CN104920066A - 提高冬虫夏草寄主感染率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高冬虫夏草寄主感染率的方法，该方法用激光照射冬虫夏草寄主幼虫体表，制造微小伤口，有助于中国被毛孢菌进入寄主幼虫体腔内，以生成冬虫夏草子实体。利用此人工培养方法所得到的冬虫夏草子实体，具有与野生冬虫夏草子实体相同的指标性成份。本发明大幅提高幼虫的感染率与存活率，且不受操作人员熟练度限制，可快速及大量地感染冬虫夏草寄主幼虫，解决了现有技术人工感染冬虫夏草寄主幼虫后感染率与存活率低的问题，能够应用于冬虫夏草的人工规模化养殖生产，对于冬夏草人工培育具有重要的推广作用。

Description

提高冬虫夏草寄主感染率的方法
技术领域
本发明涉及一种真菌感染寄主的方法，特别是涉及一种提高冬虫夏草寄主感染率的方法。
背景技术
冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是产于青藏高原海拔3,500公尺以上局部地区的珍稀名贵中药材，其味甘酸、性平、气香、入肺肾二经，有保肺气、实理、补虚、解毒、止血、化痰之功。
冬虫夏草属于昆虫寄生性真菌亦或虫生真菌，为中国被毛孢菌(Hirsutellasinensis)和蝙蝠蛾科(Hepialidae)幼虫所形成的复合体。宿主为鳞翅目蝙蝠蛾的幼虫体，寄生于其中的中国被毛孢菌吸收其养分直到寄主的组织细胞养分被消耗后，菌丝体与蝙蝠蛾虫体形成坚硬饱满的内生菌核(endosclerotium)，菌核形成后，经适当的环境下长出冬虫夏草子实体。
在自然环境下，中国被毛孢菌感染寄主蝙蝠蛾幼虫的途经为：中国被毛孢菌的子囊孢子成熟后喷洒到地面时，子囊孢子发芽生成的分生孢子梗接触到虫体表面，从虫体的体表通过进入虫体体内；由于子囊孢子弹出后，其孢子的发芽生长受到营养、温度、湿度和氧气等环境因子的影响，子囊孢子的发芽率只有10-20％，因此自然环境下中国被毛孢菌感染蝙蝠蛾幼虫的机率非常低。
目前人工感染幼虫方法包括将中国被毛孢孢子液涂抹于寄主体表、注射到寄主体内或混合饲料喂食从寄主食道进入寄主体内。例如中国专利CN201010604460.7公开了一种以针状器具注射中国被毛孢孢子液至蝠蛾幼虫体内的感染方法，该感染方法的缺点是：操作速度慢，需投入大量人力完成作业，且易因操作不慎造成虫体表面伤口过大，幼虫体液流失过多而死亡。
中国专利CN20120338583.X公开了一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法，该寄主感染方法为：将用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料的混悬液体灌注到冬虫夏草寄主幼虫口中，或拌到冬虫夏草寄主饲料中，对冬虫夏草寄主进行饲养。该感染方法的缺点为：感染6-12个月后才达感染高峰期(感染率100％)，感染僵化时间长达1年，1年后幼虫存活率低，相对冬虫夏草子实体的产量也低。
综合前述研究，虽然目前已可实现人工感染冬虫夏草寄主，但现有技术仍有其不足之处，该不足之处包括：感染后寄主死亡率高、感染率低、感染僵化时间长等问题，现有技术无法同时达到低死亡率、高感染率与缩短感染僵化时间。
发明内容
基于此，有必要针对现有技术的问题，提供一种高感染率、低死亡率的冬虫夏草寄主的人工感染方式。
解决上述技术问题的技术方案如下：
一种提高冬虫夏草寄主感染率的方法，包括以下步骤：步骤1：用能量光束于冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫体表制造伤口；步骤2：用中国被毛孢菌液接触步骤1所述蝙蝠蛾幼虫虫体。
在其中一些实施例中，所述伤口位置可在冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫体表任何部位，最佳伤口位置为尾部和头部。
在其中一些实施例中，所述伤口的数目为2-3个，所述伤口的大小为0.1mm-5mm。
在其中一些实施例中，所述能量光束为激光，激光照射的能量强度为0.5W-2.5W，所述激光照射的施打时间为1秒，所述激光照射于同一部位的施打次数为3-4次。
在其中一些实施例中，所述中国被毛孢菌液接触该蝙蝠蛾幼虫虫体方式为喷洒、涂抹或浸泡。
在其中一个实施例中，在所述步骤1之前或/和步骤2之后，在所述蝙蝠蛾幼虫的饲养基质中可进一步加入中国被毛孢菌液，加入的重量为饲养基质的20-40％。
