CN105400894A - 椎间盘退行性病变诊治标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TMED2基因可以作为椎间盘退行性病变诊断的分子标志物，本发明的实验证明：与正常人相比，TMED2基因在椎间盘退行性病变患者中表达量高。本发明还公开了TMED2基因可以用于制备治疗椎间盘退行性病变的药物，细胞凋亡实验证明TMED2基因过表达能促进髓核细胞凋亡。本发明的研究成果提供了一种新的椎间盘退行性病变临床诊断方法，同时提供了一种治疗椎间盘退行性病变的药物新靶标。

Description

椎间盘退行性病变诊治标志物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人TMED2基因在椎间盘退行性病变的诊断、治疗中的用途。

背景技术

椎间盘是人体最早最易随年龄而发生退变的组织，其确切的发病原因目前还不清楚，但与积累劳损、创伤有重大关系，与生活习惯、职业、营养、全身情况或内分泌也有一定的关系，大体上形态表现为凝胶样髓核丧失，髓核与纤维环原有的清晰界限逐渐消失，纤维环板层粗糙和进行性纤维化，最后出现裂隙及色素沉积，椎间盘的高度因水分减少而降低。目前，治疗椎间盘的方法主要有保守治疗和手术治疗。保守治疗包括卧硬板床休息、推拿按摩、牵引、针灸等，都是对症治疗；手术治疗包括髓核摘除术、脊柱融合术等，也均为对症治疗，而且是以牺牲部分或整个椎间盘的结构与功能为代价；而异体椎间盘移植术、人工髓核置换术及人工椎间盘假体置换术等都存在着明确弊端和缺陷，且有报道此类手术存在15％-40％的失败率，而二次手术的成功率更是下降到50％，以及融合椎间盘将导致相邻上、下正常节段椎间盘提早退行性变化。疾病的早期诊断能够显著提高病人摆脱该疾病的概率，因此寻找椎间盘退行性病变早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对实现椎间盘退行性病变的早期诊断及个体化治疗具有深远意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于椎间盘退行性病变早期诊断的分子标志物。相比传统的椎间盘退行性病变的诊断方法，使用基因标志物来诊断椎间盘退行性病变的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测TMED2基因表达的产品在制备诊断椎间盘退行性病变的工具中的应用。

进一步，所述检测TMED2基因表达的产品包括检测TMED2基因mRNA水平的产品、和/或检测TMED2蛋白水平的产品。

进一步，所述检测TMED2基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测TMED2基因表达以诊断椎间盘退行性病变的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括一对特异扩增TMED2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括一对特异扩增TMED2基因的引物；所述用免疫检测诊断椎间盘退行性病变的产品包括：与TMED2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断椎间盘退行性病变的产品包括：与TMED2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断椎间盘退行性病变的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与TMED2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与TMED2基因的核酸序列杂交的探针。

所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括的一对特异扩增TMED2基因的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。

所述检测TMED2基因表达的产品可以是检测TMED2基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

所述诊断椎间盘退行性病变的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断椎间盘退行性病变的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知TMED2基因的异常与椎间盘退行性病变相关也属于TMED2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断椎间盘退行性病变的工具，所述工具包括检测

TMED2基因表达的试剂；所述试剂包括检测TMED2基因mRNA的引物和/或探针、和/或检测TMED2蛋白的抗体。

所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TMED2基因转录水平的针对TMED2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的TMED2蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括TMED2基因在内的多个基因(例如，与椎间盘退行性病变相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括TMED2蛋白在内的多个蛋白质(例如与椎间盘退行性病变相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与椎间盘退行性病变的标志物同时检测，可大大提高椎间盘退行性病变诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测TMED2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括TMED2蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测TMED2基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对TMED2基因的引物和/或探针。根据TMED2基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测TMED2基因表达水平的引物和探针。

所述试纸包括检测TMED2基因表达的试剂。

所述高通量测序平台包括检测TMED2基因表达的试剂。

与TMED2基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述TMED2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述TMED2蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与TMED2蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述检测TMED2基因mRNA的引物包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物对。

本发明还提供了TMED2基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗椎间盘退行性病变的药物中的应用。所述抑制剂包括抑制TMED2基因表达的试剂、和/或抑制TMED2基因表达产物的试剂。

