CN105755146A - Serpinb3基因在制备骨关节炎诊断制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了SERPINB3基因在制备骨关节炎诊断制剂中的应用。本发明进一步公开了一种诊断骨关节炎的产品,所述产品能够通过检测组织样品中SERPINB3基因的表达水平来诊断骨关节炎,所述产品包括芯片或试剂盒。本发明还公开了一种治疗骨性关节炎的制剂,所述制剂中含有促进SERPINB3基因表达的试剂和促进SERPINB3基因表达产物的试剂。本发明公开了一种与骨关节炎相关的基因SERPINB3,并进一步证实该SERPINB3基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨关节炎组织中表达下调。利用该基因检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测,而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及人SERPINB3基因在制备骨关节炎诊断制剂中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病,所述关节软骨覆盖在骨末端,形成关节的关节面。据报道有许多因素使患者易患骨关节炎,包括遗传易感性、肥胖症、意外或运动创伤、手术、药物和重体力需求。骨关节炎被认为是从关节软骨的损伤开始的。最普遍的两种对关节的损伤是运动相关损伤和长期“反复使用”关节损伤。最经常受骨关节炎影响的关节是膝、髋和手。在多数情况下,由于膝和髋必要的承重功能,这些关节中的骨关节炎比手骨关节炎更易导致残疾。随着软骨退化的发展,关节中和关节周围的其他组织(包括骨、肌肉、韧带、半月板和滑膜)中发生次级变化。软骨组织初级衰竭和其他组织次级损伤的净效应是患者发生疼痛、肿胀、虚弱和患病关节丧失机能。这些症状经常发展到具有严重影响的程度,如使患者丧失劳动力或影响生活质量。
关节软骨主要由软骨细胞、II型胶原、蛋白聚糖和水组成。关节软骨没有血或神经分布,软骨细胞是该组织中仅有的细胞类型。软骨细胞负责制造软骨基质的II型胶原和蛋白聚糖。其后该基质又具有允许用水使基质饱和的物理化学特性。这种结构-功能关系的净效应是关节软骨具有特殊的耐磨特征,并且关节软骨面之间发生几乎无摩擦的移动。在未患骨关节炎时,关节软骨经常在甚至高需求的身体条件下提供终生的无痛承重和无限制的关节移动。
与所有的活组织一样,关节软骨持续地经历更新过程,其中去除(分解代谢活性)“老”细胞和基质组分并产生(合成代谢活性)“新”细胞和分子。相对于多数组织,关节软骨的合成代谢或分解代谢周转率较低。成熟软骨结构完整性的长期维持依赖于基质合成和降解之间适当的平衡。软骨细胞通过应答于来自其环境中的化学和机械刺激维持基质平衡。软骨细胞对这些刺激合适并有效的应答是软骨动态平衡所必需的。通过合成代谢活性不足或分解代谢活性过剩破坏动态平衡可引起软骨降解和骨关节炎(Adams等,1995,Nature377Suppl:3-174)。多数受到损伤和分解代谢活性提高的组织能够启动增强的合成代谢应答,允许组织复原。不幸的是,关节软骨应答于软骨基质损伤或消耗而上调其合成代谢活性以及提高合成蛋白聚糖和II型胶原的能力非常有限。
现有的骨关节炎治疗方法包括运动、药物、休息和关节保健、手术、疼痛缓解技术、替代治疗和体重控制。治疗骨关节炎中常用的药物包括非甾族抗炎药如阿司匹林、布洛芬等;直接用于皮肤的局部疼痛缓解乳膏、橡胶和喷雾剂等。可进行手术以使骨表面重建、骨复位和置换关节。尽管各种药物疗法已被用于治疗疾病,但是它们对长期控制和预防是无效的。此外,由于骨关节炎隐匿式发生并且发展缓慢,因此骨关节炎经常在疾病发展的晚期才得到鉴定,而不是潜在治疗可能更有效的疾病发展早期。因此预防、改变或治疗骨关节炎疾病过程中的进一步发展严重依赖于鉴定疾病的早期诊断标志物,从而允许早期干涉。
发明内容
为了实现骨关节炎的早期发现,早期干预,本发明的目的在于提供一种新的骨关节炎相关基因,以及该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。
本发明的还一目的是提供该骨关节炎相关基因在检测骨关节炎中的应用。
为实现上述目的,本发明首先提供了SERPINB3基因在制备骨关节炎诊断制剂中的应用。
优选的,所述SERPINB3基因或该基因的表达产物在骨性关节炎组织中表达下调。
进一步地,所述诊断制剂包括基因水平的诊断制剂和蛋白水平的诊断制剂。
优选的,所述基因水平的诊断制剂包括通过real-timePCR法、Northernblot、Southernblot、基因芯片、原位杂交或RNA酶保护实验等方法来检测SERPINB3基因的表达水平。
所述real-timePCR至少包括一对特异扩增SERPINB3基因的引物,所述Northernblot、Southernblot、基因芯片、原位杂交和RNA酶保护实验等至少包括检测SERPINB3基因的DNA、RNA或mRNA的探针。为了简化实验程序,所述基因水平的诊断制剂还包括核酸提取纯化类试剂盒,如DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒等。
优选的,所述一对特异扩增SERPINB3基因的引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。
优选的,所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括用于检测SERPINB3基因转录水平的针对SERPINB3基因的寡核苷酸探针。
