CN103911461A - 一种四重rt-pcr同时检测多种大蒜病毒的方法及其引物组合 - Google Patents

一种四重rt-pcr同时检测多种大蒜病毒的方法及其引物组合 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种四重RT-PCR同时检测多（10）种大蒜病毒的方法及其引物组合。具体采用四对引物，一次RT-PCR同时检测大蒜主要病毒洋葱黄矮病毒(OYDV),韭葱黄条病毒(LYSV)，葱潜隐病毒(SLV)以及青葱X病毒属病毒（Allexivirus，包括GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X）等多种大蒜病毒。因此，本发明一次检测的病毒种类增多，检测效率极大提高，检测的成本极大降低。

Description

一种四重RT-PCR同时检测多种大蒜病毒的方法及其引物组合
技术领域
本发明属于作物病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种大蒜病毒的方法及其引物组合。
背景技术
大蒜(Allium sativum L.)属于百合科葱属植物，为无性繁殖作物。大蒜具有较高的营养价值，独特的风味，是消费者喜食的调味品，在全世界广泛种植，全球种植面积约为110万hm2，总产约为1400万t。随着对大蒜药用价值的研究和应用的深入，大蒜已经备受国际医学界与消费者的青睐。现代医学研究证明大蒜和天然大蒜制剂有非常好的防病治病功效，大蒜具有抗菌消炎、防癌抗癌，改善肝脏机能障碍，抗衰老、提高机体免疫力，降血脂、降血压、防动脉硬化及血栓形成等功能。
大蒜的病毒病广泛分布于世界各地，导致其产量减少和品质的降低。由于大蒜通过鳞茎进行无性繁殖，病毒在鳞茎里积累，症状越来越严重。大蒜能感染多种病毒，而且存在多种病毒的复合感染。常见的病毒有马铃薯病毒属的洋葱黄矮病毒 (Onion yellow dwarf virus，OYDV)、韭葱黄条病毒（Leek yellow stripe virus ，LYSV) 和葱黄条纹病毒（Shallot yellow stripe virus，SYSV) ，香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)的大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latent virus，GCLV), 大蒜潜隐病毒(Garlic latent virus，GLV)和葱潜隐病毒（Shallot latent virus，SLV)，青葱X病毒属病毒（Allexivirus）的GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和葱病毒X(shallot virus x , ShV-X)。Tsuneyoshi（Tsuneyoshi T, Matsumi T., Natsuaki K.T., Sumi S., 1998. Nucleotide sequence analysis of virus isolates indicates the presence of three potyvirus species in Allium plants. Archives of Virology 143:97-113.）证明GLV和SLV为同一种病毒；我国大蒜收获面积为64万hm2，产量为1050万吨，占全球75%，但是我国脱毒大蒜种植面积较少，农民多进行留种，病毒感染严重；我国大蒜常见的病毒有洋葱黄矮病毒(OYDV), 韭葱黄条病毒(LYSV)，葱潜隐病毒(SLV) 和青葱X病毒属病毒(包括GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X)，而且普遍存在多种病毒复合侵染的现象，严重影响了大蒜的品质和产量。
 
