CN113820500A - 用于检测退变椎间盘微血管形成的生物标志物及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及两种用于分析退变椎间盘微血管形成的标志物和检测方法。这两种标志物是血红蛋白及其辅基血红素。本发明的有益效果在于首次发现血红蛋白和血红素在人退变椎间盘组织中的表达丰度显著高于在正常椎间盘组织中的表达，本发明提供了一种从血管性改变的角度理解椎间盘退变的新思路(传统的观点多集中于椎间盘的钙化和纤维化过程)，并为此提供了两种可靠的生物标志物。

Description

用于检测退变椎间盘微血管形成的生物标志物及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药检测技术领域，具体涉及一种用于检测退变椎间盘微血 管形成的生物标志物及其检测方法。
背景技术
椎间盘各部分(髓核、纤维环及软骨终板)的生理性退变(degeneration)是椎 间盘退行性疾病发生的根源。椎间盘是人体最大的无血管封闭结构，正常成人 的软骨终板和纤维环通过渗透这种特殊方式向髓核提供营养，随着年龄的增 长，软骨终板钙化的进行性发展导致椎间盘营养发生障碍，从而启动椎间盘的 退变进程。因此，探索椎间盘退变的生物标志物(biomarker)以及其中的机制是 脊柱外科的重要研究方向，具有重大的科学意义和深远的应用前景。
临床病理学家早已观察到椎间盘退变过程存在“微血管形成”的现象。新生 儿椎间盘软骨终板及纤维环内均可见丰富的血管，出生后血管管腔被细胞外基 质填充而逐渐闭塞。随着年龄增长，椎间盘内的微血管逐渐退化至终板和纤维 环外层，至成人阶段椎问盘成为人体最大的无血管封闭组织，其营养供应依赖 于软骨终板和纤维环的渗透作用。在椎间盘的退变过程中，髓核发生裂解和皱 缩，椎间盘内又再一次出现微血管形成，成为椎间盘退变的一种特征性的病理 改变。椎间盘内微血管形成可能是椎间盘损伤后的一种修复过程，同时具有促 进退变的作用。
然而，医学界对退变椎间盘微血管形成的研究还相当有限，更没有发现任何 一种可靠的生物标志物来预测退变椎间盘内是否有微血管形成。
因此，本领域迫切需要开发一种针对椎间盘退行性疾病的患病风险评估方法 和诊断方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种针对椎间盘退行性疾病的患病风险评估方法和 诊断方法。
本发明的另一目的是提供一种用于检测退变椎间盘微血管形成的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种生物标志物集合的用途，用于制备一试剂 盒，所述的试剂盒用于：(I)评估待测对象的椎间盘退行性疾病的患病风险，和/ 或(II)待测对象的椎间盘退行性疾病的诊断；
其中，所述的集合中包括选自下组的生物标志物：血红蛋白、辅基血红素， 或其组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于：
(i)检测待测对象的椎间盘组织微血管生成；
(ii)诊断待测对象的椎间盘退变；和/或
(iii)对椎间盘退行性疾病的临床病理分级鉴定。
在另一优选例中，所述生物标志物集合还包括：血管内皮标志物。
在另一优选例中，所述的血管内皮标志物为CD31。
在另一优选例中，所述试剂盒中包括：对所述集合中的各生物标志物具有特 异性的结合分子、特异性抗体、特异性扩增引物、特异性探针或芯片、同位素、酶 -底物复合物，或其组合。
在另一优选例中，所述试剂盒中包括：(i)血红蛋白的特异性结合分子、血红 蛋白的特异性抗体、特异性扩增引物、探针或芯片，或其组合；和/或(ii)血红素的 特异性探针、血红素过氧化物酶活性检测试剂，或其组合。
在另一优选例中，所述的评估或检测包括步骤：
(a)提供一来源于待测对象的待测样品，对样品中所述集合中各个生物标记物 的水平进行检测；
(b)将步骤(a)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较。
在另一优选例中，所述的对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行的 检测包括：定性检测和/或定量检测。
在另一优选例中，所述的定量检测包括对各个生物标志物的表达量进行检测。
