CN102994401B - 一种制备苹果树腐烂病菌转化子及gfp标记菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种苹果树腐烂病菌转化子及其制备方法。该方法将含有二元载体的根癌农杆菌与腐烂病菌的分生孢子悬浮液混合后共培养，用抗生素筛选，获得转化子。该方法以苹果树腐烂病菌的分生孢子为受体，以根癌农杆菌为介体，克服了苹果树腐烂病菌原生质体制备困难，且聚乙二醇(PEG)介导的转化效率低等原因导致的腐烂病菌遗传转化困难的问题。该方法的转化效率可达1/10³个分生孢子。本发明同时提供了一种苹果树腐烂病菌绿色荧光蛋白(GFP)标记菌株及其制备方法，该方法获得的转化子，表达强的绿色荧光蛋白的效率可达96.7%。

Description

一种制备苹果树腐烂病菌转化子及GFP标记菌株的方法

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种苹果树腐烂病菌转化子及其制备方法，同时还提供一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株及其制备方法。

背景技术

黑腐皮壳菌(Valsaceratosperma)引起的苹果树腐烂病，是对苹果产业威胁最大的一种毁灭性病害，该病在我国苹果产区发生普遍，可造成果树主干及整树死亡，甚至毁园（陈策，1987；2009）。自1916年苹果树腐烂病在辽宁省南部地区发现以来，该病已在我国有过几次大流行，造成了严重的产量和经济损失（陈策等，1980；2009）。随着我国苹果种植结构和栽培制度的调整，腐烂病已成为限制我国苹果产业发展的主要因子。2008年，国家苹果产业技术体系调查显示，全国范围内苹果树腐烂病的总体发生率为52.7%，部分地区发病率高达85%以上（曹克强等，2009）。2011年，山东烟台苹果产区腐烂病再次严重发生，本课题组调查发现，旺盛结果期的苹果树具有新病疤的病株率为68.20%，死株率为2.76%（王彩霞等，2012）。

针对苹果树腐烂病造成的严重危害及防治困难等问题，引起了国内外相关科研工作者及多国政府部门的高度重视，该病现在仍被列为欧洲的主要检疫对象(http://www.eppo.org)。我国自上世纪50年代以来，对苹果树腐烂病的发生和流行规律、防治技术及病原学等进行了系统研究，取得了许多有意义的成果。目前生产上对于腐烂病的防控，采取的措施主要包括加强栽培管理、喷药保护、及时刮治病斑等，但这些措施都未能有效控制病害的发生和流行。其中一个重要原因是对于腐烂病菌的侵染、致病过程与致病机理尚不清楚，制约了对病害发生、流行规律的深入了解，导致病害防治工作低效、盲目和被动，造成腐烂病的危害近年来仍在逐年加重。

植物病原菌侵染致病过程的研究，对于病害防控具有重要的实践价值，可以为施药提供一定的科学依据，如施药时期、施药部位、施药次数等，还可根据抗感病品种不同的侵染过程而筛选抗病品种。对于真菌侵染过程的研究，多采用切片染色结合电子显微镜观察的方法进行，但对于木本植物的枝干类病害如苹果树腐烂病、枝干轮纹病等，由于材料木质化程度高，采用传统的技术方法很难取得理想的观察效果，这也是该类病害侵染致病过程研究无法取得突破性进展的主要原因之一。随着生物技术和分子生物学的不断发展，利用分子标记如绿色荧光蛋白(GFP)研究病原菌的侵染过程与致病机理已成为可能(Spelligetal.,1996)。因此，在目前缺乏有效抗腐烂病品种及杀菌剂的前提下，利用GPF标记菌株揭示腐烂病菌的侵染致病过程及其潜伏位点，明确其致病机理及其与寄主的互作机制，将为苹果树腐烂病的有效、安全控制提供新的指导思路，为生产上科学、高效地防控腐烂病提供坚实的理论基础。

绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)作为一种重要的报告基因，在病原菌的侵染致病过程、病原菌在寄主组织中的发育和形态观察、致病机理及其病原物-寄主互作研究等诸多方面均显示了良好的应用前景(Chenetal.,2003;Dueketal.,2004;Sarroccoetal.,2007;Rajasekaranetal.,2008;Mansourietal.,2009;Pliegoetal.,2009)。在植物病原真菌中，GFP标记技术也已得到广泛应用，并取得了前所未有的成果，受到植物病理学家的高度关注。对于苹果树腐烂病菌而言，由于其功能基因尚未被克隆，因此，要得到其GFP标记菌株，首先必须建立高效、稳定的腐烂病菌遗传转化技术体系。

目前广泛采用的真菌转化方法有聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化法、电激法、醋酸锂法、限制性内切酶介导法(REMI)和基因枪转化法等，这些方法大都需以原生质体为受体。高静等（2011）报道了PEG介导的苹果树腐烂病菌原生质体遗传转化法，转化效率为44个/μgDNA，作者仅得到218个转化子。有大量报道称原生质体制备繁琐，或不同批次的酶活性不一致，导致原生质体制备试验不能很好的重复(Weldetal.,2006;Levyetetal.,2008;BashiZaferDallaletal.,2010)，是使用原生质体作为转化受体的主要问题。因此原生质体作为转化受体，仍有问题需要解决。针对这一问题，许多学者提出了一些改进技术和新方法，其中最有效的是根癌农杆菌介导的真菌遗传转化法(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)，在多种丝状真菌的遗传转化中得到成功应用，高静（2011，硕士论文）初步建立了苹果树腐烂病菌的ATMT转化体系，但是转化效率极低，每10⁶个分生孢子仅得到6个转化子。