优选的,所述蛋白水平的诊断制剂包括通过免疫检测、Westernblotting或蛋白芯片等方法来检测SERPINB3基因表达产物的表达水平。为了简化实验程序,所述蛋白水平的诊断制剂还包括蛋白检测试剂盒,如ELISA检测试剂盒、胶体金检测试剂盒、免疫共沉淀试剂盒、化学发光试剂盒、免疫荧光试剂盒等。所述试剂盒中一般配备有相应的使用说明书,说明书一般包括公司标志及名称、试剂盒名称、试剂盒组成、保质期、使用领域、使用方法等项目,用户按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果。
优选的,所述免疫方法为ELISA法检测和/或胶体金检测。
所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒,所述的试剂盒包括:包被SERPINB3单克隆抗体的固相载体,酶标抗体,酶的底物,蛋白标准品,阴性对照品,稀释液,洗涤液,酶反应终止液等。
所述胶体金法为使用检测试剂盒,所述的抗体可采用市售的TSPAN15单克隆抗体。进一步,所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步,所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗SERPINB3单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
进一步地,本发明提供了一种诊断骨关节炎的产品,所述产品能够通过检测组织样品中SERPINB3基因的表达水平来诊断骨关节炎。
优选的,所述产品包括芯片或试剂盒。其中,所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括用于检测SERPINB3基因转录水平的针对SERPINB3基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的SERPINB3蛋白的特异性抗体。
优选的,所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测SERPINB3基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括SERPINB3蛋白的特异性抗体。
优选的,所述试剂包括检测SERPINB3基因mRNA的引物或探针。
进一步地,本发明提供了一种治疗骨性关节炎的制剂,所述制剂中含有促进SERPINB3基因表达的试剂和促进SERPINB3基因表达产物的试剂;所述促进SERPINB3基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂,促进基因翻译的试剂,促进SERPINB3蛋白含量提高的试剂;所述促进SERPINB3基因表达产物的试剂包括促进SERPINB3基因表达稳定性的试剂,促进SERPINB3基因表达产物活性的试剂,促进SERPINB3基因表达产物功能的试剂。
本领域人员熟知促进基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种:激活分子标志物的启动子、激活分子标志物表达的蛋白或因子、导入促进分子标志物转录或表达的载体。
优选的,所述治疗骨性关节炎的制剂中含有促进SERPINB3基因的转录或表达的载体和/或激活SERPINB3基因的启动子和/或激活SERPINB3基因表达的蛋白或因子。
本发明提供的治疗骨性关节炎的制剂一方面用于补充内源性SERPINB3蛋白的缺失或不足,通过提高SERPINB3蛋白的表达,从而治疗SERPINB3蛋白缺失导致的骨关节炎。另一方面可以用于促进SERPINB3蛋白的活性或功能,从而治疗骨关节炎。
本发明的有益效果如下:
本发明公开了一种与骨关节炎相关的基因SERPINB3,并进一步证实该SERPINB3基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨关节炎组织中表达上调。利用该基因检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测,而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1本发明中实施例中不同处理时间SERPINB3蛋白水平表达差异。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法,通常为本领域常规方法,如按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆,实验手册(第三版)(科学出版社,2002)中的所述条件,或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明的发明人对10例骨性关节炎样本及4例对照样本进行高通量测序,结合生物信息学方法进行基因筛选,挑选出候选基因SERPINB3,现有研究中并没有SERPINB3和骨性关节炎相关的报道,进一步,发明人进行了分子生物学方法验证,证实了SERPINB3在骨性关节炎组织中表达下调,其相关制剂可用于治疗骨性关节炎。
本发明的SERPINB3基因是在本发明之前的已知基因,其基本信息如下:
Genbank登录号:GeneID:6317,来源于人类基因组。
本发明还采用RT-PCR方法和Westernblotting方法检测上述基因在骨关节炎患者和正常人群中的表达,并验证了该基因为骨关节炎表达下调基因。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现,极大地简化了定量检测的过程,而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现,使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率,反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