在另一优选例中，所述检测的方法包括：蛋白免疫印迹法、免疫组织化学法、 酶联免疫吸附实验、荧光探针法和实时定量聚合酶链反应法，或其组合。
在另一优选例中，所述检测的方法包括：利用抗体的检测方法、质谱分析法、 核酸适配体技术。
在另一优选例中，所述检测的方法为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)。
在另一优选例中，所述的待测样品为来源于受试对象的椎间盘组织的样品。
在另一优选例中，所述的待测样品为新鲜的、冷冻的人椎间盘组织或石蜡固 定包埋的切片。
在另一优选例中，所述参考数据集或参考值包括来源于健康对照者中所测得 的参考值，或来源于正常椎间盘组织中所测得的参考值。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，若步骤(a)测得的水平与所述参考数据集中 的参考值的比值≥2(较佳地≥3，更佳地≥4)，则所述的待测对象具有椎间盘退行性 疾病的患病风险。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，若步骤(a)测得的水平与所述参考数据集中 的参考值的比值≥2(较佳地≥3，更佳地≥4)，则所述的待测对象被诊断为患有椎间 盘退行性疾病。
在本发明的第二方面，提供了一种用于椎间盘退行性疾病的评估或诊断的试 剂组合，所述试剂组合包括用于检测选自下组的生物标志物的试剂：血红蛋白、 辅基血红素，或其组合。
在另一优选例中，所述的试剂组合还包括用于检测血管内皮标志物的试剂。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第二 方面所述的试剂组合。
在本发明的第四方面，提供了一种评估待测对象的椎间盘退行性疾病的患病 风险或对待测对象的椎间盘退行性疾病的诊断方法，包括步骤：
(a)提供一来源于待测对象的待测样品，使用如本发明第二方面所述的试剂组 合或如本发明第三方面所述的试剂盒对样品中所述集合中各个生物标志物的水平 进行检测；
(b)将步骤(a)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较。
在本发明的第五方面，提供了一种筛选治疗椎间盘退行性疾病的候选化合物 的方法，包括步骤：
(i)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对 象的样品中的生物标志物集合中，各个生物标记物的水平V1；在对照组中，向 待测对象施用空白对照(包括溶媒)，检测对照组中来源于所述对象的样品中所 述集合中各个生物标记物的水平V2；
(ii)对上一步骤检测得到的水平V1和水平V2进行比较，从而确定所述测试 化合物是否是治疗椎间盘退行性疾病的候选化合物，其中所述集合包括选自下 组的生物标志物：血红蛋白、辅基血红素，或其组合。
在另一优选例中，所述的集合还包括用于检测血管内皮标志物的试剂。
在另一优选例中，所述的待测对象为椎间盘退行性疾病患者。
在另一优选例中，如果一个或多个所述生物标志物的水平V1显著低于水 平V2，表明测试化合物为治疗椎间盘退行性疾病的候选化合物。
在另一优选例中，所述“显著低于”指水平V1/水平V2的比值≤1/2，较佳地 ≤1/3，更佳地≤1/4。
在本发明的第六方面，提供了一种椎间盘退行性疾病的患病风险评估或诊断 系统，所述系统包括：
(a)样品输入模块，所述样品输入模块用于输入来自于待测对象的样品；
(b)检测模块，所述检测模块用于检测所述样品输入模块中所输入的样品中的 生物标志物集合中各生物标志物的水平，所述的集合中包括选自下组的生物标志 物：血红蛋白、辅基血红素，或其组合；
(c)分析模块；和
(d)输出模块。
在另一优选例中，所述的待测对象是人。
在另一优选例中，所述的待测对象是年龄为≥18岁的人。
在另一优选例中，所述的样品输入模块包括高通量组织研磨仪和组织蛋白裂 解试剂，所述高通量组织研磨仪和组织蛋白裂解试剂用于获得来自待测对象的椎间 盘组织样品。
在另一优选例中，所述检测模块包括基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)。
在另一优选例中，所述分析模块中含有一参考数据集或一参考值，所述参考 数据集或参考值来源于健康对照者中所测得的所述集合中的各生物标志物的参考 值，或来源于正常椎间盘组织中所测得的所述集合中的各生物标志物的参考值。