进一步，所述抑制TMED2基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制TMED2基因表达产物的试剂包括抑制TMED2基因mRNA的试剂、抑制TMED2蛋白的试剂。所述抑制TMED2基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制TMED2蛋白的试剂包括抑制TMED2蛋白稳定性的试剂、抑制TMED2蛋白活性的试剂、抑制TMED2蛋白功能的试剂。

进一步，抑制TMED2基因mRNA的试剂包括针对TMED2基因mRNA的双链核糖核酸；抑制TMED2蛋白功能的试剂包括TMED2抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制TMED2蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。

所述针对TMED2基因mRNA的双链核糖核酸可以是siRNA。为了确保TMED2基因能够被高效剔除或沉默，根据TMED2基因的mRNA序列设计siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashiret.al2001，Schwarzet.al2003，Khvorovaet.al2003，Reynoldset.al2004，Hsiehet.al2004，Ui-Teiet.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgramofWhiteheadInstitute(BingbingYuanet.al2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTMRNAiDesignerofINVITROGEN(winnerofthe2004Frost&SullivanExcellenceinResearchAward，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBIBLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。

本发明还提供了一种用于治疗椎间盘退行性病变的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的TMED2基因和/或其表达产物的抑制剂。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

本发明的药物组合物还可与其他治疗椎间盘退行性病变的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

在本发明的上下文中，“TMED2基因”包括人TMED2基因以及人TMED2基因的任何功能等同物的多核苷酸。TMED2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中TMED2基因(NC_000012.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，TMED2基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述TMED2基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，TMED2基因表达产物包括人TMED2蛋白以及人TMED2蛋白的部分肽。所述TMED2蛋白的部分肽含有与椎间盘退行性病变相关的功能域。

“TMED2蛋白”包括人TMED2蛋白以及人TMED2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括人TMED2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人TMED2的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，TMED2蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述TMED2蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是TMED2蛋白的融合蛋白。对于与TMED2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留TMED2蛋白的生物学活性即可。

本发明的TMED2蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留TMED2蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断椎间盘退行性病变”既包括判断受试者是否已经患有椎间盘退行性病变、也包括判断受试者是否存在患有椎间盘退行性病变的风险。

在本发明的上下文中，“治疗椎间盘退行性病变”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。

本发明使用体外培养的髓核细胞来研究TMED2基因对椎间盘退行性病变的治疗作用。本领域技术人员可知，椎间盘退行性病变发生的一个重要的生理特征在于髓核细胞的增殖减缓、衰老加快、凋亡加剧，因此本发明利用髓核细胞生长凋亡指标的变化来研究TMED2基因与椎间盘退行性病变治疗的关系。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了TMED2基因表达与椎间盘退行性病变相关，通过检测受试者TMED2的表达，可以判断受试者是否患有椎间盘退行性病变、或者判断受试者是否存在患有椎间盘退行性病变的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-TMED2基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现椎间盘退行性病变的早期诊断，从而降低椎间盘退行性病变的死亡率。

附图说明

图1显示利用QPCR检测TMED2基因在椎间盘退行性病变组织中的表达情况；

图2显示利用免疫印记检测TMED2蛋白在椎间盘退行性病变组织中的表达情况；

图3显示利用QPCR检测TMED2基因的过表达情况；

图4显示利用免疫印记检测TMED2蛋白的过表达情况；

图5显示利用TUNEL检测TMED2基因表达对髓核细胞凋亡的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1正常对照组织和椎间盘退行性病变组织中TMED2基因的表达差异

1、样本收集

人正常椎间盘组织5例，取自外伤致脊柱爆裂性骨折患者。取椎间盘退行性病变手术患者的椎间盘组织5例，平均年龄75岁，根据Gr1es〔5〕评分标准，均为重度退变。样本收集时均得到患者及其家属同意。

2、髓核组织提取

正常髓核组织：手术接近完整摘取正常椎间盘组织，可见到外周白色的纤维环和中心胶冻样的髓核组织。用含双抗(青一链霉素)的生理盐水浸泡椎间盘10分钟，用刮匙轻轻将髓核组织从椎间盘中分离，双抗生理盐水浸泡冲洗直至无明显血迹为止，大约3-4次。

