CN102851301A - 一种猪流行性腹泻病毒m基因全序列的扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤：1、提取猪流行性腹泻病毒RNA；2、依据猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计RT-PCR引物，并扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因；3、依据猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计套式PCR引物，以RT-PCR产物为模板，扩增M基因全部片段；4、PCR产物的克隆及测序分析：将套式PCR产物进行纯化并连接到pMD18-TSimpleVector上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因全长，通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效力的相关性。

Description

一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒技术领域，具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法。 

背景技术

毛雅元等（2010年）设计了2对引物，用套式PCR检测在VERO细胞上不同培养代次的猪流行性腹泻病毒的M基因，其扩增的片段仅有412bp，不能扩增不同培养代次的猪流行性腹泻病毒的M基因全部序列（681bp）。 

发明内容

为此，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因全长，特别是在ST、VERO细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的M基因全长。通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效力的相关性。该方法扩增的目的片段长761bp，包含681bp的猪流行性腹泻病毒的M基因。 

本发明的技术方案如下：一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤： 

1、提取病毒RNA: 

取原病料即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液-20℃反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA; 

2、RT-PCR扩增 

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计RT-PCR引物，引物序列为： 

PEDVWF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3 

PEDVWR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3 

以步骤1所得的病毒RNA为模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2（DRR055A）扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因，目的片段长867bp； 

3、套式PCR扩增 

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计PCR引物，引物序列为： 

PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3 

PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3 

以RT-PCR产物为模板，用上述引物采用TaKaRa Premix Taq Version2.0(D334S)扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因片段； 

4、PCR产物的克隆及测序分析： 

（1）用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit(目录号EP101)对套式PCR产物进行纯化； 

（2）将纯化的PCR产物连接到pMD18-T Simple Vector上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。 

本发明的有益效果为：本发明所述猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因全长，特别是在ST、VERO细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的M基因全长。通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效力的相关性。该方 法扩增的目的片段长761bp，包含681bp的猪流行性腹泻病毒的M基因。 

附图说明

图1、将原病料、病毒在ST、vero细胞上培养的第5代、第10代、第15代毒的RNA分别用外围引物(PEDVWF/PEDVWR)扩增的RT-PCR产物以及其RT-PCR产物再用内部引物(PEDVNF/PEDVNR)扩增的套式PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。 

其中，M：DL2000；1：原病料RNA RT-PCR产物，目的片段为867bp；2-4：分别为病毒在ST细胞上培养第5代、第10代、第15代毒的RNA RT-PCR结果；5-7：分别为病毒在Vero细胞上培养第5代、第10代、第15代毒的RNART-PCR结果；8：原病料套式PCR产物，目的片段为761bp；9-11：分别为病毒在ST细胞上培养第5代、第10代、第15代毒的套式PCR产物，片段为761bp；12-14：分别为病毒在Vero细胞上培养第5代、第10代、第15代毒的套式PCR产物，片段为761bp。说明此方法能扩增出猪流行性腹泻病毒在ST、Vero细胞上培养的F5、F10、F15代毒的M基因全长； 

图2-1,2-2为Vero F15M序列用DNAstar软件进行序列比对的结果。 

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明所述猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法进一步说明。 

一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤： 

1、提取病毒RNA: 

取原病料即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液-20℃反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA;用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA的方法如下： 

①取200μl病料处理液或冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200μl 的Solution A,剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟; 

②加入75μl的Solution B，混合均匀后，12000rpm离心5分钟; 

③将上清转移到新的Collection Tube(2ml，试剂盒中提供)中，加250μl异丙醇（1%冰乙酸），上下颠倒混匀; 

④将试剂盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube(2ml，试剂盒中提供)上，将③中的上清液转移至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液; 

⑤将500μl的Rinse A加入至Spin column中，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，弃滤液; 

⑥将800μl的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液。 

⑦再次进行12000rpm离心1分钟; 

⑧将Spin column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin column膜的中央处加入50μl的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置1分钟; 

⑨12000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA;提取的病毒RNA立即用于后续试验或-20℃保存。 

2、RT-PCR扩增 

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计RT-PCR引物，引物序列为： 

PEDVWF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3 

PEDVWR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3 

以步骤1所得的病毒RNA为模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2（DRR055A）扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因。 

RT-PCR反应体系为： 

RT-PCR反应程序为： 

用琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物，结果如图1所示。 

3、套式PCR扩增 

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计PCR引物，引物序列为： 

PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3 

PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3 

以RT-PCR产物为模板，用上述引物采用TaKaRa Premix Taq Version2.0(D334S)扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因片段。 

PCR反应体系为： 

PCR反应程序为： 

用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图1所示。 

4、PCR产物的克隆及测序分析： 

（1）套式PCR产物片段长761bp，采用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit(目录号EP101)进行PCR产物的纯化，方法如下： 