在另一优选例中，在所述分析模块中，将所述检测模块中的检测结果与所述 的参考数据集或参考值进行比较。
在另一优选例中，所述的输出模块包括报告系统。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A为实施例1得到的椎间盘总蛋白裂解液在high mass3(HM3)模式下的 质谱分析图。具体地为实施例1得到的血红蛋白纯品稀释液(图1B)、椎间盘总蛋 白裂解液(图1C)、椎间盘总蛋白裂解液与血红蛋白纯品混合液(图1D)在HM3模 式下的质谱分析图。
图2A为本发明实施例2得到的17例退变椎间盘总蛋白裂解液与10例正常椎 间盘总蛋白裂解液在HM3模式下的质谱分析结果的代表性图片。图2B为17例退 变椎间盘总蛋白裂解液与10例正常椎间盘总蛋白裂解液中血红蛋白α和β相对 强表达量散点图。**P＜0.01。
图3A为血红蛋白纯品在reflectron模式下的质谱分析图。图3B为本发明实施 例3得到的退变椎间盘总蛋白裂解液(蓝)与正常椎间盘总蛋白裂解液(红)在 reflectron模式下的质谱分析图。
图4A为实施例4得到的5例退变椎间盘总蛋白裂解液与3例正常椎间盘总蛋 白裂解液的蛋白免疫印迹结果。图4B为实施例4得到的5例退变椎间盘总蛋白裂 解液与3例正常椎间盘总蛋白裂解液中血红蛋白α相对表达量柱状图。图4C为实 施例4得到的5例退变椎间盘总蛋白裂解液与3例正常椎间盘总蛋白裂解液中血 红蛋白β相对表达量柱状图。图4D为实施例4得到的5例退变椎间盘总蛋白裂解 液与3例正常椎间盘总蛋白裂解液中血管内皮标志物CD31相对表达量柱状图。 *P＜0.05，**P＜0.01。
图5为实施例5得到的3例行腰椎后路经椎间孔减压椎间植骨融合内固定 术的患者及3例其他疾病的对照组患者术前MRI(Magnetic Resonance Imaging) 影像与相对应的椎间盘总蛋白裂解液在HM3模式(a)和reflectron模式(b)下的质 谱分析图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次意外地发现了一 种用于检测退变椎间盘微血管形成的生物标志物。本发明人首次发现，血红蛋 白和血红素在退变椎间盘和正常椎间盘组织中的相对表达量有显著差异，因此 血红蛋白和血红素可以作为预测椎间盘微血管形成的生物标志物。此外，本发 明的方法还可以对椎间盘组织中血红蛋白和血红素进行快速检测。在此基础上 完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所 属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从 列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间 的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式 的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
样品
本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受 试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触 方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其 它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测 试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以 为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定 与受试者有关的信息就行。
表达
如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由 RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的 出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质 片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。