总之，目前缺乏高效、稳定的苹果树腐烂病菌遗传转化技术体系，更没有关于腐烂病菌GFP标记方法的报道，成为腐烂病菌侵染致病过程与机理研究的瓶颈。因此，建立新的高效的苹果树腐烂病菌遗传转化体系，获得稳定表达绿色荧光蛋白的标记菌株，对于推动腐烂病菌侵染致病过程的组织学研究及其分子生物学研究具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备苹果树腐烂病菌转化子的方法及制备GFP标记腐烂病菌的方法。本发明一个方面提供一种制备苹果树腐烂病菌转化子的方法，包括以下步骤：

A.制备苹果树腐烂病菌分生孢子：

（1）将苹果树腐烂病菌接种于PDA培养基上，活化培养3天；

（2）将活化培养的腐烂病菌打取菌饼接种于含有大麦粒的PDA培养基上，恒温培养20-30天，至橘黄色分生孢子角溢出；

B.培养农杆菌：

（1）将质粒pBIG3C（由中国农业大学彭友良教授馈赠）转入农杆菌中；

(2)取步骤B(1)中的农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养1天；

（3）取步骤B（2）中的农杆菌菌液于含卡那霉素的基本培养基中，28℃震荡培养2天，测量菌液的OD₆₀₀值；

（4）用含有乙酰丁香酮和2-（N-吗啉基）乙磺酸钠的IM培养基稀释步骤B（3）中的农杆菌悬浮液至OD₆₀₀值为0.15，继续在28℃条件下振荡培养6h备用；

C.根癌农杆菌与苹果树腐烂病菌分生孢子共培养：

（1）取步骤A（2）中的苹果树腐烂病菌分生孢子角至步骤B（4）中的农杆菌悬浮液中，用农杆菌溶液稀释混合均匀，调节浓度至10⁶个分生孢子/mL；

（2）将步骤C（1）中的农杆菌-腐烂病菌分生孢子混合液，按200μL/皿的量均匀涂布于铺有玻璃纸的含有乙酰丁香酮和2-（N-吗啉基）乙磺酸钠的Co-IM培养基上，置于25℃共培养3~5天；

D.转化子的筛选及保存

（1）将步骤C（2）中的玻璃纸放于一空的无菌培养皿中，使有菌丝的一面朝上，玻璃纸上面覆盖含有潮霉素和头孢霉素PDA培养基，置于25℃恒温箱中培养3~5天；

（2）将长出的腐烂病菌菌落转移至含有潮霉素的PDA平板中继续培养，将能继续生长的菌落再次接种至含有潮霉素的PDA平板上，连续培养三代得到苹果树腐烂病菌转化子；

（3）将得到的转化子保存在含有50μg/mL潮霉素的PDA斜面培养基上，置于4℃冰箱中保存。

根据本发明的具体示例，步骤A中培养的温度均为25℃。

根据本发明的具体示例，步骤A中PDA培养基制作方法如下：200g去皮马铃薯，加适量水蒸煮30min后用四层纱布过滤，然后在滤液中加入葡萄糖20g、15g琼脂煮沸溶解，补充蒸馏水至1000mL，置于121℃灭菌30min。

根据本发明的具体示例，步骤B中采用电击的方法将质粒pBIG3C转入农杆菌中。

根据本发明的具体示例，步骤B中LB液体培养基为2mL含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL利福平和50μg/mL链霉素的的LB液体培养基。

根据本发明的具体示例，步骤B中LB液体培养基配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5g，补充去离子水至1000mL，pH7.0，分装后置于121℃高压灭菌30min。

根据本发明的具体示例，步骤B中农杆菌菌液与基本培养基的体积为0.25:50。

根据本发明的具体示例，步骤B中为含50μg/mL的卡那霉素的50mL基本培养基。

根据本发明的具体示例，步骤B中基本培养基（MM）配方如下：

磷酸氢钾缓冲液(K-buffer)，含K₂HPO₄200g/L，KH₂PO₄145g/L，用H₃PO₄调pH7.0，使用量为10mL；

硫酸镁-氯化钠溶液（M-Nbuffer），含MgSO₄·7H₂O30g/L和NaCl15g/L，使用量为20mL；

20%葡萄糖(w/v），20g葡萄糖溶解于70g去离子水中，定容至100mL，过滤除菌，使用量为10mL；

其他成分包括1%CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL，20%NH₄NO₃(w/v)2.5mL，使用之前加入0.01%FeSO₄(w/v)10mL，补充去离子水至1000mL，以H₃PO₄或NaOH调节pH至7.0。

根据本发明的具体示例，步骤B中为含有200μM的乙酰丁香酮和1.0mg/mL的2-（N-吗啉基）乙磺酸钠的IM培养基。

根据本发明的具体示例，步骤B中诱导培养基培养基（IM）配方如下：

磷酸氢钾缓冲液pH4.9(1.25MK-buffer,pH4.9），含K₂HPO₄184g/L，KH₂PO₄145g/L，用H3_PO₄调节pH，使用量为0.8mL；

其他成分为：M-N溶液20mL，1%CaCl₂·2H₂O(w/v）1mL，20%葡萄糖(w/v）10mL，20%NH₄NO₃(w/v）2.5mL，50%甘油(v/v)10mL，使用前加入0.01%FeSO₄(w/v)10mL，补充去离子水至1000mL。

乙酰丁香酮（AS）配制：取AS0.1962g，用二甲基亚砜（DMSO)直接溶解后定容到10mL，即为0.1M的AS，分装于无菌1.5ml离心管中，置于-20℃保存备用。

