CN110982923B - 西番莲内参基因及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种西番莲内参基因及其筛选方法和应用，属于分子生物学领域。利用RNA‑Seq测序数据分析表达量中度、稳定的基因作为候选内参基因，选择了5个表达量中度(FPKM≈25)的基因，并进行引物设计，然后在表型差异明显的西番莲品种的不同组织部位的mRNA中去验证，利用软件评估各个候选内参基因的表达稳定性，最终筛选出适宜的西番莲内参基因C27182。C27182在台农一号和黄金果2号的茎、叶、花和果实中都能稳定的表达。为后续西番莲基因表达相关的科学研究提供了参考。

Description

西番莲内参基因及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及西番莲内参基因及其筛选方法和应用。

背景技术

西番莲是我国南方重要的果树，其果实具有芳香气味，富含糖类、维生素和矿质元素等物质，营养价值高、经济效益好。西番莲果汁中含有菠萝、香蕉、草莓、苹果、酸梅、芒果等165种水果香味，是举世闻名的香料水果，果实中含有超过132种以上的芳香物质，有“果汁之王”的美誉。它的天然原汁以其自身鲜艳的色泽，独特浓郁的芳香风味，丰富的营养以及对人体的保健作用，被称为天然营养浓缩物和热带果后。西番莲果实不仅营养价值高，生津止渴，还有防病健身的功效。据测定，西番莲汁含有60多种挥发性化合物，可溶性固物含量高达10--14％，有机酸含量为1.5--3％。氨基酸含量也相当丰富，还含有多种维生素和矿物质元素。西番莲种子含油量高达25％，可榨成食用油，油质与葵花油媲美。用它作原料，可加工成果汁、果露、果酱、果冻等产品，具有美容养颜、清暑开胃、消除疲劳、提神醒酒、消炎祛斑、降脂降压、防止动脉硬化等功效。

西番莲中的应用逐渐受到重视，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示西番莲基因表达和调控的机理。近年来，学者们已经逐步加快西番莲基因组学、分子生物学、遗传学等方面的研究。

基因行使功能就是从DNA到mRNA再到蛋白的一个过程，基因表达水平一般是通过该基因转录的mRNA的多少来衡量的。因此，准确评估目标基因的表达量对研究其生物学功能意义重大。内参基因即内源性参照基因，其在生物的不同的细胞中表达相对稳定。在基因研究过程中，RT-PCR、qRT-PCR等技术中都需要利用内参基因校正cDNA用量。常见的内参基因有β-actin、EF-1α、18SrRNA等。目前为止，尚未见西番莲内参基因相关研究的报道。这严重制约了西番莲重要性状基因定位、克隆等研究进程。因此，在西番莲中挖掘高度可信的内参基因十分必要。

发明内容

本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种西番莲内参基因，为后续西番莲基因表达相关的科学研究提供了参考。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种西番莲内参基因，所述内参基因为C27182，所述内参基因C27182的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述内参基因C27182的PCR扩增引物核苷酸序列是：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。

一种西番莲内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

S1、从数据库选择4个样品数据，序列登录号分别为：SRX4224487、SRX4224486、SRX4224485和SRX4224484，然后分别进行序列的组装，预测序列的表达量分析，基因序列的功能注释；最后计算所有西番莲基因在4个样品中表达量值的稳定性，使用变异系数CV进行评估，选择CV值小于0.2，且cDNA≥1000bp的基因作为候选内存基因。

S2、从候选内存基因中，根据西番莲基因的表达量值，选择了5个FPKM≈25的基因，分别为C24822、C24823、C27182、C25473和C13615。

S3、对步骤S2筛选的5个基因进行引物设计，并利用电泳评估引物的特异性。

S4、提取台农一号和黄金果2号的根、茎、叶、花和果实的总RNA，反转录合成第一链cDNA，进行实时荧光定量PCR分析，计算Ct值，对步骤S2筛选的5个基因的表达稳定性进行分析。