在其中一些实施例中，所述饲养基质包括以下重量百分数的组分：腐质土15-25％、河砂20-30％、木屑50-65％。
在其中一个实施例中，在所述步骤1之前或/和步骤2之后，在所述蝙蝠蛾幼虫的饲料中可进一步加入中国被毛孢菌液，加入的重量为饲养饲料的5-20％。
本发明还提供了一种提高冬虫夏草寄主感染率的饲养基质，所述饲养基质包括以下重量百分数的组分：腐质土15-25％、河砂20-30％、木屑50-65％。
在其中一个实施例中，所述饲养基质可进一步加入中国被毛孢菌液，加入的重量为饲养基质的20-40％。
所述饲养基质可以用于冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫侵染前后的饲养。
综上所述，本发明有益技术效果包括:
1.本发明提供的以激光感染冬虫夏草寄主的方法，操作容易且速度快，可大量地操作；
2.以激光于蝙蝠蛾体表制造伤口，伤口小，几乎没有体液渗出，感染后蝙蝠蛾幼虫的存活率高；
3.以激光于蝙蝠蛾体表制造伤口，使得蝙蝠蛾幼虫感染率高，且缩短幼虫僵化的时间；
4.将侵染前后的蝙蝠蛾幼虫放入含中国被毛孢菌液的饲养基质与饲料中，可更进一步提高蝙蝠蛾的感染率与存活率；
5.所述方法能够应用于冬虫夏草的人工规模化养殖生产，对于冬虫夏草人工培育具有重要的推广作用。
附图说明
图1为一种提高冬虫夏草寄主感染率的人工培养方法一的示意图。
图2为一种提高冬虫夏草寄主感染率的人工培养方法二的示意图。
图3为一种提高冬虫夏草寄主感染率的人工培养方法三的示意图。
图4为人工培养与野生冬虫夏草子实体的虫草素成份的HPLC分析图。
图5为人工培养与野生冬虫夏草子实体的腺苷成份的HPLC分析图。
具体实施方式
本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
实施例1 中国被毛孢菌液的制备方法
取无菌手术刀在酒精灯火焰下高温消毒后，浸泡于75％酒精降温后，以无菌手术刀切取冬虫夏草子实体的组织块，将所述组织块接种到人工培养基上。所述人工培养基的组成包括2-10％蛋白胨、2-10％酵母萃取物、2-10％葡萄糖、2-10％特砂及1-5％洋菜粉等，上述的成分经过高温高压灭菌，所述灭菌压力为1.2atm(kg/cm2)，所述灭菌温度为120-130℃，灭菌时间从灭菌开始到结束约50分钟。经过高温高压灭菌的人工培养基置于UV灯管下照射消毒12小时之后方可提供使用。冬虫夏草子实体的组织块以人工方式培养于温度为14-20℃的人工培养基中，培养时间为25-30天。
培养结束后挑取人工培养基上的菌丝块以显微镜镜检观察菌体孢子和菌丝形态。取菌块的基因组DNA应用广泛的ITS 1/ITS 4引子对进行聚合酶链式反应(PCR)反应，扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)，再经过核酸序列比对确认为中国被毛孢菌株。
取中国被毛孢菌株的菌块，经过捣碎机作用后，将其接种到三角瓶，进行震荡培养，培养箱转速为100-200rpm，培养温度为14-20℃，培养时间为14-20天。取菌液经过无菌过滤膜固液分离后，取菌丝体经过捣碎机作用后，再一次的固液分离，上清液即为冬虫夏草寄主感染用的中国被毛孢菌液。
实施例2 中国被毛孢菌液感染蝙蝠蛾幼虫的方法一
收集2100条3-4龄的蝙蝠蛾幼虫，均分为7组，每组300条，任意取1组300条蝙蝠蛾幼虫，以微型注射针头将实施例一制备的中国被毛孢菌液注射入幼虫体内，作为对照组。其余1800条的幼虫，以激光照射蝙蝠蛾幼虫体表，依虫体照射部位(头部、尾部)与激光功率条件(0.5W、1.5W和2.5W)不同分为6组，每组300条虫。虫体表面以无菌棉花棒沾取碘酒来回擦拭数次，依上述6组条件以激光枪头照射虫体表面，每组照射时间均为1秒，同一部位照射3-4次；将实施例1所述的中国被毛孢菌液装入无菌喷洒器中，均匀喷洒在激光照射过的蝙蝠蛾幼虫虫体上，菌液在幼虫虫体上停留20-40秒后，再放入基质与饲料中养护，其幼虫养护温度为8-20℃，相对湿度为40-90％。饲养二个月后观察幼虫生长状况，并记录每组感染后的幼虫存活数量，采取随机取样方式，每组各抽取20条幼虫抽取其体液，用显微镜观察和记录感染情形，结果如表一所示。由表一结果可知，激光技术方法应用于冬虫夏草寄主感染，可明显提高感染率和存活率，其中照射位置为幼虫尾部和照射功率1.5W组的效果最佳，感染2个月后，其幼虫存活率达82％、感染率达77％。