WesternBlotting方法即Western免疫印迹,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。该方法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
本发明的SERPINB3基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板,扩增而得到有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次扩增,然后再将多次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外,还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人,(1969)Soliod-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如,可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段,然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本文使用的术语“骨关节炎”指关节炎的特定形式,特别是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病,所述关节软骨覆盖在形成关节面的骨末端上。
本文使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列,其中序列量的测量证明,与从正常个体或从通过骨关节炎分期确定与骨关节炎不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比,所述基因在从患骨关节炎或通过骨关节炎分期确定的骨关节炎已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明,“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多的表达降低,例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更低。
本文使用的术语“蛋白质类物质”(如蛋白质、多肽、肽和抗体)的上下文中使用的术语“类似物”指这样的蛋白质类物质:其与第二种蛋白质类物质具有相似或相同的功能,但不一定包含与所述第二种蛋白质类物质相似或相同的氨基酸序列或具有与第二种蛋白质类物质相似或相同的结构。具有相似的氨基酸序列的蛋白质类物质指满足以下至少一项的第二种蛋白质类物质:
(a)具有与第二种蛋白质类物质的氨基酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性的氨基酸序列的蛋白质类物质;
(b)由核苷酸序列编码的蛋白质类物质,所述核苷酸序列在严谨条件下与编码第二种蛋白质类物质的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氢基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基或至少150个连续氨基酸残基的核苷酸序列杂交;
和(c)由核苷酸序列编码的蛋白质类物质,所述核苷酸序列与编码第二种蛋白质类物质的核苷酸序列有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性。与第二种蛋白质类物质结构相似的蛋白质类物质指具有与第二种蛋白质类物质相似的二级、三级或四级结构的蛋白质类物质。
本文使用的术语“蛋白质”、“多肽”和“蛋白质类物质”可互换使用,指通过肽键连接在一起的氨基酸链,任选地可包含天然或非天然氨基酸。任选地,蛋白质或多肽可包含除氨基酸以外的其他分子。所述链可以为任何长度,如所述蛋白质由通过肽键连接在一起的少于200个、少于175个、少于150个、少于125个、少于100个、少于50个、少于45个、少于40个、少于35个、少于30个、少于25个、少于20个、少于15个、少于10个或少于5个氨基酸组成。在另一实施方案中,蛋白质由通过肽键连接在一起的至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多氨基酸组成。
本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知和本文所述的方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。涉及本发明生物标志物对应的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA剪接变体时,表达水平可以通过杂交或更多定量测量来测定,例如包括使用SYBR绿、TaqMan和分子标记技术的定量实时RTPCR。
本文使用的“对照”指未显示任何OA症状(包括关节痛)并且未诊断为关节损伤或OA的个体或个体组。优选地,所述对照个体未使用影响OA的药物,并且未诊断为患有任何其他疾病。更优选地,对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。根据本发明,“对照”还指分离自正常个体的样品,包括分离自正常个体的总RNA或mRNA。取自对照个体的样品可包括分离自样本组织的RNA,其中RNA分离自样本组织,所述样本组织分离自组织移除时未诊断为OA并且未显示任何OA症状的个体。在本发明的一个实施方案中,为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