S5、综合确定最稳定表达的西番莲内参基因为C27182。

优选的，步骤S1中，从NCBI数据库中下载所述4个样品数据；使用Trinity软件，参数min_kmer_cov 2进行序列的组装；使用RSEM进行预测序列的表达量分析；使用BLAST和数据库NR、COG、KOG，eggNOG、KEGG、GO、Pfam和Swiss-prot进行基因序列的功能注释。

优选的，在步骤S3中，使用Primer3软件进行针对筛选的5个序列进行引物设计。

优选的，在步骤S3中，正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。

优选的，在步骤S4中，采用RNA提取试剂盒Ultrapure RNAKit提取台农一号和黄金果2号的根、茎、叶、花和果实的总RNA，分别使用BioSpec-nano紫外可见分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性。

优选的，在步骤S4中，利用AnalytikJena qTOWERE 2.2荧光定量PCR仪进行Ct计算，通过geNorm、NormFinder及BestKeepeer软件对各候选内参基因的表达稳定性进行分析。

还提供了所述西番莲内参基因在研究西番莲基因表达水平中的应用。在研究西番莲不同品种或不同发育时期或不同生长环境下基因表达水平中的应用。为后续西番莲基因表达相关的科学研究提供了参考。特别的，C27182在研究西番莲花叶病毒病的应用。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1.本发明的西番莲内参基因，首次提出将C27182基因作为内参基因用于西番莲的基因表达，解决了西番莲没有内参基因的现状。

2.本发明的西番莲内参基因的筛选方法，利用RNA-Seq测序数据分析表达量高度、稳定的基因作为候选内参基因，选择了5个表达量中度(FPKM≈25)的基因，并进行引物设计，然后在表型差异明显的西番莲品种的不同组织部位的mRNA中去验证，评估各个候选内参基因的表达稳定性，最终筛选出适宜的西番莲内参基因。

3.本发明的西番莲内参基因，在台农一号和黄金果2号的茎、叶、花和果实中都能稳定的表达。为后续西番莲基因表达相关的科学研究提供了参考。

4.本发明提出的检测引物对具有特异性，优化了PCR扩增程序，大大提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度以及西番莲基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。

附图说明

图1为本发明实施例3基因C27182扩增曲线；

图2为本发明实施例3基因C27182溶解曲线；

图3为本发明实施例3基因C27182在台农一号(TN)和黄金果2号(HJ2)的茎、叶、花和果实的Ct值。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种西番莲内参基因，所述内参基因为C27182，所述内参基因C27182的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

一种内参基因C27182的PCR扩增引物，核苷酸序列正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例3

一种西番莲内参基因C21209的筛选方法，包括以下步骤：

S1、从NCBI数据库中下载4个样品数据，序列登录号分别为：SRX4224487，SRX4224486，SRX4224485和SRX4224484；

使用Trinity(版本r20131110)软件，参数min_kmer_cov 2进行序列的组装；

使用RSEM(v1.2.3)进行预测序列的表达量分析；

使用BLAST(v2.2.31)和数据库NR、COG、KOG，eggNOG、KEGG、GO、Pfam和Swiss-prot进行基因序列的功能注释；

计算所有西番莲基因在4个样品中表达量值的稳定性，使用变异系数(CV)进行评估，选择CV值小于0.2，且cDNA≥1000bp的基因作为候选内存基因；

S2、在候选基因中，根据西番莲基因的表达量值，选择了5个表达量中度(FPKM≈25)的基因，分别为C24822(Nucleotide hydrolase)、C24823(Histone deacetylasedomain)、C27182(Uncharacterised protein family UPF0047)、C25473(Glycosyltransferases group 1)和C13615(MOZ/SAS family)。基因不同片段表达量见下表1。

表1基因表达量列表

c24823	127.2	147.25	189.84	152.69
					c24822	119.77	116.52	115.19	117
c27182	27.18	27.83	28.48	27.03
					c25473	16.96	17.26	17.07	16.99
c13615	39.94	38.06	40.01	34.61

