense)、楔叶委陵菜(Potentilla cuneata)、纤细委陵菜(P.gracillima)、多头委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)、杂色钟报春(Primula alpicola)、高原毛茛(Ranunculus tanguticus)、云生毛茛(R.nephelogens)、西藏大黄(Rheumtibeticum)、小大黄(R.pumilum)、尼泊尔酸模(Rumex nepalensis)、双齿风毛菊(Saussurealavrenkoana)、禾叶风毛菊(S.graminea)、星状凤毛菊(S.stella)、卵叶风毛菊(S.ovatifolia)、钩柱唐松草(Thalictrum uncatum)、高山唐松草(T.alpinun)和长果婆婆娜(Veronica chayuensis)中的一种或多种。

本发明所述的冬虫夏草寄主钩蝠蛾包括曲线钩蝠蛾T.fusconebulosa(De Geer，1778)(Hepialus)comb.n.、赭褐钩蝠蛾T.gallicus(Lederer，1852)(Hepialus)comb.n.、白线钩蝠蛾T.nubifer(Lederer，1853)(Hepialus)comb.n.、德氏钩蝠蛾T.davidi(Poujade，1886)(Hepialus)comb.n.、虫草钩蝠蛾Thitarodes armoricanus(Oberthür，1909)(Hepialus)、斜脉钩蝠蛾T.oblifurcus(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、樟木钩蝠蛾T.zhangmoensis(Chu etWang，1985)(Hepialus)、康姬钩蝠蛾T.kangdingroides(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、康定钩蝠蛾T.kangdingensis(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、德钦钩蝠蛾T.deqingensis(Liang，1988)(Hepialus)、白马钩蝠蛾T.baimaensis(Liang，1988)(Hepialus)、梅里钩蝠蛾T.meiliensis(Liang，1988)(Hepialus)、贡嘎钩蝠蛾T.gonggaensis(Fu et Huang，1991)(Hepialus)、人支钩蝠蛾T.renzhiensis(Yang，1991)(Hepialus)、芒康钩蝠蛾T.markamensis(Yang et al.，1992)(Hepialus)、草地钩蝠蛾T.pratensis(Yang et al.，1992)(Hepialus)、锈色钩蝠蛾T.ferrugineus(Yang et al.，1993)(Hepialus)、金沙钩蝠蛾T.jinshaensis(Yang，1993)(Hepialus)、白纹钩蝠蛾T.albipictus(Yang，1993)(Hepialus)、甲郎钩蝠蛾T.jialangensis(Yang，1994)(Hepialus)、察里钩蝠蛾T.zaliensis(Yang，1994)(Hepialus)、中支钩蝠蛾T.zhongzhiensis(Liang，1995)(Hepialus)、叶日钩蝠蛾T.yeriensis(Liang，1995)(Hepialus)、美丽钩蝠蛾T.callinivalis(Liang，1995)(Hepialus)、里塘钩蝠蛾T.litangensis(Liang，1995)(Hepialus)、循化钩蝠蛾T.xunhuaensis(Yang et Yang，1995)(Hepialus)、白带钩蝠蛾T.cingulatus(Yang et Zhang，1995)(Hepialus)、巴青钩蝠蛾T.baqingensis(Yang et Jiang，1995)(Hepialus)、当雄钩蝠蛾T.damxungensis(Yang，1995)(Hepialus)、玉树钩蝠蛾T.yushuensis(Wang et al.，1995)(Hepialus)、宽兜钩蝠蛾T.latitegumenus(Shen et al.，1997)(Hepialus)comb.n.、双带钩蝠蛾T.bibelteus(Shen et al.，1997)(Hepialus)comb.n.、拉脊蝠蛾T.lagii(Yan，2001)(Hepialus)comb.n.、比如钩蝠蛾T.biruens(Fu，2002)(Hepialus)comb.n.、海南钩蝠蛾T.hainanensis(Chu et Wang，2004)(Hepialus)comb.n.、纳木钩蝠蛾T.namensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、日喀则钩蝠蛾T.xigazeensis(Chu etal.，2004)(Hepialus)comb.n.、永胜钩蝠蛾T.yongshengensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、定结钩蝠蛾T.dinggyeensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、南木林钩蝠蛾T.nanmlinensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、亚东钩蝠蛾T.yadongensis(Chu etal.，2004)(Hepialus)comb.n.、蒲氏钩蝠蛾T.pui(Zhang et al.，2007)(Hepialus)comb.n.、小金钩蝠蛾T.xiaojinensis(Tu et al.，2009)(Hepialus)comb.n.、色季拉钩蝠蛾T.sejilaensis(Zou et al.，2011)、加查钩蝠蛾T.jiachaensis(Zou et al.，2011)中的一种或多种。