2-（N-吗啉基）乙磺酸钠（MES）的配制：在无菌1.5mL离心管中称取0.1~0.15gMES，用1.0~1.5mL无菌去离子水完全溶解，配制成100mg/mLMES置于-20℃下保存备用。

根据本发明的具体示例，步骤C中为含有200μM的乙酰丁香酮和1.0mg/mL的2-（N-吗啉基）乙磺酸钠的Co-IM培养基。

根据本发明的具体示例，步骤C中共培养培养基（Co-IM）的配方如下：

磷酸氢钾缓冲液(K-buffer)，含K₂HPO₄200g/L，KH₂PO₄145g/L，用H₃PO₄调pH7.0，使用量为10mL；

硫酸镁-氯化钠溶液（M-Nbuffer），含MgSO₄·7H₂O30g/L和NaCl15g/L，使用量为20mL；

20%葡萄糖(w/v），20g葡萄糖溶解于70g去离子水中，定容至100mL，过滤除菌，使用量为5mL；

其他成分包括1%CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL，20%NH₄NO₃(w/v)2.5mL，使用之前加入0.01%FeSO₄(w/v)10mL，补充去离子水至1000mL，以H₃PO₄或NaOH调节pH至7.0。

根据本发明的具体示例，步骤D（1）中为20mL含有50μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢霉素的PDA培养基。

根据本发明的具体示例，步骤D（2）和（3）中均为含有50μg/mL的潮霉素的PDA平板。

根据本发明的具体示例，步骤D中制得的转化子保存在含有PDA斜面培养基的1.5mL的离心管中，置于4℃冰箱中保存。

本发明的一个方面，提供一种苹果树腐烂病菌转化子，采用如上述方法制备。

本发明的另一个方面，提供一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）以权利要求1中步骤B（1）的载体pBIG3C为框架，通过限制性内切酶ApaI和SacI进行酶切；将经相同酶切处理的PtrpC-GFP-TtrpC表达盒连接到载体中，获得以潮霉素抗性标记基因为筛选标记，组成性表达egfp的表达载体命名为pHG-C。进一步的，利用特异性引物分别以质粒pEGFP-C1和pAN52-1为模板扩增到egfp基因和来自于构巢曲霉Aspergillusnidulans的色氨酸合成酶基因启动子PtrpC及终止子TtrpC，获得PtrpC-GFP-TtrpC表达盒，再经相同内切酶ApaI和SacI酶切处理后连接到pBIG3C载体中，获得以潮霉素抗性标记基因为筛选标记，组成性表达egfp的表达载体命名为pHG-C；

（2）将上述步骤（1）中构建的载体pHG-C转入农杆菌中，然后按权利要求1所述步骤B-D进行后续操作，在含潮霉素PDA平板上筛选获得转化子；

（3）利用荧光显微镜观察各转化子的菌丝体在488nm蓝色激发光源的激发下能否产生绿色荧光，将表达绿色荧光蛋白的转化子接种至含有50μg/mL潮霉素的PDA平板上，连续培养三代得到稳定表达egfp的苹果树腐烂病菌转化子。

根据本发明的具体示例，按照上述方法保存苹果树腐烂病菌转化子。

本发明的另一个方面，提供一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株，采用如上述方法制备。

本发明提供了一种简便的农杆菌介导的苹果树腐烂病菌转化子制备方法，同时还提供了一种高效的腐烂病菌GFP分子标记方法。具有的优点如下：

1.苹果树腐烂病菌诱导分生孢子的方法与已报道的腐烂病菌诱导产孢方法更为简单，可以直接在培养皿内产生分生孢子，无需其它药品及处理，更为经济，同时已经证实此方法适宜于不同致病力腐烂病菌菌株分生孢子的诱导。

2.以腐烂病菌分生孢子为受体，无需制备原生质体，操作简便。

3.以根癌农杆菌作为转化介体，具有转化效率高、转化子稳定且单拷贝频率高等优点。

4.本发明的转化方法效率高，约10³个分生孢子可以获得1个转化子，而已报道的腐烂病菌分生孢子为受体进行的转化为每1.67×10⁵个分生孢子获得一个转化子，转化效率提高了约167倍。

5.建立的ATMT转化方法应用广泛，适合于多种果树病原真菌。已在梨树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)和樱桃干腐病菌(Phomopsisperniciosa)中得到验证。其它难以制备原生质体的丝状真菌，也可参考此说明方法。

6.构建的组成性表达egfp载体pHG-C，利用本方法转化苹果树腐烂病菌后，96.7%的转化子可表达强的绿色荧光蛋白，且遗传稳定性良好。

利用本方法成功转化了多个不同致病力的苹果树腐烂病菌菌株，而且经多次重复实验具有相同转化效率，为构建腐烂病菌菌株T-DNA随机插入突变体库提供了高效的转化技术。这是国内外首次报道利用农杆菌介导转化苹果树腐烂病菌，获得大量稳定表达绿色荧光蛋白的腐烂病菌转化子。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1、实施例1中苹果树腐烂病菌LXS080901在大麦粒培养基上产生的分生孢子。