S3、使用Primer3软件进行针对筛选的5个序列进行引物设计；

S4、采用RNA提取试剂盒Ultrapure RNAKit提取台农一号和黄金果2号的根、茎、叶、花和果实的总RNA，分别使用BioSpec-nano紫外可见分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性。反转录按照TransScript One-Step gDNARemoval andcDNA synthesis superMi00x试剂盒使用说明进行，合成第一链cDNA；

S5、利用1％琼脂糖凝胶电泳评估内参基因引物的特异性；利用AnalytikJenaqTOWERE 2.2荧光定量PCR仪进行Ct计算，通过geNorm、NormFinder及BestKeepeer软件对各候选内参基因的表达稳定性进行分析；综合几种软件计算结果，选出最佳的西番莲内参基因C27182。

PCR扩增引物核苷酸序列正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3所示。正向序列：GCAACGGAAAGGGTCCAAAC；反向序列：GGCATCCCGACATGATGCTA。

从图1可以看出，荧光定量PCR扩增曲线均很好。且为检验反应的特异性。

从图2可显示出，溶解曲线均只有一个特异峰，表明无引物二聚体，扩增条带单一，特异性强，没有非特异性扩增出现，从而表明所述实时荧光定量PCR引物特异性强，扩增效率高，能够用于西番莲荧光定量PCR的内参引物实验。

图3显示C27182在台农一号和黄金果2号的茎、叶、花和果实的Ct值，可以看出，C27182在台农一号和黄金果2号的茎、叶、花和果实中都能稳定的表达。

上述说明是针对本发明较佳可行试验例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 西番莲内参基因及其筛选方法和应用