退变髓核组织：手术均从后侧入路，不能完整取出椎间盘。分离纤维环组织与髓核组织时，依靠肉眼、手感等进行区分。髓核组织呈胶冻状半透明状，纤维环呈白色柔韧状。髓核组织用眼科剪容易剪碎，无韧性。

3、组织总RNA的提取

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

①加入Trizol，室温保存5min；

②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；

③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；

④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/mlTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。

4、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

5、RNA样品的质量分析(AgilentTechnologies2100Bioanalyzer)

AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28SrRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。

6、高通量转录组测序

(1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHatv1.3.1将清洁片段与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiensUCSChg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

(2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinksv1.0.3处理，Cufflinksv1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

(3)差异表达基因的检测

将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

7、结果

RNA-seq结果显示，与正常对照组织相比，椎间盘退行性病变组织中TMED2基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2大样本验证差异表达基因

1、样本收集和组织处理

人正常椎间盘组织40例，取自外伤致脊柱爆裂性骨折患者。取椎间盘退行性病变手术患者的椎间盘组织40例，平均年龄75岁，根据Gr1es〔5〕评分标准，均为重度退变。样本收集时均得到患者及其家属同意。

髓核组织提取同实施例1。

2、转录水平上检测TMED2基因的差异表达

2.1提取组织总RNA

步骤同实施例1。

2.2逆转录

利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。

2.3QPCR

(1)引物设计

根据Genbank中TMED2基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

TMED2基因：

正向引物为5’-GGAGATTACAGGACCAGATAA-3’(SEQIDNO.3)；

反向引物为5’-ATGTGAGCAGCAAATGTG-3’(SEQIDNO.4),

GAPDH基因：

正向引物为5’-AAAGGGTCATCATCTCTG-3’(SEQIDNO.5)；

反向引物为5’-GCTGTTGTCATACTTCTC-3’(SEQIDNO.6)。

(2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1PCR反应体系

试剂	体积
		正向引物	1μl
反向引物	1μl
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μl
模板	2μl
		去离子水	补足25μl

(3)PCR反应条件：95℃5min，(95℃5s，60℃60s)*45个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

2.4统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

2.5结果

结果如图1所示，与正常对照组织相比，椎间盘退行性病变组织中TMED2基因表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3、蛋白水平上检测TMED2基因的差异表达

3.1组织总蛋白的提取

使用北京普利莱基因技术有限公司的总蛋白提取试剂盒(货号：P1250)提取组织中的总蛋白，具体操作步骤参见说明书。

3.2Westernblot

总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。

3.3统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用ImageJ软件进行分析，以β-actin为内参，将TMED2蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3.4结果

结果如图2所示，与正常对照组织相比，椎间盘退行性病变组织中TMED2蛋白的表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3TMED2基因过表达

1、TMED2基因表达载体的构建

根据TMED2基因的编码序列(如SEQIDNO.1所示)设计扩增引物。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的TMED2基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-TMED2用于后续实验。

2、细胞培养

椎间盘髓核组织放入盛有10m12％II型胶原酶的100ml烧杯中，磁力搅拌器搅拌约60分钟。待组织完全溶解后，1000r/min离心10分钟，吸出上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基lml轻轻吹散细胞，吸至50ml培养瓶中，加入10％胎牛血清的DMEM培养基6-8ml，静置于37℃、饱和湿度、5％CO₂孵箱中培养3天。3天后倒置显微镜观察细胞贴壁生长情况，隔天换液。

3、细胞转染

将髓核细胞按1.5×10⁴/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的高糖1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为对照组(转染空载体pcDNA3.1)和过表达组(转染pcDNA3.1-TMED2)，pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-TMED2的工作浓度均为0.5μg/ml。

4、利用QPCR实验检测TMED2基因过表达情况

4.1提取细胞总RNA

利用QIAGEN公司的组织/细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。

4.2逆转录和QPCR

步骤同实施例2。

4.3统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，TMED2基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4.4结果

结果如图3显示，与对照组相比，转染pcDNA3.1-TMED2的细胞中TMED2基因表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