图2、实施例1中所用质粒pBIG3C的图谱。

图3、实施例1中腐烂病菌LXS080901部分转化子菌落形态（PDA，25℃，5d）。图中：

W为未转化的LXS080901野生型菌株，其余均为LXS080901的转化子。

图4、实施例1中随机挑选腐烂病菌转化子潮霉素磷酸转移酶基因（hph）的PCR扩增电泳图谱。图中：

泳道M：DL2000DNAMaker；泳道CK：质粒pBIG3C；泳道W：LXS080901

未转化的野生型菌株；泳道1~14：腐烂病菌LXS080901菌株的转化子；泳道15：无菌水对照

图5、实施例1中随机挑选的转化子以潮霉素磷酸转移酶基因（hph）片段为探针进行的Southern杂交图谱。图中：

泳道M：λ-HindIIIdigestDNAMarker；泳道CK：ApaI酶切的pBIG3C质粒；

泳道W：HindIII酶切的腐烂病菌LXS080901野生型菌株基因组DNA；泳道1~8：HindIII酶切的腐烂病菌LXS080901转化子基因组DNA。

图6、实施例2中随机挑取部分转化子的GFP荧光显微观察（3个连续继代5次的GFP标记转化子）

图7、实施例2中部分转化子的潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和绿色荧光蛋白(efpg)基因稳定性检测的PCR和RT-PCR扩增电泳图谱。图中：

泳道M：DL2000DNAMarker；泳道1,11：质粒pBIG3C；泳道2,12：LXS080901未转化的野生型菌株；泳道3-10:转化子hph基因的PCR扩增产物；13:不表达egfp基因的转化子；14-17:转化子的egfp基因的RT-PCR产物。

图8、实施例2中部分转化子的菌丝生长速率。

图9、实施例2中GFP标记苹果树腐烂病菌菌株对富士离体枝条侵染过程的显微观察。

图10、实施例3中梨树腐烂病菌LXS240101部分转化子菌落形态（PDA，25℃，4d）。图中：W为未转化的LXS240101野生型菌株，其余均为LXS240101的转化子。

图11、实施例3中部分梨树腐烂病菌转化子以潮霉素磷酸转移酶基因（hph）片段为探针进行的Southern杂交图谱。图中：

泳道M：λ-HindIIIdigestDNAMarker；泳道CK：ApaI酶切的pBIG3C质粒；

泳道W：HindIII酶切的梨树腐烂病菌LXS240101野生型菌株基因组DNA；泳道1~3：HindIII酶切的梨树腐烂病菌LXS240101转化子基因组DNA。

图12、实施例3中部分樱桃干腐病菌转化子潮霉素磷酸转移酶基因（hph）的PCR扩增电泳图谱。图中：

泳道M：DL2000DNAMarker；泳道W：LXS230101未转化的野生型菌株；泳道CK：质粒pBIG3C；泳道1-9：LXS230101转化子hph基因的PCR扩增产物。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实例1：苹果树腐烂病菌菌株LXS080901的T-DNA随机插入突变体库的构建

1.转化受体苹果树腐烂病菌LXS080901分生孢子的制备

将保存的腐烂病菌菌株LXS080901接种在PDA培养基中，于25℃恒温暗培养3天。将活化后的苹果树腐烂病菌，打取菌饼（直径6mm）接种于下列6种培养基制备的平板上，继续置于25℃恒温箱暗培养。下述第6种培养基诱导产孢时，待腐烂病菌菌丝在PDA培养基上长满整个平皿后，放入灭菌的苹果枝条，并置黑光灯下（365nm）诱导。6种培养基的配方如下：

（1）PDA培养基称取200g去皮马铃薯，加适量蒸馏水煮30min后用四层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g，琼脂15g煮沸，补充蒸馏水至1000mL，分装后121℃灭菌30min。

（2）大麦粒PDA培养基将带壳大麦粒冲洗干净后，蒸馏水中浸泡1h，取70g浸泡过的大麦粒于250mL三角瓶中，加入1%(w/v)的蛋白胨20mL，6%(v/v)的蜂蜜20mL，混匀后置于121℃灭菌1h。PDA培养基制备方法同前，此大麦粒培养基与PDA培养基分开单独灭菌。之后先倒PDA平板，后将大麦粒均匀撒在上面，即为含大麦粒的PDA培养基。

（3）苹果树皮浆培养基取2~3年生富士苹果幼树枝干的树皮300g，组织匀浆后，加入10g琼脂，用蒸馏水定容至1000mL，分装后灭菌。

（4）燕麦片培养基称取燕麦片30g，煮沸后，加入琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL，分装后灭菌。

（5）苹果汁培养基成熟富士果实去皮，称取果肉组织300g,匀浆后四层纱布过滤，滤液中补加蒸馏水300mL，加入琼脂15g，分装后灭菌。

（6）苹果枝条培养基取1年生富士苹果枝条剪成5cm小段，高压灭菌后放置于长满腐烂病菌菌丝的PDA平板上，每个平皿2~4个枝条。

苹果树腐烂病菌LXS080901仅在大麦粒PDA培养基和灭菌苹果枝条上产生的子实体可溢出孢子角，在苹果枝条上诱导65天后仅5%的子实体能溢出孢子角，而在大麦粒PDA培养基上，20天左右即可见大量的橘黄色分生孢子角溢出，每个大麦粒平均可产生6个子实体，其中1.8个子实体可溢出孢子角，每个孢子角含有约10⁸个分生孢子，为利用腐烂病菌分生孢子进行遗传转化提供了足够的试材（见表1和图1）。

表1苹果树腐烂病菌在6种培养基上的产孢数量

2.转化质粒的制备

利用质粒pBIG3C为转化载体（图谱见图2），按试剂盒PlasmidMiniKitI（OMEGA公司）说明书提取质粒DNA。制备农杆菌EHA105的电击感受态细胞，通过电击转化的方法（电转仪为eppendorf公司产品，本实验所用电压为2.5KV，具体操作参考该仪器的使用说明书）将质粒pBIG3C转化到农杆菌EHA105中。