因此，在免疫印迹如western印迹上斑点密度的增加也处于以生物学分子为基 础的术语“表达”的范围内。
参比值
如本文所用，术语“参比值”、“参考值”、“参考数据”和“对照参比值”可互换使 用，是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。
在优选的实施方案中，参比值是根据对比较血红蛋白和/或血红素基因、mRNA 或蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施 例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户 经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、 年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。
本发明生物标志物集合及其用途
在本发明中，提供了一种生物标志物集合及其用途，其可用于制备一试剂盒， 所述的试剂盒用于：(I)评估待测对象的椎间盘退行性疾病的患病风险，和/或(II) 待测对象的椎间盘退行性疾病的诊断；
其中，所述的集合中包括选自下组的生物标志物：血红蛋白、辅基血红素， 或其组合。
优选地，所述生物标志物集合还包括血管内皮标志物。所述的血管内皮标志 物为CD31。
在一个实施方式中，所述试剂盒中包括：对所述集合中的各生物标志物具有 特异性的结合分子、特异性抗体、特异性扩增引物、特异性探针或芯片、同位素、 酶-底物复合物，或其组合。优选地，所述试剂盒中包括：(i)血红蛋白的特异性结 合分子、血红蛋白的特异性抗体、特异性扩增引物、探针或芯片，或其组合；和/ 或(ii)血红素的特异性探针、血红素过氧化物酶活性检测试剂，或其组合。
血红蛋白和血红素
血红蛋白(hemoglobin)由珠蛋白和血红素(heme)组成，是红细胞的主要组成部分。血红素是铁卟啉化合物，是血红蛋白的辅基，参与血红蛋白合成的血红素主要 在骨髓的幼期红细胞和网织红细胞中合成。血红蛋白的主要作用是运输氧气和二氧 化碳。
在生理条件下，血红蛋白与氧气结合形成氧合血红蛋白，然后运输到机体各组 织器官参与能量代谢，同时又把组织器官产生的二氧化碳，通过碳氧血红蛋白的形 式由肺部排出体外。临床通常以血液中血红蛋白含量来反映机体贫血程度。
检测方法
在本发明中，提供了一种评估待测对象的椎间盘退行性疾病的患病风险或 对待测对象的椎间盘退行性疾病的诊断方法，所述的评估或检测包括步骤：
(a)提供一来源于待测对象的待测样品，对样品中所述集合中各个生物标志物 的水平进行检测；所述的生物标志物包括血红蛋白、辅基血红素，或其组合；
(b)将步骤(a)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较。
在所述的方法中，所述的对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行的 检测包括：定性检测和/或定量检测。其中，所述的定量检测包括对各个生物标志 物的表达量进行检测。优选地，所述检测的方法包括：蛋白免疫印迹法、免疫组 织化学法、酶联免疫吸附实验、荧光探针法和实时定量聚合酶链反应法，或其 组合。在一个实施方式中，所述检测的方法包括：利用抗体的检测方法、质谱分 析法、核酸适配体技术。
更加优选地，所述检测的方法为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法 (MALDI-TOF MS)。
在本发明的检测方法中，所述的待测样品为来源于受试对象的椎间盘组织的 样品。优选地，所述的待测样品为新鲜的、冷冻的人椎间盘组织或石蜡固定包埋的 切片。
优选地，所述参考数据集或参考值包括来源于健康对照者中所测得的参考值， 或来源于正常椎间盘组织中所测得的参考值。
在一个实施方式中，所述步骤(b)中，若步骤(a)测得的水平与所述参考数据集 中的参考值的比值≥2(较佳地≥3，更佳地≥4)，则所述的待测对象具有椎间盘退行 性疾病的患病风险。