本文使用的术语“引物”指存在于纯化的限制性消化物中或合成产生的寡核苷酸,置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时,即存在核苷酸和诱导剂(如DNA聚合酶)以及适当的温度和pH时,所述寡核苷酸能作为合成的起始点。引物可以为单链或双链,并且必须具有足够的长度,以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度会取决于许多因素,包括温度、引物来源和使用的方法。例如,就诊断应用而言,取决于靶序列的复杂性,寡核苷酸引物一般含有15-25或更多的核苷酸,尽管也可以含有更少的核苷酸。引物合适长度的确定中涉及的因素为本领域普通技术人员所公知。一般而言,根据本领域熟知的标准方法设计和选择本发明的引物,参阅Dieffenbach,C.W.,Lowe,T.M.J.,Dveksler,G.S.(1995)GeneralConceptsforPCRPrimerDesign.《PCRPrimer,ALaboratoryManual》(Dieffenbach,CW和Dveksler,G.S.编辑)ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,133-155。
本文使用的“核酸”,通常指任何多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸,可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA或其任何组合。“核酸”包括但不限于单链和双链核酸。本文使用的术语“核酸”还包括如上文所述含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此,为了稳定性或其他原因修饰了骨架的DNA或RNA为“核酸”。本文使用的术语“核酸”包括核酸的这些化学、酶或代谢修饰的形式以及病毒和细胞(包括如简单细胞和复杂细胞)DNA和RNA特征的化学形式。“核酸”或“核酸序列”还可包括单链或双链RNA或DNA的区域或其任何组合,并可包括本发明一些实施方案的表达序列标签(EST)。EST是通过逆转录mRNA区以产生cDNA而产生的基因的一部分表达序列(即序列的“标签”)。
本文使用的“核酸探针”包括能通过一组非共价结合相互作用(包括互补碱基配对相互作用)与阵列上核酸成员的互补序列结合的核酸。本文使用的核酸探针可包含天然(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外,核酸探针中的碱基可以通过磷酸二酯键以外的键结合,只要它不干扰杂交(即该核酸探针仍在标准严谨或选择性杂交条件下与其互补序列特异性结合)。因此,核酸探针可以为肽核酸,其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键结合。
本文使用的术语“生物学样品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、软骨、滑膜组织等样品。
本发明的生物学样品
用于本发明的生物学样品得自任何受试者的任何组织样品(如软骨、滑膜、滑液或血样)或细胞样品(如软骨细胞或血细胞样品)均可以根据本发明方法使用。可以从中获得这些样品并根据本发明方法使用这些样品的受试者实例包括但不限于无症状受试者、表现或更多骨关节炎症状的受试者、临床诊断为患有骨关节炎的受试者、易患骨关节炎的受试者(如有骨关节炎家族史的受试者、有骨关节炎遗传易感性的受试者以及生活方式使其易感骨关节炎或提高患骨关节炎可能性的受试者)、怀疑患有骨关节炎的受试者、正接受骨关节炎治疗的受试者、患有骨关节炎和非接受骨关节炎治疗的受试者、开业医生(如医师)确定为健康或无骨关节炎的受试者(即正常)、已治愈骨关节炎的受试者、正在控制其骨关节炎的受试者和未诊断为骨关节炎的受试者。在一个具体的实施方案中,可获得样品并使用的受试者患手、足、脊柱、膝、髋和/或腕骨关节炎。
软骨、滑膜
在一个方面中,根据本领域已知并描述于下文的方法从生存的正常个体或死后14小时以内的软骨组织获得软骨样品或滑膜样品。使用任何已知方法获得来自成人的正常关节软骨,如软骨或滑膜得自接受关节镜手术或全膝置换术的个体,样品在液氮中保存待用。由于伦理考虑,通常不能从活供体中广泛采样真实的正常软骨或滑膜。因此,优选地,在14小时的死后窗口中在停止对采样关节灌注后从死亡供体获得正常软骨或滑膜样品,以使观察到的RNA降解最小。在另一方面中,软骨或滑膜得自诊断为骨关节炎的受试者。使用任何已知技术获得来自骨关节炎个体的人关节样品。优选地,将关节样品保存在液氮中待用。在一个具体实施方案中,分离至少0.05g软骨或滑膜样品,以获得2μg总RNA提取物。可根据本发明使用的软骨或滑膜样品为足以检测一种或多种本发明核酸序列或氨基酸序列的量。
滑液
在一个方面中,使用本领域熟知的方法从受试者获得滑液样品。例如,可以进行关节穿刺。在关节穿刺中,使用无菌针从关节中移出滑液。可以使用关节穿刺从膝、肘、腕、指、髋、脊柱或任何其他关节收集滑液。在一个具体的实施方案中,滑液收集自患骨关节炎或怀疑患骨关节炎的关节。滑液可得自患OA、未患OA的受试者或得自测试受试者。
可根据本发明使用的滑液样品为足以检测一种或多种本发明核酸序列或氨基酸序列的量。在一个具体实施方案中,可根据本发明使用的滑液样品的量范围从0.1mL至20mL、0.1mL至15mi、0.1mL至10mL、0.1mL至5mL、0.1至2mL、0.5mL至20mL、0.5mL至15mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL或0.5mL至2mL。
