CN110117677B - 一种百香果黄瓜花叶病毒的pcr引物组合及检测方法 - Google Patents

一种百香果黄瓜花叶病毒的pcr引物组合及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种百香果黄瓜花叶病毒的的PCR引物组合及检测方法，具体包括，3条百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物，2条百香果通用内参基因EF1a特异引物。本发明通过3条百香果黄瓜花叶病毒外壳特异引物的设计，可同时检测病毒3个特异性位点，避免假阳性的产生，1对百香果EF1a内参引物的使用，可以检测百香果cDNA合成质量，避免假阴性的产生，整个检测过程可以在4个小时内完成，可在1%琼脂糖进行PCR结果检测，不需使用昂贵的荧光定量PCR仪，具有快速、经济、灵敏度高、稳定性强的特点。

Description

一种百香果黄瓜花叶病毒的PCR引物组合及检测方法
技术领域
本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及一种百香果黄瓜花叶病毒的PCR引物组合及检测方法。
背景技术
百香果(Passifloraspp.)又名西番莲，鸡蛋果，作为可鲜食、加工用水果，广泛种植于世界各地热带与亚热带地区。
百香果易受多种病毒病的影响，其中以黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)最为常见。CMV是一种非常严重的RNA类病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的任何部位，而百香果长期以来通过扦插或嫁接进行种苗繁育，极易造成大面积带病植株的传播，对于商业化种植来讲，通常在百香果发现病毒病只能将整株植株直接销毁，因此，培育无CMV病苗、极早发现带CMV病毒植株是防控百香果CMV的关键。
虽然百香果CMV发病植物可表现明显的特征，但CMV的发病需要一定的气候条件，对带病植株材料的鉴定存在较大困难。利用PCR技术进行CMV病毒检测，具有特异性强、灵敏度高、快速稳定、检测成本低等特点，已在多种植物上有成功的案例，但目前，还未在百香果见相关报道。
发明内容
根据上述领域存在的不足，本发明提供用于检测百香果CMV的引物组合和检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种百香果(Passifloraspp.)黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)的PCR引物组合，包含3条百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物，具体信息为：
PeCMV CP F1：ATGGACAAATCTGAATCAACC，
PeCMV CP F318：ATAAGAAGCTTGTTTCGCGC，
PeCMV CP R619：GCTCAATGTCGACATGAAGTAC；
2条百香果内参基因EF1a特异引物，具体信息为：
PeEF1a F2：TTGCTGTTAAGGATTTGAAG，
PeEF1a R355：GTTTGACGCATGTCCCTAAC。
所述的引物组合用于检测百香果黄瓜花叶病毒的PCR检测方法，包括如下步骤
（1）待测样品总RNA提取，反转录为cDNA。
（2）采用所述引物组合，以待测样品cDNA为模板，以进行PCR反应，获得扩增产物。
（3）1%琼脂糖电泳检测1-6 μL扩增产物，若出现350 bp以及619 bp或301 bp大小阳性条带，则表示样品cDNA可用且含有CMV病毒，若仅出现350 bp，则表示样品cDNA可用，但未检测到CMV病毒。
所述 PCR反应体系20 μL为：cDNA模板1 μL，10 μmol/L不同上、下游引物各1 μL，2X Taq PCR Mix反应液10 μL，加dd H2O至总体积20 μL。
所述PCR反应体系中引物采用两种形式：
（1）百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物组合：PeCMV CP F1、PeCMV CP F318、PeCMV CP R619为组合检测百香果CMV；内参引物组合：PeEF1a F2、PeEF1a R355组合检测百香果cDNA质量；
（2）初检引物组合：百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物PeCMV CP F1、PeCMVCP R619，内参引物PeEF1a F2、PeEF1a R355为初检组合同时检测百香果CMV与cDNA合成质量；复检引物组合：百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物PeCMV CP F318、PeCMV CP R619为复检引物组合排除假阳性。
所述PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性20 s，52-56 ℃退火20 s，72℃延伸30 s, 共40 个循环；72 ℃延伸6 min。
本发明的优点在于：
利用黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物可在稀释倍数为10000倍病叶cDNA中扩增生成301 bp、619 bp特异性条带，利用1对百香果EF1a内参引物可在稀释100000倍正常叶、病叶cDNA中扩增生成350 bp条带。
本发明通过3条百香果黄瓜花叶病毒外壳特异引物的设计，可同时检测病毒3个特异性位点，避免假阳性的产生，1对百香果EF1a内参引物的使用，可以检测百香果cDNA合成质量，避免假阴性的产生，整个检测过程可以在4个小时内完成，可在1%琼脂糖进行PCR结果检测，不需使用昂贵的荧光定量PCR仪，具有快速、经济、灵敏度高、稳定性强的特点。
本发明对从不同地区百香果发病植株CMV病毒壳蛋白（coat protein）编码基因进行测序，从保守区设计3条特异性引物组成2对引物组合，在提高针对百香果CMV特异性检测的同时，可以产生对假阳性扩增产物的排除的作用（图1），增加设计1对百香果内参引物可以检测cDNA合成质量，可以产生对假阴性扩增产物的排除的作用（图2）。本检测方法可检出百香果CMV灵敏度相当于10-5g病叶组织量（50 ng 病叶），即在样品cDNA稀释10000倍后仍能扩增出CMV特异性条带（图1）。
附图说明
图1 3条CMV特异性引物组成2对引物组合扩增效果。1-6为CMV阳性百香果cDNA从1、10、100、1000、10000、100000倍稀释液的扩增效果，M为DNA Marker 2000。
图2 1对百香果内参基因扩增效果。1-6为百香果cDNA从1、10、100、1000、10000、100000倍稀释液的扩增效果，M为DNA Marker 2000。
图3 待测百香果叶片。1为脱毒苗百香果叶片，2为‘黄金果’百香果叶片，3为‘台农1号’百香果叶片，4为‘天王星’百香果叶片。
图4 利用PeCMV CP F1、PeCMV CP R619、PeEF1a F2、PeEF1a R355为组合同时检测百香果CMV与cDNA合成质量扩增效果。1为脱毒苗百香果叶片，2为‘黄金果’百香果叶片，3为‘台农1号’百香果叶片，4为‘天王星’百香果叶片。阳性为已知CMV百香果叶片cDNA阳性对照，M为DNA Marker 2000。