在另一个实施方式中，所述步骤(b)中，若步骤(a)测得的水平与所述参考数据 集中的参考值的比值≥2(较佳地≥3，更佳地≥4)，则所述的待测对象被诊断为患有 椎间盘退行性疾病。
本发明的主要优点包括：
1、本发明首次发现血红蛋白和血红素可作为判断退变椎间盘组织微血管 形成的生物标志物。
2、通过搜集的临床样本，发现血红蛋白和血红素在退变椎间盘组织内的 表达显著高于在正常椎间盘组织中的表达；
3、本发明提供了一种从血管性改变的角度理解椎间盘退变的新思路，并 提供了两种预测椎间盘微血管生成的可靠生物标志物。
4、本发明首次发现了血红蛋白和血红素的含量与椎间盘的临床病理分级 密切相关。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：检测退变椎间盘组织中有血红蛋白的表达
1.1检测样本：
人椎间盘组织样品在手术后被迅速冲洗并保存于1.5mL的低吸附冻存管 中，置于液氮中储存待用。所有样品的使用均得到患者知情同意和海军军医大 学附属长征医院伦理委员会的批准。
1.2检测方法
(1)椎间盘组织总蛋白提取：取50mg冷冻组织，经去离子水冲洗后切碎放入 EP管内，按10μL/mg比例加入RIPA裂解液(含1％PMSF)。加入1颗研磨珠于匀浆 管中，经过组织研磨仪(wonbio-48R)在60Hz下研磨45s后，置于4℃下裂解30min， 然后在4℃下12000g离心15min，取上清并-80℃保存。
(2)蛋白提取液的分析前处理：以sinapinic acid(10mg/ml)作为MALDI基质。 待测蛋白样品与基质以1:40比例混匀后，取1.5μL点在不锈钢板上。室温下风干 后进入离子源进行MALDI-TOF MS分析。
(3)MALDI-TOF MS分析：本发明所有质谱图均由axima performance, shimadzubiotech lauchpad MALDI-TOF MS采集，配备ND:YAG 337nm激光源。 加速电压20kV，激光频率10Hz。操作模式为HM3线性模式，power:130,profiles: 100per sample,shots:2。由fetal bovine serum albumin纯品进行质量校正。
1.3检测结果：
如图1A所示，MALDI结合HM3质量检测器的分析结果显示，退变椎间盘 组织蛋白裂解液在高质量范围(10kDa-100kDa)有两个相对强度较高的峰(m/z ＝16-17kDa)。通过与血红蛋白纯品相比较，这两个峰最终被确定为血红蛋白的 α亚基(m/z＝16kDa)和β亚基(m/z＝17kDa)(图1B,C,D)。
实施例2：血红蛋白在退变椎间盘组织中的表达量高于在正常椎间盘组织 中的表达
2.1检测样本：
人椎间盘组织样品在手术后被迅速冲洗并保存于1.5mL的低吸附冻存管 中，置于液氮中储存待用。所有样品的使用均得到患者知情同意和海军军医大 学附属长征医院伦理委员会的批准。
2.2检测方法
(1)椎间盘组织总蛋白提取：取50mg冷冻组织，经去离子水冲洗后切碎放入 EP管内，按10μL/mg比例加入RIPA裂解液(含1％PMSF)。加入1颗研磨珠于匀浆 管中，经过组织研磨仪(wonbio-48R)在60Hz下研磨45s后，置于4℃下裂解30min， 然后在4℃下12000g离心15min，取上清并-80℃保存。
(2)蛋白提取液的分析前处理：以sinapinic acid(10mg/ml)作为MALDI基质。 待测蛋白样品与基质以1:40比例混匀后，取1.5μL点在不锈钢板上。室温下风干 后进入离子源进行MALDI-TOF MS分析。
(3)MALDI-TOF MS分析：本发明所有质谱图均由axima performance, shimadzubiotech lauchpad MALDI-TOF MS采集，配备ND:YAG 337nm激光源。 加速电压20kV，激光频率10Hz。操作模式为HM3线性模式，power:130,profiles: 100per sample,shots:2。由fetal bovine serum albumin纯品进行质量校正。
2.3检测结果：
利用MALDI结合HM3质量检测器对17例退变椎间盘和10例正常椎间盘组 织进行分析。如图2A-B所示，血红蛋白在退变椎间盘组织中的相对表达量高于 在正常椎间盘中的表达，说明退变椎间盘组织内有微血管生成。