3.转化介体农杆菌的培养

将含有质粒pBIG3C的农杆菌菌株EHA105，室温静置2min加入800μLSOC培养基，于28℃，220rpm/min条件下振荡培养2h；将菌液在含有50μg/mL的卡那霉素、50μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的固体YEP平板上划线培养2天。

SOC培养基配制方法：YeastExtract5g，Tryptone20g，NaCl0.584g，KCl0.186g，MgSO₄·7H₂O2.4g，用NaOH调节pH至7.5，定容至1000mL，分装后高压灭菌。SOC培养基在使用之前加入10mL1MMgCl₂，加入无菌1MGlucose2mL。

50mg/mL链霉素及卡那霉素的配方为：取1g链霉素或卡那霉素用去离子水溶解后定容到20mL，配成浓度为50mg/mL的链霉素或卡那霉素，细菌过滤器过滤除菌后，分装于1.5mL离心管中置于-20℃贮存备用。

50mg/mL利福平配方为：取1g利福平用甲醇溶解后定容到20mL，配成浓度为10mg/mL的利福平，细菌过滤器过滤除菌后，分装于1.5mL离心管中置于-20℃贮存备用。

YEP培养基的配制方法：Bacto-trptone10g，YeastExtract5g，NaCl5g，琼脂15g，调节pH至7.0，定容至1000mL，分装后121℃高压蒸汽灭菌30min。

挑取农杆菌单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的2mL液体LB培养基中，放置于28℃、220rpm振荡培养24h。然后取250μL农杆菌溶液于含有50μg/mL卡那霉素的50mLMM培养基中28℃、220rpm振荡培养24h，测量菌液OD₆₀₀值。用IM培养基稀释MM培养基中的菌液至OD₆₀₀为0.15，加入不同浓度200μmol/mL的AS，于28℃、220rpm条件下培养6h。

LB液体培养基配方如下：Tryptone10g，YeastExtract5g，NaCl5g，补充去离子水至1000mL，pH7.0，分装后置于121℃高压灭菌30min。

基本培养基（MM）配方如下：

磷酸氢钾缓冲液(K-buffer，pH7.0)，含K₂HPO₄200g/L，KH₂PO₄145g/L，用H₃PO₄调pH，使用量为10mL；

硫酸镁-氯化钠溶液（M-Nbuffer），含MgSO₄·7H₂O30g/L和NaCl15g/L，使用量为20mL；

20%葡萄糖(w/v），20g葡萄糖溶解于70g去离子水中，定容至100mL，过滤除菌，使用量为10mL；

其他成分包括1%CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL，20%NH₄NO₃(w/v)2.5mL，使用之前加入0.01%FeSO₄(w/v)10mL，补充去离子水至1000mL，以H₃PO₄或NaOH调节pH至7.0。

诱导培养基培养基（IM）配方如下：

磷酸氢钾缓冲液pH4.9(1.25MK-buffer,pH4.9），含K₂HPO₄184g/L，KH₂PO₄145g/L，用H₃PO₄调pH，使用量为0.8mL；

其他成分为：M-N溶液20mL，1%CaCl₂·2H₂O(w/v）1mL，20%葡萄糖(w/v）10mL，20%NH₄NO₃(w/v）2.5mL，50%甘油(v/v)10mL，使用前加入0.01%FeSO₄(w/v)10mL，补充去离子水至1000mL。

乙酰丁香酮（AS）配制：取AS0.1962g，用二甲基亚砜（DMSO)直接溶解后定容到10mL，即为0.1M的AS，分装于无菌1.5ml离心管中，置于-20℃保存备用。

2-(N-吗啉基）乙磺酸钠（MES）的配制：在无菌1.5mL离心管中称取0.1~0.15gMES，用1.0~1.5mL无菌去离子水完全溶解，配制成100mg/mLMES置于-20℃下保存备用。

4.苹果树腐烂病菌LXS080901分生孢子与农杆菌共培养

用灭菌牙签挑取腐烂病菌孢子角至农杆菌悬浮液中，用农杆菌溶液稀释混合均匀，调节腐烂病菌分生孢子浓度至10⁶个/mL，得到农杆菌-腐烂病菌分生孢子混合液备用；在无菌培养皿中倒含有终浓度为200μMAS和1.0mg/mLMES的Co-IM培养基，在其上铺一层无菌玻璃纸，吸取200μL农杆菌-腐烂病菌分生孢子混合液均匀涂布于玻璃纸上，在超净台内吹至半干后置于25℃黑暗培养3~5天。72h后观察玻璃纸上是否有孢子的萌发，如果有，则进行下面步骤的操作，如果无，则继续共培养后进行下面步骤的操作。

共培养诱导培养基（Co-IM）的配方如下：

同IM培养基的制作，但20%葡萄糖(w/v）用量减半。Co-IM在使用之前加入0.1%FeSO₄(w/v）1μL/mL。

Co-IM配制双倍浓度，再配制两倍浓度的水琼脂，等体积混合后使用。

5.转化子的筛选及保存

将Co-IM培养基中的玻璃纸转移至另一无菌的空培养皿中，有菌丝的一面朝上，玻璃纸上面覆盖20mL含有50μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢霉素的PDA培养基，置于25℃恒温箱中培养3~5天，一旦有菌落长出，立即将其挑出并转移至含有50μg/mL潮霉素的PDA平板中连续培养3代至生长稳定，菌丝从7.5cm培养皿的一端生长至另一端为1代。最终将得到的表型稳定遗传的转化子保存在含有50μg/mL潮霉素的PDA培养基斜面上，置于4℃保存。

