CN103993035A

CN103993035A - 利用gfp蛋白检测烟草遗传转化的方法

Info

Publication number: CN103993035A
Application number: CN201410017274.1A
Authority: CN
Inventors: 宋雯雯; 段方猛
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2014-01-07
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2014-08-20

Abstract

本发明公开了一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其将GFP蛋白的编码基因导入目的植物中获得转基因植物，通过检测转基因植物的根、茎、叶在紫外光的激发下是否呈现绿色荧光来检测烟草遗传转化，从而筛选出转化组织；本发明中将含有GFP蛋白的表达载体pB7WG2D通过农杆菌介导的叶盘法进行烟草的遗传转化，丛生芽诱导时期即可进行GFP蛋白的检测，确保了筛选出的丛生芽都是转化组织，并且避免了筛选剂的使用，节省了非转化组织的继代培养工作，从而提高了基因的遗传转化效率。

Description

利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法

技术领域

本发明涉及一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法。

背景技术

转基因植物的检测通常采用PCR扩增、Southern杂交和ELISA等分子技术，这些检测技术必须在获得抗性植株后才能进行，并不能在培育转基因植株的过程中应用；且需要提取植株的基因组DNA或蛋白，对DNA或蛋白的纯度和浓度均高质量的要求。因此，有必要给出一种在转基因植株的培育过程进行实时、简便的检测的方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其可在烟草转基因植株的培育过程进行实时、简便的检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，具体操作为：将GFP蛋白的编码基因导入目的植物中获得转基因植物，通过检测转基因植物的根、茎、叶在紫外光的激发下是否呈现绿色荧光来检测烟草遗传转化，从而筛选出转化组织；

GFP蛋白编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

具体的操作为：

将表达载体pB7WG2D采用冻融法转化到根瘤农杆菌LBA4404中构建得到重组菌LBA4404/pB7WG2D；表达载体pB7WG2D中含有启动子和连接在启动子下游的GFP蛋白的编码基因；

将制备好的重组菌LBA4404/pB7WG2D的菌液进行活化，用菌液以共培养方式浸染烟草叶盘，暗培后将叶盘移入至恢复培养基恢复培养1周后移入丛生芽诱导培养基培养，然后荧光检测筛选转化的丛生芽，将其切下后移入伸长培养基继代培养，采用荧光检测继代培养获得的抗性苗，将发绿色荧光的再生苗移入生根培养基培养，获得组培植株，最后将组培植株经过驯化后，移入营养土中栽培。

启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子。

将烟草种子用次氯酸钠溶液消毒，用OD值在0.6～0.8之间的菌液以共培养方式浸染烟草叶盘5分钟，暗培3天。

本发明中将含有GFP蛋白的表达载体pB7WG2D通过农杆菌介导的叶盘法进行烟草的遗传转化，丛生芽诱导时期即可进行GFP蛋白的检测，确保了筛选出的丛生芽都是转化组织，并且避免了筛选剂的使用，节省了非转化组织的继代培养工作，从而提高了基因的遗传转化效率。

另外，虽然该方法相对于分子检测，操作简便，快速高效，且利用手携式长波紫外灯检测含有GFP的转基因植物，可以进行活体的实时检测，但是这种检测方法的还是存在一定的缺陷，亦即必须要有足够的GFP转录，如果GFP转录不足的话，就会导致荧光现象不足而检测不出来。因此，如何在GFP转录不足的情况下依然可以检测到强荧光信号也是本发明的关键，本发明通过法国VILBER Fusion FX7成像系统对GFP绿色荧光蛋白进行检测，Fusion FX7采用固定的F0.95大光圈镜头，能够保证透光率最大，即使再微弱的光也能够被有效传至CCD传感器，另外，低于室温67℃的4级Pelti er制冷CCD，使得成像过程中所产生的暗电流更小，背景噪音更低，进一步保证了荧光检测的高灵敏度。

附图说明

图1为FX7荧光检测筛选转化的丛生芽；

图2为FX7荧光检测伸长的丛生芽；

图3为PCR分别扩增GFP基因和BAR基因结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、培育转GFP烟草植株

将表达载体pB7WG2D采用冻融法转化到根瘤农杆菌LBA4404(Invitrogen公司，产品编号18313015)中构建重组菌LBA4404/pB7WG2D。表达载体pB7WG2D中含有启动子和连接在启动子下游的GFP蛋白的编码基因；启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子。

GFP蛋白编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

SEQ ID NO：1

tggtgaagactaatctttttctctttttcatcttttcacttctcctatcattatcctcggccgacatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagaaggacgagctgtaa

将烟草种子用次氯酸钠溶液消毒，将制备好的重组菌LBA4404/pB7WG2D菌液进行活化，用OD(吸光)值在0.6-0.8之间的菌液以共培养方式浸染烟草叶盘5分钟，再暗培养3天。将暗培养后的叶盘移入到恢复培养基(B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，0.59g·L-1Mes，1.7mg·L-16-BA，100mg·L-1cefotaxime，0.8％琼脂，PH＝5.6)。

恢复培养1周后，移入丛生芽诱导培养基(B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，0.59g·L-1Mes，1.7mg·L-16-AP，100mg·L-1cefotaxime，5mg·L-1PPT，0.8％琼脂，PH＝5.6)，采用FX7荧光检测来筛选转化的丛生芽，如图1所示，将其切下后移入伸长培养基(MS大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，0.59g·L-1Mes，0.1mg·L-1IAA，100mg·L-1cefotaxime，0.8％琼脂，PH＝5.6)，每隔1周继代1次。待伸长的抗性苗转入生根培养基之前，再次采用FX7荧光检测抗性苗，将发绿色荧光的再生苗(图2)移入生根培养基(1/2浓度的B5大量盐和微量盐，MS铁盐，2％蔗糖，0.59g·L-1Mes，1m g·L-1IAB，0.8％琼脂，PH＝5.6)，获得组培植株10株。最后将组培植株经过驯化后，移入营养土中栽培。

实施例2、转GFP烟草植株的PCR鉴定

分别提取上述获得的转化植株的基因组DNA，PCR分别检测GFP基因和BAR基因，结果如图3所示，野生型烟草均未扩增出GFP基因和BAR基因的特异条带，而经过绿色荧光蛋白筛选得到的10株转化植株，全部扩增出GFP基因和BAR基因的特异条带，转化率达到100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，具体操作为：将GFP蛋白的编码基因导入目的植物中获得转基因植物，通过检测转基因植物的根、茎、叶在紫外光的激发下是否呈现绿色荧光来检测烟草遗传转化，从而筛选出转化组织；

GFP蛋白编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其特征在于，具体的操作为：

3.如权利要求2所述的利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其特征在于：启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子。

4.如权利要求2所述的利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其特征在于：将烟草种子用次氯酸钠溶液消毒，用OD值在0.6～0.8之间的菌液以共培养方式浸染烟草叶盘5分钟，暗培3天。