应用大蒜茎尖脱毒技术培育脱毒大蒜的研究很早就开始进行，并且都取得了一定的进展（海燕,康明辉,何宁,等. 2006.大蒜茎尖脱毒及组织培养研究[J].河南农业科学,11:97-98；李昌华,李小川,赵美华,等. 1 995.大蒜茎尖脱毒技术及组织培养研究[J].华北农学报, 10 (3):20-25；于德才,李学湛,吕典秋,等. 2005.大蒜茎尖脱毒及快繁研究[J].北方园艺,6:84-85；曲英华,高树英明.2003.低温处理对大蒜茎尖离体培养芽形成及生长的影响[J].中国农业大学学报, 8 (4):24-26；许 蕊. 三种大蒜病毒的RT-PCR及多重RT-PCR检测研究.硕士学位论文.甘肃农业大学,2012.)。在培育脱毒大蒜的过程中，需要对茎尖繁殖的大蒜进行病毒检测，以确定病毒是否脱除。目前常用的植物病毒检测方法有生物学方法又叫指示植物法、血清学方法又叫酶联免疫法、电子显微镜法、反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT- PCR）。生物学方法测定耗时长、工作量大、灵敏度较差，不同病毒侵染后也常常表现出相似症状，显症反应也会受到复合侵染的影响；血清学检测方法在一定范围内可能出现假阴性和假阳性的现象，且对于检测样本较小的试验来说，试剂盒的成本较高；生物学方法和血清学方法的每一次检测只能针对单种病毒，检测效率低。电镜法对于病毒科或属以下的分类不能判定，且设备昂贵，样本数量不宜过大。而 RT-PCR 因其特异性最强、灵敏度最高，已成为当前病原检测的首选方法，并广泛应用于植物病毒检测。对于多种病毒复合侵染，可以通过多重RT-PCR方法同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，提高了检测效率，降低了检测成本，而且检测成本低，是其他检测方法所不能比拟的。但是大蒜病毒单重RT-PCR检测研究较多，但多重RT-PCR研究较少。Majumder等（Majumder S., Baranwal V.K.  and Joshi S. 2008.Simultaneous detection of onion yellow dwarf virus and shallot latent virus in infected leavers and cloves of garlic by duplex RT-PCR . Journal of Plant Pathology, 90 (2), 371-374）建立了一种双重RT-PCR同时检测OYDV和SLV 2种病毒。许蕊等通过2个双重RT-PCR，检测了大蒜潜隐病毒（GLV）、韭葱黄条病毒（LYSV）、洋葱黄矮病毒（OYDV）。虽然PARK等(Park KS, Bae YJ, Jung EJ, Kang SJ. 2005. RT-PCR-based detection of six garlic viruses and their phylogenetic relationships. Journal of microbiology and biotechnology. 15 (5):1110-1114.)用一个多重RT-PCR检测GarV-X、OYDV、大蒜螨传播的丝状病毒（Garlic mite-borne filamentous virus，GarMbFV）、LYSV、大蒜花叶病毒（Garlic mosaic virus,GarMV，经序列比对实为LYSV）、GLV等6种病毒，由于扩增片段长度分别为661、693、723、768、825、921bp，片段大小太接近，凝胶电泳后成像时661、693、723、768bp四个片段重叠在一起，也因片段大小太接近，无法根据电泳图中的条带大小判断是何种病毒，给病毒检测带来不便，只有检测GarV-X、GarMbFV、GarMV（LYSV）、GLV的四重RT-PCR比较清楚，可以根据其片段大小，分别为661、723、825和921bp；GarMbFV只是一个暂名病毒，这种病毒不常见，可能属于青葱X病毒属。因此，Park建立的方法只能同时检测常见病毒中的GarV-X、LYSV和GLV等病毒, 而已经发现的青葱X病毒属病毒有7种，加上OYDV、LYSY和SLV病毒，常见的病毒有近10种。对经茎尖繁殖的大量大蒜种进行病毒检测，需要RT-PCR检测技术具有检测的病毒种类多、检测步骤简单、准确、经济等特点，现有大蒜病毒RT-PCR检测技术存在的检测病毒种类较少，片段区分较难等问题，而且由于病毒种类太多，很难建立十重RT-PCR来检测这10种病毒。
发明内容
为提高RT-PCR检测效率，降低检测成本，本发明根据Genbank发布的这些病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计通用引物，旨在建立一个简单、高效、灵敏的四重RT-PCR检测技术，同时检测国内发现的大蒜主要病毒洋葱黄矮病毒(OYDV), 韭葱黄条病毒 (LYSV)，大蒜潜隐病毒(GLV) 或葱潜隐病毒(SLV)、 GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X等10种病毒，为研究国内大蒜病毒病流行情况及脱毒大蒜种的病毒检测提供技术支撑。
因而，本发明所要解决的技术问题是：针对大蒜病毒种类较多、现有RT-PCR检测方法的不足，建立一种高效的四重RT-PCR大蒜病毒检测方法，同时检测10种大蒜病毒。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种四重RT-PCR检测多种大蒜病毒的方法，针对我国大蒜主要病毒的基因组保守序列设计4对通用引物，并建立四重RT-PCR反应体系和程序，同时检测大蒜主要病毒洋葱黄矮病毒(OYDV), 韭葱黄条病毒(LYSV)，葱潜隐病毒(SLV) 以及青葱X病毒属病毒包括GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X等10种大蒜病毒。
根据Genbank发布的这些病毒全基因组或部分序列的保守序列，并根据四重RT-PCR产物大小不同的要求，设计了四对引物具体请见表1和SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8，其中引物对allexivirus-F和allexivirus-F为检测青葱X病毒属病毒GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X等7种病毒的通用引物（图1），片段大小均在180bp左右。
表1  四重RT-PCR检测大蒜病毒的引物及其检测的病毒
本发明检测方法具体包括以下步骤：
1）大蒜植株叶片RNA的获得：取田间花叶症状的大蒜幼嫩叶片，冰上保存并带回实验室，采取Trizol方法提取RNA；
2）以步骤1）得到的RNA为模板，以6碱基随机引物Random Primers 为反向引物，通过反转录，得到cDNA；
3）以步骤2）得到的cDNA为模板，用表1中的四对引物对其进行PCR扩增；本发明中四重PCR的条件为：
PCR 反应体系（50 μl）：2× PCR mix 25 μl、模板（cDNA）4 μl、表1中每对正向引物和反向引物各2 μl、超纯水补至所需体积；
PCR程序：92℃ 2min预变性后，40个循环参数为，92℃ 30s，44℃ 30s，72℃ 1min，最后72℃ 10min。
4）PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。
本发明具有以下有益效果：本发明的四重RT-PCR能够检测常见的大蒜病毒多达10种，与目前单重RT-PCR和双重RT-PCR检测方法相比，用一个RT-PCR可检测10种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率极大提高，检测的成本极大降低。而且本发明检测灵敏度非常高，如实验所表明的，在初始RNA稀释10-100倍时，还能扩增出4个目的片段，说明此RT-PCR检测技术的灵敏度高。
 