表一 以激光技术感染幼虫的结果
实施例3 含有中国被毛孢菌液的饲养基质
饲养基质组成设计参考高寒草甸土质的成分，包括腐质土、河砂和木屑，其最佳重量比例为腐质土15-25％、河砂20-30％、木屑50-65％。
该饲养基质的制备方法如下：
上述饲养基质成分混合后，经过高温高压灭菌，压力约1.2atm(kg/cm2)，温度为120-130℃，灭菌时间从灭菌开始到结束为120-180分钟，灭菌后的饲料基质经无菌检测分析，杂菌数需低于102CFU/g。
在上述混合基质中加入实施例1制备的中国被毛孢菌液，添加重量为上述混合基质的20-40％，混合均匀后铺于无毒聚氯乙烯(PVC)盒或无菌塑胶盒中，进行蝙蝠蛾幼虫的饲养。
实施例4 中国被毛孢菌液感染蝙蝠蛾幼虫的方法二
收集1200条3-4龄的蝙蝠蛾幼虫，均分为4组，每组300条，每组依照实施例2中国被毛孢菌液感染蝙蝠蛾幼虫的方法进行感染，激光照射部位为幼虫尾部，照射功率为1.5W，照射时间均为1秒。任意取1组300条蝙蝠蛾幼虫作为对照组，对照组感染前后的饲养，其饲养基质均不添加中国被毛孢菌液；任意取1组300条蝙蝠蛾幼虫，感染前后的饲养，其饲养基质均采用实施例3含有中国被毛孢菌液的饲养基质，此为实验组Ⅰ；任意取1组300条蝙蝠蛾幼虫，感染前的饲养，其饲养基质采用实施例3含有中国被毛孢菌液的饲养基质，此为实验组Ⅱ；剩余300条蝙蝠蛾幼虫，感染后的饲养，其饲养基质采用实施例3含有中国被毛孢菌液的饲养基质，此为实验组Ⅲ。幼虫饲养的温度为8-20℃，相对湿度为40-90％。饲养二个月后观察幼虫生长状况，并记录每组感染后的幼虫存活数量，采取随机取样方式，每组各抽取20条幼虫抽取其体液，用显微镜观察和记录感染情形，结果如表二所示。由表二结果可知，以激光感染的蝙蝠蛾幼虫，感染前或感染后的饲养，其饲养基质采用实施例3含有中国被毛孢菌液的饲养基质，感染2个月后实验组Ⅰ-Ⅲ的感染率明显提高，其中以实验组Ⅰ最佳，幼虫存活率达80％、感染率达87％。
表二 中国被毛孢菌液感染蝙蝠蛾幼虫的方法二结果
实施例5 含有中国被毛孢菌液的饲养饲料的制备
选取胡萝卜、甘薯、马铃薯作为饲料，将上述饲料表面清洗干净后，以6-20ppm食用级消毒液浸泡30-50分钟，用无菌刀切成3×5cm2大小，加入实施例1制备的中国被毛孢菌液，添加的重量为饲养饲料的5-20％，混合均匀后置于饲养基质上方。幼虫饲养过程中需定时观察幼虫是否有病虫害发生，一旦发生病虫害，需隔离饲养并且环境喷洒消毒水进行消毒。
实施例6 中国被毛孢菌液感染蝙蝠蛾幼虫的方法三
收集1200条3-4龄的蝙蝠蛾幼虫，均分为4组，每组300条，每组依照实施例2中国被毛孢菌液感染蝙蝠蛾幼虫的方法进行感染，激光照射部位为幼虫尾部，照射功率为1.5W，照射时间均为1秒。任意取1组300条蝙蝠蛾幼虫作为对照组，对照组感染前后的饲养，其饲养饲料均不添加中国被毛孢菌液；任意取1组300条蝙蝠蛾幼虫，感染前后的饲养，其饲养饲料均采用实施例5含有中国被毛孢菌液的饲养饲料，此为实验组Ⅳ；任意取1组300条蝙蝠蛾幼虫，感染前的饲养，其饲养饲料采用实施例5含有中国被毛孢菌液的饲养饲料，此为实验组Ⅴ；剩余300条蝙蝠蛾幼虫，感染后的饲养，其饲养饲料采用实施例5含有中国被毛孢菌液的饲养饲料，此为实验组Ⅵ。幼虫饲养的温度为8-20℃，相对湿度为40-90％。饲养二个月后观察幼虫生长状况，并记录每组感染后的幼虫存活数量，采取随机取样方式，每组各抽取20条幼虫抽取其体液，用显微镜观察和记录感染情形，结果如表三所示。由表三结果可知，以激光感染的蝙蝠蛾幼虫，感染前或感染后的饲养，其饲养饲料采用实施例5含有中国被毛孢菌液的饲养饲料，感染2个月后实验组Ⅳ-Ⅵ的感染率明显提高，其中以实验组Ⅳ最佳，幼虫存活率达90％、感染率达92％。
表三 中国被毛孢菌液感染蝙蝠蛾幼虫的方法三结果
实施例7 人工培育冬虫夏草子实体与天然冬虫夏草子实体活性成分的比较
将实施例2、4、6所述中国被毛孢菌液经由激光感染的蝙蝠蛾幼虫持续饲养，直到菌丝体与虫体形成坚硬饱满内生菌核，需2-3个月，接着经适当的环境下长出子实体。本发明的冬虫夏草子实体与天然冬虫夏草子实体型态特征一致，如子座构造从幼虫的头部生成，发育成熟后的子实体顶部表面可观察到子囊壳，经过数日后有成熟的子囊孢子喷发出来，将本发明的冬虫夏草子实体与天然冬虫夏草子实体指标性成分进行比较，结果如下：