实施例3：血红素在退变椎间盘组织中的表达量高于在正常椎间盘组织中 的表达
3.1检测样本：
人椎间盘组织样品在手术后被迅速冲洗并保存于1.5mL的低吸附冻存管 中，置于液氮中储存待用。所有样品的使用均得到患者知情同意和海军军医大 学附属长征医院伦理委员会的批准。
3.2检测方法
(1)椎间盘组织总蛋白提取：取50mg冷冻组织，经去离子水冲洗后切碎放入 EP管内，按10μL/mg比例加入RIPA裂解液(含1％PMSF)。加入1颗研磨珠于匀浆 管中，经过组织研磨仪(wonbio-48R)在60Hz下研磨45s后，置于4℃下裂解30min， 然后在4℃下12000g离心15min，取上清并-80℃保存。
(2)蛋白提取液的分析前处理：以dihydroxybenzoic acid(10mg/ml)作为 MALDI基质。待测蛋白样品与基质以1:40比例混匀后，取1.5μL点在不锈钢板上。 室温下风干后进入离子源进行MALDI-TOF MS分析。
(3)MALDI-TOF MS分析：本发明所有质谱图均由axima performance, shimadzubiotech lauchpad MALDI-TOF MS采集，配备ND:YAG 337nm激光源。 加速电压20kV，激光频率10Hz。操作模式为reflectron模式，power:60,profiles: 100per sample,shots:2。
3.3检测结果：
在reflectron模式下对退变椎间盘和正常椎间盘组织进行分析。血红素是血 红蛋白辅基，如图3所示，在退变椎间盘组织中出现血红素峰(m/z＝616.4Da)， 而正常椎间盘组织中未发现血红素峰。
实施例4：血红蛋白α、血红蛋白β和血管内皮标志物CD31在退变椎间盘组 织中的表达高于在正常椎间盘组织中的表达
4.1检测样本：
人椎间盘组织样品在手术后被迅速冲洗并保存于1.5mL的低吸附冻存管 中，置于液氮中储存待用。所有样品的使用均得到患者知情同意和海军军医大 学附属长征医院伦理委员会的批准。
4.2检测方法：
(1)椎间盘组织总蛋白提取及蛋白变性：取50mg冷冻组织，经去离子水冲洗 后切碎放入EP管内，按10μL/mg比例加入RIPA裂解液(含1％PMSF)。加入1颗研 磨珠于匀浆管中，经过组织研磨仪(wonbio-48R)在60Hz下研磨45s后，置于4℃ 下裂解30min，然后在4℃下12000g离心15min，取上清，加入SDS上样缓冲液至 终浓度为1×，100℃热浴10min，待冷却后上样。
(2)蛋白浓度测定：取一块96孔板，按照下表加入试剂：
孔号 0 1 2 3 4 5 6 7
蛋白标准溶液(μL) 0 1 2 4 8 12 16 20
去离子水(μL) 20 19 18 16 12 8 4 0
各孔加入200μLBCA工作液(BCA试剂A:BCA试剂B＝1:50)后振荡30s，37℃ 下孵育30min，然后测定在562nm下的optical density值。以蛋白含量为横坐标， opticaldensity值为纵坐标，绘出标准曲线。另取一块新的96孔板，根据待测样 品数量，取2μL待测样品(未变性)并稀释至总体积为20μL，每孔加入BCA工作 液200μL，充分混匀，37℃下孵育30min后，在562nm波长下测optical density值， 根据标准曲线计算待测蛋白样品浓度。
(3)SDS-PAGE电泳：取25μg蛋白量经SDS-PAGE电泳分离。电泳至需要检 测的目的蛋白被分离开后终止电泳(约90min，电压80V)。SDS-PAGE胶成分如 下所示：
10％分离胶 体积(mL) 5％浓缩胶 体积(mL)
去离子水 4.0 去离子水 1.4
30％聚丙烯酰胺 3.3 30％聚丙烯酰胺 0.33
1.5MTris(pH8.8) 2.5 1.5M Tris(pH6.8) 0.25
10％SDS 0.1 10％SDS 0.02
10％APS 0.1 10％APS 0.02
TEMED 0.006 TEMED 0.002
(4)转膜：将切好的硝酸纤维素膜、海绵垫、转印滤纸置于转膜液中浸湿。 将转膜夹子打开使黑面水平朝上，依次放入海绵垫、双层滤纸、分离胶、硝酸 纤维素膜、双层滤纸和海绵垫，闭合转膜夹子，此过程在转膜液中进行，应注 意排除气泡。将制备好的“三明治”夹子放入转膜槽，倒入预冷的转膜液，用 200mA电流转膜1h。