<141> 2019-12-21

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7405

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

ctttccttta ctatgcttcg tccagccccc atccctccag ctgcaacggc gaagccaaat 60

ccctcgtcta aggtggtttt ccgcgtcaat tctctctacg ccgccaaacc gtcctccgac 120

cgcaacagca tggctgctcc tcctactccc aagtgggccc agaagactat cactctcgct 180

cctgtgtcac ggggctgcca tctggttact tccaagattt tgaacgaaat tggctctgat 240

ttgtcgggat tcaactgcgg cctcgctcat ttcttcttgc accacactag tgcttctctc 300

actatcaacg agaattatga ctctgatgtt cgccatgaca ccgagacttt cctcaacaag 360

attgtccccg agggaagttc tgcaccgtgg aggcacacca ttgaaggtcc ggatgacatg 420

ccagcacata tcaagtcatc catgtttgga tgtgcactca cgattccaat cacaaacggg 480

aagcttaata tgggcacttg gcaggtttgt aacaatgttt cttaatggag gtagacaact 540

tacatgtttt tacgttctat atatttacgc ttaagtaaga aagcaaatat accttgcaca 600

gaagaaagca agtggttcca ggtgcacttg cttccaaatg cttcaaaatc cacagtaaga 660

tcattctcgt agatgtttag ctgtactagt gttggtttgg tattggttgt caaacaacta 720

tcataaccaa aaaggtgcaa aaagaagaat taagggcatg tggagatttg aagccagggt 780

cacttggtca taatgattct tttattatgt taagaactgt gtcaatccaa aagtttaaag 840

ttccaagaat taggcaggac tcggacaatc tggccaatgt atgataaaga tttcatcatt 900

gttttgctta tttattttag tgaaacggaa ttattgtcca agtactgcag aaagtgagca 960

agaatatatg ccatagatca gctcattaat ttttaaaaat tctgcaagga tttggaatta 1020

cagaatatgt ttttgaaacg acaaaaaaaa aaaaaaatcc tgattttctt ttctggtata 1080

ggagaaacag aagttagctt tggtctcacc ttttgcttga gatgaccgat atgcttgctt 1140

tgtttccttc taggctaatt ttaatggtaa ctctttatcc tcttctttcg tggttcaggg 1200

aatctggctg tgtgagcatc gcgactaccc tactgctcgt aaaattgtag tcaccctaaa 1260

tggaatataa cgtgttaata ttcagcattt tctccttagt tttcccatac atttaagcat 1320

aagtattgta ctactgtatg atgtggtcat gcctgtttac ttgttaacaa gcttactata 1380

ttggttctgt cttctcctta ttgagaagtt tggcacccgt acagtggacg tgaagagtta 1440

gaataactgc ctgcgatgtg catttttttt ttttcctttt ataagctaat ctgtgcattc 1500

ctgctaattg attatttttt atatgtttaa gcagattcat acgactcacc taagttttaa 1560

gcagaatgca tatttagtat ttctctcacc tgctctgata ctatcacatc atatatcaca 1620

tccaataatt ttaacattgt tgactcctgc tttttgtatt ttatgaattt tctctttgtt 1680

ctttttttta tttatttaaa tagcataatc ataattctcc aatgactgaa attctgtgtg 1740

atatcaaaac tttattataa tggtgaacac gttcgtttcc aacttttgtt gtagaacacc 1800

tcatgatata gacaggttgt tatgccaagt attgtattat atcttataca tggcaacatg 1860

aaaatattga catgtcatgg gaccacagtc agatactata accttttaac tagatgcata 1920

tgagggaaat ggcattttac catttagata taaatagatc aatctctgac atgcgtatcg 1980

cttgtagaaa tatgatagca agttaggaat acagaacgca gaatttcctt tgccgtctcc 2040

cgtagtccat ttctgcatca gacctgagct ccataattct ggataatact ttctgctgat 2100

ttttgattac ccagccttgg acaaaatggc gttatcaggg gatacaagat aatctccacc 2160

ctaaaacaat actggtttca cttggagtac cctacacagt caaaagaaaa cgaacagaaa 2220

aatatataaa caataattaa aataactaac taataaattt atcaagcaac taaaactcat 2280

gacaacgctt caaaataact tgttatcata tatattcata ttcaagccgc attagtctca 2340

tcagcgacaa aatgatatgt tttgtttatc atggtacata gtcaccatgc atgtcaacta 2400

catttcactc gctttttcat tcccggtcat caatattgat tattgacagt aaaaataaaa 2460

taaaaaataa tactaacatc agtactctac tctgcaagga tatggactct aatgctctta 2520