图5利用PeCMV CP F318、PeCMV CP R619为组合检测百香果CMV扩增效果。1为脱毒苗百香果叶片，2为‘黄金果’百香果叶片，3为‘台农1号’百香果叶片，4为‘天王星’百香果叶片。阳性为已知CMV百香果叶片cDNA阳性对照，M为DNA Marker 2000。
具体实施方式
以下通过具体实验对本发明进行解释，需要解释的是，下述实施例仅作为解释和说明，不构成对本发明的任何限制。
实施例 1
植物材料
以三明沙县CMV阳性百香果叶片为材料。
待测叶总RNA提取与cDNA合成
分别剪取0.5g CMV阳性百香果叶片，采用1 mL Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA，1%琼脂糖检测RNA质量，采用紫外分光光度计测定RNA浓度。取0.5 μg总RNA，采用RevertAid Fisrst Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)进行cDNA第一链合成（10 μL体系 ）。
引物合成
根据CMV外壳蛋白序列设计保守核苷酸序列，采用Primer 5.0设计特异性引物。引物由北京六合华大基因科技有限股份公司进行合成。引物序列与预期目的片段大小见表1。
表1 引物序列、预期目的片段大小
Figure DEST_PATH_IMAGE002
PCR扩增与检测
PCR反应体系为：
CMV特异性引物检测：cDNA模板1 μL（从1、10、100、1000、10000、100000倍稀释液），10 μmol/L表1所述CMV特异性引物各1 μL，2 × Taq PCR Master Mix（Thermo FisherScientific）反应液10 μL，加dd H2O至总体积20 μL。
内参引物检测：cDNA模板1 μL（从1、10、100、1000、10000、100000倍稀释液），10 μmol/L表1所述内参引物各1 μL，2 × Taq PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）反应液10 μL，加dd H2O至总体积20 μL。
PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性20 s，52-56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s, 共40 个循环；72 ℃延伸6 min。
20 μL体系反应液于Bio-rad MyCycle PCR仪扩增约2小时后，取6 μL反应液于1%琼脂糖电泳检测扩增结果，0.5 μg/mL溴化乙锭染色，Biosens SC805 BIOTOP凝胶成像系统观察拍照。
结果如图1所示，3条CMV特异性引物组成2对引物组合可以在最高稀释倍数为10000的cDNA模板中扩增两条特异性条带，PeCMV CP F318与PeCMV CP R619组合可以在最高稀释倍数为100000的cDNA模板中扩增特异条带。表明2对引物组合可以检测可检出百香果CMV灵敏度相当于10-5g病叶组织量（50 ng 病叶RNA），即在样品cDNA稀释10000倍后仍能扩增出CMV特异性条带（图1）。
如图2所示，内参引物可以最高稀释倍数为100000的cDNA模板中扩增特异性条带，表明cDNA合成质量符合检测要求。
CMV阳性条带送华大基因进行测序，经NBCI BLAST核酸序列比对，与已知百香果CMV外壳蛋白基因一致性99%，序列GenBank登录号为MK205392。
实施例2
植物材料
供试材料来自广东省惠州新沃农业科技有限公司百香果脱毒苗基地脱毒苗百香果叶片（图3-1）；福建省三明市农业科学研究院疑似CMV ‘黄金果’百香果叶片（图3-2）、‘台农1号’百香果叶片（图3-3）、‘天王星’百香果叶片（图3-4）。三明市沙县百香果CMV阳性对照叶片。
待测叶总RNA提取与cDNA合成
分别剪取0.5 g百香果待测叶及CMV阳性对照叶片，采用1 mL Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA，1%琼脂糖检测RNA质量，采用紫外分光光度计测定RNA浓度。取0.5μg总RNA，采用RevertAid Fisrst Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)进行cDNA第一链合成（10 μL体系 ）。
引物合成
根据CMV外壳蛋白序列设计保守核苷酸序列，采用Primer 5.0设计特异性引物。引物由北京六合华大基因科技有限股份公司进行合成。引物序列与预期目的片段大小见表2。
表2 引物序列、预期目的片段大小
Figure DEST_PATH_IMAGE004
PCR扩增与检测
PCR反应体系为：初检：cDNA模板1 μL，10 μmol/L表2所述初检引物各1 μL，2 ×Taq PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）反应液10 μL，加dd H2O至总体积20 μL。
复检：cDNA模板1 μL，10 μmol/L表2所述复检引物各1 μL，2 × Taq PCR MasterMix（Thermo Fisher Scientific）反应液10 μL，加dd H2O至总体积20 μL。
PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性20 s，52-56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s, 共40 个循环；72 ℃延伸6 min。
20 μL体系反应液于Bio-rad MyCycle PCR仪扩增约2小时后，取6 μL反应液于1%琼脂糖电泳检测扩增结果，Biosens SC805 BIOTOP凝胶成像系统观察拍照。结果如图4所示，脱毒百香果叶片仅扩增350 bp内参PeEF1a基因片段，表明其不带有CMV；疑似CMV ‘黄金果’百香果叶片、‘台农1号’百香果叶片、‘天王星’百香果叶片与阳性对照叶片扩增结果一致，除350 bp内参PeEF1a基因片段，还扩增得到619 bp百香果CMV特异片段。表明疑似待测叶片感染CMV（图4）。
为排除假阳性，使用表2所述复检引物，采用上述PCR反应体系及条件扩增并检测，结果如图5所示，疑似CMV ‘黄金果’百香果叶片、‘台农1号’百香果叶片、‘天王星’百香果叶片与阳性对照叶片扩增结果一致，得到301 bp百香果CMV特异片段，表明疑似待测叶片感染CMV；脱毒百香果叶片不能扩增该片段，再次表明脱毒百香果不带有CMV。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 三明市农业科学研究院
<120> 一种百香果黄瓜花叶病毒的的PCR引物组合及检测方法
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggacaaatc tgaatcaacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ataagaagct tgtttcgcgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctcaatgtc gacatgaagt ac 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgctgttaa ggatttgaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtttgacgca tgtccctaac 20