①取50-100μl的PCR产物，加入5倍体积的溶液BB，混匀后加入吸附柱中，静置1分钟10000rpm离心1分钟，弃去流出液。 

②加入650μl溶液WB，10000rpm离心1分钟，弃去流出液。 

③10000rpm离心1-2分钟，去除残留的WB。 

④将吸附柱放于一新的1.5ml离心管中，在柱的中央加入30-50μlEB或灭菌蒸馏水（65-70℃预热EB或灭菌蒸馏水）。室温静置1分钟，10000rpm离心1分钟，洗脱DNA。洗脱的DNA立即用于后续试验或-20℃保存。 

（2）用pMD18-T Simple Vector（TaKaRa code：D103A）连接PCR纯化产物，即洗脱的DNA。 

①在1.5ml离心管中配制下列溶液，全量为5μl。 

②加入5μl的Solution Ⅰ。 

③16℃反应30分钟。 

④洗脱的DNA与pMD18-T Simple Vector的连接产物-20℃保存。 

（3）连接产物转化DH5α感受态细胞。 

①取3μl连接产物放入100μl DH5α感受态细胞悬液中，轻轻混匀； 

②冰上放置20-30分钟，然后42℃水浴热激90秒，迅速冰上冷却2分钟； 

③立即加入0.8mlLB液体培养基，摇匀后于37℃150-180rpm振荡培养45-60分钟； 

④取培养液200μl接种于含有100μg//ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀； 

⑤倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养14-16小时。 

（4）阳性克隆筛选： 

①挑取培养皿上的单个菌落（6-10个），每个单菌落接种于2ml含100μg//ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃180-200rpm振荡培养14-16小时； 

②用引物PEDVNF、PEDVNR PCR鉴定阳性克隆，采用TaKaRa Premix Taq Version 2.0(D334S)。 

引物序列为：PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3 

            PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3 

反应体系为： 

反应程序为： 

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，出现761bp大小的条带的为阳性克隆菌液。对阳性菌进行序列测定。 

（5）原病料、病毒在ST、vero细胞上培养的第5代、第10代、第15代毒采用以上方法扩增出了761bp的目的片段(包含M基因全序列)，经测序，其序列为： 

原液M序列： 

TTACATGCGAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAACTTTATG GCTTCTGTCAGCT 

ST F5M序列： 

TTACATGCGAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAACTTTATGGCTTCTGTCAGCT 

ST F10M序列： 

TTACATGCGAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAAGTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAACTTTATG GCTTCTGTCAGCT 

ST F15M序列： 

TTACATGCGAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAACTTTATGGCTTCTGTCAGCT 

Vero F5M序列： 

TTACATGCGAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTCCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAACTTTATG GTCTCTGTCAGCT 

Vero F10M序列： 

TTACATGCGAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACACTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAACTTTATGGCTTCTGTCAGCT 

Vero F15M序列： 

TTACATGCGAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATCGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAACTTTATG GCTTCTGTCAGCT 

用DNAstar软件进行序列比对，结果为：如图2-1，2-2所示。 

由比较结果可知：此猪流行性腹泻病毒在ST、Vero细胞上传到第15代时，其M基因序列与原病料中病毒的M序列相似度为99.9%，未发生显著差异。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。 

Claims (3)

1.一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

1、提取病毒RNA:

取原病料，即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液，-20℃反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viralRNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA;

2、RT-PCR扩增

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计RT-PCR引物，引物序列为：

PEDVWF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3

PEDVWR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3

以步骤1所得的病毒RNA为模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRaPrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2（DRR055A）扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因；

3、套式PCR扩增

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计PCR引物，引物序列为：

PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3

PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3

以RT-PCR产物为模板，用上述引物采用TaKaRa Premix Taq Version2.0(D334S)扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因片段；

4、PCR产物的克隆及测序分析：

（1）用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit(目录号EP101)对套式PCR产物进行纯化；

（2）将纯化的PCR产物连接到pMD18-T Simple Vector载体上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。

2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA的方法如下：

①取200μl病料处理液或冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200μl的Solution A,剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟;

②加入75μl的Solution B，混合均匀后，12000rpm离心5分钟;

③将上清转移到新的Collection Tube(2ml，试剂盒中提供)中，加250μl异丙醇（1%冰乙酸），上下颠倒混匀;

④将试剂盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube(2ml，试剂盒中提供)上，将③中的上清液转移至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液;

⑤将500μl的Rinse A加入至Spin column中，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，弃滤液;

⑥将800μl的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑦再次进行12000rpm离心1分钟;

⑧将Spin column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin column膜的中央处加入50μl的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置1分钟;

⑨12000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA;提取的病毒RNA立即用于后续试验或-20℃保存。

3.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，采用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit(目录号EP101)进行PCR产物纯化的方法如下：

①取50-100μl的PCR产物，加入5倍体积的溶液BB，混匀后加入吸附柱中，静置1分钟10000rpm离心1分钟，弃去流出液。

②加入650μl溶液WB，10000rpm离心1分钟，弃去流出液。

③10000rpm离心1-2分钟，去除残留的WB。

④将吸附柱放于一新的1.5ml离心管中，在柱的中央加入30-50μlEB或灭菌蒸馏水（65-70℃预热EB或灭菌蒸馏水）。室温静置1分钟，10000rpm离心1分钟，洗脱DNA。洗脱的DNA立即用于后续试验或-20℃保存。

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