caaacacgtt atgataataa cagctatgct tcactgcttc cgtatgaaca cttaaatata 2580

taagtaattg tttctttcca gatatttgat aatttggcat cgaaaccaag ataacaaacc 2640

caaatttcta gcaatttctc taaactcaag aaaaaaaagt tatttgatac caaattatat 2700

acaagattca ccacatatac tcaattccgg tttgtattca atcatgaata aagaaataat 2760

acatatttgt gccacatatt gatattctga atatgtgatg tagcaccaga acaataaact 2820

catttgttat tttctaagag aagaaactca tctgtaacaa aaagagatct ataagaaatg 2880

cccgagttga taatgtctgc aacaactagc aaaaactcgc atgtagaaag atcaccataa 2940

tcgaaatttc cacactttat aagcccgtgc tatcacaacc tgaaatgaca agatagtcac 3000

gtcaatgcct gcaataaggg agctccatat tcaacaattt ggcaaaagag acagcaaaat 3060

tttaacattt ttcagatgca caactgactc aaggttattc cagccaagaa taacataaaa 3120

atactaatac aatctccttt ataaatcata aacggcaaat ggtaaacttc tataagaaat 3180

tttttggcgc tccatcacca gaaacttatc ctagcagaat ccaccactag atgaagggac 3240

tctactaaga aagcagcagg gaaaggccca caacataagt ttacccccac tagagaagaa 3300

aagacccaac ttgtgctatt cttgaattca acttcgccaa tgcatagtaa gagaagtttt 3360

agactttcat ttccagtttt ccttggctgg cccagagctt tgaagtatag cattttggtt 3420

caaactggtg atcagtaacc attgatcaaa atgtctaacg cactaactat tgccaatcat 3480

acaaactgta aattggagct ccttaagaaa ttgcctgcaa aaatacagga ttgcatagtc 3540

agcatatcct agttcaatga tccacgacac ttcctggaac cacagttaca aggaatcttt 3600

ttctcctcca gaggaaattt gtagttgtaa gtgatttctt caccagcagc tacatgcctt 3660

tttgcataaa tgaaaatttt cttctcgcct tcaacactta tcactttggt atagcagttg 3720

ggctcacaag aatgatttat aaaccttgca atcccaccgc gctttgtggc atccaccaca 3780

taaccatcat caagtctgaa taggtaactg ctgccaattc ccattttttc ataaagccgt 3840

tcccgtatgt cagatatact gggacgaatt agttcaccaa catattcgat gacaaagtcc 3900

tcggcctcaa ttggctccat tgcaacaaga ccccagtcat gtatcttgct ccgctggaag 3960

cgtaaacgtt ttttccttgc cttcaactga gtcgctttca aaagatcagc accttctgcg 4020

acagcaagaa gatttcgcat ttttgcccta ttagtccttg cagagaggcc tttaccattt 4080

ggcaactgag aactataagc ctcacagttt gaatgcttgg catgaataaa ttgaactcct 4140

ctaacacgag ctctttcagc aggacttgca ttaagtgacc acttatgcca ttcccagcca 4200

ttaattgaag agcgtgcaca tccatgagat ttagggcagg gatttaataa cttggtttta 4260

ccagactttg tcttctgccc tacattgtgc cttgacgtca tttgcttcgc attagcacca 4320

tccaccatct tcagaatctt tacaggtttc agcactgatt tagcatcttc tgtgtgcttc 4380

ctttttagct ttgatacctt ggtcttattg tatgacattg cctggttacc atctagcatc 4440

ttcttggatc tgtccccaaa taatgatttc tccaacctgg aatcttggct ggcgctattg 4500

gtaactttcc cagcatcatc aatatccttg ccaacatctg aaacactctc cttagaaaag 4560

tttttccccg ccttatcatc atggactttt ggtgcaatgg gcattctttt tttatgctta 4620

gcctttttgc ccaacaaatt ctcacttcgt gaattgcttt tagtaatgga tttcaaaggg 4680

caggctgtta cagatttagc atggcccttg gttttttcag tcttcttggg agtgacagca 4740

gcaacatcaa cctcaacatt ctcagcagca tctcttgaaa caggatgcat cctggacttt 4800

tcaacatgtg agttctgcaa tccagtgcca accacggatt gactagaccc caaactctgt 4860

atgaactttc tctttcggga atatgtatat ttccctgaaa cagcagatgc cactggaacg 4920

cccaaactgt tagactttct tgacccttcc ctaaatttgt cctctacagc aattgaatgc 4980

ttagaatttg gattatttgg accaaatgat cctgtcttat tccttgctgc agtttgattc 5040

aagcctagaa aatggtgcaa aggatcaaca acaaacaatg atttgcactc actaagaaca 5100

tcgttatgta gcttctgtct gcaaattgca attgcaacat gttctccaat attaggaaca 5160

aaatccagtg atcctagagg ctggaactta agtctgggag atggaaaaag agcttcacca 5220

ctatcctcca atccaggtgg tggtggctca ttactgttta ggtcatcagt cacaccatca 5280

tgatatgcca atgatctacc aaaagcgctt tccaaaaagt tggacataag atcattggat 5340

gtgacttgac aggaggactt tcttgttggt agagaagttt gagagtcacc agacgtaatt 5400

tcttccacag gcattaggtt ggtatcaaca ccccatacat ccaagaattt tgtactattg 5460

agttttgttg tatctcttac agctgccttc tttaatttcc tcacttcctt cttgataagc 5520

attttaacat actctgtcaa agagacatct aaggacaaat gcagctcatt ttcaacattt 5580

tctaagatgg attttatttc atcaggaaaa ttatcattag atgatggatt gcgttgttgc 5640

actgatgctt cttcatcaga agatgaaggc attatagatg atagcgcgag atcatccatt 5700

aaagatctca caaactcaaa accaggagga ctgccaccat tagaagcaga ggttccttgt 5760

gaagacaaca caagttgact gggtaatttc tcaataatcc tgcaaaaatc actgtcacta 5820

gcaggaactc tagtagttgg atgaacaaac caaagtttct gtcttctcca gaaagataca 5880

taatctgcca cttcatcatg aaaaacacca ttccacagga cttgcataca ataatcaaaa 5940

agaaatctac aaacaactgc ataggactcc caaaagtcct caatatttcc aacagatttt 6000

gtccttttag aacatgggga agacaactca ttagcaagtc tcatgtcaca tgcatctacg 6060

taagctgcag tgtcaccctc gggagaagaa tgatccatct tcttgccaac atcttcagac 6120

accattctgt cctctgtaga gtgaattctg gaaggatgat catcaagctt gagaagtctt 6180

tgatctctct tctgattagc aaactccaaa atgacattgc tgatcatttc atctagggca 6240

actcttcgcg ctgctttcat tattccagaa tgcagttgaa aagaaacaac ttcagaaatc 6300

tcagatatga aattcaacat tgtatcagtt acatgttttg catcagatgg aaagagagaa 6360

tcaagtttat cactgctcca agcattcaaa acagacagca acggaaaggg tccaaacttg 6420

ttttcagtat gatatatcat tactgcatgt cgaaaatacc caaactggtg ccaacaacag 6480

agttccttaa gagaatgagg gccatgtttc cgcccttcct catcctcaaa gaaccaacaa 6540

gaatcgtcac ctgacattag tgaaaagggg gagattccct tagtctctcg agagtttgac 6600

attatctgtg cagatctata gttaccataa tgtatgtgag aatgagatgg aaactgtcca 6660

tctggatgag cagtgtttat agcatcatgt cgggatgcct cttgtacgtg ttcaactaaa 6720

tctgcactgg aagacgtata acaattcgtg ggcatggttg ttcttgagat gctcatgccc 6780

aagtacaaaa aaccagtggc gacatggtct gggaactgct tgaagtactt taaaggtaca 6840

ggattgacta acgccccgtt aacaatagga tacacgggaa ggtcttcggg cagaaaacca 6900

gttgacaaac cttgatataa ctgttgctga atgtacggac cgcacatttg tccattttca 6960

ttaatgtaca tccagccact cacagaagca ggaggcacac agtcggagta attctttccc 7020

gggaacgaag tccctccagc atcgcaagac tctgcaatac caccactatt tccattcaac 7080

tggcaactta ttcccaataa ggagtttgaa gcatttttgt catcgtaatt tccatgaaat 7140

gagccttctc cggtgttcag caaagtgggt gtggcaatgt catcgaagtg gccgatagaa 7200

atacgtgaat cgaattcatc atgctctaga accgacggtt tgaatctctt tattgataaa 7260

tactggtcgg catgttcaag gagaaagact gtggaagaaa ccatggagag tgtttgagag 7320

aaaactctcc acaaaagaaa gcggtattgg aggagaaaac taacaaaaga cgtgatgcga 7380

gttgaggttg cagaaggaca gcaaa 7405

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

gcaacggaaa gggtccaaac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

ggcatcccga catgatgcta 20

Claims (2)

1.西番莲内参基因，其特征在于，所述内参基因为C27182，所述内参基因C27182的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的西番莲内参基因在西番莲基因表达分析中的应用。

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