具体实施方式

实施例一

1.在青藏高原海拔2800米的高山灌丛草甸区，选取地势排水较好的区域，以长20m×宽10m为一个单位建设培育大棚，将大棚范围内原有草甸植被除去并将土壤平整，用农用薄膜材料搭建顶棚及四周可控开关的大棚，采用通常农业园艺规划方法在大棚内进行分区建垄，建成8个90cm×1900cm的培育垄，在垄面上方高100cm处铺设水肥管理管路，垄间挖开宽、深分别为30cm×8cm的区域便于排水及管理人员行走，大棚四周分别留下约50cm的工作区。

2.应用适合高原的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，根据空气及土壤湿度条件每个月喷淋水三至六次，使15cm深度的土壤含水量保持在30％左右，每2个月在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶5浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥，施放量为干重每平方米约250g。

3.在冬虫夏草适生地区域采集圆穗蓼(Polygonum macrophytum)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、高山唐松草(Thactriun alpinun)、矮火绒草(Leontopodium alpinum)、委陵菜(Potentilla anserine)、黑褐苔草(Carexa trofusca)等植物的种子收集后撒入培育大棚内，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部透明材料的开关，同时通过调节棚外辅助层(遮阴网或保温被)的开关以及喷雾装置调节大棚内温度，使棚内最高气温不超过22℃，空气湿度在55～100％；利用原生态光照条件栽培大棚内的高寒植物苗，并使之旺盛生长获得高寒植物苗。

4.从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规察氏培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，经通常蛋白胨水液体培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，最后按发酵液与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

5.每年9～11月，选择日间温度不超过18℃，夜间温度不低于4℃的时段，将制备的冬虫夏草菌源，利用喷淋管路或加压喷枪均匀喷淋接种到培育大棚高寒植物苗上，每平方米喷入100ml菌悬液，连续喷施5天，每天黄昏时喷施1次，喷完后用黑色遮阴网盖在大棚顶部及四周，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部的开关以调节大棚内温度在13±5℃，湿度65～95％；温度达到18℃时，通过喷雾装置喷水雾通风降温，遮阴共生培育7天后，采用显微镜检查冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成共生体，经分子检验菌丝为中国被毛孢后，将获得的共生体组织切成5～20mm小段，制备成具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法存放于4℃，保存备用。

6.将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，每头幼虫投放5～10克，使寄主幼虫取食并充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为92.7％。

实施例二

1.在青藏高原海拔4000米的冬虫夏草适生地区域的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，保留原有草甸植被，以长10m×7.5m为一个单位建设培育大棚，用阳光板材料搭建顶棚及四周可控开关的大棚，培育大棚内规划建设成6个90cm×920cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄中间高30cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，垄间挖开宽、深分别约为25cm×5cm的区域便于排水及管理人员行走，大棚四周分别留下约40cm的工作区。

2.应用适合高原的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，根据空气及土壤湿度情况，每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在33％左右，每2个月在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶20浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约150g。

3.在培育大棚附近冬虫夏草适生地区域采集珠芽蓼(Polygonum viviparum)、大萼委陵菜(Potentilla conferta)、杂色钟报春(Primula alpicola)、大萼蓝钟花(Cyananthusmacrocalyx)、舌叶垂头菊(Cremanthodium linguiatum)、锡金柳叶菜(Epilobiumsikkimense)等植物苗及种子移栽至培育大棚内，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部透明材料的开关，同时通过调节棚外辅助层(遮阴网或保温被)的开关以及喷雾装置调节大棚内温度，使棚内最高气温不超过20℃，空气湿度在55～100％；利用原生态光照条件栽培大棚内的原有植被及移栽高寒植物苗，并使之旺盛生长。

4.从培育大棚附近冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规马铃薯培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经大麦固态培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，将发酵获得的菌团用搅拌器均匀打碎，并按发酵物质量与水体积比1∶400进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径2mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源。