50mg/mL潮霉素的配制：取1g潮霉素用去离子水溶解后定容到20mL，配成浓度为50mg/mL的潮霉素，细菌过滤器过滤除菌后，分装于1.5mL离心管中置于-20℃贮存备用。

300mg/mL头孢霉素的配制：称取6g头孢霉素，用去离子溶解后定容到20mL，配成浓度为300mg/mL头孢霉素，细菌过滤器过滤除菌后，分装于1.5mL离心管中置于-20℃贮存备用。

在上述制备步骤中，除非特别说明，所有培养基及无菌试验用品均按照常规的121℃高压蒸汽灭菌30min的方法进行灭菌，然后置于室温保存备用。

通过该方法获得了大量苹果树腐烂病菌LXS080901转化子，构建了腐烂病菌LXS080901的T-DNA插入突变体库。筛选获得了产孢缺陷型、致病力缺陷型、生长速度缺陷型等各种类型的腐烂病菌LXS080901菌株的突变体（部分转化子菌落形态见图3）。

6.腐烂病菌LXS080901转化子的PCR验证

随机选取腐烂病菌转化子14个，经过3代的连续培养后，转化子菌落形态不发生变化。利用PCR扩增转化子T-DNA上的潮霉素磷酸转移酶基因片段，对转化子进行验证。

(1)提取转化子的基因组DNA：用铺有玻璃纸的PDA平板培养活化后的腐烂病菌转化子3天，收集菌丝，利用微波法提取转化子基因组DNA。

具体方法为：在1.5mL离心管中加入50~100μL的裂解缓冲液（50mMTris-HCl，pH7.2；50mMEDTA，pH8.0；3%SDS；1%巯基乙醇），取0.5cm2的边缘菌丝放入裂解液中；在微波炉中加热3个时间：15s、10s、5s，沸腾前取出；立即加入300~350μL裂解缓冲液，总体积达到400μL，80℃保温10min；加入等体积的氯仿：苯酚，涡旋混匀，4℃、10000rpm离心15min；取上清液300μL，加入等体积氯仿后混匀，4℃、10000rpm离心15min；取上清液250μL，加入0.6倍的异丙醇和1/103MNaAC，-20℃静置20min，4℃、10000rpm离心10min；弃上清，沉淀用500μL80%乙醇洗涤两次；将沉淀在超净台内吹干后溶于30μL无菌去离子水中，置于-20℃下保存，备用。

(2)以质粒pBIG3C为阳性对照，以苹果树腐烂病菌LXS080901野生型菌株为阴性对照，用潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物Hphup（5'-AAAGCCTGAACTCACCGCGACG-3'）和Hphdown（5'-CGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTAC-3'）对转化子基因组DNA进行PCR验证。

PCR扩增体系：Hphup和Hphdown（10μM）各1μL，dNTPmix2μL，PCRbuffer2.5μL，无菌双蒸水17.25μL，rTaq酶0.25μL，DNA模板1μL，共25μL反应体系。

PCR反应程序：94℃预变性3min；进入PCR循环，每个循环94℃45s，61℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物按照常规方法用1%琼脂糖凝胶进行电泳，经凝胶成像系统成像后拍照观察电泳结果。

所有供试转化子及质粒pBIG3C均能扩增出预期大小的目标片段（987bp），而未经转化的LXS080901野生型菌株和无菌水中均未扩增到相应大小的片段，说明转化子含有插入的T-DNA片段（见图4）。

为了进一步验证PCR扩增结果的可靠性，对PCR产物纯化后进行测序。Blast分析表明PCR扩增产物均为潮霉素磷酸转移酶基因（Hph）的片段。证明T-DNA已成功转入腐烂病菌LXS080901的染色体，且可以稳定遗传。

7.腐烂病菌LXS080901转化子的Southernblot检测

(1)DNA样品制备

随机选取部分转化子，采用CTAB法提取腐烂病菌基因组DNA。具体步骤如下：

将活化后的腐烂病菌LXS080901及其转化子，接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，待菌丝长满平皿，收集菌丝。称取1g菌丝，液氮研磨后加入5mLCTAB提取缓冲液(2%CTAB;2%PVP;100mMTris-HCl,pH8.0;25mMEDTA;2.0MNaCl)，混匀后于65℃水浴30min，间隔5min轻轻颠倒混匀一次；12000rpm/min离心15min，取上清，加入等体积的苯酚:氯仿(1:1)，混匀后按上述条件离心，取上清再次用氯仿抽提一次。取上清加入2.5倍体积的无水乙醇及1/10体积的3M醋酸钠溶液，于-20℃沉淀2h后12000rpm/min离心15min；弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤两遍，干燥后用适量的双蒸水溶解，加入5μLRNaseA（10mg/mL）置于37℃孵育2h，并用等体积的氯仿:苯酚（1:1）再次抽提DNA，加水溶解后于-20℃保存备用。利用紫外分光光度计测定DNA的浓度，并经1%琼脂糖凝胶电泳分析核酸的质量。

用限制性核酸内切酶ApaI、HindIII（购自宝生物（大连）有限公司）分别完全酶切阳性对照转化载体pBIG3C、腐烂病菌LXS080901转化子及阴性对照菌株LXS080901的基因组DNA。酶切体系为真菌基因组DNA15μg，限制性核酸内切酶15U，加入30μL对应的Buffer，用双蒸水补足300μL，37℃酶切过夜（12~16h）。