在本发明的一些实施方案中,使用本领域已知的方法分离滑液中存在的细胞,并根据本发明方法使用。通常在滑液中可见以下细胞:淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、单核细胞、嗜中性粒细胞、滑膜细胞和巨噬细胞。在来自病理状态(如骨关节炎)的患者的滑液中还可见以下细胞:软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。可以根据本发明的方法分离并使用这些细胞。在一个具体实施方案中,从滑液样品中分离淋巴细胞(B和T淋巴细胞)并根据本发明方法使用。在另一实施方案中,从滑液样品中分离单核细胞或嗜中性粒细胞并根据本发明方法使用。在用于本发明方法前,可以通过标准技术冷冻分离自滑液的细胞。
血
在本发明的一个方面中,根据本领域熟知的方法从受试者中获得血样。可以使用本领域技术人员已知的技术(特别是已知的采血方法)从受试者的任何身体部位(如指、手、腕、臂、腿、足、踝、胃和颈)取血。在一个具体的实施方案中,从受试者获得静脉血并根据本发明方法使用。可以使用真空管、注射器或蝶形针取血。
采血量将取决于采血部位、本发明方法需要的量和受试者的舒适度而变化。如在多个具体的实施方案中,从受试者收集0.001mL、0.005mL、0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL或更多血。将血保存在K3/EDTA管中。
在一个方面中,根据本领域熟知的采血方法从正常个体或者从诊断为患骨关节炎或怀疑患骨关节炎的个体取全血。全血包括可直接使用的血,并包括已经根据本领域熟知的方法(例如优选在300-800×g温和离心5-10分钟)除去血清或血浆并且已经从剩余血样中分离了RNA或mRNA的血。在一个具体的实施方案中,将得自受试者的全血(即未分级血)与裂解缓冲液(如裂解缓冲液(1L):0.6gEDTA;1.0gKHCO2,8.2gNH4Cl,用NaOH调整至到pH7.4)混合,离心样品并保留细胞沉淀,根据本领域熟知的方法提取RNA或mRNA(“裂解血”)(参阅如Sambrook等)。优选使用全血,因为它避免了昂贵耗时的分离血中细胞类型的步骤(Kimoto,1998,Mol.Gen.Genet258:233-239;ChellyJ等,1989,Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:2617-2621;ChellyJ等,1988,Nature333:858-860)。
在本发明的一些实施方案中,将收集自受试者的全血进行分级(即分离成组分)。在本发明的一个具体实施方案中,使用本领域已知技术从收集自受试者的全血分离血细胞。例如,可以对收集自受试者的血进行Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度离心。这种离心将红细胞(血红细胞)与各种类型的有核细胞和血浆分离开。具体地,Ficoll-Hypaque梯度离心可用于分离外周血白细胞(PBL),它们可根据本发明方法使用。其他全血分离方法按照本领域技术人员所熟知的方法进行操作。
在根据本发明方法使用前,任选地(但优选)将收集的生物学样品保存在低温如4℃下。在一些实施方案中,在第一时间根据本发明方法使用样品的一部分,而将一个或多个剩余的样品部分保存一段时间以备后用。该段时间可以是1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定。就长期保存而言,可以使用本领域熟知的保存方法,例如在冷冻温度(如低于-80℃)保存。在一些实施方案中,作为保存样品的补充或替代,将分离的核酸或蛋白质保存一段时间(如1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定)以备后用。
实施例1高通量测序筛选差异表达基因
1、取样
取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊骨性关节炎患者,病例组共收集10例,对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者,共收集4例。获取所有研究对象的软骨组织样本,编号后置-80℃低温冰箱保存。
病例组均符合膝关节OA诊断标准,进行膝关节人工关节置换术患者;对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。根据1995年美国风湿协会骨性关节炎的诊断标准,诊断为重度骨性关节炎,有膝关节置换指征的患者病例。
其中,临床诊断标准依据1995年美国风湿病协会所制定的标准:
(1)1个月内大多数时间有膝痛;
(2)关节活动时响声;
(3)晨僵不大于30分钟;
(4)年龄不小于40岁;
(5)膝关节骨性肿胀伴弹响;
(6)膝关节骨性肿胀不伴有弹响。
最少存在((1)、(2)、(3)、(4)或(1)、(2)、(3)、(5)或(1)、(6)即可诊断OA。
2、对软骨组织进行总RNA提取
采用Reagent(invitrogen,货号15596-018)进行样本RNA提取,实验操作按产品说明书进行,具体操作如下:
收集样本后冻存于液氮,取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨,待组织样本成粉末状后:
①加入Trizol,室温保存5分钟;
②加氯仿0.2mL,用力振荡离心管,充分混匀,室温下放置5分钟-10分钟;
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70%)到另一新离心管管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的-20℃预冷异丙醇,充分颠倒混匀,置于冰上10分钟;
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液,按ImL/mLTrizol的比例加入75%DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存),洗漆沉淀物,振荡混合,4℃下12000rpm高速离心5分钟;