附图说明
图1 引物Allexivirus-F和Allexivirus-R及Allexivirus病毒序列比对。
图2 单重与四重RT-PCR检测Allexivirus、OYDV、LYSV和SLV病毒。
其中，M：DNA ladder；1，2，3，4 分别为Allexivirus、OYDV、LYSV和SLV的PCR产物，4为 Allexivirus、OYDV、LYSV和SLV的四重PCR产物。
图3 不同退火温度下四重RT-PCR检测Allexivirus、OYDV、LYSV和SLV病毒。
其中，M：DNA ladder；1-7的温度分别为42.5、43.7、45.6、47.7、49.9、52.1、54.3和56.4℃。
图4 不同稀释倍数模板四重RT-PCR检测Allexivirus、OYDV、LYSV和SLV病毒。
其中，M：DNA ladder；1-5 RNA 浓度分别为初始浓度的100、10-1、10-2、10-3和10-4倍。
图5 四重RT-PCR检测湖南大蒜植株样品中Allexivirus、OYDV、LYSV和SLV病毒。
其中，M：DNA ladder；1，阳性对照；2-8为湖南省茶陵县大蒜样品，9-11为湖南省长沙市芙蓉区大蒜样品。
 
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1
1、引物设计
由于需要检测10种大蒜病毒，其中有7种为青葱X病毒属病毒，为建立具有检测的病毒种类多、检测步骤简单、准确、经济等特点多重RT-PCR检测方法，根据Genbank青葱X病毒属（Allexivirus） GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X等7种病毒的保守序列用Primer 5.0设计引物设计通用引物对（正向引物Allexivirus-F，反向引物Allexivirus-R）(图1)，扩增的目的片段大小为180bp，为7种病毒共有的特征带；根据大蒜潜隐病毒(GLV，又称葱潜隐病毒SLV)的保守序列，设计通用引物对（正向引物SLV-F，反向引物SLV-R），扩增的目的片段大小为592 bp；同样根据(OYDV)和韭葱黄条病毒(LYSV)的保守序列分别设计通用引物对（正向引物OYDV-F，反向引物OYDV-R）和（正向引物LYSV-F，反向引物LYSV-R），扩增的目的片段大小分别为265 bp和404 bp；引物序列见如表1。各对引物扩增的片段大小分别为180、265、404和594 bp，片段大小差异较大，不会出现重叠，能清晰的分开，设计引物时排除了各对引物和其他几种病毒之间的错配以及各引物之间的互补。目的片段经克隆测序，均为各病毒的特异片段。
引物由上海生工生物技术有限公司合成。
、大蒜总RNA的提取
取经单重RT-PCR检测大蒜病毒属病毒（Allexivirus）、OYDV、LYSV和SLV分别为阳性的大蒜植株叶片，液氮研磨后，采用Trizol 试剂盒提取总RNA，电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量和浓度。
、用上述引物分别对提取的总RNA进行单重RT-PCR和四重RT-PCR扩增。
第一步是反转录，
RNA变性：取RNA  2.5 μl  65℃温浴8分钟，冰上冷却；
配置反转录反应液（7.5μl），5×反应缓冲液 2 μl，、100mM DTT 1μl ,10mM dNTPs 1 μl、RNA酶抑制剂 0.125μl、反转录酶 0.5μl、10μM随机引物0.5 μl, 超纯水补至7.5μl。
将7.5μl反应液加入到变性的2.5μl RNA中，混匀，42℃延伸1小时，95 ℃变性2分钟。
第二步  PCR
单重PCR 反应体系（50 μl）：2× PCR mix 25 μl、模板（cDNA）2 μl、分别加入表1中的正向引物和反向引物各2 μl、超纯水补至所需体积。
四重PCR 反应体系（50 μl）：2× PCR mix 25 μl、模板（cDNA）4 μl、表1中每对正向引物和反向引物各2 μl、超纯水补至所需体积。
PCR程序：92℃ 2min预变性后，40个循环参数为，92℃ 30s，44℃ 30s，72℃ 1min，最后72℃ 10min。
、凝胶电泳
10μl PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相。结果见图2。结果表明四重RT-PCR能检测SLV、OYDV和LYSV 和Allexivirus病毒，其中湖南茶陵大蒜青葱X病毒属病毒（Allexivirus）片段经克隆测序为GarV-D。由于检测Allexivirus的引物为GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X 7种青葱X病毒属病毒的通用引物，因此，四重RT-PCR能检测OYDV、LYSV、SLV和GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X 、ShV-X等10种病毒。
 
实施例2 不同退火温度及不同模板稀释倍数对四重RT-PCR检测效果的影响
由于每对引物的Tm值不尽相同，因此，需要筛选合适的退火温度，使四重RT-PCR获得四个目的片段，提高检测灵敏度。退火温度设置为42.5、43.7、45.6、47.7、49.9、52.1、54.3和56.4℃ 8个温度梯度，PCR产物电泳结果见图3。结果表明退火温度在42.5-45.6℃时，四重RT-PCR能获得4个清晰的目的片段。
为检验四重RT-PCR检测的灵敏度，初始RNA分别稀释10，100、1000和10000倍，即RNA 浓度分别为初始浓度的10-1、10-2、10-3和10-4倍。
PCR产物电泳结果见图4。可见初始RNA稀释10-100倍时，还能扩增出4个目的片段，说明此RT-PCR检测技术的灵敏度高。
 
实施例3  四重RT-PCR检测田间大蒜植株样品
在湖南长沙市芙蓉区和株洲市茶陵县大蒜主产区田间调查和采取具有黄化和花叶症状的大蒜植株，植株带土带回实验室，选取幼嫩叶片，液氮研磨后，提取RNA，用建立好的四重RT-PCR检测其病毒感染情况，检测结果见图5。结果表明四重RT-PCR能很好的检测湖南主产区大蒜样品的病毒，湖南醴陵和芙蓉区两个主产区的大蒜植株样品普遍存在3-4种病毒复合侵染的情况。
<110> 湖南农业大学
<120>一种四重RT-PCR同时检测多种大蒜病毒的方法及其引物组合
<160> 8
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 1
CCTGCTAAGCTATATGCTGA   20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 2
GTAAGTTTAGCGATATCAAC    20
 
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 3
TAATGGCACATTTCAGTGATGC  22
 
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 4
TCCGTGTCCTCTTCCGTTGT    20
 
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 5
TGCAGAACTGAGCATGGGTA   20
 
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 6
GTAAGGTTGGTTGTGCGTGT  20
 
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 7
GAGCGAAAGTAGATTCAACAAAC   23
 
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 8
CCTTATCAGACCCTCAAGTGGT   22

Claims (7)

1. 一种四重RT-PCR同时检测多种大蒜病毒的方法，其特征在于，其步骤包括：
1）取大蒜叶片，提取其RNA；
2）以步骤1）得到的RNA为模板，通过反转录，得到cDNA；
3）以步骤2）得到的cDNA为模板，用四对引物对其进行PCR扩增；
4）PCR产物凝胶电泳，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况；
其中，所述引物如下：
青葱X病毒属病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；
检测洋葱黄矮病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；
检测韭葱黄条病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；
检测大蒜潜隐病毒和葱潜隐病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：四重PCR检测的反应体系，按50 μl计：2× PCR mix 25 μl、模板（cDNA）4 μl、四对引物的正向引物和反向引物各2 μl、超纯水补至所需体积。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于四重PCR检测的PCR程序：92℃ 2min预变性后，40个循环参数为，92℃ 30s，42.5-45.6℃退火 30s，72℃ 1min，最后72℃ 10min。
4.按照权利要求1至3任一项所述的方法，其可以同时检测国内发现的大蒜主要病毒洋葱黄矮病毒(OYDV), 韭葱黄条病毒 (LYSV)，葱潜隐病毒(SLV)、 GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X。
5.一种用于四重RT-PCR同时检测多种大蒜病毒的引物对组合，其特征在于：其由四对引物组合而成，所述引物分别如下：
青葱X病毒属病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；
检测洋葱黄矮病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；
检测韭葱黄条病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；
检测大蒜潜隐病毒和葱潜隐病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示。
6.按照权利要求5所述的引物对组合，其可以用于同时检测国内发现的大蒜主要病毒洋葱黄矮病毒(OYDV)、 韭葱黄条病毒 (LYSV)、葱潜隐病毒(SLV)、 GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X。
7.一种检测青葱X病毒属病毒的引物对，其特征在于：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示。
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