取10μL酶切产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。基因组DNA酶切充分后，用苯酚:氯仿抽提，加入无水乙醇，-20℃沉淀2h，12000rpm/min离心20min，75%乙醇洗涤两次，干燥后溶解于30μL双蒸水中。

同时，用限制性核酸内切酶ApaI酶切质粒pBIG3C的DNA，作为阳性对照，酶切体系：pBIG3C3μL，ApaI1μL，10×LBuffer2μL，DDW14μL。37℃酶切3h。用上述相同的方法纯化酶切产物并溶解于双蒸水中。

(2)电泳及转膜

将获得的酶切产物，用0.8%琼脂糖凝胶电泳，以1V/cm的电压电泳12~16h。然后用毛细管转移法将酶切产物转移至尼龙膜上（HybondN⁺，购自Amersham公司）。具体步骤如下：

先用DDW水清洗凝胶5~10min，加入足够的变性液（87.6gNaCl，20gNaOH，定容到1L)使胶能够漂浮起来，放在摇床上处理45min；倒出溶液，用DDW清洗，加入等量的中和液(121gTris-HCl，87.6gNaCl，调节pH至8.0，定容到1L)放在摇床上处理45min；倒掉中和液，用DDW清洗后移入2×SSC溶液中润洗，之后将胶倒放在玻璃板上，用Para膜将四周封住；剪一张与胶同样大小的尼龙膜在2×SSC溶液中润洗一下，平铺在胶的上面，其上先放一张同样大小的3MM滤纸，并将一叠整齐的吸水纸切开放到滤纸上方，用重物压实，转膜过夜。将尼龙膜放在120℃下烘烤30min固定核酸，用2×SSC清洗至少30min，然后在65℃中烘干，将处理好的膜置于室温下保存备用。

(3)探针标记

利用实施例1中步骤6的潮霉素磷酸转移酶基因的扩增引物Hphup和Hphdown从质粒pBIG3C中扩增hph片段，并用胶回收试剂盒（GelExtractionKit，购自Omega公司）回收扩增的片段。以随机引物法用地高辛对回收片段进行标记作为探针，标记方法按照试剂盒（DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI，购自Roche公司）说明书进行操作。

(4)Southern杂交

按照DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI说明书，将标记后的探针与转移至尼龙膜上的酶切产物进行杂交。对杂交后的尼龙膜进行显色并拍照扫描保存，对杂交结果进行分析。

结果如图5所示，LXS080901未转化的野生型菌株没有杂交信号，而阳性对照质粒及所有转化子均能检测到强的杂交信号，并且杂交信号带型多样，表明T-DNA在转化子中为随机插入。

实施例2：利用腐烂病菌LXS080901的GFP标记菌株观察病原菌的侵染过程

1.腐烂病菌LXS080901GFP标记菌株的获得

将构建的以潮霉素抗性标记基因为筛选标记，组成性表达egfp的表达载体pHG-C转入农杆菌中，按实施例1中所述方法进行后续操作，获得大量的转化子。挑取转化子，在荧光显微镜(LeicaDM2500)下观察各转化子的菌丝体在488nm蓝色激发光源的激发下能否产生绿色荧光蛋白。结果表明，所挑取的转化子中96.7%可表达强烈的绿色荧光，部分转化子的荧光观察结果见图6。

2.腐烂病菌LXS080901GFP标记菌株遗传稳定性的检测

随机选取7个表达GFP的腐烂病菌转化子，1个不表达egfp基因的转化子，转接至含有50μg/mL潮霉素的PDA平板上活化，后接种在不含潮霉素的PDA固体平板上反复转接五代，重新反接到含有50μg/mL潮霉素的PDA平板上。结果表明腐烂病菌转化子反接到含有潮霉素的培养基上后能正常生长，且7个表达egfp基因的转化子均能观察到强的绿色荧光。

对挑取的转化子提取基因组DNA和RNA，DNA提取方法同实施例1中步骤6，RNA提取方法按Trizol试剂盒（购自Invitrogen公司）说明书进行；以表达载体作阳性对照，野生型菌株作阴性对照，利用潮霉素转移酶基因和绿色荧光蛋白基因的特异性引物进行扩增。hph基因引物、扩增体系及PCR条件同实施例1中步骤6，egfp基因的扩增引物为：primerF（5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'）和primerR（5'-TGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'），扩增体系和反应程序同hph基因。

结果见图7，所有的转化子均可扩增到hph基因的目标条带（987bp）；不表达绿色荧光蛋白的转化子未能扩增到egfp基因的特异性条带，但其余的转化子均可检测到egfp基因的目标条带（715bp），表明T-DNA已经插入到腐烂病菌的染色体上，表现出hph基因和egfp基因在复制和转录水平上的遗传稳定性。

3.腐烂病菌LXS080901GFP标记菌株的生物学特性分析

随机挑取34个表达绿色荧光蛋白的GFP标记腐烂病菌菌株，以未转化的野生型菌株作为对照，活化后接种至PDA培养基，于25℃恒温暗培养，定期测定菌落生长直径，观察菌落形态，统计其产孢量并进行致病力测定。

在菌落长满平皿前，定期（24h、36h、48h、60h、72h）测定转化子的菌落直径，如图8所示为31个转化子的生长速率测定结果，可见部分转化子的生长速度加快，部分转化子的生长速度明显降低，但大部分转化子的生长速度同野生型对照没有明显差异。在此基础上，选择菌落形态、产孢量及致病力没有发生变异的菌株（3号转化子），进行腐烂病菌侵染过程观察。