⑤弃去乙醇液体,室温下放置5分钟以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀;
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,冻存于-80℃。RNA质量判定标准:RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间;总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带;70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
3、RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳,从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否,是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。
4、高通量测序
测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台,进行高通量转录组深度测序,测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估,包括碱基的质量值分布,质量值的位置分布,GC含量,PCRduplication含量,kmer的frequency等。在差异基因表达分析时,根据得到的FPKM值,采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中,筛选时,LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能,我们对差异表达基因进行了GeneOnlogy和信号通路分析,并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析,鉴于以上数据分析的结果,结合文献我们筛选了差异表达基因SERPINB3,该基因在骨性关节炎样本组织中表达下调。
实施例2验证骨性关节炎患者及对照软骨组织SERPINB3基因表达情况
1、材料
选取42例骨性关节炎患者软骨组织及8例对照软骨组织,对其进行分组及编号。病例组均符合膝关节OA诊断标准,进行膝关节人工关节置换术患者;对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
2、方法
2.1对软骨组织进行总RNA提取,同实施例1的提取方法。
2.2逆转录合成cDNA
采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen,货号18080-044)进行cDNA反转录,实验操作按产品说明书进行,具体操作如下:
使用逆转录试剂盒,用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系,每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3real-TimePCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI7500型荧光定量PCR仪,采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件,基因序列参照NCBI:GeneID:6317(SERPINB3),内参选GAPDH,引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下:
表1引物序列
操作过程如下:
(一)反应体系:用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen,货号4367659)进行扩增,实验操作按产品说明书进行。扩增程序为:95°5min,(95℃15sec,60℃45sec,72℃45sec,)×40个循环。
表2RealTime反应体系
组分 | 加入量 |
2×mix | 10μL |
上游引物(10μM) | 0.5μL |
下游引物(10μM) | 0.5μL |
模板 | 2μL |
加入灭菌蒸馏水 | 至25μL |
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后,以此为模板进行5倍梯度稀释,稀释后样品各取2μL作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增,同时在60-95℃进行融解曲线分析,根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品RealTimePCR检测
将各样品cDNA10倍稀释后取2μL作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
二、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚,扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,极限平而无上扬现在,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高;样本扩增产物溶解曲线都是单峰,说明扩增产物只有一条,为特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式:2-ΔCt×100%,比较SERPINB3基因在骨性关节炎组织和对照组织中的表达水平。结果显示:qRT-PCR扩增结果稳定,其中SERPINB3基因在骨性关节炎组织中的表达水平仅为对照组织的0.3倍,以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析SERPINB3基因在骨性关节炎患者中表达下调的结果。