(5)免疫反应：将膜转移到封闭液中，室温摇床上封闭约1h。根据说明书， 用封闭液将一抗稀释至适当浓度，将膜在4℃下孵育过夜。用 PBST(PBS+Tween-20)在室温下洗膜3次，每次10min。用封闭液稀释二抗并与 膜在室温下孵育1h后，用PBST在室温下洗膜3次，每次10min。
(6)检测：用ECL显色液显影，Image Lab 5.1软件呈像并计算条带灰度值。
4.3检测结果：
采用蛋白免疫印迹法验证5例退变椎间盘组织和3例正常椎间盘组织中血 红蛋白α、血红蛋白β和血管内皮标志物CD31的表达。如图4所示，血红蛋白α(图 4B)和血红蛋白β(图4C)在退变椎间盘组织中的表达均高于在正常椎间盘组织中 的表达。同时，血管内皮标志物CD31在两例退变椎间盘组织中显著高表达，而 在正常椎间盘中的表达量很低(图4D)。
实施例5：高血红蛋白与血红素含量与椎间盘退化的临床病理特征密切相 关
5.1检测样本：
术前MRI影像选取自3例行腰椎后路经椎间孔减压椎间植骨融合内固定术 患者及3例对照组。人椎间盘组织样品在手术后被迅速冲洗并保存于1.5mL的低 吸附冻存管中，置于液氮中储存待用。所有样品的使用均得到患者知情同意和 海军军医大学附属长征医院伦理委员会的批准。
5.2检测方法：
(1)根据患者术前腰椎MRI矢状面T2WI的信号改变，参照Pfirrmann分级标 准进行柞间盘退变程度分级，并与相对应的血红蛋白和辅基血红素的 MALDI-TOF MS结果进行对比分析。1级，髓核结构均一，与纤维环界限清晰， 信号强度与脑脊液相当，椎间隙高度正常；2级，髓核结构不均，有水平低信 号带，与纤维环界限清晰，信号强度与脑脊液相当，椎间隙高度正常；3级， 髓核结构不均，与纤维环界限不清，信号强度减低，椎间隙高度轻度降低；4 级，髓核结构不均，与纤维环界限丢失，信号强度减低呈灰黑色，椎间隙高度 降低。
(2)椎间盘组织总蛋白提取：取50mg冷冻组织，经去离子水冲洗后切碎放入 EP管内，按10μL/mg比例加入RIPA裂解液(含1％PMSF)。加入1颗研磨珠于匀浆 管中，经过组织研磨仪(wonbio-48R)在60Hz下研磨45s后，置于4℃下裂解30min， 然后在4℃下12000g离心15min，取上清，并-80℃保存。
(3)蛋白提取液的分析前处理：以芥子酸(sinapinic acid)(10mg/ml)作为 MALDI基质。待测蛋白样品与基质以1:40比例混匀后，取1.5μL点在不锈钢板上。 室温下风干后进入离子源进行MALDI-TOF MS分析。
(4)MALDI-TOF MS分析：本发明所有质谱图均由axima performance, shimadzubiotech lauchpad MALDI-TOF MS采集，配备ND:YAG 337nm激光源。 加速电压20kV，激光频率10Hz。对于血红蛋白的分析，操作模式为HM3线性模 式，power:130,profiles:100persample,shots:2。由胎牛血清白蛋白纯品进行 质量校正。对于血红素的分析，操作模式为reflectron模式，power:60,profiles: 100per sample,shots:2。
5.3检测结果：
通过患者术前腰椎MRI影像与相对应的血红蛋白和辅基血红素的 MALDI-TOF MS信号进行对比分析发现，血红蛋白及血红素含量与椎间盘退 化的Pfirrmann分级正相关，提示高血红蛋白与血红素含量与椎间盘退化的临床 病理特征密切相关。
基于此，血红蛋白及其辅基血红素有作为分析退变椎间盘组织内是否有微 血管生成的潜力，从而为椎间盘退化的机制研究提供一定的指标。
讨论
迄今为止，在本领域内，椎间盘中的微血管形成检测存在相当的困难。目 前医学研究领域针对组织中微血管形成的分析方法存在操作过程复杂、耗时、样本 需求量大等缺点，如蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法。
质谱(mass spectrometry)是一种分析质量的仪器，可以鉴定出分子种类及进行定量分析。其中，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)具有快速、 准确、耗时少和自动化操作等优点，是分析蛋白质和多肽等生物大分子的有力工具。 然而，基于MALDI-TOF MS的蛋白质分析技术并没有被广泛应用于临床相关的蛋 白质检测和疾病的诊断中。