4.腐烂病菌的侵染过程观察

将上述3号腐烂病菌的转化子活化后，打取菌饼（6mm）烫伤接种富士苹果的1~2年生离体枝条，置于25℃，100%相对湿度下恒温保湿，待发病后，切取皮层组织，包埋后用冷冻切片机（Microm525）切取5~10μm的超薄切片。在荧光显微镜下可观察到，皮层组织中存在表达绿色荧光蛋白的腐烂病菌菌丝，见图9。

实施例3：可行性分析实施例

利用本发明所提供的方法，建立了梨树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、樱桃干腐病菌(Phomopsisperniciosa)等多种丝状真菌的遗传转化体系，证明本发明提供的方法稳定性及使用范围。下面分别以梨树腐烂病菌和樱桃干腐病菌为例，对本发明提供的农杆菌介导真菌遗传转化方法再做详细说明。

1.农杆菌介导的梨树腐烂病菌的遗传转化体系

将活化后的梨树腐烂病菌LXS240101接种至PDA培养基上，25℃恒温暗培养至产生分生孢子，挑取其分生孢子，用含有质粒pBIG3C的农杆菌EHA105稀释至10⁶个/mL，然后按照实施例1中步骤所述方法进行后续操作，在此转化条件下，每皿可得到约150个转化子。对240101部分转化子的生物学特性进行分析，发现有的转化子菌落形态发生明显改变，见图10；对所获得梨树腐烂病菌LXS240101转化子进行PCR和Southern杂交分子验证，部分转化子hph基因片段为探针进行的Southern杂交结果，见图11。

2.农杆菌介导的樱桃干腐病菌的遗传转化体系

将活化的樱桃干腐病菌LXS230101接种至PDA培养基上，25℃恒温暗培养至产生大量的α-分生孢子，挑取α-分生孢子用含有质粒pBIG3C的农杆菌EHA105稀释至10⁶个/mL，然后按照实施例1中步骤所述方法进行后续操作。在此转化条件下，每皿可得到约130个转化子，对所得樱桃干腐病菌LXS230101转化子进行遗传稳定性和分子验证，表现出hph基因在复制和转录水平上的遗传稳定性，hph基因特异引物的PCR扩增结果，见图12。

Claims (5)

1.一种制备苹果树腐烂病菌转化子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.制备苹果树腐烂病菌分生孢子：

(1)将苹果树腐烂病菌接种于PDA培养基上，活化培养3天；

(2)将活化培养的腐烂病菌打取菌饼接种于含有大麦粒的PDA培养基上，25℃恒温培养20-30天，至橘黄色分生孢子角溢出；

B.培养农杆菌：

(1)将质粒pBIG3C转入农杆菌中；

(2)取步骤B(1)中的农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养1天；所述LB液体培养基为2mL含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL利福平和50μg/mL链霉素的LB液体培养基；

(3)取步骤B(2)中的农杆菌菌液于含卡那霉素的基本培养基中，28℃震荡培养2天，测量菌液的OD600值；农杆菌菌液与基本培养基的体积为0.25:50；所述基本培养基为含50μg/mL的卡那霉素的50mL基本培养基；

(4)用含有乙酰丁香酮和2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的IM培养基稀释步骤B(3)中的农杆菌悬浮液至OD600值为0.15，继续在28℃条件下振荡培养6h备用；IM培养基为含有200μM的乙酰丁香酮和1.0mg/mL的2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的IM培养基；

C.根癌农杆菌与苹果树腐烂病菌分生孢子共培养：

(1)取步骤A(2)中的苹果树腐烂病菌分生孢子角至步骤B(4)中的农杆菌悬浮液中，用农杆菌溶液稀释混合均匀，调节浓度至106个分生孢子/mL；

(2)将步骤C(1)中的农杆菌-腐烂病菌分生孢子混合液，按200μL/皿的量均匀涂布于铺有玻璃纸的含有乙酰丁香酮和2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的Co-IM培养基上，置于25℃共培养3～5天；

D.转化子的筛选及保存

(1)将步骤C(2)中的玻璃纸放于一空的无菌培养皿中，使有菌丝的一面朝上，玻璃纸上面覆盖含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基，置于25℃恒温箱中培养3～5天；

(2)将长出的腐烂病菌菌落转移至含有潮霉素的PDA平板中继续培养，将生长的菌落再次接种至含有潮霉素的PDA平板上，连续培养三代得到苹果树腐烂病菌转化子；

(3)将得到的转化子保存在含有50μg/mL潮霉素的PDA斜面培养基上，置于4℃低温保存。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中为含有200μM的乙酰丁香酮和1.0mg/mL的2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的Co-IM培养基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D(1)中为含有50μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢霉素的PDA培养基。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D(2)和(3)中为含有50μg/mL的潮霉素的PDA平板。

5.一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以权利要求1中步骤B(1)的载体pBIG3C为框架，通过限制性内切酶ApaI和SacI进行酶切，将经相同酶切处理的PtrpC-GFP-TtrpC表达盒连接到载体中，获得以潮霉素抗性标记基因为筛选标记，组成性表达egfp的表达载体命名为pHG-C；

(2)将上述步骤(1)中构建的载体pHG-C转入农杆菌中，然后按权利要求1中步骤B-D进行后续操作，在含潮霉素PDA平板上筛选获得转化子；

(3)利用荧光显微镜观察各转化子的菌丝体在488nm蓝色激发光源的激发下能否产生绿色荧光，将表达绿色荧光蛋白的转化子接种至含有50μg/mL潮霉素的PDA平板上，连续培养三代得到稳定表达egfp的苹果树腐烂病菌转化子。