实施例3木瓜蛋白酶诱发的骨性关节炎模型
OA动物模型的建立有多种方法,如Hulth模型、前交叉韧带和半月板切除模型、关节内注射木瓜蛋白酶、卵巢切除、高脂肪食物喂养自发形成、关节制动等。相关研究表明,将木瓜蛋白酶注入兔、豚鼠的髓关节或膝关节腔内可引发迅速进展的骨性关节炎。木瓜蛋白酶可分解软骨基质中的蛋白多糖,促使其从软骨中丢失,而骨性关节炎患者软骨早期发生的最显著变化就是水分增加及蛋白多糖减少,故木瓜蛋白酶诱发的OA模型与人体骨性关节炎类似,是研究OA的较佳造模方法。
实验动物:30只健康雄性新西兰大白兔,6月龄,体重2kg左右,实验兔进入实验室后,单笼饲养一周以适应实验室环境,实验室温度控制在16-26℃之间,相对湿度40%-70%,换气次数为8-10次/小时,昼夜明暗交替时间为12/12,适应性喂养一周后,观察无明显全身疾患及其他异常后开始试验,自由摄食实验兔专用饲料和摄水。
实验分组:将实验动物按照随机分配表分为6组,每组均为5只,分别标明实验组为Al、A2、A3,分别标明对照组为C1、C2、C3。
造模:分组后分别于第1、4、7日实验新西兰大白兔用固定架固定,使用3%戊巴比妥钠1mL/kg体重对兔子行耳缘静脉注射进行麻醉,麻醉后于兔膝关节周围进行剃毛,并使用脱毛膏脱去剩余兔毛,完整暴露兔膝关节,碘伏消毒3遍,轻度弯曲兔膝关节于骸韧带附着点外上方进针,针头从上前方向下倾斜刺入,直至针头阻力变小为止,然后针头稍后退,以垂直方向推入,当出现落空感后,表明已经进入关节腔内,即可开始注射。C1、C2、C3组注入1.6%木瓜蛋白酶溶液0.5mI,Al、A2、A3组注入等量的生理盐水溶液。注射完成后被动活动兔膝关节数次,使得液体在关节中尽可能均匀分布。
取样及处理:分别于造模后第2周末(A1),第4周末(A2),第6周末(A3)再次使用兔固定架固定,用气栓法处死兔子,处死后将兔置于动物手术台上,消毒兔膝关节,铺洞巾,逐层切开兔膝关节,观察标本软骨组织,软骨的大体形态,切取股骨骸间的软骨组织,使用滤纸拭去取出标本处的血液,置于PBS溶液中,并予1分钟之内存入液氮瓶中,待整组软骨都切取结束后,将所有标本置入-80℃冰箱中保存。
实施例4WB方法检测骨性关节炎软骨中SERPINB3的表达水平
一、蛋白质样品制备及定量
1.RIPA裂解液(Beyotime)进行蛋白质样品制备,操作步骤如下:
将软骨组织自冰箱取出,用滤纸擦拭组织上的PBS溶液,称取重量,并将软骨组织置于机械组织匀浆器中,1:10组织比裂解液的重量体积比例加入相应体积的裂解液进行匀浆,10000-14000g离心3-5分钟,取上清液,按1:1加入样品缓冲液强力混匀后置于100度的水浴箱水浴加热3-5分钟,10000g离心10分钟,取上清液,将其转入另一洁净的试管中。
2.利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量
采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒(货号:CW2011),具体步骤见其说明书。
二、SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
1.蛋白质样品变性:
a)根据BCA蛋白质浓度测定结果,每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例,混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5×)。
b)100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。
c)冷却到室温后,直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
2.胶板制备:
采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶,照说明书安装好玻璃板后,先在小烧杯中配制5mL10%的分离胶,配方如下:
表3分离胶配方
组分 | 用量 |
30%丙烯酰胺溶液 | 1.7mL |
Tris-HCl(1.5M,pH8.8) | 1.3mL |
10%SDS | 0.05mL |
10%AP | 0.05mL |
TEMED | 0.002mL |
灭菌ddH2O | 补充至5mL |
混匀后立即灌胶,然后加lmL蒸馏水覆盖,室温下放置约30min待胶聚合后,用蒸馏水洗2-3次,再用滤纸吸干。然后制备2m15%的浓缩胶,配方如下:
表4浓缩胶配方
组分 | 用量 |
30%丙烯酰胺溶液 | 0.33mL |
Tris-HCl(1.0M,pH6.8) | 0.25mL |
10%SDS | 0.02mL |
10%AP | 0.02mL |
TEMED | 0.002mL |
灭菌ddH2O | 补充至2mL |
混匀后立即灌胶,插入样品梳,避免产生气泡,待胶凝固后,取出样品梳,后用蒸馏水和1×蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。
三、上样及电泳
将凝胶板装在电泳装置上,内槽中加满l×蛋白电泳缓冲液,外槽中l×蛋白电泳缓冲液应超过铂丝,按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
四、蛋白质印迹
1.按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。