不同于血管丰富的肿瘤组织，退化椎间盘内只是局部微血管生成，血管化 肉芽组织自突出椎间盘处由内向外生长，这就需要在切片时对血管生成区域进 行定位。对于新发血管化肉芽组织的突出椎间盘来说，组织切片几乎难以准确 获取血管区域，这极大的影响了研究结果的可靠性。例如，通过组织学染色的 方法，有研究者在101例重度LDH患者完全退化脱出的椎间盘组织中只观察 到57例样本有血管生成(约56.4％)。这一结果可能是由于分析方法的局限性 造成的。另外，受限于研究人员的技术原因，容易导致所取材的微血管结构破 坏，使染色结果不均匀一致。
因此，在本发明中，考虑是否能通过寻找退变椎间盘内与血管生成相关的 生物标志物来预测这一病理改变。
经过大量的筛选，本发明人发现了血红蛋白和血红素这两个重要的生物标 志物，并且基于MALDI-TOF MS技术，可以用来诊断椎间盘退行性疾病或者 判断患者对椎间盘退行性疾病的易感性。
另外，特别值得注意的是，本发明是首次发现了血红蛋白和血红素的含量 与椎间盘的临床病理分级的密切相关性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种生物标志物集合的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于：(I)评估待测对象的椎间盘退行性疾病的患病风险，和/或(II)待测对象的椎间盘退行性疾病的诊断；
其中，所述的集合中包括选自下组的生物标志物：血红蛋白、辅基血红素，或其组合。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于：
(i)检测待测对象的椎间盘组织微血管生成；
(ii)诊断待测对象的椎间盘退变；和/或
(iii)对椎间盘退行性疾病的临床病理分级鉴定。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物标志物集合还包括：血管内皮标志物；优选地，所述的血管内皮标志物为CD31。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的评估或检测包括步骤：
(a)提供一来源于待测对象的待测样品，对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；和
(b)将步骤(a)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较。
5.一种用于椎间盘退行性疾病的评估或诊断的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括用于检测选自下组的生物标志物的试剂：血红蛋白、辅基血红素，或其组合。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求5所述的试剂组合。
7.一种椎间盘退行性疾病的患病风险评估或诊断系统，其特征在于，所述系统包括：
(a)样品输入模块，所述样品输入模块用于输入来自于待测对象的样品；
(b)检测模块，所述检测模块用于检测所述样品输入模块中所输入的样品中的生物标志物集合中各生物标志物的水平，所述的集合中包括选自下组的生物标志物：血红蛋白、辅基血红素，或其组合；
(c)分析模块；和
(d)输出模块。
8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述的待测对象是年龄为≥18岁的人。
9.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述检测模块包括基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)。
10.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述分析模块中含有一参考数据集或一参考值，所述参考数据集或参考值来源于健康对照者中所测得的所述集合中的各生物标志物的参考值，或来源于正常椎间盘组织中所测得的所述集合中的各生物标志物的参考值。
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