Claims (1)

1.一种用于检测百香果黄瓜花叶病毒的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）待测样品总RNA提取，反转录为cDNA；
（2）采用引物组合，以待测样品cDNA为模板，以进行PCR反应，获得扩增产物；
（3）1%琼脂糖电泳检测1-6 μL扩增产物，若出现350 bp以及619 bp或301 bp大小阳性条带，则表示样品cDNA可用且含有CMV病毒，若仅出现350 bp，则表示样品cDNA可用，但未检测到CMV病毒；
所述引物组合包含3条百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物：
PeCMV CP F1：ATGGACAAATCTGAATCAACC，
PeCMV CP F318：ATAAGAAGCTTGTTTCGCGC，
PeCMV CP R619：GCTCAATGTCGACATGAAGTAC，
2条百香果内参基因EF1a特异引物：
PeEF1a F2：TTGCTGTTAAGGATTTGAAG，
PeEF1a R355：GTTTGACGCATGTCCCTAAC；
所述PCR反应体系为20 μL：cDNA模板1 μL，10 μmol/L不同上、下游引物各1 μL，2×TaqPCR Mix反应液10 μL，加dd H2O至总体积20 μL；
所述PCR反应体系中引物采用两种形式：
（1）百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物组合：PeCMV CP F1、PeCMV CP F318、PeCMVCP R619为组合检测百香果CMV；内参引物组合：PeEF1a F2、PeEF1a R355组合检测百香果cDNA质量；
（2）初检引物组合：百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物PeCMV CP F1、PeCMV CPR619，内参引物PeEF1a F2、PeEF1a R355为初检组合同时检测百香果CMV与cDNA合成质量；复检引物组合：百香果黄瓜花叶病毒外壳蛋白特异引物PeCMV CP F318、PeCMV CP R619为复检引物组合排除假阳性；
所述PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，52-56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环；72 ℃延伸6 min。
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