5.每年6～11月，选择日间温度不超过18℃，夜间温度不低于4℃的时段，将制备的冬虫夏草菌源利用灌溉管路或加压喷枪均匀喷淋接种到培育大棚高寒植物苗上，每平方米喷入200ml菌悬液，连续喷施2天，每天3次，分早中晚喷施，喷施后用黑色遮阴网盖在大棚顶部及四周，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部的开关以调节大棚内温度在13±5℃，湿度65％～95％；温度达到18℃时，通过遮阴网和喷雾装置喷水雾通风降温，遮阴共生培育15天后，采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体，经分子检验为中国被毛孢后，可直接作为具有高侵染活性的菌种材料。

6.每年8～10月，选择白天温度不超过18℃，夜间温度不低于0℃的时段，寄主蒲氏钩蝠蛾(Thitarodes pui)幼虫在黄昏时段投置到冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，每平方米约控释50头，使蒲氏钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，14天后将蒲氏钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测蒲氏钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，蒲氏钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为93.6％。

实施例三

1.在青藏高原海拔4300米的冬虫夏草适生地区域的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，保留原有草甸植被；以20m×10m为一个单位建设培育大棚，用阳光板材料搭建顶棚及四周可控开关的大棚；培育大棚内规划建设成19个75cm×920cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄上方高50cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，用于喷施水肥管理；垄间挖开宽、深分别为27cm×10cm的区域便于排水及管理人员行走，大棚四周分别留下约45cm的工作区。

2.应用适合高原的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，根据空气及土壤湿度情况，每月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在25％，每2个月在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶15浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥，施放量为干重每平方米约175g。

3.通过人工或自动化控制大棚四周及顶部阳光板的开关，同时通过调节棚外辅助层(遮阴网或保温被)的开关以及喷雾装置调节大棚内温度，使棚内最高气温不超过19℃，空气湿度在55～100％；利用原生态光照条件促进培育大棚内原有的珠芽蓼(Polygonum viviparum)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodium hastioides)、头花蓼(Polygonum macrophytum)等植物旺盛生长。

4.在每年的6～8月在培育大棚附近的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草子囊孢子，直接稀释制成菌悬液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有100个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

5.每年6～8月，选择白天温度不超过18℃，晚上温度不低于4℃的时段，将制备的冬虫夏草菌源，利用灌溉管路或加压喷枪均匀喷淋接种到培育大棚高寒植物苗上，每平方米喷入300ml菌悬液，连续喷施3天，每天2次，分早中晚喷施，喷施后用黑色遮阴网盖在大棚顶部及四周，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部阳光板的开关以调节大棚内温度在13±5℃，湿度65～95％；温度达到18℃时，通过遮阴网和喷雾装置喷水雾通风降温，遮阴共生培育20天后，采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体，经分子检验为中国被毛孢后，可直接作为具有高侵染活性的菌种材料。

6.每年8～9月，选择白天温度不超过18℃，晚上温度不低于0℃的时段，在黄昏时段寄主虫草钩蝠蛾(Thitarodes armoricanus)幼虫投置到冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，每平方米约控释100头，使虫草钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，15天后将虫草钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测虫草钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，虫草钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为90.8％。

实施例四

1.在青藏高原海拔3800米的冬虫夏草适生地区域的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，将原有草甸植被除去并平整，以长20m×宽15m为一个单位建设培育大棚，用玻璃材料搭建顶棚及四周可控开关的大棚，培育大棚内规划建设成19个75cm×1920cm的垄区，在每个垄中间高80cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，垄间挖开宽、深分别为27.5cm×10cm的区域便于排水及管理人员行走，培植园四周分别留下约40cm的工作区。

2.应用适合高原的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，根据空气及土壤湿度情况，每月喷淋水二至五次，每年5月至10月视当月降水量情况每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在35％左右，每2个月在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶10浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约160g。

3.在冬虫夏草适生地区域采集细茎蓼(Polygonum filicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圆穗蓼(P.macrophyllum)、狭叶圆穗蓼(P.macrophyllum)、头花蓼(P.capitatum)、西藏大黄(Rheum tibeticum)、小大黄(R.pumilum)植株或种子，经常规组织培养快速繁殖技术获得组培苗，每年6月将组培苗移栽至大棚内培植，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部玻璃的开关，同时通过调节棚外辅助层(遮阴网或保温被)的开关以及喷雾装置调节大棚内温度，使棚内最高气温不超过18℃，空气湿度在55～100％；利用原生态光照条件栽培大棚内的原有植被及移栽高寒植物苗，并使之旺盛生长。

4.在每年的6～8月在培育大棚附近的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草子囊孢子，直接稀释制成悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有1000个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

5.每年7～9月，选择日间温度不超过18℃，夜间温度不低于4℃的时段，将制备的冬虫夏草菌源，喷淋接种到高寒植物苗上，每平方米喷淋150ml，连续喷施5天，每天1次，中午喷施，喷施后用黑色遮阴网盖在喷淋管路上面，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部阳光板的开关以调节大棚内温度在13±5℃，湿度65～95％；温度达到18℃时，通过遮阴网和喷雾装置喷水雾通风降温，遮阴共生培育30天后，促进中国被毛孢与高寒植物组织共生，激活冬虫夏草菌的侵染活性；采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢菌丝与高寒植物组培组织缠绕形成大量共生体，经分子检验为中国被毛孢后，可直接作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料。

6.每年8～9月，选择黄昏时段寄主色季拉钩蝠蛾(Thitarodes sejilaensis)幼虫投置到冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，每平方米约控释100头，使色季拉钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，12天后将色季拉钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测色季拉钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，色季拉钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为91.4％。

实施例五

1.在青藏高原海拔5200米的冬虫夏草适生地区域的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，保留原有草甸植被，以15m×10m为一个建设单位，用透明塑料板材料搭建顶棚及四周可控开关的大棚，培育大棚内规划建设2排50cm×450cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄中间高80cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，垄间挖开宽、深分别为20cm×5cm的区域便于排水及管理人员行走。培育大棚四周及排间分别留下约35cm的工作区。

2.应用适合高原的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，根据空气及土壤湿度情况，每个月喷淋水一至六次，使15cm深度的土壤含水量保持在30％左右，每月在第一次喷水中加入水：尿体积比为100∶13浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约200g。

3.采集培育大棚附近的圆穗蓼(Polygonum macrophytum)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、高山唐松草(Thactriun alpinun)、矮火绒草(Leontopodium alpinum)、委陵菜(Potentilla anserine)、高山嵩草(Kobrasiapygmaea)、黑褐苔草(Carexa trofusca)等植物的种子收集后撒入培育大棚的垄内，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部透明塑料的开关，同时通过调节棚外辅助层(遮阴网或保温被)的开关以及喷雾装置调节大棚内温度，使棚内最高气温不超过16℃，空气湿度在55～100％；利用原生态光照条件栽培大棚内的原有植被及移栽高寒植物苗，并使之旺盛生长。

4.从青海玉树地区的冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规肉汤培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经通常普通肉汤液体培养基在13±5℃发酵7天，然后置于小麦为底物的固体培养基上再继续发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得菌团用搅拌器均匀打碎，按发酵物重量与水体积比1∶1000进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径1.5mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源；

5.每年7～9月，选择日间温度不超过18℃，夜间温度不低于4℃，将制备的冬虫夏草菌源利用灌溉管路均匀喷淋接种到培育大棚高寒植物苗上，每平方米喷入250ml菌悬液，喷完后用黑色遮阴网盖在喷淋管路上面，连续喷施4天，每天喷施2次，早晚各一次，喷施后用黑色遮阴网盖在大棚顶部及四周，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部的开关以调节大棚内温度在13±5℃，湿度65～95％；温度达到18℃时，通过喷雾装置喷水雾通风降温，遮阴共生培育14天后，经显微镜及分子鉴定检查共培养的冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体；经分子检验菌丝为中国被毛孢后，将共生体地上部分割回，将共生体组织切成5～20mm小段，制备成具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法存放于2℃，保存备用；

6.将制备的高侵染活性菌种材料在黄昏时段投喂冬虫夏草寄主比如钩蝠蛾(Thitarodesbiruens)幼虫，每头投入5g高侵染活性菌种材料，使寄主幼虫取食并充分接触菌种，7天后将比如钩蝠蛾幼虫从饲养盒中取出，采用显微镜检查及分子生物方法检测比如钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，比如钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为94.9％。

实施例六(反向例)

1.在青藏高原海拔2800米的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，以10m×20m为一个单位建设培育大棚，将培育大棚内原有草甸植被除去并将土壤平整，在培育大棚内规划建设成8个90cm×1900cm的高寒植物原生态草甸培育垄区，在每个垄中间高75cm处铺设一条喷淋管及配套水泵设施，垄间挖开宽、深分别为30cm×8cm的区域便于排水及管理人员行走，培植大棚四周分别留下约50cm的工作区。

2.应用适合高原的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，根据空气及土壤湿度情况，每个月喷淋水一至四次，使土壤15cm深处的含水量保持在33％左右，每2个月在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶15浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约210g。

3.采集高山嵩草(Kobresia pygmaea)、一岁苔草(Carex heterostachya)、珠芽蓼(Polygonum viviparum)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodium hastioides)、头花蓼(Polygonum macrophytum)等植物及种子移栽至培育大棚中，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部的开关以调节大棚内温度在13±5℃，温度达到18℃时，空气湿度在55～100％，通过喷雾装置喷水雾通风降温，并使之旺盛生长获得高寒植物苗。

4.从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规察氏培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，经通常蛋白胨水液体培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，最后按发酵液与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

5.将获得的高寒植物苗地上及地下部分组织切成5～20mm小段作为钩蝠蛾幼虫的饲料，同时将冬虫夏草菌源喷淋到高寒植物饲料表面或喷淋到替代饲料如胡萝卜表面，直接投喂冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，每头幼虫投放5～10克，使寄主幼虫取食并充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率只有23.4％。

实施例七(反向例)

1.从西藏那曲冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规马铃薯培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经通常的大麦固态培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，并按发酵物重量与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径2mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源。

2.将制备的冬虫夏草菌源直接喷淋到冬虫夏草寄主比如钩蝠蛾Thitarodes biruens幼虫，使寄主幼虫充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，中国被毛孢侵染比如钩蝠蛾幼虫的侵染率只有18.7％。

实施例八(反向例)

1.在每年的6～8月在青海玉树的冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草子囊孢子，直接稀释制成悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有1000个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

2.将冬虫夏草菌源直接喷淋到冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，使寄主幼虫充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被冬虫夏草子囊孢子的侵染率只有10.8％。

Claims (5)

1.一种利用高寒植物培育大棚制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法，该方法包括：在青藏高原环境下建立高寒植物培育大棚，利用大棚营造合适的温湿度及光照条件，通过适合高原大棚的农业园艺栽培技术进行水肥管理，栽培并获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物苗；将冬虫夏草菌源接种到培育大棚栽培的高寒植物苗上，利用大棚营造的适合的温湿度及光照条件，使冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与活体高寒植物共生培育，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料；

所述的将冬虫夏草菌源接种到培育大棚栽培的高寒植物苗上的方法是：选择外界气温日间温度不超过18℃，夜间温度不低于4℃的月份时段，将制备的冬虫夏草菌源喷淋接种到培育大棚栽培的高寒植物苗上，每平方米喷施100～300ml菌悬液，连续喷施2～5天，每天喷施1～3次，接种后遮阴培育，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部的开关以调节大棚内温度在13±5℃，湿度65～95％，时间为7～30天。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述的高寒植物培育大棚是在海拔2800～5200米的青藏高原高寒草甸，保留原有高寒草甸植被或将草甸开垦平整，以长10～20m×宽7.5～15m大小为建设单位，用薄膜或阳光板或玻璃透明材料搭建顶棚及四周可控开关的大棚，采用通常农业园艺规划方法在大棚内进行分区建垄，垄面大小为50～90cm×450～1920cm，在垄面上方高30～100cm处铺设水肥管理管路，垄间设立宽20～30cm，深5～10cm的区域便于排水和管理人员行走，培育大棚四周留下35～50cm的空区。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述的合适高原大棚的农业园艺栽培水肥管理是：根据天气空气湿度条件每个月喷淋水一至六次，使15cm深度的土壤含水量保持在25～35％，每2个月在一次喷水中加入水：尿体积比为100∶5～100∶20浓度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥干重每平方米约150～250g。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述的利用大棚营造适合的温湿度及 光照条件是：通过人工或自动化控制大棚四周及顶部透明材料的开关，同时通过调节棚外辅助层遮阴网或保温被的开关以及喷雾装置调节大棚内温湿度，使棚内最高气温不超过22℃；空气湿度为55～100％；利用青藏高原自然光照条件提供光照。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述的冬虫夏草菌种的制备方法是：从冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，通过常规低温发酵法在13±5℃条件下发酵为冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子分生孢子或芽生孢子，并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子分生孢子或芽生孢子按发酵物质量与水体积比1∶100～1∶1000稀释成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源；或直接采用冬虫夏草的新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。