5、利用Westernblot检测TMED2蛋白的表达情况

5.1细胞总蛋白的提取

使用北京普利莱基因技术有限公司的总蛋白提取试剂盒(货号：P1250)提取细胞中的总蛋白，具体操作步骤参见说明书。

5.2Westernblot

步骤同实施例2。

5.3统计学处理

同实施例2。

5.4结果

结果如图4所示，与对照组相比，转染pcDNA3.1-TMED2的细胞中TMED2蛋白的表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4TMED2基因对髓核细胞增殖的影响

1、使用CellCountingkit-8(cck-8)试剂盒用于检测髓核细胞增殖

1.1步骤

按照前面实施例2的方法进行正常髓核细胞的培养和转染，细胞分为三个实验组：

组1：细胞转染pcDNA3.1，作为对照组；

组2：细胞转染pcDNA3.1-TMED2。

转染24h后，以2×10⁵/ml密度接种于96孔细胞培养板中，每个实验组设计三复孔，每孔100μl，放置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育，24h细胞贴壁后，分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μlCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。

1.2统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

1.3结果

结果如表2所示，与对照组相比，转染pcDNA3.1-TMED2的髓核细胞增殖缓慢。上述实验结果表明，TMED2基因过表达能够抑制髓核细胞的增殖。

表2髓核细胞OD值

实验组	OD值(光密度)
		pcDNA3.1	0.1713±0.003
pcDNA3.1-TMED2	0.0951±0.002

实施例4TMED2基因对髓核细胞凋亡的影响

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染髓核细胞悬液3.0×10⁴/ml接种于预置盖玻片的6孔板，之后按照实施例3的步骤进行转染。

3、TUNEL法原位检测细胞凋亡：转染48h后，取出盖玻片用新鲜配制的4％多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)说明书进行操作，BLIP/NBT显色，核固红复染，甘油封片。用PBS代替TUNEL染色液作对照组，高倍镜下计数300个细胞。TUNEL凋亡指数计算公式为：阳性细胞数/总细胞数。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果：

结果如图5所示，与转染pcDNA3.1的细胞相比，转染pcDNA3.1-TMED2的细胞凋亡指数明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，TMED2基因的高表达可以促进髓核细胞的凋亡。

实施例5TMED2基因对髓核细胞衰老的影响

SA-β-gal染色检测髓核细胞的衰老情况。SA-β-gal是一种可鉴定衰老细胞的生物学标志物。按照细胞衰老测定试剂盒(Biovision公司)说明检测，观察并计数显微镜下细胞质内有蓝色的细胞百分数，判断细胞衰老的情况。每组设3个复孔，每次实验重复3次。

细胞培养和转染同实施例2。

细胞转染48h后进行SA-β-gal染色。

结果显示，转染pcDNA3.1细胞组蓝色细胞平均百分数为8％，转染pcDNA3.1-TMED2细胞组蓝色细胞平均百分数为39％，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明TMED2过表达可以加速髓核细胞的衰老过程。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测TMED2基因表达的产品在制备诊断椎间盘退行性病变的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测TMED2基因表达以诊断椎间盘退行性病变的产品；所述用RT-PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括一对特异扩增TMED2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括一对特异扩增TMED2基因的引物；所述用免疫检测诊断椎间盘退行性病变的产品包括：与TMED2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断椎间盘退行性病变的产品包括：与TMED2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断椎间盘退行性病变的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与TMED2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与TMED2基因的核酸序列杂交的探针。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括的一对特异扩增TMED2基因的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。

4.一种诊断椎间盘退行性病变的工具，其特征在于，所述工具包括检测TMED2基因表达的试剂。

5.根据权利要求4所述的工具，其特征在于，所述试剂包括检测TMED2基因mRNA的引物和/或探针、和/或检测TMED2蛋白的抗体。

6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述检测TMED2基因mRNA的引物包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物对。

7.TMED2基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗椎间盘退行性病变的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制TMED2基因表达的试剂、和/或抑制TMED2基因表达产物的试剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制TMED2基因表达产物的试剂包括抑制针对TMED2基因的siRNA、和/或TMED2蛋白的抗体。

10.一种用于治疗椎间盘退行性病变的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求7-9中任一项所述的抑制剂。