1.多糖含量：
将冬虫夏草子实体磨碎后，以硫酸水解，加入5％酚以显色，读取OD490的吸光值，结果显示人工养殖培养冬虫夏草子实体的多糖含量为5.1％，与野生冬虫夏草子实体的多糖含量5.0％相近。
2.虫草素含量：
用高效液相色谱仪(High-performance Liquid Chromatography，HPLC)分析，结果如附图4所示，人工养殖冬虫夏草子实体、野生冬虫夏草子实体及虫草素标准品，虫草素在保留时间(retentiontime)13.0分钟时出现，人工养殖冬虫夏草的虫草素含量为12mg/g，与野生冬虫夏草子实体的虫草素含量13mg/g相近。
3.腺苷含量：
用HPLC分析，结果如附图5所示，人工养殖冬虫夏草子实体、野生冬虫夏草子实体及腺苷标准品，腺苷在保留时间(retention time)10.6分钟时出现，人工养殖培养冬虫夏草的腺苷含量为0.06％，高于野生冬虫夏草子实体的腺苷含量0.02％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用能量光束于冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫体表制造伤口；
(2)用中国被毛孢菌液接触步骤(1)所述蝙蝠蛾幼虫虫体。
2.根据权利要求1所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，所述伤口位置可在冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫体表任何部位。
3.根据权利要求2所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，所述伤口位置为尾部或头部。
4.根据权利要求1-3任一项所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，所述伤口的数目为2-3个，所述伤口的大小为0.1mm-5mm。
5.根据权利要求1所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，所述能量光束为激光，所述激光照射的能量强度为0.5-2.5W，所述激光照射的施打时间为1秒，所述激光照射于同一部位的施打次数为3-4次。
6.根据权利要求1所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，所述中国被毛孢菌液接触所述蝙蝠蛾幼虫虫体的方式为喷洒、涂抹或浸泡。
7.根据权利要求1所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，在步骤(1)之前和/或步骤(2)之后，在蝙蝠蛾幼虫的饲养基质中加入中国被毛孢菌液。
8.根据权利要求7所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，所述中国被毛孢菌液加入的重量为饲养基质的20-40％。
9.根据权利要求7所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，所述饲养基质包括以下重量百分数的组分：腐质土15-25％、河砂20-30％、木屑50-65％。
10.根据权利要求1所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，在步骤(1)之前和/或步骤(2)之后，在蝙蝠蛾幼虫的饲养饲料中加入中国被毛孢菌液。
11.根据权利要求10所述的提高冬虫夏草寄主感染率的方法，其特征在于，所述中国被毛孢菌液加入的重量为饲养饲料的5-20％。
12.一种提高冬虫夏草寄主感染率的饲养基质，其特征在于，所述饲养基质包括以下重量百分数的组分：腐质土15-25％、河砂20-30％、木屑50-65％。
13.根据权利要求12所述的提高冬虫夏草寄主感染率的饲养基质，其特征在于，所述饲养基质中还加入占饲养基质重量百分比20-40％的中国被毛孢菌液。
14.一种权利要求12-13任一项所述的提高冬虫夏草寄主感染率的饲养基质在饲养冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫中的应用。
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