2.预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶,去除浓缩胶,在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒,然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开电转印夹,每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫,再各放一块转印液浸透的滤纸,滤纸与海面垫大小相同或与NC膜,凝胶大小相同均可,将凝胶平放在阴极侧滤纸上,最后将NC膜平放在凝胶上,去除气泡,夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液,插入电转印夹,将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷),连接好电极,接通电流,转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。
3.封闭:用1×TBS漂洗一次。加入含5%的无脂奶粉TBS封闭缓冲液,置于振荡培养箱中进行封闭;
4.一抗杂交:弃封闭液,加入用一抗稀释液稀释的一抗(Anti-SERPINB3antibody-C-terminal(ab139578))杂交溶液,置于4℃杂交过夜,第二天在振荡培养箱中进行杂交;
5.回收一抗杂交液,用TBST洗膜3次;
6.弃TBST,加入用封闭缓冲液稀释的二抗(GoatAnti-RabbitIgG,HRPConjugated(CW0103))杂交溶液,置于振荡培养箱中进行杂交;
7.弃二抗溶液,用TBST洗膜3次;
8.ECL化学发光及图像采集和分析:按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪货号CW0049B),具体步骤参照说明书。
9.以β-Actin作为内参进行数据标准化,以对照组软骨组织中SERPINB3作为参照样本,计算实验组中SERPINB3蛋白的相对表达水平。
五、实验结果
分别在造模后第2周处死A1组和C1组、第4周处死A2组和C2组、第6周处死A3组和C3组取得的样品检测结果显示,实验组A1、A2、A3组与对照组C1、C2和C3组相比,SERPINB3蛋白表达明显降低(P<0.01),对照组C1、C2和C3组内SERPINB3蛋白表达无显著差异,但实验组A1、A2、A3组内SERPINB3蛋白表达差异显著,其中A1>A2>A3(P<0.01)。具体参见图1所示。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.SERPINB3基因在制备骨关节炎诊断制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述SERPINB3基因或该基因的表达产物在骨性关节炎组织中表达下调。
3.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述诊断制剂包括基因水平的诊断制剂和蛋白水平的诊断制剂。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述基因水平的诊断制剂包括通过real-timePCR、Northernblot、Southernblot、基因芯片、原位杂交或RNA酶保护实验方法来检测SERPINB3基因的表达水平;所述real-timePCR至少包括一对特异扩增SERPINB3基因的引物,所述Northernblot、Southernblot、基因芯片、原位杂交和RNA酶保护实验至少包括一条检测SERPINB3基因的DNA、RNA或mRNA的探针。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述一对特异扩增SERPINB3基因的引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述蛋白水平的诊断制剂包括通过免疫检测、Westernblotting或蛋白芯片来检测SERPINB3基因表达产物的表达水平。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述免疫方法为ELISA法检测和/或胶体金检测;所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒,所述的试剂盒包括:包被SERPINB3单克隆抗体的固相载体,酶标抗体,酶的底物,蛋白标准品,阴性对照品,稀释液,洗涤液,酶反应终止液等;所述胶体金法为使用检测试剂盒,其所用抗体可采用市售的TSPAN15单克隆抗体。
8.一种诊断骨关节炎的产品,其特征在于,所述产品能够通过检测生物学样品中SERPINB3基因的表达水平来诊断骨关节炎,所述产品包括芯片或试剂盒。
9.一种治疗骨性关节炎的制剂,其特征在于,所述制剂中含有促进SERPINB3基因表达的试剂和促进SERPINB3基因表达产物的试剂。
10.如权利要求9所述的制剂,其特征在于,所述促进SERPINB3基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂,促进基因翻译的试剂,促进SERPINB3蛋白含量提高的试剂;所述促进SERPINB3基因表达产物的试剂包括促进SERPINB3基因表达稳定性的试剂,促进SERPINB3基因表达产物活性的试剂,促进SERPINB3基因表达产物功能的试剂。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160713 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |