CN102348715A - 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含连接到延伸重组多肽(XTEN)的生物活性蛋白质的组合物、编码该组合物的分离的核酸和含有该核酸的载体和宿主细胞，以及使用这些组合物治疗葡萄糖相关疾病、代谢疾病、凝血障碍和生长激素相关障碍和病症的方法。

Description

延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
关于联邦资助研究的声明
本发明是在国立卫生研究院资助的SBIR基金2R44GM079873-02下由政府支持完成的。政府在本发明中享有一定的权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年2月3日提交的序号为61/149,669的美国临时申请、2009年6月8日提交的61/268,193、2009年6月8日提交的61/185,112、2009年8月24日提交的61/236,493、2009年8月25日提交的61/236,836、2009年9月18日提交的61/243,707、2009年9月24日提交的61/245,490、2009年11月10日提交的61/280,955、2009年11月10日提交的61/280,956和2009年11月12日提交的61/281,109的优先权，以上申请都是未决的，在此全文引入作为参考。
发明背景
生物活性蛋白质，包括作为治疗剂的那些，一般是不稳定的分子，表现出短的储存期，特别是当配制在水溶液中时。另外，许多生物活性肽和蛋白质具有有限的溶解度，或者在重组生产过程中聚集，需要复杂的溶解和重折叠过程。多种化学聚合物可以连接到这些蛋白质上以改变其性质。特别有意义的是具有柔性构象并且在水溶液中良好水合的亲水性聚合物。一种常用的聚合物是聚乙二醇(PEG)。这些聚合物常常具有相对于它们的分子量较大的水动力学半径(Kubetzko，S.等人，(2005)MolPharmacol，68：1439-54)，并且可能导致增强的药代动力学性质。根据连接点，聚合物常常具有有限的与它们所连接的蛋白质之间的相互作用，使得该聚合物修饰的蛋白质保持其相关功能。然而，聚合物与蛋白质的化学偶联需要复杂的多步过程。通常，需要在化学偶联步骤之前产生和纯化蛋白质成分。另外，偶联步骤可能导致形成不均一的产物混合物，它们需要分离，因此导致明显的产物损失。或者，这些混合物可以用作最终药物产品，但是难以标准化。一些例子是目前已在销售的作为混合物使用的PEG化干扰素-α产品(Wang，B.L.等人，(1998)J SubmicroscCytol Pathol，30：503-9；Dhalluin，C.等人，(2005)Bioconjug Chem，16：504-17)。这样的混合物难以可重复地生产和表征，因为它们含有治疗活性降低或缺失的异构体。
白蛋白和免疫球蛋白片段如Fc区已经用于偶联其它生物活性蛋白质，但在半衰期或免疫原性提高方面具有不可预测的结果。遗憾的是，Fc域在重组表达过程中不能有效折叠，并且倾向于形成被称为包涵体的不可溶沉淀物。这些包涵体必须被溶解，功能性蛋白质必须复性。这是一个耗时的、低效的、昂贵的过程，需要额外的生产步骤和通常复杂的纯化操作。
因此，仍然非常需要能够提高生物活性蛋白质的生物学、药理学、安全性和/或药学性质的组合物和方法。
发明内容
本发明涉及能够用于提高生物活性蛋白质的生物学、药学、安全性和/或治疗性质的组合物和方法。该组合物和方法特别可用于提高药代动力学性质，如半衰期，延长生物活性蛋白质治疗窗内停留的时间，以及简化这种生物活性蛋白质的生产过程和药学性质，如溶解性。
部分上，本发明涉及包含融合蛋白的药物组合物及其在治疗疾病、障碍或病症中的应用。可以治疗的具体的疾病取决于生物活性蛋白质的选择。在一些实施方案中，组合物和方法可用于治疗代谢和心血管疾病(包括但不限于葡萄糖或胰岛素相关疾病)、凝血和出血障碍以及生长激素相关的障碍。
在一方面，本发明提供延伸重组多肽(XTEN)的组合物，当延伸重组多肽连接到生物活性蛋白质时提高药代动力学性质，和/或提高得到的融合蛋白的溶解性和稳定性，同时保持或提高生物活性蛋白质的总体生物和/或治疗活性。这样的组合物可以用于治疗某些疾病、障碍或病症，如本文所述。得到的融合蛋白可以表现出更好的安全性性质，并且允许频率较低的给药，这又导致了更好的患者依从性。本发明也提供了编码XTEN和与XTEN连接的生物活性蛋白质的融合蛋白的多核苷酸，以及与编码XTEN和与XTEN连接的生物活性蛋白质的融合蛋白的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一方面，本发明提供延伸重组多肽(XTEN)的组合物，该XTEN可用作能够连接到生物活性蛋白质(BP)从而产生单体BPXTEN融合蛋白的融合配偶体。
在一个实施方案中，本发明提供分离的延伸重组多肽(XTEN)，其包含超过大约400至大约3000个氨基酸残基，其中该XTEN的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和占XTEN总氨基酸序列的超过大约80％、或大约85％、或大约90％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％，XTEN序列基本是非重复的，当通过TEPITOPE算法分析时XTEN序列缺乏预测的T细胞表位，其中对XTEN序列内表位的TEPITOPE算法预测是基于-5或-6或-7或-8或-9或以上的得分，通过GOR算法确定，该XTEN序列具有大于90％、或大于91％、或大于92％、或大于93％、或大于94％、或大于95％、或大于96％、或大于96％、或大于98％、或大于99％的无规卷曲形成，通过Chou-Fasman算法确定，该XTEN序列具有低于2％的α螺旋和低于2％的β-折叠。
在另一实施方案中，本发明提供包含超过大约400至大约3000个氨基酸残基的XTEN，其中该XTEN的特征在于天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和低于XTEN总氨基酸序列的10％，甲硫氨酸和色氨酸残基的总和低于XTEN总氨基酸序列的2％，该XTEN序列具有低于5％的带正电荷的氨基酸残基，通过GOR算法确定，该XTEN序列具有大于90％的无规卷曲形成，通过Chou-Fasman算法确定，该XTEN序列具有低于2％的α螺旋和低于2％的β-折叠。
在另一实施方案中，本发明提供包含超过大约400至大约3000个氨基酸残基的XTEN，其中该XTEN的特征在于XTEN序列的至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约91％、或至少大约92％、或至少大约93％、或至少大约94％、或至少大约95％、或至少大约96％、或至少大约97％、或至少大约98％、或至少大约99％由非重叠基序组成，其中每个基序具有大约9至大约14个氨基酸残基，并且其中在每个基序中任两个连续氨基酸残基的序列不出现超过两次，该基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸组成，XTEN当连接到生物活性蛋白质时增强生物活性蛋白质的药代动力学性质，其中药代动力学性质通过测定施用于受试者的生物活性蛋白质的终末半衰期并与连接到生物活性蛋白质并以相当的剂量施用于受试者的XTEN比较来确定。
在上述实施方案的一些情况中，没有一种类型的氨基酸占XTEN序列的30％以上。在上述实施方案的其它情况中，XTEN可具有这样一种序列，其中没有三个连续氨基酸是相同的，除非该氨基酸是丝氨酸，在这种情况中不超过3个连续氨基酸是丝氨酸。在上述实施方案的其它情况中，XTEN序列具有小于10或9或8或7或6的亚序列得分。在上述实施方案的另外其它的情况中，XTEN序列的至少大约80％、或大约90％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％或100％由非重叠基序组成，其中每个基序具有12个氨基酸残基。在一个实施方案中，XTEN序列由非重叠基序组成，其中该基序来自表1的一个或多个序列。
在一些实施方案中，所得融合蛋白的增强的药代动力学性质包括终末半衰期提高至至少大约2倍、或至少大约3倍、或至少大约4倍、或至少大约5倍、或至少大约6倍、或至少大约8倍、或至少大约10倍。在一些情况中，以下事实反映了增强的药代动力学性质：融合蛋白在治疗窗内保持给定期限的血液浓度是未连接到XTEN的相应BP的至少大约2倍、或至少大约3倍、或至少大约4倍、或至少大约5倍、或至少大约6倍、或至少大约8倍、或至少大约10倍。半衰期和治疗窗内经历时间的延长可允许与未连接到XTEN的相应BP相比较频率较低的给药和降低的施用于受试者的融合蛋白量(摩尔当量)。在一个实施方案中，治疗有效剂量方案导致与利用相当的剂量方案施用于受试者的、未连接到融合蛋白的相应BP相比，融合蛋白血液水平的至少两个连续Cmax波峰和/或Cmin波谷之间的时间增加至至少2倍或至少3倍或至少4倍或至少5倍或至少6倍或至少8倍或至少10倍。
在一个实施方案中，XTEN的至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％或大约99％包含选自表1的一个或多个序列的基序。在另一实施方案中，XTEN表现出与选自表2的序列有至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约91％、或至少大约92％、或至少大约93％、或至少大约94％、或至少大约95％、或至少大约96％、或至少大约97％、或至少大约98％、或至少大约99％或100％的序列同一性。
在一些情况中，XTEN当连接到生物活性蛋白质时增强了生物活性蛋白质的热稳定性，其中通过测定生物活性蛋白质暴露于大约37℃的温度至少大约7天后保持的生物活性并与连接到生物活性蛋白质的XTEN相比较来确定热稳定性。在上述一个实施方案中，生物活性的保持相比包含XTEN、未连接到XTEN的BP提高至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约100％、或大约150％、至少大约200％、至少大约300％、或大约500％。
在另一方面，本发明提供一种分离的融合蛋白，其包含连接到生物活性蛋白质(BP)的上述任一实施方案的XTEN。在一些实施方案中，融合蛋白的BP表现出与选自表3、表4、表5、表6、表7和表8的序列至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约91％、或至少大约92％、或至少大约93％、或至少大约94％、或至少大约95％、或至少大约96％、或至少大约97％、或至少大约98％、或至少大约99％或100％的序列同一性。在上述的另一实施方案中，分离的融合蛋白进一步包含第二XTEN序列，其中该XTEN序列中的氨基酸残基的累积总数大于大约400至大约3000个残基。
在一些情况中，分离的具有上述实施方案之一的XTEN的融合蛋白包含BP，其中BP是一种葡萄糖调节肽。在上述的一个实施方案中，葡萄糖调节肽是毒蜥外泌肽-4(exendin-4)。在上述的一个实施方案中，葡萄糖调节肽是胰高血糖素。
在其它情况中，分离的融合蛋白包含BP，其中BP是一种代谢蛋白质。在上述的一个实施方案中，代谢蛋白质是IL-1ra。
在另外其它情况中，分离的融合蛋白包含BP，其中BP是凝血因子。在上述的一个实施方案中，凝血因子是因子IX。在上述的一个实施方案中，凝血因子是因子VII。
在其它情况中，分离的融合蛋白包含BP，其中BP是一种生长激素。
在一个实施方案中，分离的融合蛋白与未连接到XTEN的生物活性蛋白质相比可以具有较低的免疫原性，其中通过在给受试者施用相当剂量后测定选择性结合生物活性蛋白质的IgG抗体的产生确定免疫原性。
包含上述实施方案的XTEN和BP的融合蛋白可以在BP和XTEN之间包含间隔区序列，其中该间隔区序列包含大约1至大约50个氨基酸残基，任选地包含切割序列。在一个实施方案中，该切割序列易于被蛋白酶切割。这样的蛋白酶的非限制性例子包括FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa、FIXa、FXa、凝血酶、弹性蛋白酶-2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20、TEV、肠激酶、鼻病毒3C蛋白酶和分选酶A。
在一些情况中，分离的融合蛋白构建为与未连接到融合蛋白的相应BP相比，具有降低的对相应BP的靶受体的结合亲和力。在一个实施方案中，融合蛋白表现出与BP的靶受体的结合，其范围为未连接到融合蛋白的相应BP的结合能力的大约0.01％-30％、或大约0.1％至大约20％、或大约1％至大约15％、或大约2％至大约10％。在相关实施方案中，具有降低的亲和力的融合蛋白可能具有降低的受体介导的清除和相应的半衰期延长，与未连接融合蛋白的相应BP相比延长至少大约50％、或至少大约60％、或至少大约70％、或至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约100％、或至少大约150％、或至少大约200％、或至少大约300％、或至少大约500％。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，其表现出与选自表40、表41、表42、表43和表44的序列至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约91％、或至少大约92％、或至少大约93％、或至少大约94％、或至少大约95％、或至少大约96％、或至少大约97％、或至少大约98％、或至少大约99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明提供包含融合蛋白的组合物，其中该融合蛋白包含至少第一BP，该BP包含显示与表3-8任一的序列具有至少大约80％的序列同一性或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列，其中BP连接到一个或多个延伸重组多肽(XTEN)，每个XTEN包含超过大约100至大约3000个氨基酸残基，更优选地超过大约400至大约3000个氨基酸残基，具有基本非重复的序列，其中甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和占XTEN总氨基酸序列的超过大约80％、或大约85％、或大约90％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％。当通过TEPITOPE算法分析时，BPXTEN的XTEN成分可能缺乏预测的T细胞表位，其中对XTEN序列内表位的TEPITOPE算法预测基于-7或更高、或-8或更高、或-9或更高的得分。如通过GOR算法确定的，BPXTEN的XTEN成分可能具有含有超过80％、或大约85％、或大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％的无规卷曲形成的序列；并且通过Chou-Fasman算法确定，该XTEN序列可能具有少于2％的α螺旋和少于2％的β折叠。
在一些实施方案中，本发明提供BPXTEN融合蛋白，其中与未连接到融合蛋白的相应BP相比，向受试者施用的BPXTEN显示BPXTEN终末半衰期延长至至少大约2倍、或至少大约3倍、或至少大约4倍、或至少大约5倍、或至少大约6倍、或至少大约7倍、或至少大约8倍、或至少大约9倍、或至少大约10倍、或至少大约15倍或至少20倍或更多倍。
在一些实施方案中，本发明提供BPXTEN融合蛋白，其中与未连接到融合蛋白的BP相比，BPXTEN显示在生理条件下溶解度提高至至少3倍、或至少大约4倍、或至少大约5倍、或至少大约6倍、或至少大约7倍、或至少大约8倍、或至少大约9倍、或至少大约10倍、或至少大约15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。
在一些实施方案中，如通过尺寸排阻色谱法确定的，BPXTEN融合蛋白显示表观分子量比实际分子量增加，其中表观分子量为至少大约100kD、或至少大约150kD、或至少大约200kD、或至少大约300kD、或至少大约400kD、或至少大约500kD、或至少大约600kD、或至少大约700kD，而融合蛋白的每个BP成分的实际分子量小于大约25kD。因此，BPXTEN融合蛋白的表观分子量可以为融合蛋白的实际分子量的大约4倍、或大约5倍、或大约6倍、或大约7倍、或大约8倍。在一些情况中，上述实施方案的分离的融合蛋白在生理条件下显示大于大约4、或大约5、或大约6、或大约7、或大约8的表观分子量因数。
本发明提供多种结构的BPXTEN，其中BP至少保留未连接到XTEN的相应BP的一部分生物活性。在一个实施方案中，BPXTEN包含式I结构的连接到XTEN的BP：
(BP)-(S)x-(XTEN)    I
其中对于每次出现独立地，BP是如上所述的生物活性蛋白质；S是间隔序列，具有1至大约50个氨基酸残基，可能任选地包括切割序列(如上所述)；x是0或1；且XTEN是延伸重组多肽(如本文所述)。该实施方案具有特定应用，其中BP的希望的生物活性需要游离的N末端，或者其中BP的C末端与融合蛋白的连接降低了生物活性，并且希望降低施用的BPXTEN的生物活性和/或副作用。
在BPXTEN结构的另一个实施方案中，本发明提供一种式II结构的融合蛋白(如上所述的成分)：
(XTEN)-(S)x-(BP)    II
在BP的希望的生物活性需要游离的C末端，或者其中BP的N末端与融合蛋白的连接降低了生物活性，并且希望降低施用的BPXTEN的生物活性和/或副作用的情况下，该实施方案特别有用。
在另一方面，本发明提供分离的BPXTEN融合蛋白，其包含两个BP分子，并且任选地包含第二XTEN和/或间隔序列，其中该融合蛋白具有选自式III、式IV和式V的结构：
(BP)-(S)w-(XTEN)-(S)x-(BP)-(S)y-(XTEN)z    III
(XTEN)-(S)w-(BP)-(S)x-(XTEN)y-(BP)    IV
(BP)-(S)x-(BP)-(S)y-(XTEN)            V
其中对于每次出现独立地，BP是一种如本文以上所述的生物活性蛋白质，S是间隔序列，具有1至大约50个氨基酸残基，可能任选地包含切割序列；w是0或1；x是0或1；y是0或1；z是0或1；且XTEN是延伸重组多肽(如本文所述)，其中XTEN氨基酸残基的累计总数大于400至大约3000。
在另一方面，本发明提供分离的融合蛋白，其包含一个BP分子和两个XTEN分子，和任选的一个或两个间隔序列，其中该融合蛋白如式VI所示：
(XTEN)-(S)x-(BP)-(S)y-(XTEN)  VI
其中对于每次出现独立地，BP是一种生物活性蛋白质，S是间隔序列，具有1至大约50个氨基酸残基，任选地包含切割序列；w是0或1；x是0或1；y是0或1；z是0或1；且XTEN是延伸重组多肽(如本文所述)，其中XTEN氨基酸残基的累计总数大于400至大约3000。
因此，融合蛋白可以设计为具有不同的BP、XTEN和任选的间隔序列的N至C末端结构，包括但不限于XTEN-BP、BP-XTEN、XTEN-S-BP、BP-S-XTEN、XTEN-BP-XTEN、BP-BP-XTEN、XTEN-BP-BP、BP-S-BP-XTEN和XTEN-BP-S-BP。如本文公开的，结构的选择可以提供特别的药代动力学、物理/化学性质或药理学性质。
在一个实施方案中，与未连接到融合蛋白的BP相比，上述式I、II、III、IV或V或VI的BPXTEN融合蛋白显示至少大约40％、或至少大约50％、或至少大约60％、或至少大约70％、或至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约95％的生物活性。在另一实施方案中，式I、II、III、IV或V的BPXTEN融合蛋白与未共价连接到融合蛋白的相应的亲本生物活性蛋白质结合相同的受体或配体。
本发明提供分离的核酸，其包含选自以下的多核苷酸序列：(a)编码上述任一实施方案的融合蛋白的多核苷酸，或(b)(a)的多核苷酸的互补序列。在上述的一个实施方案中，分离的核酸包含与以下序列具有至少80％的序列同一性、或大约85％、或至少大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％至大约100％的序列同一性的多核苷酸序列：(a)编码选自表40、表41、表42、表43和表44的多肽的多核苷酸序列；或(b)(a)的多核苷酸的互补序列。本发明提供包含本段以上所述任一实施方案的核酸的表达载体。在一个实施方案中，上述表达载体进一步包含任选地连接到多核苷酸序列的重组调节序列。在另一实施方案中，上述表达载体的多核苷酸序列与编码分泌信号序列的多核苷酸符合读框地融合，该信号序列可以是原核信号序列。在一个实施方案中，分泌信号序列选自OmpA、DsbA和PhoA信号序列。
本发明提供一种宿主细胞，它可以包含上段公开的表达载体。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在另一实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。
在一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含上述任一实施方案的融合蛋白和至少一种药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供试剂盒，其包括包装材料和包含上述实施方案的药物组合物的至少第一容器，和标识药物组合物和贮存和处理条件的标签，和用于重配和/或向受试者施用该药物组合物的说明书。
本发明进一步提供包含上述任一实施方案的融合蛋白的药物组合物在制备用于治疗需要的受试者的疾病的药物中的用途。在上述的一个实施方案中，治疗疾病、障碍或病症包括将上述药物组合物施用于需要的受试者。在上述的一个实施方案中，疾病、障碍或病症选自1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖症、高血糖症、超高胰岛素血症、胰岛素产生减少、胰岛素抗性、综合征X、冬眠心肌或糖尿病性心肌病、食欲过盛、饱感不足、代谢紊乱、胰高血糖素瘤、多囊卵巢综合征、血脂异常、冬眠心肌、尿钠排出不足、尿钾浓度过高、与中毒性血容量过多有关的病症或障碍、糖尿病性心肌病和视网膜神经变性过程。在有些情况中，药物组合物可以皮下、肌肉内或静脉内施用。在一个实施方案中，药物组合物以治疗有效剂量施用。在上述的一些情况中，治疗有效剂量导致，与以相当的剂量向受试者施用的未连接到融合蛋白的该融合蛋白的相应BP相比，该融合蛋白在治疗窗内经历的时间增加。治疗窗内经历的时间增加可以是未连接到融合蛋白的相应BP的至少3倍，或者是未连接到融合蛋白的相应BP的至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍或至少10倍或至少20倍。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗疾病、障碍或病症的方法，包括采用使用治疗有效剂量方案施用的药物组合物的多个连续剂量，向受试者施用上述药物组合物。在上述的一个实施方案中，治疗有效剂量方案可以导致对于融合蛋白的血液水平，与以相当的剂量方案向受试者施用的未连接到融合蛋白的该融合蛋白的相应BP相比，至少两个连续Cmax波峰和/或Cmin波谷之间的时间延长至至少3倍，或者至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍。在上述的另一个实施方案中，该融合蛋白的施用导致与使用治疗有效方案施用于受试者的未连接到融合蛋白的相应生物活性蛋白质成分相比，使用较低给药频率或较低总剂量摩尔数的该药物组合物的融合蛋白获得至少一个测量参数的可比的改善。该参数可以选自空腹血糖水平、对口服葡萄糖耐量试验的反应、餐后葡萄糖相对于基线的峰值变化、HA1c、热摄取、饱感、胃排空速率、胰岛素分泌、外周胰岛素敏感度、对胰岛素攻击的反应、β细胞量、体重、凝血酶原时间、出血时间、凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)、D-二聚体、出血发生、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白、骨密度、肌肉质量、血压、血浆甘油三酯、HDL、胆固醇、LDL胆固醇、咽峡炎发病和心输出量。
在另一方面，本发明提供一种改善生物活性蛋白质的性质的方法，包括将生物活性蛋白质连接到上述任一实施方案的XTEN以实现一种性质的步骤，该性质的特征在于(a)连接到XTEN的生物活性蛋白质的终末半衰期比未连接到XTEN的生物活性蛋白质的终末半衰期长；(b)连接到XTEN的生物活性蛋白质的贮存期比未连接到XTEN的生物活性蛋白质的贮存期长，其中贮存期通过一定时间间隔后与基线样品相比生物活性的保留来确定；(c)连接到XTEN的生物活性蛋白质在生理条件下的溶解度比未连接到XTEN的生物活性蛋白质的溶解度提高；(d)当施用于受试者时选择性结合连接到XTEN的生物活性蛋白质的IgG抗体的产生比当以相当的剂量向受试者施用未连接到XTEN的生物活性蛋白质时IgG的产生减少；和/或(e)连接到XTEN的生物活性蛋白质当施用于受试者时在治疗窗内经历的时间比未连接到XTEN的生物活性蛋白质施用于受试者时的时间长。
参考引用
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均在此引用作为参考，如同每一单独的出版物、专利和专利申请具体且分别地在此引用作为参考。
附图说明
本发明的特征和优点可以参考以下详细说明和阐述说明性实施方案的附图进一步解释。
图1显示示例性BPXTEN融合蛋白的图示(图1A-G)，均以N至C末端的方向显示。图1A显示BPXTEN融合蛋白(100)的两种不同的结构，每个结构包含一个生物活性蛋白质(BP)和一个XTEN，其中第一个具有连接到BP(103)的C末端的XTEN分子(102)，其中第二个具有连接到BP(103)的N末端的XTEN分子。图1B显示BPXTEN融合蛋白(100)的两种不同的结构，每一个包含一个BP、间隔序列和XTEN，其中第一个具有连接到间隔序列(104)的C末端的XTEN分子(102)和连接到BP(103)的C末端的间隔序列，其中第二个具有具有连接到间隔序列(104)的N末端的XTEN分子和连接到BP(103)的N末端的间隔序列。图1C显示BPXTEN融合蛋白(101)的两种不同的结构，每个包含一种BP的两个分子和一个XTEN分子，其中第一个具有连接到第一BP的C末端的XTEN，第一BP连接到第二BP的C末端，其中第二个为相反方向，其中XTEN连接到第一BP的N末端，第一BP连接到第二BP的N末端。图1D显示BPXTEN融合蛋白(101)的两种不同的结构，每个包含一种BP的两个分子、间隔序列和一个XTEN分子，其中第一个具有连接到间隔序列的C末端的XTEN，和连接到第一BP的C末端的间隔序列，该第一BP连接到第二BP的C末端，其中第二个为相反方向，其中XTEN连接到间隔序列的N末端，间隔序列连接到第一BP的N末端，该第一BP连接到第二BP的N末端。图1E显示BPXTEN融合蛋白(101)的两种不同的结构，每一个包含一种BP的两个分子、间隔序列和一个XTEN分子，其中第一个具有连接到第一BP的C末端的XTEN和连接到间隔序列C末端的第一BP，该间隔序列连接到第二BP分子的C末端，其中第二个为相反结构，为连接到第一BP的N末端的XTEN，第一BP连接到间隔序列的N末端，间隔序列又连接到第二BP分子的N末端。图1F显示BPXTEN融合蛋白(105)的两种不同的结构，每个包含一种BP的两个分子、两个XTEN分子，其中第一个具有连接到第一BP的C末端的第一XTEN，第一BP连接到第二XTEN的C末端，第二XTEN连接到第二BP分子的C末端，其中第二个为相反结构，为连接到第一BP的N末端的XTEN，第一BP连接到第二XTEN的N末端，第二XTEN连接到第二BP的N末端。图1G显示在BP的N末端和C末端连接到两个XTEN的一个BP的结构(106)。
图2是BPXTEN基因的示例性多核苷酸构建体的示意图(图2A-G)，该基因编码图1的相应BPXTEN多肽；它们全都以5’至3’方向显示。在这些说明性的实例中，基因编码BPXTEN融合蛋白，该融合蛋白具有一个BP和XTEN(100)；或两个BP、一个间隔序列和一个XTEN(201)；两个BP和两个XTEN(205)；或一个BP和两个XTEN(206)。这些图示中，多核苷酸编码下列成分：XTEN(202)，BP(203)，和可能包括切割序列(204)的间隔氨基酸，所有序列均符合读框地连接。
图3是被可以内源性获得的蛋白酶作用的示例性单体BPXTEN，以及单体融合蛋白或反应产物结合细胞表面的靶受体的能力，以及随后的细胞信号发生的图示。图3A显示BPXTEN融合蛋白(101)，其中BP(103)和XTEN(102)被含有可切割序列(104)的间隔序列连接，可切割序列(104)对MMP-13蛋白酶(105)敏感。图3B显示游离BP、间隔序列和XTEN的反应产物。图3C显示反应产物游离BP(103)或BPXTEN融合蛋白(101)与细胞表面(107)上BP的靶受体(106)的相互作用。在此情况下，当BP具有游离C末端时表现出希望的与受体的结合，这得到以下事实的证实：游离BP(103)与受体结合，而未切割的融合蛋白不与该受体紧密结合。图3D显示具有高结合亲和力的游离BP(103)保持结合受体(106)，而完整的BPXTEN(101)从受体上释放。图3E显示结合的BP已经被内化到细胞(107)内的内体(108)，说明受体介导的结合的BP的清除以及引发细胞信号传导(109)，描绘为斑点状的细胞质。
图4是XTEN装配、生产和评价的典型步骤的示意流程图。
图5是编码融合蛋白的BP-XTEN多核苷酸构建体装配中的典型步骤的示意流程图。各寡核苷酸501与基序502如12氨基酸基序(“12-mer”)退火，随后与含有BbsI和KpnI限制酶切位点503的寡核苷酸连接。来自文库的另外的基序与12-mer退火，直到达到XTEN基因504的希望的长度。将XTEN基因克隆到填充载体中。该载体编码标志序列506，其后为终止序列，终止序列的侧翼为BsaI、BbsI和KpnI位点507和毒蜥外泌肽-4基因508，产生用于引入BPXTEN组合中的编码BP-XTEN融合体的基因500。
图6是编码包含生物活性蛋白质(BP)和XTEN的融合蛋白的基因的装配、其作为融合蛋白的表达和回收及其作为候选BPXTEN产物的评价中的典型步骤的示意流程图。
图7是使用不同加工策略的IL-1raXTEN表达载体设计的图示。图7A显示一种表达载体，其编码融合到编码生物活性蛋白质IL-1ra的序列的3’端的XTEN。注意该载体中不需要另外的前导序列。图7B显示一种表达载体，其编码融合到编码IL-1ra的序列的5’端的XTEN，具有CBD前导序列和TEV蛋白酶位点。图7C显示如图7B所示的表达载体，其中CBD和TEV加工位点已经被替换为优化的N末端前导序列(NTS)。图7D显示一种表达载体，其编码NTS序列、XTEN、编码IL-1ra的序列，以及编码XTEN的第二序列。
图8显示包含GFP和XTEN序列的所示构建体的表达试验的结果。使用荧光读板器(激发395nm，发射510nm)测定了表达培养物，以确定存在的GFP报道分子的量。绘制为方框和须状图的结果表明，与“基准”CBD N末端辅助域相比，表达水平中值大约为表达水平的一半，但是来自该文库的最佳克隆更接近于基准，表明在该序列周围进一步优化是合理的。结果也表明开始于氨基酸MA的文库比开始于ME的文库具有更好的表达水平(见实施例14)。
图9显示三个随机化文库，其用于来自LCW546、LCW547和LCW552的克隆的N末端序列中的第三和第四密码子。文库设计为第三和第四残基修饰，使得允许的XTEN密码子的所有组合存在于这些位置，如图所示。为了使每个文库包括所有允许的XTEN密码子，设计了9对寡核苷酸，它们编码第三和第四残基具有密码子多样性的12氨基酸，退火，并连接到NdeI/BsaI限制酶消化的填充载体pCW0551(Stuffer-XTEN_AM875-GFP)，并转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，以获得三个文库LCW0569(SEQ ID NOS 1,708和1,709)、LCW0570(SEQ ID NOS 1,710和1,711)和LCW0571(SEQ ID NOS 1,712和1,713)的菌落。
图10显示在如实施例15所述的优化步骤后，相对于基准CBD_AM875构建体，对前75个克隆的GFP荧光信号进行重新检测的直方图。结果表明几个克隆优于基准克隆，如图10所示。
图11是为了对N末端48个氨基酸的两个区域进行密码子优化偏好统一而进行的组合方法的图示。该方法在XTEN蛋白的N末端产生新的48mers，用于评价产生前导序列的表达的优化，这可能是其中XTEN位于BP的N末端的XTEN蛋白的表达方案。
图12显示SDS-PAGE凝胶，证实了从XTEN N末端密码子优化实验获得的优选克隆的表达，与在构建体序列的N末端含有CBD前导序列的基准XTEN克隆比较。
图13显示来自稳定性研究的样品的SDS-PAGE凝胶，其研究融合到GFP的N末端的XTEN_AE864的融合蛋白(见实施例21)。GFP-XTEN在食蟹猴血浆和大鼠肾裂解物中37℃孵育最多7天。另外，也评价了施用于食蟹猴的GFP-XTEN。在第0、1、7天采集样品，通过SDS PAGE分析，然后利用Western分析并用抗GFP抗体检测。
图14显示连接到XTEN_AE864的IL-1ra的2和10mcg最终纯化蛋白质的两个样品，如实施例23所述。结果显示通过所述方法回收IL-1raXTEN组合物，近似MW为大约160kDa。
图15显示如实施例23所述进行的代表性尺寸排阻色谱法分析的输出。校准标准以虚线显示，包括标准甲状腺球蛋白(670kDa)、牛γ-球蛋白(158kDa)、鸡卵白蛋白(44kDa)、马肌球蛋白(17kDa)和维生素B12(1.35kDa)。连接到XTEN_AM875的IL-1ra的BPXTEN成分融合蛋白显示为实线。数据表明BPXTEN构建体的表观分子量显著大于球形蛋白质的预期分子量(如通过在相同试验中与标准蛋白质比较显示)，并且表观分子量显著大于通过SDS-PAGE确定的分子量(数据未显示)。
图16显示IL-1ra_XTEN_AM875的反相C18分析。吸光度相对于时间的输出证明了终产物融合蛋白的纯度。
图17显示IL-1受体结合试验的结果，相对于IL-1ra-XTEN_AM875或IL-1ra浓度作图，产生结合等温线。为了估计每种融合蛋白对IL-1受体的结合亲和力，将结合数据与S形剂量-反应曲线拟合。从数据拟合确定每种构建体的EC50(信号为最大值一半时的IL-1ra或IL-1ra-XTEN的浓度)，如实施例23所述。阴性对照XTEN_hGH构建体显示在实验条件下没有结合。
图18显示热稳定性研究的SDS-PAGE，该研究比较了IL-1ra与连接到XTEN_AM875的IL-1ra的BPXTEN，如实施例23所述。IL-1ra和连接到XTEN的IL-1ra的样品在25℃和85℃孵育15分钟，此时通过离心快速除去任何不溶性蛋白质。然后通过SDS-PAGE分析可溶性级分，如图18所示，显示只有IL-1ra-XTEN在加热后保持可溶性，而相反，重组IL-1ra(不含作为融合配偶体的XTEN)在加热后完全沉淀。
图19显示对图19所示的样品进行的IL-1ra受体结合试验的结果。如实施例23所述，通过热处理完全变性的重组IL-1ra在热处理后保留小于0.1％的受体活性。然而，连接到XTEN的IL-1ra保留大约40％的受体结合活性。
图20显示连接到不同XTEN序列的IL-1ra的三种不同BPXTEN组合物在单次皮下剂量后的药代动力学分布(血浆浓度)，它们分别皮下施用于食蟹猴，如实施例24所述。
图21显示药效学和代谢研究的体重结果，该研究使用两种融合蛋白的组合，即连接到Y288的胰高血糖素(Gcg-XTEN)和连接到AE864的毒蜥外泌肽-4(Ex4-XTEN)，在饮食诱导的肥胖小鼠模型中研究联合有效性(实验细节参见实施例26)。该图显示饮食诱导的肥胖小鼠在28天连续给药期间的体重变化。所示数据为每组10只动物的平均值+/-SEM(安慰剂组为20只动物)。
图22显示来自药效学和代谢研究的空腹葡萄糖水平变化，该研究在饮食诱导的肥胖小鼠模型中使用单一和联合的两种BPXTEN融合蛋白，即连接到Y288的胰高血糖素(Gcg-XTEN)和连接到AE864的毒蜥外泌肽-4(Ex4-XTEN)(实验细节参见实施例26)。分组如下：组1Tris载体；组2Ex4-AE576，10mg/kg；组3Ex4-AE576，20mg/kg；组4载体，50％DMSO；组5艾塞那肽，30μg/kg/天；组6艾塞那肽，30uL/kg/天+Gcg-Y288 20μg/kg；组7Gcg-Y288，20μg/kg；组8Gcg-Y288，40μg/kg；组9Ex4-AE576 10mg/kg+Gcg-Y28820μg/kg；组10Gcg-Y288 40μg/kg+Ex4-AE576 20mg/kg。该图显示饮食诱导的肥胖小鼠在28天连续给药期间的空腹血液葡萄糖水平变化。所示数据为每组10只动物的平均值+/-SEM(安慰剂组为20只动物)。
图23显示连接到不同长度非组织多肽的GFP不同组合物单剂量给药后，食蟹猴中的药代动力学分布(血浆浓度)，该组合物皮下或静脉内施用，如实施例20所述。组合物为GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-Y576和XTEN_AD836-GFP。在注射后的不同时间分析血液样品，通过ELISA测定血浆中GFP的浓度，其中使用抗GFP的多克隆抗体用于捕获，使用同一多克隆抗体的生物素化制品用于检测。结果显示为相对于给药后时间(h)的血浆浓度，特别显示XTEN_AD836-GFP的半衰期大大延长，该组合物具有最长的XTEN序列长度。具有最短序列长度的构建体GFP-L288具有最短的半衰期。
图24显示Ex4-XTEN_AE864的近紫外圆二色谱，如实施例30所述进行。
图25显示通过皮下和静脉途径施用于食蟹猴的Ex4-AE864的药代动力学结果(实验细节参见实施例27)。
图26说明根据从四个动物种即小鼠、大鼠、食蟹猴和狗测定的结果预测人对Ex4-XTEN_AE864的反应的类比结果。图26A显示相对于体重的测定的终末半衰期，在人中预测的T1/2为139小时。图26B显示相对于体重的测定的药物清除率，在人中预测的清除率值为30ml/h。图26C显示相对于体重的测定的分布容量，在人中预测的值为5970ml。
图27显示胰高血糖素活性的体外细胞试验结果，其中比较胰高血糖素与连接到Y288的胰高血糖素(实验细节参见实施例31)。
图28显示GLP-1活性的体外细胞试验结果，其中比较来自两个商业来源的毒蜥外泌肽-4(实心三角形)与连接到Y288的毒蜥外泌肽-4(实心正方形)，使用未处理的细胞(实心菱形)作为阴性对照(实验细节参见实施例31)。EC50用虚线表示。
图29显示热处理对hGH和AM864-hGH的稳定性的影响。图29A是在25℃和80℃处理15分钟的两种制品的SDS-PAGE凝胶，而图29B显示80℃样品相对于25℃处理的受体结合活性的相应的百分比。
图30显示hGH-AM864(圆形)和AM864-hGH(倒三角形)对hGHR-Fc的体外结合亲和力试验结果。为了比较显示未修饰的重组hGH(正方形)。
图31显示生长激素融合蛋白，与未修饰的hGH相比，结合hGHR-Fc的体外结合亲和力试验结果，该融合蛋白含有连接到hGH的N和C末端的XTEN序列。列出了每种化合物对于AE912_hGH_AE144(圆形)和未修饰的重组hGH(正方形)的表观EC50值。
图32显示与未修饰的重组hGH相比，通过皮下途径施用于大鼠的四种hGH BTXEN融合蛋白的药代动力学结果。
图33显示三种hGH XTEN构建体在皮下施用于食蟹猴后的浓度分布。
图34显示在hypox大鼠模型中以指定剂量施用hGH或AM864-hGH对体重的影响。结果显示与hGH效能相当的BPXTEN构建体保留生物活性，然而给药频率更低。
图35显示在hypox大鼠中施用安慰剂、hGH和AM864-hGH对胫骨骺板中软骨生长的比较效果，示出治疗9天后的胫骨的组织横切面(分组为图34使用的分组)。
图36显示示例性FIX和FIX-XTEN融合蛋白的图示。图36A显示天然FIX的域结构，具有γ-羧基谷氨酸域、EGF1和EGF2域、激活肽和蛋白酶域。箭头指示激活肽域的切割位点。图36B显示具有连接到C末端的XTEN多肽的FIX分子，并且指示了蛋白水解切割释放XTEN的位点。
图37说明了几种FIX-XTEN结构和相关蛋白酶切割位点的实例。图37A显示FIX-XTEN，其在XTEN内具有两个蛋白水解切割位点(箭头)，靠近融合蛋白的FIX部分。图37B显示FIX-XTEN，其可被自催化激活，释放XTEN。图37C显示FIX-XTEN的四种结构，在FIX的各个域之间整合了XTEN。图37D显示FIX-XTEN，XTEN部分插入激活肽，这将在蛋白水解激活FIX时释放XTEN。图37E显示FIX-XTEN，其含有多个插入不同域之间的XTEN序列。图37F显示FIX-XTEN，其中XTEN已插入FIX的域内。图37G显示FIX-XTEN，其中XTEN连接至FIX的C末端，并且靠近XTEN的N末端含有多个切割位点。
图38是从FIX-XTEN释放XTEN的图示。具有缔合的XTEN的FIX-XTEN具有延长的半衰期，但是主要是非活性前药形式。在XTEN释放位点(箭头)蛋白水解切割后，FIX部分可以被凝血级联激活，但是具有短半衰期。
图39是凝血级联的图示，显示内源性和外源性途径。
图40说明FIX-XTEN设计方法的策略，使用编码FIX的基因内的外显子位置，在外显子边界之间插入XTEN的示例性位点以箭头表示。
图41.图41A是代表性FIX-XTEN构建体AC296、AC299和AC300的图示。FIX序列中的两个箭头表明FXI激活位点。AC299和AC300中的另一个箭头说明XTEN释放位点。图41B是凝血酶处理的蛋白质AC296、AC299和AC300的Western印迹，以圆形显示FIX已经在类似于Western印迹左侧FIX阳性对照的位置从XTEN部分上释放。
图42是含有FIX-XTEN基因的FIX-XTEN表达载体pCW0590设计的示意图。
图43.图43A是未加工的FIX多肽链的图示，它是表达的产物，和成熟FIX多肽链，包括在FIX分泌过程中发生的N末端翻译后切割。图8B是FIXa的匹配图，显示移除的未加工和成熟形式的激活肽的残基数。
图44显示FIX-XTEN构建体FIX-CFXIa-AG864(SEQ ID NO：1819)在FXIa切割前的序列和在蛋白水解切割和激活为FIXa后得到的片段1、2、3和4(分别为SEQ ID NOS 1820-1823，按出现顺序)。
图45显示FVII试验的结果图，各浓度的FVII标准的反应谱和FVII-XTEN的反应谱。FVII-XTEN测定结果在图下的表中显示。
图46是含有FVII-XTEN基因的表达载体pCW0590的质粒图谱。
图47显示相对于已知分子量的蛋白质标准测定的胰高血糖素-XTEN构建体样品的尺寸排阻色谱法分析的结果，图形输出为吸光度相对于保留体积。胰高血糖素-XTEN构建体为1)胰高血糖素-Y288；2)胰高血糖素Y-144；3)胰高血糖素-Y72；和4)胰高血糖素-Y36。结果表明随着XTEN部分的长度增加，表观分子量增加。
发明详述
在描述本发明的实施方案之前，应当理解这些实施方案只是以举例方式提供，在实施本发明时可以使用此处所述的本发明实施方案的各种替代方案。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到大量的变化、改变和替换。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。下面描述了合适的方法和材料，尽管在本发明的实施或测试中可以使用与此处所述的相似或等同的方法和材料。如果有不一致，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例只是说明性的，并非意在限制。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到大量的变化、改变和替换。
定义
如本文使用的，除非另外说明，下列术语具有所属含义。
在说明书中和权利要求书中使用时，单数形式“一个”、“该”包括复数形式，除非上下文中明确说明不是这样。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
术语“多肽”、“肽”和蛋白质在本文中可以交换使用，是指任意长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性的或分支的，可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸序列中断。该术语也包括已经修饰的氨基酸聚合物，例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作(例如与标记的成分相偶联)而修饰。
本文使用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然的或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L光学异构体，和氨基酸类似物和拟肽。标准单字母或三字母密码用于表示氨基酸。
术语“天然L-氨基酸”是指甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的L光学异构体形式。
术语“非天然存在的”当用于序列和在本文中使用时，是指与哺乳动物中发现的野生型或天然存在序列没有对应物、不互补或没有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，适当比对时，非天然存在的多肽与天然序列相比可以具有不超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更低的氨基酸序列同一性。
术语“亲水的”和“疏水的”是指一种物质对水的亲和力的程度。亲水性物质对水具有强亲和力，倾向于溶解于水、与水混合或被水湿润，而疏水性物质基本上缺乏对水的亲和力，倾向于排斥水并且不吸收水，并且不倾向于溶解于水、与水混合或被水湿润。氨基酸可以基于它们的疏水性进行表征。已经发展了大量衡量标准。一个例子是Levitt，M等人，J Mol Biol(1976)104：59发展的衡量标准，它在Hopp，TP等人，ProcNatl Acad Sci U S A(1981)78：3824中列出。“亲水性氨基酸”的例子是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别有意义的是亲水性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸和甘氨酸。“疏水性氨基酸”的例子是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
“片段”是天然生物活性蛋白质的截短形式，它保留至少一部分的治疗和/或生物活性。“变体”是与天然生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质，它保留生物活性蛋白质的至少一部分的治疗和/或生物活性。例如，变异蛋白质可以具有与参考生物活性蛋白质至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“生物活性蛋白质部分”包括有意修饰的蛋白质，例如通过定点诱变、插入进行修饰或通过突变偶然修饰。
“宿主细胞”包括可能是或者已经是目标载体的接受者的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单宿主细胞的后代。该后代由于自然的、意外的或有意的突变，可能不一定与原亲本细胞完全相同(在形态学上或在总DNA互补体的基因组中)。宿主细胞包括在体内用本发明的载体转染的细胞。
“分离的”当用于描述本文公开的各种多肽时，是指已经从其天然环境的成分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染物成分是通常干扰该多肽的诊断或治疗应用的材料，可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。本领域技术人员明白，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以使其区别于天然存在的对应物。另外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可区别于其天然存在的对应物，因为每体积的分子的浓度或数目通常大于其天然存在的对应物。通常，通过重组手段制备并且在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
“分离的”多核苷酸或编码多肽的核酸或其它编码多肽的核酸是从至少一个污染核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，在该编码多肽的核酸的天然来源中它通常与该污染核酸分子结合。分离的编码多肽的核酸分子在形式或设置上与在自然中发现的不同。因此分离的编码多肽的核酸分子区别于存在于天然细胞中时的特定的编码多肽的核酸分子。但是，分离的编码多肽的核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中含有的编码多肽的核酸分子，其中，例如，该核酸分子位于不同于天然细胞的染色体或染色体外位置。
“嵌合”蛋白含有至少一个融合多肽，该融合多肽在该序列的不同于天然存在的位置包含区域。该区域可以正常存在于单独的蛋白质中，并且在融合多肽中集合在一起；或者它们可以正常存在于同一蛋白质中，但是在融合多肽中具有新的排列。嵌合蛋白可以通过例如化学合成或通过产生并翻译其中肽区以希望的关系编码的多核苷酸来产生。
“偶联的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文中可以互换使用。这些术语是指通过无论何种手段，包括化学偶联或重组手段，将两个化学元件或成分连接在一起。例如，启动子或增强子与编码序列有效连接，如果它影响该序列的翻译的话。通常，“有效连接”的意思是连接的DNA序列是连续的，并且在阅读相内或符合读框。“符合读框的融合”是指两个或多个开放阅读框(ORF)连接形成连续的更长的ORF，其连接方式保持原ORF的正确的阅读框。因此，得到的重组融合蛋白是单一蛋白质，其包含两个或多个对应于原ORF编码的多肽的区段(该区段在自然中通常不这样连接)。
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基端到羧基端方向的氨基酸顺序，其中该序列中彼此邻近的残基在该多肽的一级结构中相邻。“部分序列”是多肽的部分的线性序列，已知其在一个或两个方向上包含额外的残基。
“异源”的意思是来源于与所比较的其余实体在遗传型上不同的实体。例如，从其天然编码序列中移出的并且与天然序列以外的编码序列有效连接的富含甘氨酸的序列是异源的富含甘氨酸的序列。术语“异源”当用于多核苷酸、多肽时是指该多核苷酸或多肽来源于与所比较的其余实体在遗传型上不同的实体。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用。它们是指任意长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以行使任何已知的或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，核苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，例如通过与标记成分相偶联。
术语“多核苷酸的互补体”是指与参考序列相比具有互补碱基序列和相反方向，使得它能够以完全保真度与参考序列杂交的多核苷酸分子。
“重组的”当用于多核苷酸时，意思是该多核苷酸是体外克隆、限制性消化和/或连接步骤和产生可能在宿主细胞中表达的构建体的其它操作的各种组合的产物。
术语“基因”或“基因片段”在本文中可以交换使用。它们是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，该开放阅读框在转录和翻译后能够编码特定蛋白质。基因或基因片段可以是基因组或cDNA，只要该多核苷酸含有至少一个开放阅读框，该开放阅读框可以覆盖整个编码区或其区段。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸组成的基因。
“同源性”或“同源的”是指两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列之间的序列相似性或互换性。当使用诸如BestFit的程序确定不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用缺省设置，或者可以选择适当的评分矩阵，如blosum45或blosum80，来优化同一性、相似性或同源性得分。优选地，同源的多核苷酸是与那些序列在本文定义的严格条件下杂交并且具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％、更优选97％、更优选98％、甚至更优选99％的序列同一性的多核苷酸。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括这样的条件，在该条件下多核苷酸将与其靶序列杂交，其可检测到的程度大于其它序列(例如，至少是背景的2倍)。通常，杂交的严格性部分地以进行洗涤步骤的温度和盐浓度表示。一般地，严格条件是在pH 7.0-8.3下盐浓度小于大约1.5M Na离子，一般为大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短多核苷酸(例如，10-50个核苷酸)为至少大约30℃、对于长多核苷酸(例如，大于50个核苷酸)为至少大约60℃的条件—例如，“严格条件”可以包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60-65℃的温度下在0.1×SSC/1％SDS中洗涤三次各15分钟。或者，可以使用大约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可以为大约0.1至2×SSC不等，SDS的浓度为大约0.1％。该洗涤温度一般选择为在规定的离子强度和pH下比特定序列的热解链温度
Figure BPA00001431324300261
低大约5℃至20℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在规定的离子强度和pH下)。计算Tm和核酸杂交条件的公式是众所周知的，并且可见于Sambrook，J.等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Press，PlainviewN.Y.；特别参见第2卷第9章。一般来说，利用阻断试剂阻断非特异性杂交。这样的阻断试剂包括，例如，大约100-200μg/ml的剪切和变性鲑精DNA。在特定情况下，例如对于RNA:DNA杂交，也可以使用有机溶剂，例如浓度为大约35-50％v/v的甲酰胺。这些洗涤条件的有用的变化是本领域技术人员容易明白的。
术语“同一性百分比”和“％同一性”当用于多核苷酸序列时，是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间残基匹配的百分比。这种算法可以以标准化的和可重复的方式在比较序列中插入空位，以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。同一性百分比可以在定义的(例如，由特定的SEQ ID号定义的)完整多核苷酸序列的长度上测量，或者可以在较短的长度上测量，例如，在从较长的、定义的多核苷酸序列获得的片段长度上测量，例如至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这些长度只是举例，应当理解在本文、表格、附图或序列表中所示的序列支持的任意片段长度可以用来描述可以测量同一性百分比的长度。
对于本文确定的多肽序列，“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后，与第二、参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的查询序列中氨基酸残基的百分比，并且不认为任何保守置换是序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以用本领域技术人员熟知的多种方式实现，例如，使用公众可以获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在定义的(例如，由特定的SEQ ID号定义的)完整多肽序列的长度上测量，或者可以在较短的长度上测量，例如，在从较长的、定义的多核苷酸序列获得的片段长度上测量，例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度只是举例，应当理解在本文、表格、附图或序列表中所示的序列支持的任意片段长度可以用来描述可以测量同一性百分比的长度。
本文使用的术语“非重复性”在多肽的上下文中是指在肽或多肽序列中缺乏或有限程度的内部同源性。术语“基本非重复的”可以表示，例如，在该序列的四个连续氨基酸中极少或者没有一个是相同的氨基酸类型，或者该多肽具有10或更低的亚序列得分(如下定义)，或者在从N端到C端的顺序中没有构成该多肽序列的基序的模式。此处在多肽的上下文中使用的术语“重复性”是指肽或多肽序列中的内部同源性程度。相反，“重复”序列可以含有多个相同拷贝的短氨基酸序列。例如，目标多肽序列可以分为n-mer序列，并且可以计数相同序列的数目。高度重复的序列含有高比例的相同序列，而非重复序列含有极少的相同序列。在多肽的上下文中，序列可以含有多个拷贝的定义的或可变长度的较短序列，或基序，其中基序本身具有非重复序列，使得全长多肽基本上是非重复的。测量非重复性的多肽的长度可以从3个氨基酸至大约200个氨基酸不等，大约6个至大约50个氨基酸，或者大约9个至大约14个氨基酸不等。多核苷酸序列上下文中使用的“重复性”是指序列中的内部同源性程度，例如，给定长度的相同核苷酸序列的频率。例如，重复性可以通过分析相同序列的频率来测量。
“载体”是核酸分子，优选在适当宿主中自我复制，它将插入的核酸分子转移到宿主细胞之内和/或之间。该术语包括功能主要是将DNA或RNA插入细胞中的载体、功能主要是DNA或RNA复制的复制载体，以及功能是DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。“表达载体”是当引入合适的宿主细胞时能够转录和翻译为多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含可以用来产生希望的表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
“血清降解抗性”当用于多肽时是指多肽抵抗在血液或其成分中降解的能力，该降解一般涉及血清或血浆中的蛋白酶。血清降解抗性可以通过将蛋白质与人(或适当的小鼠、大鼠、猴)血清或血浆通常在大约37℃下混合通常几天(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)来测定。这些时间点的样品可以在Western印迹分析上运行，并且该蛋白质用抗体检测。抗体可以是蛋白质中的标签。如果蛋白质在western上显示一条条带，其中蛋白质的大小与注入的蛋白质相同，则不发生降解。在该示例性的方法中，通过Western印迹法或等同的技术判断，50％的蛋白质降低的时间点是蛋白质的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
本文使用的术语“t1/2”是指以ln(2)/Kel计算的终末半衰期。Kel是通过对log浓度-时间曲线的末端线性部分进行线性回归计算的终末清除速率常数。半衰期一般是指在活生物体内沉积的施用物质的量将被正常生物过程代谢或清除一半所需的时间。术语“t1/2”、“终末半衰期”、“清除半衰期”和“循环半衰期”在本文中可以互换使用。
“表观分子量因数”或“表观分子量”是相关的术语，是指特定氨基酸序列显示的表观分子量相对增加或减少的量度。表观分子量使用尺寸排阻色谱法(SEC)和用来比较球形蛋白质标准的类似方法确定，并且以“表观kD”单位表示。表观分子量因数是表观分子量与实际分子量之间的比例；后者通过基于氨基酸组成将组合物中每种类型氨基酸的计算分子量相加来预测。
“流体动力学半径”或“Stokes半径”是分子在溶液中的有效半径(Rh，nm)，它是通过假定它是通过溶液移动并被溶液的粘度抵抗的物体而测量的。在本发明的实施方案中，XTEN融合蛋白的流体动力学半径测量与“表观分子量因数”相关，后者是一个更直觉的量度。蛋白质的“流体动力学半径”影响其在水溶液中的扩散速率以及其在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径取决于其分子量以及其结构，包括形状和紧密性。确定流体动力学半径的方法是本领域公知的，例如利用尺寸排阻色谱法(SEC)，如美国专利Nos.6,406,632和7,294,513所述。大多数蛋白质具有球形结构，这是蛋白质可能具有的、具有最小流体动力学半径的最紧密的三维结构。一些蛋白质采用随机和开放的、非组织的或“线性”构象，结果比相似分子量的典型球形蛋白质具有更大的流体动力学半径。
“生理条件”是指活宿主内的一组条件以及模拟活对象的条件的体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经确定了用于体外试验的生理学相关条件的宿主。通常，生理缓冲液含有生理浓度的盐，并且调节到范围为大约6.5至大约7.8、优选大约7.0至大约7.5的中性pH。多种生理缓冲液在Sambrook等人(1989)中列出。生理相关温度的范围是大约25℃至大约38℃，优选大约35℃至大约37℃。
“反应基团”是一种能够与第二反应基因偶联的化学结构。反应基因的例子有氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应基因可以被激活，以利于与第二反应基因的偶联。激活的例子包括羧基与碳二亚胺的反应、羧基转化为活化酯、或者羧基转化为叠氮官能团。
“控制释放剂”、“缓释剂”、“储库制剂”或“持续释放剂”可以互换使用，是指相对于在不含该试剂的情况下施用多肽时的释放时间，能够延长本发明多肽释放时间的试剂。本发明的不同实施方案可以具有不同的释放速率，导致不同的治疗量。
术语“抗原”、“靶抗原”或“免疫原”在本文中可以互换使用，是指抗体片段或基于抗体片段的治疗剂结合的或对其具有特异性的结构或结合决定簇。
术语“有效负荷(payload)”在本文中使用时是指具有生物或治疗活性的蛋白质或肽序列；小分子药效基因的对应物。有效负荷的例子包括但不限于细胞因子、酶、激素和血液和生长因子。有效负荷还可以包括遗传融合的或化学偶联的部分，如化疗剂、抗病毒化合物、毒素或造影剂。这些偶联部分可以通过连接体连接到多肽的其余部分，该连接体可以是可切割的或不可切割的。
本文使用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和此处公开的天然多肽的生物活性的任何分子。鉴定多肽的拮抗剂的方法可以包括使天然多肽接触候选拮抗剂分子，及测定通常与该天然多肽相关的一个或多个生物活性的可检测的变化。在本发明的上下文中，拮抗剂可包括蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体或任何其它能够降低生物活性蛋白质的影响的分子。
术语“激动剂”最广义地使用，包括模拟此处公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂分子特别包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、有机小分子等。鉴定天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽接触候选激动剂分子并测定通常与该天然多肽有关的一个或多个生物活性的可检测的变化。
用于本文目的的“活性”是指融合蛋白成分与相应的天然生物活性蛋白质一致的作用或效果，其中“生物活性”是指在体外或体内的生物功能或效果，包括但不限于受体结合、拮抗剂活性、激动剂活性，或细胞或生理反应。
本文所用的“治疗”或“减轻”或“缓解”在本文中可以互换使用。这些术语是指用于获得有益的或希望的效果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。治疗益处是消除或改善所治疗的基础疾病。此外，实现治疗益处可根除或改善一个或多个与基础疾病等有关的生理症状，使得在受试者中观察到改善，尽管该受试者可能仍然遭受该基础疾病的折磨。对于预防性益处，可将组合物施用于具有发生特定疾病危险的受试者，或施用于报告了一种疾病的一个或更多生理症状的受试者，即使对该疾病的诊断可能尚未做出。
此处使用的“治疗效果”，是指一种生理效果，包括但不限于人类或其他动物的疾病的治疗、缓解、改善或预防，或以其他方式加强人类或动物的身体或精神的健康，这是由本发明的融合多肽引起的，而不是由诱导产生针对生物活性蛋白质具有的抗原性表位的抗体的能力引起的。治疗有效量的测定属于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据此处提供的详细公开内容。
“治疗有效量”和“治疗有效剂量”，在此处使用时，是指单独或作为融合蛋白组合物一部分的生物活性蛋白质的量，当它以一个或重复剂量施用于受试者时，对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量的参数或特征能够具有任何可检测到的有益的效果。这样的效果不需要绝对是有益的。
术语“治疗有效剂量方案”在此处使用时是指单独或作为融合蛋白组合物一部分的生物活性蛋白质的连续给药剂量的时间表，其中以治疗有效量给予剂量，导致对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量的参数或特征能够具有持续有益的效果。
I)一般技术
除非另外说明，本发明的实施使用免疫学、生物化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、遗传学和重组DNA的常规技术，这些属于本领域的技术。参见Sambrook，J.等人，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual，”3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001；“Current protocols in molecular biology”，F.M.Ausubel等人，eds.，1987；系列“Methods in Enzymology，”Academic Press，San Diego，CA.；“PCR 2：apractical approach”，M.J.MacPherson，B.D.Hames and G.R.Taylor eds.，Oxford University Press，1995；“Antibodies，a laboratory manual”Harlow，E.and Lane，D.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；“Goodman &Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，”11th Edition，McGraw-Hill，2005；和Freshney，R.I.，“Culture of Animal Cells：A Manualof Basic Technique，”4th edition，John Wiley&Sons，Somerset，NJ，2000，其内容在此引用作为参考。
II)延伸重组多肽
本发明提供包含延伸重组多肽(“XTEN”或“XTENs”)的组合物。在一些实施方案中，XTEN通常是延长长度多肽，具有非天然存在的、基本上非重复的序列，主要由亲水性小氨基酸组成，该序列在生理条件下具有低度的或没有二级或三级结构。
在本发明的一个方面，公开了XTEN多肽组合物，其可用作可连接到生物活性蛋白质(“BP”)的融合配偶体，产生BPXTEN融合蛋白(例如，单体融合)。XTEN可以用作融合蛋白配偶体，因为它们当连接到生物活性蛋白质产生融合蛋白时可以提供某些化学和药学性质。这些希望的性质包括但不限于增强的药代动力学参数和溶解度特征，尤其是以下描述的性质。这些融合蛋白组合物可以用于治疗如本文所述的某些疾病、障碍或病症。如本文所用的“XTEN”特别不包括抗体或抗体片段，如单链抗体、轻链或重链的Fc片段。
在一些实施方案中，XTEN是长多肽，当用作单序列时具有大于大约100至大约3000个氨基酸残基，优选大于400至大约3000个残基，当在单融合蛋白或偶联物中使用多于一个的XTEN单位时，累积起来具有大于大约400至大约3000个氨基酸残基。在其它情况中，在不需要融合蛋白半衰期延长，但希望生物活性蛋白质融合配偶体的溶解度或物理/化学性质改善时，可以将短于100个氨基酸残基，如大约96、或大约84、或大约72、或大约60、或大约48、或大约36个氨基酸残基的XTEN序列引入具有BP的融合蛋白组合物中，以实现该性质。
将要连接到生物活性蛋白质产生本发明融合蛋白的XTEN的选择标准通常与XTEN的物理/化学性质和构象结构有关，后者又可用于给该融合蛋白提供增强的药学和药代动力学性质。本发明的XTEN可以表现出一个或多个以下有利性质；构象柔性、增强的水溶解度、高度的蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合、增强的流体动力学(或Stokes)半径；能够使其特别可用作融合蛋白配偶体的性质。可以被XTEN增强的、包含BP的融合蛋白的性质的非限制性实例包括总溶解度和/或代谢稳定性的提高、对蛋白水解敏感性的降低、免疫原性降低、当皮下或肌肉内施用时吸收速率降低、以及改善的药代动力学性质如终末半衰期和曲线下面积(AUC)、皮下或肌肉注射后较慢的吸收(与未连接到XTEN的BP相比)，使得Cmax较低，这又可能导致BP的不良反应减少，共同可导致与未连接到XTEN的相应BP成分相比，施用至受试者的BPXTEN组合物的融合蛋白保持在治疗窗内的时间延长。
多种方法和试验在本领域已知用于确定蛋白质如包含本发明XTEN的融合蛋白组合物的物理/化学性质；诸如二级或三级结构、溶解度、蛋白质聚集、熔解性质、污染和水含量等性质。这些方法包括分析离心、EPR、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、HPLC-反相、光散射、毛细管电泳、圆二色性、示差扫描量热法、荧光、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼光谱、折光法和UV/可见光谱法。另外的方法在Arnau等人，Prot Expr and Purif(2006)48，1-13中公开。这些方法应用于本发明在本领域技术人员的能力范围内。
一般而言，设计融合蛋白的XTEN成分，使其表现在生理条件下类似于变性肽序列，尽管聚合物的长度延长。变性描述了肽在溶液中的状态，其特征在于肽骨架的高构象自由度。大多数肽和蛋白质在高浓度变性剂的存在下或升高的温度下采取变性构象。变性构象的肽具有，例如，特征性的圆二色性(CD)谱，其特征在于缺乏远距离相互作用，如通过NMR测定的。“变性构象”和“非组织构象”在本文可互换使用。在有些情况中，本发明提供XTEN序列，该序列在生理条件下可能类似于变性的序列，主要是缺乏二级结构。在其它情况中，XTEN序列在生理条件下可能基本上不含二级结构。“主要不含”在本文中使用时是指，如通过此处所述的手段测量或确定的，XTEN序列的少于50％的XTEN氨基酸残基贡献于二级结构。“基本不含”在上下文中使用时是指XTEN序列的XTEN氨基酸残基的至少大约60％、或大约70％、或大约80％、或大约90％、或大约95％、或至少大约99％不贡献于二级结构，如通过此处所述的手段测量或确定的。
本领域中已经建立了多种方法，用来判别给定多肽的二级和三级结构的存在或不存在。特别是，二级结构可以通过分光光度法测量，例如，通过圆二性色谱法在“远紫外”光谱区(190-250nm)测量。二级结构元件，如α-螺旋和β-折叠，各自产生CD谱的特有的形状和强度。也可以通过某些计算机程序或算法预测多肽序列的二级结构，如众所周知的Chou-Fasman算法(Chou，P.Y.等人，(1974)Biochemistry，13：222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson(“GOR”)算法(Garnier J，Gibrat JF，Robson B.(1996)，GOR method for predicting protein secondary structure from aminoacid sequence.Methods Enzymol 266：540-553)，如美国专利申请公布No.20030228309A1所述。对于给定序列，该算法可以预测是否存在一些或根本不存在二级结构，表示为构成例如α-螺旋或β-折叠的序列的残基总数和/或百分比，或预测产生无规卷曲形成(缺乏二级结构)的序列的残基百分比。
在有些情况中，通过Chou-Fasman算法测定，本发明的融合蛋白组合物中使用的XTEN序列可以具有范围从0％到小于大约5％的α-螺旋百分比。在其它情况中，通过Chou-Fasman算法测定，该融合蛋白组合物的XTEN序列可以具有范围从0％到小于大约5％的β-折叠百分比。在有些情况中，通过Chou-Fasman算法测定，该融合蛋白组合物的XTEN序列可以具有范围从0％到小于大约5％的α-螺旋百分比和范围从0％到小于大约5％的β-折叠百分比。在优选的实施方案中，该融合蛋白组合物的XTEN序列具有小于大约2％的α-螺旋百分比和小于大约2％的β-折叠百分比。在其它情况中，通过GOR算法测定，该融合蛋白组合物的XTEN序列具有高度的无规卷曲百分比。在一些实施方案中，通过GOR算法测定，XTEN序列可具有至少大约80％，更优选至少大约90％，更优选至少大约91％，更优选至少大约92％，更优选至少大约93％，更优选至少大约94％，更优选至少大约95％，更优选至少大约96％，更优选至少大约97％，更优选至少大约98％，最优选至少大约99％的无规卷曲。
1.非重复序列
本组合物的XTEN序列可以是基本上非重复的。通常，重复氨基酸序列具有聚集形成更高级结构的倾向，其例子为天然重复序列如胶原蛋白和亮氨酸拉链，或者形成接触，导致晶体或拟晶体结构。相反，非重复序列聚集的低倾向使得能够设计具有相对较低频率的带电荷氨基酸的长序列XTEN，如果序列重复它可能聚集。一般来说，BPXTEN融合蛋白包含大于大约100至大约3000个氨基酸残基，优选大于400至大约3000个残基的XTEN序列，其中该序列基本不重复。在一个实施方案中，XTEN序列可能具有大于大约100至大约3000个氨基酸残基，优选大于400至大约3000个氨基酸残基，其中序列中没有三个连续氨基酸是相同的氨基酸类型，除非该氨基酸是丝氨酸，在这种情况下不超过三个连续氨基酸是丝氨酸残基。在前述实施方案中，XTEN序列将是基本不重复的。
多肽或基因的重复程度可以通过计算机程序或算法或通过本领域已知的其它手段来确定。例如，多肽序列的重复性可以通过测定多肽内出现给定长度的较短序列的次数来估计。例如，200个氨基酸残基的多肽具有192个重叠的9-氨基酸序列(或9-mer“框”)和198个3-mer框，但是独特的9-mer或3-mer序列的数目取决于序列内的重复程度。可以产生得分(下文称为“亚序列得分”)，该得分反映整个多肽序列内亚序列的重复性程度。在本发明的上下文中，“亚序列得分”的意思是多肽的200个连续氨基酸序列中出现每个独特3-mer框的总和除以200个氨基酸序列内独特3-mer亚序列的绝对数。来自于重复和非重复多肽的前200个氨基酸的亚序列得分的例子在实施例73中列出。在一些实施方案中，本发明提供各包含XTEN的BPXTEN，其中XTEN可具有小于12的亚序列得分，更优选小于10，更优选小于9，更优选小于8，更优选小于7，更优选小于6，最优选小于5。在本段所述的上述实施方案中，亚序列得分小于大约10(即9、8、7等)的XTEN将是“基本非重复的”。
XTEN的非重复特征可使含有BP的融合蛋白比具有重复序列的多肽具有更高程度的溶解度和更低的聚集倾向。这些性质可有利于含XTEN药物制品的配制，其中含有极高的药物浓度，在有些情况下超过100mg/ml。
此外，该实施方案的XTEN多肽序列设计为具有低程度的内部重复性，以在施用哺乳动物时减少或基本消除免疫原性。由主要限于如甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸等三种氨基酸的短、重复基序组成的多肽序列当施用于哺乳动物时可导致相对较高的抗体效价，尽管这些序列缺乏预测的T细胞表位。这可能是由多肽的重复性质造成的，因为已经证明具有重复表位的免疫原，包括蛋白质聚集体、交联免疫原和重复碳水化合物，具有高免疫原性，并且可能导致例如B细胞受体交联，引起B细胞激活(Johansson，J.等人，(2007)Vaccine，25：1676-82；Yankai，Z.等人，(2006)Biochem Biophys Res Commun，345：1365-71；Hsu，C.T.等人，(2000)Cancer Res，60：3701-5)；Bachmann MF等人，Eur J Immunol.(1995)25(12)：3445-3451)。
2.基序实例
本发明包括可包含多个单位的较短序列或基序的XTEN，其中基序的氨基酸序列基序是非重复的。在设计XTEN序列时，发现尽管使用“构件块”方法，该方法使用多聚化产生XTEN序列的基序文库，仍然可以满足非重复标准。因此，XTEN序列可以由多个单位的少至四种不同类型的基序组成，因为该基序本身通常由非重复氨基酸序列组成，总XTEN序列基本上是非重复的。
在一个实施方案中，XTEN可以具有大于大约100至大约3000个氨基酸残基、优选大于大约400至大约3000个残基的非重复序列，其中XTEN序列的至少大约80％、或至少大约85％、或至少大约90％、或至少大约95％、或至少大约97％、或大约100％由非重叠基序组成，其中每个基序具有大约9-36个氨基酸残基。在其它实施方案中，XTEN序列的至少大约80％、或至少大约85％、或至少大约90％、或至少大约95％、或至少大约97％、或大约100％由非重叠基序组成，其中每个基序具有9-14个氨基酸残基。在其它实施方案中，XTEN序列成分的至少大约80％、或至少大约85％、或至少大约90％、或至少大约95％、或至少大约97％、或大约100％由非重叠基序组成，其中每个基序具有12个氨基酸残基。在这些实施方案中，优选地基序主要由小亲水性氨基酸组成，使得总体序列具有未组织的、柔性的特征。XTEN中可以包括的氨基酸的例子例如是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸。作为测试的变量如密码子优化、装配多核苷酸编码基序、蛋白质表达、电荷分布和表达蛋白质的溶解度和二级和三级结构的结果，发现具有增强的特性的XTEN组合物主要包括甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基，其中该序列被设计为基本非重复的。在优选的实施方案中，XTEN序列主要有选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸，它们以基本非重复序列排列，长度大于大约100至大约3000个氨基酸残基，优选大于400至大约3000个残基。在一些实施方案中，XTEN可以具有大于大约100至大约3000个氨基酸残基、优选大于400至大约3000个残基的序列，其中该序列的至少大约80％由非重叠基序组成，其中每个基序具有9-36个氨基酸残基，其中每个基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸组成，并且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其它实施方案中，XTEN序列的至少大约90％由非重叠基序组成，其中每个基序具有9-36个氨基酸残基，其中该基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸组成，并且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其它实施方案中，XTEN序列的至少大约90％由非重叠基序组成，其中每个基序具有由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸组成的12个氨基酸残基，并且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其它实施方案中，XTEN序列的至少大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％至大约100％由非重叠基序组成，其中每个基序具有12个由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成的氨基酸残基，并且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。
在另外其它的实施方案中，XTEN包含大于大约100至大约3000个氨基酸残基，优选大于400至大约3000个氨基酸残基的非重复序列，其中该序列的至少大约80％、或至少大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％由9-14个氨基酸残基的非重叠基序组成，其中该基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸组成，并且其中任一基序中的任两个连续氨基酸残基的序列在该基序中不重复两次以上。在其它实施方案中，XTEN序列的至少大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％由12个氨基酸残基的非重叠基序组成，其中该基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸组成，并且其中任一基序中的任两个连续氨基酸残基的序列在该基序中不重复两次以上。在其它实施方案中，XTEN序列的至少大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％由12个氨基酸残基的非重叠基序组成，其中该基序由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成，并且其中任一基序中的任两个连续氨基酸残基的序列在该基序中不重复两次以上。在另外其它实施方案中，XTEN由12个氨基酸的基序组成，其中该氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)，并且其中任一基序中的任两个连续氨基酸残基的序列在该基序中不重复两次以上，并且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在本段的上述实施方案中，XTEN序列基本上是非重复的。
在有些情况中，本发明提供包含大于大约100至大约3000个氨基酸残基，优选大于400至大约3000个残基的非重复XTEN序列的组合物，其中该序列的至少大约80％、或至少大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％至大约100％由多个单位的两个或多个非重叠基序组成，该基序选自表1的氨基酸序列。在有些情况中，XTEN包含非重叠基序，其中该序列的大约80％、或至少大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％至大约100％由两个或多个非重叠序列组成，该序列选自表1的单基序家族，产生“家族”序列，其中总序列保持基本非重复。因此，在这些实施方案中，XTEN序列可包含多个单位的以下家族的非重叠基序：表1序列的AD基序家族或AE基序家族或AF基序家族或AG基序家族或AM基序家族或AQ基序家族或BC家族或BD家族。在其它情况中，XTEN包含来自表1的两个或多个基序家族的基序序列。
表1：12个氨基酸的XTEN基序和基序家族
  基序家族*   SEQ ID NO：   基序序列
  AD   182   GESPGGSSGSES
  AD   183   GSEGSSGPGESS
  AD   184   GSSESGSSEGGP
  AD   185   GSGGEPSESGSS
  AE，AM   186   GSPAGSPTSTEE
  AE，AM，AQ   187   GSEPATSGSETP
  AE，AM，AQ   188   GTSESATPESGP
  AE，AM，AQ   189   GTSTEPSEGSAP
  AF，AM   190   GSTSESPSGTAP
  AF，AM   191   GTSTPESGSASP
  AF，AM   192   GTSPSGESSTAP
  AF，AM   193   GSTSSTAESPGP
  AG，AM   194   GTPGSGTASSSP
  AG，AM   195   GSSTPSGATGSP
  AG，AM   196   GSSPSASTGTGP
  AG，AM   197   GASPGTSSTGSP
  AQ   198   GEPAGSPTSTSE
  AQ   199   GTGEPSSTPASE
  AQ   200   GSGPSTESAPTE
  AQ   201   GSETPSGPSETA
  AQ   202   GPSETSTSEPGA
  AQ   203   GSPSEPTEGTSA
  BC   1715   GSGASEPTSTEP
  BC   1716   GSEPATSGTEPS
  BC   1717   GTSEPSTSEPGA
  BC   1718   GTSTEPSEPGSA
  BD   1719   GSTAGSETSTEA
  BD   1720   GSETATSGSETA
  BD   1721   GTSESATSESGA
  BD   1722   GTSTEASEGSAS
*表示各基序序列，其在各种排列中一起使用时产生“家族序列”。
在其它情况中，BPXTEN组合物可包含大于大约100至大约3000个氨基酸残基，优选大于400至大约3000个残基的非重复XTEN序列，其中该序列的至少大约80％、或至少大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％至大约100％由非重叠的36氨基酸序列基序组成，该序列选自表12-15的一个或多个多肽序列。
在这样的实施方案中，其中BPXTEN融合蛋白的XTEN成分有少于100％的氨基酸由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种氨基酸组成，或少于100％的序列由表1的基序或表12-15的多肽序列组成，或与表2的XTEN有小于100％的序列同一性，其它氨基酸残基可以选自任意其它14种天然L-氨基酸。其它氨基酸可以散布在整个XTEN序列中，可以位于基序之内或之间，或者可以集中在XTEN序列的一个或多个短区段中。在这样的情况中，其中BPXTEN的XTEN成分包含甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)以外的氨基酸，优选地该氨基酸不是疏水性残基，并且不应实质上使XTEN成分具有二级结构。因此，在上述的一个优选的实施方案中，除了甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)外还含有其它氨基酸的BPXTEN融合蛋白的XTEN成分将具有这样一种序列，如通过Chou-Fasman算法确定，其少于5％的残基贡献于α-螺旋和β-折叠，并且如通过GOR算法确定，其具有至少90％的无规卷曲形成。
3.序列的长度
在特定特征中，本发明包括包含具有延长长度序列的XTEN多肽的BPXTEN组合物。本发明利用以下发现：延长非重复的、非组织的多肽的长度增强了XTEN的非组织性质和包含XTEN的融合蛋白的生物学和药代动力学性质。如实施例中更全面描述的，XTEN长度成比例增加，即使是通过固定重复顺序的单家族基序(例如，表1的4个AE基序)产生的，也可产生通过GOR算法，比较短的XTEN长度具有更高无规卷曲形成百分比的序列。另外，如实施例中所述，发现增加非组织多肽融合配偶体的长度能够产生与具有较短序列长度的非组织多肽配偶体的融合蛋白相比终末半衰期成比例延长的融合蛋白。
预期用于包含在本发明BPXTEN中的XTEN的非限制性实例在表2中列出。因此，本发明提供BPXTEN组合物，其中融合蛋白的XTEN序列长度大于大约100至大约3000个氨基酸残基，在有些情况下大于400至大约3000个氨基酸残基，其中XTEN使BPXTEN相比未连接到XTEN的有效负荷具有增强的药代动力学性质。在有些情况中，本发明的BPXTEN组合物的XTEN序列可以是大约100、或大约144、或大约288、或大约401、或大约500、或大约600、或大约700、或大约800、或大约900、或大约1000、或大约1500、或大约2000、或大约2500或最多大约3000个氨基酸残基的长度。在其它情况中，XTEN序列可以是大约100至150、大约150至250、大约250至400，401至大约500、大约500至900、大约900至1500、大约1500至2000、或大约2000至大约3000个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中，BPXTEN可以包含一种XTEN序列，其中该序列显示与选自表2的XTEN有至少大约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在有些情况中，为了优化表达，设计XTEN序列为BPXTEN的N末端成分。在上述的一个实施方案中，XTEN序列与AE912或AM923的序列具有至少90％的序列同一性。在上述的另一实施方案中，XTEN具有实施例14-17所述的N-末端残基。
在其它情况中，PXTEN融合蛋白可以包含第一和第二XTEN序列，其中XTEN序列中残基的累计总数大于大约400至大约3000个氨基酸残基。在上述的实施方案中，BPXTEN融合蛋白可以包含第一和第二XTEN序列，其中该序列各表现出与选自表2的至少第一或另外第二XTEN有至少大约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在BPXTEN组合物中使用超过一个XTEN的实例包括但不限于具有连接到至少一个BP的N和C末端的XTEN的构建体。
如以下更全面描述的，本发明提供方法，其中通过选择XTEN的长度来设计BPXTEN，以使施用于受试者的融合蛋白具有目标半衰期。通常，引入BPXTEN组合物的较长的XTEN长度比较短的XTEN导致更长的半衰期。然而，在另一实施方案中，BPXTEN融合蛋白可以设计为包含具有选择的较长序列长度的XTEN，以在皮下或肌肉施用于受试者后提供更慢的全身吸收速率。在这些情况中，与未连接到XTEN的BP的相当剂量相比，Cmax降低，从而导致使BPXTEN保持在治疗窗内的能力，用于比较。因此，XTEN使施用的BPXTEN具有储库性质，以及此处所述的其它物理/化学性质。
表2：XTEN多肽
Figure BPA00001431324300421
Figure BPA00001431324300431
Figure BPA00001431324300441
Figure BPA00001431324300451
Figure BPA00001431324300461
4.净电荷
在其它情况中，XTEN多肽可能具有引入具有净电荷的氨基酸残基和/或减少XTEN序列中疏水性氨基酸的比例引起的非组织的特征。通过改变XTEN序列中带电荷氨基酸的含量可以控制总净电荷和净电荷密度。在有些情况中，组合物的XTEN的净电荷密度可以高于+0.1或低于-0.1电荷/残基。在其它情况中，XTEN的净电荷可以是大约0％、大约1％、大约2％、大约3％、大约4％、大约5％、大约6％、大约7％、大约8％、大约9％、大约10％、大约11％、大约12％、大约13％、大约14％、大约15％、大约16％、大约17％、大约18％、大约19％、或大约20％或更多。
由于人或动物的大多数组织和表面具有净负电荷，XTEN序列可以设计为具有净负电荷以使含有XTEN的组合物与各种表面如血管、健康组织或各种受体之间的非特异性相互作用最小化。不受特定理论的束缚，由于XTEN多肽的各个氨基酸之间的静电排斥，XTEN可以采用开放构象，所述氨基酸分别携带高净负电荷并且分布在XTEN多肽的序列之间。XTEN的延伸序列长度中的这种净负电荷分布可以导致非组织的构象，后者又可导致流体动力学半径的有效的增加。因此，在一个实施方案中，本发明提供XTEN，其中XTEN序列含有大约8％、10％、15％、20％、25％或甚至大约30％的谷氨酸。本发明的组合物的XTEN通常不具有或者具有低含量的带正电荷的氨基酸。在一些情况中，该XTEN可具有小于大约10％的带正电荷的氨基酸残基，或小于大约7％，或小于大约5％，或小于大约2％的带正电荷的氨基酸残基。然而，本发明涉及构建体，其中有限数量的带正电荷的氨基酸如赖氨酸可以引入XTEN中，以允许赖氨酸的epsilon氨基和肽的反应基团之间的偶联、连接桥、或药物或小分子上的反应基团与XTEN骨架偶联。在上述中，可以构建融合蛋白，其包含XTEN、生物活性蛋白质，加可用于治疗代谢疾病或障碍的化疗剂，其中引入XTEN成分的试剂的最大分子数取决于引入XTEN中的赖氨酸或其它具有反应性侧链的氨基酸(例如，半胱氨酸)的数目。
在有些情况中，XTEN序列可以包含被其它残基如丝氨酸或甘氨酸隔开的带电荷的残基，它们可以导致更好的表达或纯化行为。根据净电荷，所述组合物的XTEN可具有1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或甚至6.5的等电点(pI)。在优选的实施方案中，XTEN将具有1.5和4.5之间的等电点。在这些实施方案中，引入本发明的BPXTEN融合蛋白组合物的XTEN在生理条件下将携带净负电荷，这可导致非组织构象和降低的XTEN成分与哺乳动物蛋白质和组织的结合。
由于疏水性氨基酸可能影响多肽的结构，本发明提供XTEN中的疏水性氨基酸的含量一般小于5％，或小于2％，或小于1％的疏水性氨基酸含量。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白的XTEN成分中甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸含量一般小于5％，或小于2％，最优选小于1％。在另一实施方案中，XTEN将具有这样一种序列，它具有小于10％的带正电荷的氨基酸残基，或小于大约7％，或小于大约5％，或小于大约2％的带正电荷的氨基酸残基，甲硫氨酸和色氨酸残基的总和小于总XTEN序列的2％，天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于10％。
5.低免疫原性
在另一方面，本发明提供组合物，其中XTEN序列具有低程度的免疫原性或基本上没有免疫原性。几种因素可以导致XTEN的低免疫原性，例如，非重复序列、非截短的构象、高度溶解性、低度和缺乏自聚集、在序列内低度或缺乏蛋白水解位点、在XTEN序列中的低度或缺乏表位。
构象表位由蛋白质表面区域形成，该区域由蛋白质抗原的多个不连续的氨基酸序列组成。蛋白质的精确折叠使这些序列具有良好定义的、稳定的空间构型或者表位，它们可能被宿主体液免疫系统识别为“外来的”，导致产生该蛋白质的抗体或者引发细胞介导的免疫应答。在后一情况中，个体中对蛋白质的免疫应答受到T细胞表位识别的高度影响，该识别是个体HLA-DR同种异型的肽结合特异性的功能。T细胞表面上的同源T细胞受体对MHC II类肽复合物的配合，以及某些其它辅助受体如CD4分子的交叉结合，能够诱导T细胞内的激活状态。激活导致细胞因子释放，进一步激活其它淋巴细胞如B细胞，产生抗体或激活T杀伤细胞作为一个完整的细胞免疫应答。
为了在APC(抗原呈递细胞)表面上呈递，肽结合给定MHC II类分子的能力取决于大量因素；最主要的是其一级序列。在一个实施方案中，较低程度的免疫原性可以这样实现：设计在抗原呈递细胞冲抵抗抗原加工的XTEN序列，和/或选择不良好结合MHC受体的序列。本发明提供具有基本非重复的XTEN多肽的BPXTEN融合蛋白，其设计为减少与MHC II受体的结合，以及避免形成用于T细胞受体或抗体结合的表位，导致低程度的免疫原性。避免免疫原性部分上是XTEN序列的构象柔性的直接结果；即，由于氨基酸残基的选择和顺序导致的二级结构的缺乏。例如，特别感兴趣的是在水溶液或在可能导致构象表位的生理条件下具有采用紧密折叠构象的低趋势的序列。使用常规治疗实践和给药，施用包含XTEN的融合蛋白，通常不会导致XTEN序列的中和抗体的形成，并且也可以降低BPXTEN组合物中BP融合配偶体的免疫原性。
在一个实施方案中，在所述融合蛋白中使用的XTEN序列可能基本上不含被人T细胞识别的表位。为了产生低免疫原性的蛋白质而消除这些表位在以前已经公开；参见，例如，WO 98/52976、WO02/079232和WO 00/3317，它们在此引入作为参考。对人T细胞表位的分析已有记载(Stickler，M.等人，(2003)J Immunol Methods，281：95-108)。特别有意义的是可以寡聚化而不产生T细胞表位或非人序列的肽序列。这可以通过以下方法实现：检测这些序列的直接重复中T细胞表位的存在和6至15-mer，特别是9-mer非人序列的出现，然后改变XTEN序列的设计，以消除或破坏表位序列。在有些情况中，通过限制预测结合MHC受体的XTEN的表位数，XTEN序列基本上没有免疫原性。通过减少能够结合MHC受体的表位数，同时有T细胞激活以及T细胞辅助功能的能力的降低，减少的B细胞激活或上调，和减少的抗体产生。低程度的预测的T细胞表位能够通过表位预测算法确定，例如，TEPITOPE(Sturniolo，T.等人，(1999)Nat Biotechnol，17：555-61)，如实施例74所示。蛋白质内给定肽框的TEPITOPE得分是肽框与多个最常见的人MHC等位基因结合的Kd(解离常数，亲和力，解离速率)的log，如Sturniolo，T.等人(1999)Nature Biotechnology 17：555)所公开的。得分范围跨越至少20个log，从大约10至大约-10(对应于10e10Kd至10e-10Kd的结合约束)，并且能够通过在肽在MHC上展示过程中避免能用作锚残基的疏水性氨基酸如M、I、L、V、F而减小。在一些实施方案中，在TEPITOPE得分为大约-5或更高时，或者-6或更高，或者-7或更高，或者-8或更高时，或者在TEPITOPE得分为-9或更高时，引入BPXTEN中的XTEN成分不具有预测的T细胞表位。本文使用的“-9或更高”的得分包括10至-9(含)的TEPITOPE得分，但是不包括-10的得分，因为-10小于-9。
在另一实施方案中，本发明的XTEN序列，包括引入所述BPXTEN融合蛋白的那些，通过限制XTEN序列的已知的蛋白水解位点，减少XTEN加工为能够结合MHC II受体的小肽，能够基本上没有免疫原性。在另一实施方案中，通过使用基本上不含二级结构的序列，由于结构的高熵提供对许多蛋白酶的抗性，能够使XTEN序列基本上没有免疫原性。因此，减少TEPITOPE得分和从XTEN组合物中消除已知蛋白水解位点，可以使XTEN组合物，包括XTEN融合蛋白组合物的XTEN，基本上不能被哺乳动物受体(包括免疫系统的受体)结合。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白的XTEN可以具有＞100nM Kd的与哺乳动物受体的结合，或大于500nM Kd、或大于1μM Kd的对哺乳动物细胞表面或循环多肽受体的结合。
另外，非重复序列和相应的XTEN表位的缺乏可限制B细胞结合XTEN或被XTEN激活的能力。重复序列被识别，并且甚至可与少数B细胞形成多价接触，并且作为多个T细胞独立受体的交联的结果，能够刺激B细胞增殖和抗体产生。相反，尽管XTEN可以在其延长序列上与许多不同的B细胞接触，但每个单独的B细胞只可能与个体XTEN进行一个或少量的接触，因为该序列缺乏重复性。结果，XTEN一般可能具有更低的刺激B细胞增殖因此刺激免疫应答的趋势。在一个实施方案中，BPXTEN可能具有比未融合的相应BP降低的免疫原性。在一个实施方案中，向哺乳动物施用最多三个肠胃外剂量的BPXTEN在血清稀释度为1∶100时可导致可检测的抗-BPXTEN IgG，但在稀释度为1∶1000时没有。在另一实施方案中，向哺乳动物施用最多三个肠胃外剂量的BPXTEN在血清稀释度为1∶100时可导致可检测的抗-BP IgG，但在稀释度为1∶1000时没有。在另一实施方案中，向哺乳动物施用最多三个肠胃外剂量的BPXTEN在血清稀释度为1∶100时可导致可检测的抗-XTEN IgG，但在稀释度为1∶1000时没有。在上述实施方案中，哺乳动物可以是小鼠、大鼠、兔或食蟹猴。
相对于具有高度重复性的序列，具有非重复序列的XTEN的另一个特征可能是非重复XTEN与抗体形成较弱的接触。抗体是多价分子。例如，IgG具有两个相同的结合位点，IgM含有10个相同的结合位点。因此，抗重复序列的抗体可以与这些重复序列形成高亲合力的多价接触，这可影响这些重复序列的效能和/或消除。相反，针对非重复XTEN的抗体可能产生单价相互作用，导致较低可能性的免疫清除，使得BPXTEN组合物能够在循环中保持延长的一段时间。
6.增加的流体动力学半径
在另一方面，本发明提供XTEN，其中XTEN多肽可具有高流体动力学半径，它使引入XTEN的BPXTEN融合蛋白具有相应提高的表观分子量。如实施例19详述，XTEN连接至BP序列可产生BPXTEN组合物，与未连接到XTEN的BP相比，它可具有增大的流体动力学半径、增大的表观分子量和增大的表观分子量因数。例如，在希望延长半衰期的治疗应用中，具有高流体动力学半径的XTEN引入包含一个或多个BP的融合蛋白的组合物能够有效扩大该组合物的流体动力学半径，超过大约3-5nm的肾小球孔径(对应于大约70kDA的表观分子量)(Caliceti.2003.Pharmacokinetics and biodistribution properties ofpoly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv Drug Deliv Rev 55：1261-1277)，导致循环蛋白质的肾清除率降低。蛋白质的流体动力学半径取决于其分子量以及其结构，包括形状和紧密性。不受特定理论的束缚，由于肽的各个电荷之间的静电排斥，或缺乏提供二级结构能力的序列中特定氨基酸引起的固有柔性，XTEN可以采用开放构象。XTEN多肽的开放、延伸和非组织的构象可比具有二级和/或三级结构的相当序列长度和/或分子量的多肽(如典型球形蛋白质)具有较高比例的流体动力学半径。确定流体动力学半径的方法是本领域公知的，例如利用尺寸排阻色谱法(SEC)，如美国专利Nos.6,406,632和7,294,513所述。实施例19的结果证明，增加长度逐渐延长的XTEN导致流体动力学半径、表观分子量和表观分子量因数等参数成比例增加，允许调整BPXTEN至希望的特有截断表观分子量或流体动力学半径。因此，在某些实施方案中，BPXTEN融合蛋白可以构造为含有XTEN，使得该融合蛋白可以具有至少大约5nm、或至少大约8nm、或至少大约10nm或12nm、或至少大约15nm的流体动力学半径。在上述实施方案中，BPXTEN融合蛋白中的XTEN提供的大流体动力学半径可导致得到的融合蛋白的肾清除减少，导致终末半衰期相应延长，平均经历时间延长，和/或肾清除率降低。
在另一实施方案中，具有选择长度和序列的XTEN可以选择性引入BPXTEN中，以产生融合蛋白，该融合蛋白在生理条件下具有至少大约150kDa、或至少大约300kDa、或至少大约400kDa、或至少大约500kDA、或至少大约600kDa、或至少大约700kDA、或至少大约800kDa、或至少大约900kDa、或至少大约1000kDa、或至少大约1200kDa、或至少大约1500kDa、或至少大约1800kDa、或至少大约2000kDa、或至少大约2300kDa或更高的表观分子量。在另一实施方案中，具有选择长度和序列的XTEN可以选择性连接到BP上，以产生BPXTEN融合蛋白，该融合蛋白在生理条件下的表观分子量因数至少为3，或至少为4，或至少为5，或至少为6，或至少为8，或至少为10，或至少为15，或表观分子量因数至少为20或更高。在另一实施方案中，相对于融合蛋白的实际分子量，该BPXTEN融合蛋白在生理条件下的表观分子量因数为大约4至大约20，或大约6至大约15，或大约8至大约12，或大约9至大约10。
III).BXTEN融合蛋白组合物的生物活性蛋白质
本发明部分涉及包含生物活性蛋白质和XTEN的融合蛋白组合物，及其用于治疗受试者的疾病、障碍或病症的应用。
在一方面，本发明提供共价连接到融合蛋白的至少第一生物活性蛋白质(下文称为“BP”)，该融合蛋白包含一个或多个延伸重组多肽(“XTEN”)，产生XTEN融合蛋白组合物(下文称为“BPXTEN”)。如下文详述，该融合蛋白可任选地包括间隔序列，该间隔序列可进一步包含切割序列以在被蛋白酶作用时从融合蛋白释放BP。
本文使用的术语“BPXTEN”意在包括融合多肽，该融合多肽包含一个或两个各自包含介导一个或多个生物学或治疗活性的生物活性蛋白质的有效负荷区，和至少另一个包含至少一个XTEN多肽的区域。
本发明组合物的BP，特别是表3-8中公开的那些BP，及其相应的核酸和氨基酸序列，是本领域公知的，其说明和序列可从公共数据库中获得，如Chemical Abstracts Services Databases(例如，CAS Registry)、GenBank、The Universal Protein Resource(UniProt)和订购的数据库如GenSeq(例如，Derwent)。多核苷酸序列可以是编码给定BP的野生型多核苷酸序列(例如，全长或成熟的)，或者在一些情况中，该序列可以是野生型多核苷酸序列的变体(例如，编码野生型生物活性蛋白质的多核苷酸，其中该多核苷酸的DNA序列已被优化，例如，用于在特定物种中表达；或编码野生型蛋白质变体如定点突变体或等位基因变体的多核苷酸)。本领域技术人员能够利用BP的密码子优化的变体的野生型或共有cDNA序列，利用本领域已知的方法和/或结合此处提供的指导和方法，并且如实施例更全面描述的，产生本发明的BPXTEN构建体。
用于包括在本发明的BPXTEN中的BP可以包括具有生物学、治疗、预防或诊断意义或功能的任何蛋白质，或者可用于当施用于受试者时介导生物活性或预防或缓解疾病、障碍或病症。特别有意义的是其药代动力学参数改善、溶解度提高、稳定性增强或具有一些其它增强的药学性质的BP，或延长终末半衰期将改善有效性、安全性或导致给药频率降低和/或改善患者依从性的BP。因此，为了各种目的制备BPXTEN融合蛋白组合物，包括与未连接到XTEN的BP相比改善生物活性化合物的治疗效果，例如，这是通过当施用于受试者时提高体内暴露或延长BPXTEN保持在治疗窗内的时间长度。
本发明的BP可以是天然、全长蛋白质，或者可以是生物活性蛋白质的片段或序列变体，其保留天然蛋白质的至少一部分生物活性。
在一个实施方案中，引入组合物中的BP可以是具有对应于自然中发现的蛋白质的序列的重组多肽。在另一实施方案中，BP可以是天然序列的序列变体、片段、同源物和模拟物，它们保留天然BP的至少一部分生物活性。在非限制性实例中，BP可以是与选自表3-8的蛋白质序列有至少大约80％的序列同一性或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白可以包含连接到XTEN的一个BP分子(如以下更全面描述)。在另一实施方案中，BPXTEN可包含第一BP和第二分子的相同BP，产生包含连接到一个或多个XTEN的两个BP的融合蛋白(例如，两分子胰高血糖素，或两分子hGH)。
通常，BP当体内使用时或当在体外试验中使用时，将显示对给定靶标的结合特异性或另一种希望的生物学特征。例如，BP可以是激动剂、受体、配体、拮抗剂、酶或激素。特别有意义的是使用的或已知可用于疾病或障碍的BP，其中天然BP具有相对短的终末半衰期，并且药代动力学参数的增强(任选地能够通过间隔序列的切割从融合蛋白上释放)将允许频率较低的给药或者增强的药理学效果。感兴趣的还有在最小有效剂量或血液浓度(Cmin)和最大耐受剂量或血液浓度(Cmax)之间具有窄治疗窗的BP。在这些情况中，与未连接到XTEN的BP相比，BP连接到包含选择的XTEN序列的融合蛋白可导致这些性质改善，使它们可用作治疗剂或预防剂。
本发明组合物中包括的BP可以在各种治疗或疾病种类的治疗中应用，包括但不限于葡萄糖和胰岛素疾病、代谢性疾病、心血管疾病、凝血/出血疾病、生长障碍或病症、肿瘤发生病症、炎性病症、自身免疫病症等。
(a)葡萄糖调节肽
内分泌和肥胖症相关的疾病或障碍在大多数发达国家已经达到流行比例，并且是大多数发达国家的重要的和逐渐增长的卫生保健负担，包括多种影响身体的器官、组织和循环系统的病症。特别关注的是内分泌和肥胖症相关的疾病或障碍。其中主要的是糖尿病：美国的主要死因之一。糖尿病分为两种主要亚型：I型，也被称为青少年糖尿病，或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，和II型，也称为成年发病型糖尿病，或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。I型糖尿病是一种自身免疫性疾病的形式，完全或部分破坏这些患者的胰腺中产生胰岛素的细胞，并且在其一生中需要使用外源性胰岛素。甚至在良好控制的患者中，也可发生偶发并发症，其中有些是危及生命。
在II型糖尿病患者中，餐后血糖水平上升不会适当地刺激胰腺产生胰岛素。此外，外围组织一般抵抗胰岛素的影响，这些患者往往具有比正常更高的血浆胰岛素水平(高胰岛素血症)，因为身体试图克服其胰岛素抗性。在晚期的疾病状态下胰岛素分泌也受到影响。
胰岛素抗性和高胰岛素血症也已与其他两个构成相当大的健康风险的代谢性疾病(葡萄糖耐量低减和代谢性肥胖)相联系。葡萄糖耐量低减的特点是进食前血糖水平正常，餐后倾向于水平升高(高血糖症)。这些人被认为具有较高的糖尿病和冠状动脉疾病的风险。肥胖也是一种称为胰岛素抗性综合征或“X综合征”的一组病症的危险因素，如同高血压、冠状动脉疾病(动脉粥样硬化)和乳酸性酸中毒，以及相关的疾病状态一样。肥胖的发病机制被认为是多因素的，但一个根本的问题是，在肥胖中，养分获得和能量消耗不平衡，直到有多余的脂肪组织。其他相关的疾病或障碍包括但不限于，妊娠糖尿病、青少年糖尿病、肥胖、食欲过度、饱感不足、代谢性疾病、胰高血糖素瘤、视网膜神经变性过程、I型糖尿病的“蜜月期”。
血脂异常在糖尿病患者之间频繁发生；通常其特征在于升高的血浆甘油三酯、低HDL(高密度脂蛋白胆固醇)，正常至升高水平的LDL(低密度脂蛋白)胆固醇和水平提高的小而致密的血流中的LDL颗粒。血脂异常是冠脉事件和糖尿病患者死亡的发病率增加的一个主要原因。
葡萄糖稳态和胰岛素反应中的大多数代谢过程受多种肽和激素的调节，并且很多这样的肽和激素及其类似物已用于代谢性疾病和病症的治疗。许多这样的肽往往彼此高度同源，甚至在它们具有相反的生物学功能时。增加葡萄糖的肽的例子有肽类激素胰高血糖素，而降低葡萄糖的肽包括毒蜥外泌肽-4、胰高糖素样肽1和糊精。然而，治疗肽和/或激素的使用，即使在被小分子药物的应用增强时，在此类疾病和障碍的控制中也只有有限的成功。特别是，剂量优化对于代谢性疾病治疗中使用的药品和生物制剂(尤其是具有窄治疗窗的那些)是重要的。一般的激素和参与葡萄糖稳态的肽往往有窄治疗窗。窄治疗窗，再加上这些激素和肽通常具有短半衰期的事实，这就需要频繁给药，以达到临床益处，导致对此类患者的控制困难。虽然对治疗性蛋白质的化学修饰，如聚乙二醇化，可以改变其在体内的清除率和随后的血清半衰期，但它需要额外的制造步骤，并且产生非均质的最终产品。此外，慢性给药引起的不可接受的副作用已有报道。另外，通过Fc域与治疗性蛋白质或肽的融合的遗传修饰增加了治疗性蛋白质的大小，使得通过肾脏的清除率降低，促进通过FcRn受体从溶酶体回收。遗憾的是，Fc域在重组表达过程中不能有效折叠，往往形成不溶性沉淀，被称为包涵体。必须将这些包涵体溶解，功能性蛋白质必须被复性，这是一个费时、低效、昂贵的过程。
因此，本发明的一个方面是在BPXTEN融合蛋白中引入与葡萄糖稳态、胰岛素抗性和肥胖有关的肽(统称为“葡萄糖调节肽”)，以产生用于治疗葡萄糖、胰岛素和肥胖障碍、疾病和相关病症的组合物。葡萄糖调节肽可包括具有生物、治疗或预防意义或功能的任何蛋白质，可用于预防、治疗、介导或缓解葡萄糖稳态或胰岛素抗性或肥胖的疾病、障碍或病症。可以连接到XTEN产生BPXTEN的合适的葡萄糖调节肽包括能够增加葡萄糖依赖性的胰腺β细胞分泌胰岛素或加强胰岛素作用的所有的生物活性多肽。葡萄糖调节肽还可以包括刺激胰腺β细胞中的促胰岛素基因转录的所有的生物活性多肽。此外，葡萄糖调节肽还可以包括减慢胃排空时间和减少食物摄入的所有的生物活性多肽。葡萄糖调节肽还可以包括抑制胰岛α细胞释放胰高血糖素的所有的生物活性多肽。表3提供了本发明BPXTEN融合蛋白包含的葡萄糖调节肽序列的非限制列表。本发明BPXTEN组合物的葡萄糖调节肽可以是与选自表3的蛋白质序列具有至少约80％的序列同一性或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的肽。
表3：葡萄糖调节肽和相应的氨基酸序列
Figure BPA00001431324300581
“肾上腺髓质素”或“ADM”是指人肾上腺髓质素肽类激素和其物种和序列变体，其至少具有成熟ADM的一部分生物活性。ADM是通过连续的酶切和酰胺化从185个氨基酸的前激素原生成的，产生52个氨基酸的生物活性肽，测定的血浆半衰期为22分钟。本发明的含有ADM的融合蛋白可能会特别用于糖尿病，用于对胰岛细胞分泌胰岛素的刺激作用，以用于葡萄糖调节，或用在持续性低血压的患者中。人类AM的完整的基因组构造已经报道(Ishimitsu等人，Biochem.Biophys.Res.Commun 203：631-639(1994))，ADM肽的类似物已被克隆，如美国专利No.6,320,022所述。
“糊精(amylin)”是指被称为糊精、普兰林肽及其物种变体的人肽激素，如美国专利No.5,234,906所述，其具有成熟糊精的生物活性的至少一部分。
糊精是一种37个氨基酸的多肽激素，它由胰腺β细胞响应养分摄入与胰岛素共分泌(Koda等人，Lancet 339：1179-1180.1992)，已经报道其调节碳水化合物代谢的几个关键途径，包括葡萄糖向糖原中的引入。本发明的含糊精融合蛋白特别可用于糖尿病和肥胖症，用于调节胃排空，抑制胰高血糖素分泌和食物摄入，从而影响循环中的葡萄糖出现速率。因此，该融合蛋白可以与胰岛素的作用互补，调节葡萄糖从循环中消失的速率及其被周围组织的摄取。糊精类似物已被克隆，如美国专利Nos.5,686,411和7,271,238所述。可以产生保留生物活性的糊精模拟物。例如，普兰林肽具有序列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID NO：43)，其中来自大鼠糊精序列的氨基酸替代人糊精序列中的氨基酸。在一个实施方案中，本发明涉及包含具有以下序列的糊精模拟物的融合蛋白：KCNTATCATX1RLANFLVHSSNNFGX2ILX2X2TNVGSNTY(SEQID NO：44)，其中X1独立地是N或Q，X2独立地是S、P或G。在一个实施方案中，引入BPXTEN中的糊精模拟物可以具有序列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY(SEQ ID NO：45)。在另一实施方案中，其中糊精模拟物用在BPXTEN的C末端，该模拟物可具有序列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY(NH2)(SEQ IDNO：46)。
“降钙素”(CT)是指人降钙素蛋白和其物种和序列变体，包括鲑鱼降钙素(“sCT”)，其至少具有成熟CT生物活性的一部分。CT是从甲状腺的较大激素原上切下的32个氨基酸的肽，似乎在神经和血管系统中起作用，但也已报道是饱感反射的强有力的激素介质。CT的命名是根据响应诱导的高钙血症的分泌及其快速的降血钙效果。它在被称为C细胞的甲状腺神经内分泌细胞中产生和分泌。CT对破骨细胞有影响，并且CT抑制破骨细胞功能导致骨吸收减少。CT的体外效应包括皱褶缘的快速丢失和溶酶体酶释放减少。CT(1-32)的一个主要功能是对抗紧急情况下的急性高钙血症和/或在“钙应激”如生长、怀孕和哺乳期间保护骨骼。(综述见Becker，JCEM，89(4)：1512-1525(2004)和Sexton，Current Medicinal Chemistry 6：1067-1093(1999))。本发明的包含降钙素的融合蛋白特别可用于治疗骨质疏松症和作为佩吉特骨病的治疗。合成降钙素肽已经产生，如美国专利Nos.5,175,146和5,364,840所述。“降钙素基因相关肽”或“CGRP”是指人类CGRP的肽和其物种和序列变体，其具有成熟CGRP的至少一部分的生物活性。降钙素基因相关肽是肽降钙素家族的成员，在人类中存在两种形式：α-CGRP(37个氨基酸肽)和β-CGRP。CGRP与人糊精具有43-46％的序列同一性。本发明的含有CGRP的融合蛋白特别可用于减少与糖尿病相关的发病率，减轻高血糖和胰岛素缺乏，抑制淋巴细胞浸润胰岛，和保护β细胞免受自身免疫性破坏。用于制备合成的和重组的CGRP的方法在美国专利No.5,374,618中描述。
“胆囊收缩素”或“CCK”是指人类CCK的肽和其物种和序列变体，其至少具有成熟CCK的一部分生物活性。CCK-58是成熟的序列，而在人类首次确定的CCK-33的氨基酸序列是肽的主要循环形式。CCK家族也包括8个氨基酸的体内C末端片段(“CCK-8”)、为C末端肽CCK(29-33)的五肽胃泌素或CCK-5和为C末端四肽CCK(30-33)的CCK-4。CCK是负责刺激脂肪和蛋白质消化的胃肠道系统的肽激素。本发明的包含CCK-33和CCK-8的融合蛋白特别可用于减少餐后循环葡萄糖增加，和加强循环胰岛素的增加。CCK-8的类似物已经制备，如美国专利No.5,631,230所述。
“毒蜥外泌肽-3”是指从念珠蜥蜴(Heloderma horridum)分离的葡萄糖调节肽及其序列变体，其至少具有成熟毒蜥外泌肽-3的一部分生物活性。毒蜥外泌肽-3酰胺是特异性的毒蜥外泌肽受体拮抗剂，它介导胰腺cAMP的增加和胰岛素和淀粉酶的释放。本发明的包含毒蜥外泌肽-3的融合蛋白尤其可用于治疗糖尿病和胰岛素抗性疾病。序列和其检测方法在美国专利5,4242,86中记载。
“毒蜥外泌肽-4”是指在希拉毒蜥(Heloderma suspectum)的唾液中发现的葡萄糖调节肽，及其物种和序列变体，包括天然的39氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：47)和其同源序列和肽类似物，和变体；天然序列，例如来自灵长类动物，和非天然的，具有成熟毒蜥外泌肽-4的至少一部分生物活性。毒蜥外泌肽-4是一种肠促胰岛素多肽激素，其降低血糖，促进胰岛素分泌，延缓胃排空和提高饱感，提供了餐后高血糖的明显改善。毒蜥外泌肽与胰高血糖素样肽家族成员有一定的序列相似性，具有最高同一性的是GLP-1(Goke等人，J.Biol.Chem.，268：19650-55(1993))。多种同源序列在功能上可能等同于天然毒蜥外泌肽-4和GLP-1。不同物种间GLP-1序列的保守在Regulatory Peptides2001 98 p.1-12中公开。表4显示了来自多种物种的序列，而表5显示了合成GLP-1类似物的列表；它们都用于此处所述的BPXTEN。毒蜥外泌肽-4在分泌胰岛素的βTC1细胞上的GLP-1受体处结合，并且也刺激生长抑素的释放，并抑制分离的胃中释放胃泌素(Goke等人，J.Biol.Chem.268：19650-55，1993)。由于GLP-1的类似物，毒蜥外泌肽-4，显示类似的范围很广的生物活性，但仍有比GLP-1更长的半衰期，平均终末半衰期为2.4小时。艾塞那肽是毒蜥外泌肽-4的合成形式，作为Byetta销售。然而，由于其半衰期短，艾塞那肽目前每日给药两次，限制了它的应用。本发明的包含毒蜥外泌肽-4的融合蛋白特别可用于治疗糖尿病和胰岛素抗性疾病。
“成纤维细胞生长因子21”或“FGF-21”是指FGF21基因编码的人类蛋白质，或其物种和序列变体，其具有成熟FGF21的至少一部分生物活性。FGF-21能刺激脂肪细胞对葡萄糖的摄取，但在其他类型的细胞中不这样；效果与胰岛素活性是加成性的。在ob/ob小鼠中注射FGF-21导致脂肪组织中GLUT1增加。FGF21当在转基因小鼠中表达时还保护动物免于饮食诱导的肥胖以及当施用于糖尿病啮齿类动物时降低血糖和甘油三酯水平(Kharitonenkov A等人，(2005).“FGF-21 as a novelmetabolic regulator”.J.Clin.Invest.115：1627-35)。本发明的含FGF-21的融合蛋白特别可用于治疗糖尿病，包括导致能量消耗增加、脂肪利用和脂质排泄。FGF-21已被克隆，如美国专利No.6,716,626所述。
“FGF-19”或“成纤维细胞生长因子19”是指人类FGF19基因编码的蛋白质，或其物种和序列变体，其中至少具有成熟FGF-19的一部分生物活性。FGF-19是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的蛋白质成员。FGF家族成员具有广泛的有丝分裂和细胞存活活性，并参与多种生物学过程。FGF-19增加瘦素受体的肝脏表达，代谢率，刺激脂肪细胞对葡萄糖的摄取，在肥胖小鼠模型中导致体重减轻(Fu，L等人)。本发明的含有FGF-19的融合蛋白特别可用于提高代谢率和逆转饮食和瘦素缺乏的糖尿病。FGF-19已被克隆和表达，如美国专利申请号No.20020042367所述。
“胃泌素”是指人类胃泌素肽、截短形式和其物种和序列变异，其具有成熟胃泌素的至少一部分生物活性。胃泌素是十二指肠G细胞和胃幽门窦产生并分泌到血液中的线性肽激素。发现胃泌素主要有三种形式：胃泌素-34(“大胃泌素”)；胃泌素-17(“小胃泌素”)；和胃泌素-14(“微胃泌素”)。它与CCK有序列同源性。本发明的含胃泌素的融合蛋白特别可用于治疗肥胖和糖尿病，用于血糖调节。已经合成了胃泌素，如美国专利5,843,446所述。
“生长素释放肽”是指诱导饱感的人类激素或其物种及其序列变体，包括天然的、加工的27或28个氨基酸序列和同源序列。生长素释放肽主要由衬于人胃底部的P/D1细胞和刺激饥饿的胰腺epsilon细胞产生，被认为是瘦素的对应激素。生长素释放肽水平在饭前提高在饭后降低，并可能通过在下丘脑水平发挥的作用导致食物摄入增加和脂肪量增加。生长素释放肽也刺激生长激素的释放。生长素释放肽在丝氨酸残基处被正辛酸酰化；这种酰化对于与GHS1a受体的结合和对于生长素释放肽的GH释放能力是必需的。本发明的含有生长素释放肽的融合蛋白特别可用作激动剂；例如，在胃肠动力障碍中选择性地刺激胃肠道蠕动，加速胃排空，或刺激生长激素的释放。具有序列置换的生长素释放肽的类似物或截短变体，如美国专利7385026中所述的，特别可用作与XTEN的融合配偶体，以作为抑制剂用于改善稳态，治疗胰岛素抗性和治疗肥胖。生长素释放肽的分离和表征已有报道(Kojima M等人，Ghrelin is agrowth-hormone-releasing acylated peptide from stomach.Nature.1999；402(6762)：656-660.)，并且已经通过肽合成制备了合成类似物，如美国专利No.6,967,237所述。
“胰高血糖素”是指人胰高血糖素葡萄糖调节肽，或其物种和序列变体，包括天然29氨基酸序列和同源序列；天然的，如来自灵长类动物，和非天然的序列变体，具有成熟胰高血糖素的至少一部分生物活性。术语“胰高血糖素”在本文使用时也包括胰高血糖素的肽模拟物。天然胰高血糖素由胰产生，当血糖水平降至过低时释放，使肝脏将贮存的糖原转化为葡萄糖并将其释放至血流中。胰高血糖素的作用与胰岛素相反，它发出信号使身体细胞从血流中吸收葡萄糖，胰高血糖素也刺激胰岛素的释放，使得血流中新获得的葡萄糖可以被胰岛素依赖性组织吸收和利用。本发明的含胰高血糖素的融合蛋白特别可用于提高已有肝糖原贮存的个体的血液葡萄糖水平，并保持糖尿病中的葡萄糖稳态。胰高血糖素已被克隆，如美国专利No.4,826,763所述。
“GLP-1”是指人类胰高血糖素样肽1和其序列的变体，其至少具有成熟GLP-1的一部分生物活性。术语“GLP-1”包括人GLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1刺激胰岛素的分泌，但只是在高血糖时期。这种性质以及以下发现增加了GLP-1相比胰岛素的安全性：胰岛素的分泌量与高血糖的程度成正比。GLP-1(7-37)OH的生物半衰期只有3～5分钟(美国专利号5,118,666)。本发明的含有GLP-1的融合蛋白特别可用于治疗糖尿病和胰岛素抗性疾病，用于血糖调节。GLP-1已被克隆并且制备了衍生物，如美国专利5,118,666所述。来自多个物种的GLP-1序列的非限制的例子如表4所示，表5显示了大量合成GLP-1类似物的序列；它们预期都用于本文所述的BPXTEN组合物中。
表4：天然GLP-1同源物
Figure BPA00001431324300641
GLP天然序列可以用几个基序描述，它们如下所示。括号中的字母代表每个序列位置上可接受的氨基酸：[HVY][AGISTV][DEHQ][AG][ILMPSTV][FLY][DINST][ADEKNST][ADENSTV][LMVY][ANRSTY][EHIKNQRST][AHILMQVY][LMRT][ADEGKQS][ADEGKNQSY][AEIKLMQR][AKQRSVY][AILMQSTV][GKQR][DEKLQR][FHLVWY][ILV][ADEGHIKNQRST][ADEGNRSTW][GILVW][AIKLMQSV][ADGIKNQRST][GKRSY]。另外，GLP-1的合成类似物可用作与XTEN的融合配偶体，以产生具有可用于治疗葡萄糖相关疾病的生物活性的BPXTEN。与毒蜥外泌肽-4或GLP-1同源的其它序列可通过标准同源性搜索技术发现。
表5：GLP-1合成类似物
  SEQ ID NO：   序列
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“GLP-2”是指人类胰高血糖素样肽-2和其序列的变体，其至少具有成熟GLP-2的一部分生物活性。更特别的是，GLP-2是一种33个氨基酸的肽，与GLP-1一起从小肠和大肠的肠道内分泌细胞分泌。
“IGF-1”或“胰岛素样生长因子1”是指人类IGF-1蛋白和其物种和序列变体，其至少具有成熟IGF-1的一部分生物活性。IGF-1，曾经被称为生长调节素C，是一种多肽蛋白质合成代谢激素，在分子结构上与胰岛素相似，并调节生长激素的作用。IGF-1由70个氨基酸组成，主要由肝脏作为内分泌激素产生以及在靶组织中以旁分泌/自分泌方式产生。本发明的含有IGF-1的融合蛋白特别可用于治疗糖尿病和胰岛素抗性疾病，用于血糖调节。IGF-1已被克隆并在大肠杆菌和酵母中表达，如美国专利号5324639所述。
“IGF-2”或“胰岛素样生长因子2”是指人IGF-2蛋白和其物种和序列变体，其至少具有成熟IGF-2一部分生物活性。IGF-2是一种多肽蛋白质激素，在分子结构上类似于胰岛素，主要作用是在妊娠期间作为生长促进激素。IGF-2已被克隆，如Bell GI等人，Isolation of the humaninsulin-like groth factor genes：insulin-like groth factor II and insulin genesare contiguous.Proc Natl Acad Sci U S A.1985.82(19)：6450-4所述。
“INGAP”或“胰岛新生相关蛋白”或“胰岛β细胞生长因子”是指人INGAP肽和其物种和序列变体，其至少具有成熟INGAP的一部分生物活性。INGAP能够启动胆管细胞增殖，这是胰岛新生的先决条件。本发明的含有INGAP的融合蛋白特别可用于治疗或预防糖尿病和胰岛素抗性疾病。INGAP已被克隆和表达，如R Rafaeloff R等人，Cloning andsequencing of the pancreatic islet neogenesis associated protein(INGAP)gene and its expression in islet neogenesis in hamsters.J Clin Invest.1997.99(9)：2100-2109所述。
“促黑激素”或“AFP-6”是指人促黑激素肽和其物种和序列变体，其至少具有成熟促黑激素的一部分生物活性。促黑激素是降钙素受体样受体的配体。促黑激素治疗导致正常和高血压受试者的血压下降，以及抑制胃排空活动，并且参与葡萄糖稳态。本发明的含有促黑激素的融合蛋白特别可用于治疗糖尿病、胰岛素抗性疾病和肥胖。促黑激素肽和变体已被克隆，如美国专利6,965,013所述。
“瘦素”是指来自任何物种的自然产生的瘦素，及其生物活性D-异构体，或片段和序列变体。瘦素在调节能量摄入和能量消耗，包括食欲和新陈代谢中起关键作用。本发明的含有瘦素的融合蛋白特别可用于在治疗糖尿病中进行葡萄糖调节，用于胰岛素抗性疾病和肥胖。瘦素是ob基因的多肽产物，如国际专利公布WO 96/05309所述。瘦素已被克隆，如美国专利No.7,112,659所述，瘦素类似物和片段在美国专利No.5,521,283，美国专利No.5,532,336，PCT/US96/22308和PCT/US96/01471中描述。
“神经调节肽”是指包括神经调节肽U和S肽及其序列变体的神经调节肽家族。天然活性神经调节肽U肽类激素是神经调节肽-U25，特别是其酰胺形式。特别感兴趣的是其加工的活性肽激素及类似物、衍生物和片段。神经调节肽U家族包括各种截短或剪接变体，例如，FLFHYSKTQKLGKSNVVEELQSPFASQSRGYFLFRPRN(SEQ ID NO：180)。神经调节肽S家族的例子是人神经调节肽S，其序列为ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN(SEQ ID NO：181)，特别是其酰胺形式。本发明的含有神经调节肽的融合蛋白特别可用于治疗肥胖症、糖尿病，减少食物摄入，以及用于如本文所述的其他相关病症和障碍。特别感兴趣的是神经调节肽成分与糊精家族肽、毒蜥外泌肽肽家族或GLP I肽家族成分的组合。
“调酸素(Oxyntomodulin)”或“OXM”是指人调酸素和其物种和序列变体，其至少具有成熟OXM的一部分生物活性。OXM是在结肠内产生的一种37个氨基酸的肽，包含胰高血糖素的29个氨基酸的序列，之后是8个氨基酸的羧基末端延伸。已发现OXM能抑制食欲。本发明的含有OXM的融合蛋白特别可用于调节血糖以治疗糖尿病、用于胰岛素抗性疾病、肥胖，并可用作减肥治疗。
“PYY”是指人类肽YY多肽和其物种和序列变体，其至少具有成熟PYY的一部分生物活性。PYY包括人类全长、36氨基酸肽、PYY1-36和PYY3-36，它们具有PP折叠结构基序。PYY抑制胃肠蠕动，增加结肠中的水和电解质的吸收。PYY也可能抑制胰液分泌。本发明的含PYY的融合蛋白特别可用于调节血糖以治疗糖尿病、用于胰岛素抗性症和肥胖。PYY类似物已经制备，如美国专利美国专利Nos.5,604,203，5,574,010和7,166,575所述。
“尿皮质激素”是指人尿皮质激素肽激素和其序列变体，其至少具有成熟尿皮质激素的一部分生物活性。人类有三种尿皮质激素：Ucn-1，Ucn-2和Ucn-3。其它的尿皮质激素和类似物已在美国专利6214797中记载。尿皮质激素Ucn-2和Ucn-3具有食物摄入抑制、降压、保护心脏和影响肌肉收缩力的性质。Ucn-2和Ucn-3具有在应激刺激如节食/禁食后抑制慢性HPA激活的能力，对于CRF 2型受体是特异性的，并且不激活介导ACTH释放的CRF-R1。包含尿皮质激素例如Ucn-2和Ucn-3的BPXTEN可用于血管扩张，因而可用于心血管疾病，如慢性心衰竭。本发明的含有尿皮质激素的融合蛋白也可用于治疗或预防与刺激ACTH释放有关的病症，血管扩张效应引起的高血压，通过ACTH升高以外介导的炎症，高热，食欲紊乱，充血性心力衰竭，应激，焦虑和牛皮癣。含尿皮质激素的融合蛋白也可与利钠肽成分、糊精家族和毒蜥外泌肽家族或GLP1家族成分组合，提供增强的心血管益处，例如治疗CHF，例如通过提供有益的血管舒张作用。
(b)用于代谢性疾病和心血管疾病的蛋白质
代谢和心血管疾病是大多数发达国家的庞大的医疗负担，心血管疾病仍然是美国和大部分欧洲国家的死亡和残疾的首要原因。代谢性疾病和精神障碍包括大量的影响器官、组织和体内循环系统的病症。其中首要的是糖尿病：在美国的主要死亡原因之一，因为它在脉管系统、中枢神经系统、主要脏器及周围组织中导致病理和代谢功能障碍。胰岛素抗性和高胰岛素血症也已与两种造成相当大的健康风险的其他代谢紊乱相联系：糖耐量降低和代谢性肥胖。糖耐量降低的特点是进食前血糖水平正常，而餐后倾向于水平升高(高血糖)。这些个体被认为具有较高的糖尿病和冠状动脉疾病的风险。肥胖也是称为胰岛素抗性综合征或“综合征X”的一组病症的一个危险因素，如同高血压、冠状动脉疾病(动脉粥样硬化)、乳酸性酸中毒，以及相关的疾病状态一样。肥胖的发病机制被认为是多因素的，但一个根本的问题是肥胖、养分利用率和能源消耗失衡，直到有多余的脂肪组织。
血脂异常在糖尿病患者和心血管疾病患者中经常发生；其典型特征为以下参数，如升高的血浆甘油三酯，低HDL(高密度脂蛋白)胆固醇，正常至升高水平的LDL(低密度脂蛋白)胆固醇，和血液中水平升高的致密的小LDL颗粒。血脂异常和高血压是冠脉事件、肾脏疾病发病率和代谢性疾病如糖尿病和心血管疾病患者死亡率上升的主要贡献者。
心血管疾病可以表现为许多障碍、症状和涉及心脏、脉管系统和全身器官系统的临床参数的变化，包括微动脉瘤、咽峡炎、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管病、充血性心力衰竭、冠状动脉病、心肌梗死、心排血量减少和外周血管病、高血压、低血压、血流标志物(例如，C反应蛋白、BNP和酶，如CPK、LDH、SGPT、SGOT)，等等。
大多数代谢过程和许多心血管参数受多种肽和激素(“代谢蛋白质”)调节，并且发现许多这样的肽和激素以及其类似物可用于治疗这类疾病和障碍。然而，治疗肽和/或激素的使用，即使在被小分子药物的应用增强时，此类疾病和障碍的控制也只有有限的成功。特别是，剂量优化对于代谢性疾病治疗中使用的药品和生物制剂(尤其是具有窄治疗窗的那些)是重要的。一般的激素和参与葡萄糖稳态的肽往往有窄治疗窗。窄治疗窗，再加上这些激素和肽通常具有短半衰期的事实，这就需要频繁给药，以达到临床益处，导致对此类患者的控制困难。因此，仍然需要在代谢性疾病的治疗方面具有提高的疗效和安全性的治疗剂。
因此，本发明的一个方面是向BPXTEN融合蛋白中引入参与或用于治疗代谢和心血管疾病和障碍的生物活性代谢蛋白质，以产生用于治疗这类障碍、疾病和病症的组合物。代谢蛋白质可以包括具有生物学、治疗、预防或诊断意义或功能、可用于预防、治疗、介导或缓解代谢或心血管疾病、障碍或病症的任何蛋白质。表6提供了本发明的BPXTEN融合蛋白包含的代谢BP的这类序列的非限制性列表。本发明的BPXTEN组合物的代谢蛋白质可以是显示与选自表6的蛋白质序列有至少大约80％的序列同一性或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的蛋白质。
表6：用于代谢性疾病和心脏病的生物活性蛋白质
Figure BPA00001431324300711
“抗CD3”是指针对T细胞表面蛋白CD3的单克隆抗体、物种和序列变体和其片段，包括OKT3(也称为muromonab)和人源化抗CD3(hOKT31(Ala-Ala))(KC Herold等人，New England Journal of Medicine346：1692-1698.2002)。抗CD3通过结合所有分化T细胞上存在的T细胞受体复合物阻止T细胞活化和增殖。本发明的含抗CD3的融合蛋白可用于减缓新发的1型糖尿病，包括使用抗CD3作为治疗效应物以及作为针对BPXTEN组合物中的第二治疗BP的靶向部分。可变区序列和抗CD3的产生已在美国专利Nos.5,885,573和6,491,916中描述。
“IL-1ra”是指人IL-1受体拮抗蛋白和其物种和及其序列变体，包括序列变体阿那白滞素(Kineret
Figure BPA00001431324300722
)，至少具有成熟IL-1ra的一部分生物活性。人IL-1ra是152个氨基酸残基的成熟糖蛋白。IL-1ra的抑制作用是由于它与I型IL-1受体的结合。该蛋白质具有25kDa的天然分子量，分子显示与IL-1α(19％)和IL-1β(26％)有有限的序列同源性。阿那白滞素是非糖基化的重组人IL-1ra，与内源性人IL-1ra的不同在于添加了N-末端甲硫氨酸。一种商业形式的阿那白滞素以Kineret销售。它以相同的亲和力结合天然IL-1ra和IL-1b，但不会导致受体激活(信号转导)，这是相比在IL-1α和IL-1β上有两个受体结合基序，在IL-1ra上只有一个受体结合基序引起的效应。阿那白滞素有153个氨基酸和17.3kD的大小，并已报告半衰期约为4-6小时。
在以下患者中已经报道了IL-1产生增加：各种病毒、细菌、真菌和寄生虫感染；血管内凝血；高剂量的IL-2治疗；实体瘤；白血病；阿尔茨海默病；HIV-1感染；自身免疫病；创伤(手术)；血液透析；缺血性疾病(心肌梗死)；非传染性肝炎；哮喘；紫外线辐射；闭合性颅脑损伤；胰腺炎；腹膜炎；移植物抗宿主病；移植排斥反应；和健康者在剧烈运动后。阿尔茨海默病患者中IL-1b产生增加与IL-1在淀粉样前体蛋白释放中可能的作用有关。IL-1也已与以下疾病相关联：2型糖尿病，肥胖，高血糖，高胰岛素血症，1型糖尿病，胰岛素抗性，视网膜神经变性过程，以胰岛素抗性为特征的疾病状态和病症，急性心肌梗死(AMI)，急性冠脉综合征(ACS)，动脉粥样硬化，慢性炎症紊乱，类风湿关节炎，退行性椎间盘疾病，结节病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，妊娠糖尿病，食欲过盛，饱感不足，代谢性疾病，胰高血糖素瘤，气道分泌性疾病，骨质疏松，中枢神经系统疾病，再狭窄，神经变性疾病，肾功能衰竭，充血性心力衰竭，肾病综合征，肝硬化，肺水肿，高血压，希望减少食物摄入的疾病，肠易激综合征，心肌梗塞，中风，手术后的代谢变化，冬眠心肌，糖尿病性心肌病，尿钠排泄不足，尿钾浓度过多，与毒性血容量过多有关的病症或疾病，多囊卵巢综合征，呼吸窘迫，慢性皮肤溃疡，肾病，左心室收缩功能不全，胃肠道腹泻，术后倾倒综合征，肠易激综合征，危重病性多发性神经病(CIPN)，全身炎症反应综合征(SIRS)，血脂异常，缺血再灌注损伤，冠心病危险因素(CHDRF)综合征。本发明的含IL-1ra的融合蛋白可用于治疗上述疾病和障碍。IL-1ra已被克隆，如美国专利Nos.5,075,222和6,858,409所述。
“利钠肽”是指心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP或B型利钠肽)和C型利钠肽(CNP)；人类和非人类物种和序列变体，其具有成熟对应利钠肽的至少一部分生物活性。α心房利钠肽(aANP)或(ANP)及脑利钠肽(BNP)和C型利钠肽(CNP)是同源多肽激素，参与调节体液和电解质的动态平衡。有用形式的利钠肽的序列在美国专利公布20010027181公开。ANP的例子包括人ANP(Kangawa等人，BBRC 118：131(1984))，或来自不同物种的形式，包括猪和大鼠ANP(Kangawa等人，BBRC 121：585(1984))。序列分析表明，preproBNP由134个残基组成，被切割为108个氨基酸的proBNP。从proBNP的C末端切割32个氨基酸序列产生人BNP(77-108)，它是循环的生理活性形式。32氨基酸的人BNP涉及二硫键的形成(Sudoh等人，BBRC159：1420(1989)和美国专利Nos.5,114,923，5,674,710，5,674,710和5,948,761)。包含一个或多个尿钠排泄功能的BPXTEN可以用于治疗高血压，利尿诱导，排钠诱导，血管扩张或放松，利钠肽受体(如NPR-A)的结合，肾的apida分泌抑制，肾上腺的醛固酮分泌抑制，治疗心血管疾病和失调，减少、停止或逆转心脏事件后或充血性心力衰竭引起的心脏重构，治疗肾脏疾病和失调，治疗或预防缺血性中风，及治疗哮喘。
“FGF-2”或肝素结合生长因子2，是指人类FGF-2蛋白，和其物种和序列变体，其至少具有成熟对应物的一部分生物活性。FGF-2已显示出刺激分化成纹状体样神经元的神经干细胞的增殖，和在毒素诱导的亨廷顿疾病模型中保护纹状体神经元，也已用于治疗心脏再灌注损伤，并可具有内皮细胞生长、抗血管生成和肿瘤抑制性质，伤口愈合，以及促进骨折愈合。FGF-2已被克隆，如Burgess，W.H.and Maciag，T.，Ann.Rev.Biochem.，58：575-606(1989)；Coulier，F.等人，1994，Prog.GrowthFactor Res.5：1；和PCT公布WO 87/01728所述。
“TNF受体”是指人类TNF受体，和其物种和序列变体，其至少具有成熟TNFR的一部分生物受体活性。p75 TNF受体分子是p75 TNF受体的胞外域，来自于结构上同源的受体家族，其中包括p55 TNF受体。TNFα和TNFβ(TNF配体)与p55和p75TNF受体竞争结合。人p55TNF受体和TNFβ的胞外结构域形成的复合物的X-射线晶体结构已被确定(Banner等人Cell 73：431，1993，在此引入作为参考)。
(c)凝血因子
在血友病中，凝血受到缺乏某些血浆凝血因子的干扰。人因子IX(FIX)是一种丝氨酸蛋白酶的酶原，它是凝血级联的内源性途径的一个重要成分。在没有FIX缺乏的个体中，FIX的平均半衰期很短，约为18-24小时。在大约1/30000男性中发生的X-连锁疾病引起的功能FIX缺陷导致血友病B，也称为Christmas病。已经记载了超过100个因子IX的突变；其中一些不引起症状，但许多导致明显的出血性疾病。如果不及时治疗，血友病B与损伤后无法控制的肌肉、关节和体腔内的出血有关，并可能导致死亡。此前，该疾病的治疗包括施用由来自供体库的人血浆制备的FIX，这具有随之而来的感染血源性病毒的风险，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)。最近，重组FIX产品已经市售。外来提供的因子IX的体内活性受到蛋白质半衰期和凝血抑制剂(包括抗凝血酶III)的限制。因子IX组合物通常有短半衰期，这需要经常注射。此外，目前的基于FIX的疗法由于较差的生物利用度，需要静脉给药。于是，需要当作为血友病B的预防和/或治疗方案的一部分施用时具有延长的半衰期和保留活性的因子IX组合物。
凝血的生理触发是在表达TF的细胞表面上在组织因子(TF)和VIIa(FVIIa)之间形成复合物，它们通常位于脉管外。这将导致因子IX和因子X的激活，最终产生一些凝血酶。凝血酶又激活因子VIII和因子IX，所谓的血液凝血级联的“内源性”部分，从而增加Xa因子的生成，这是产生全面凝血酶爆发以达到完全止血所需的。后来证明，通过施用高浓度的因子VIIa，可以实现止血，而在某些出血性疾病中不需要因子VIIIA和因子IXA。凝血和出血性疾病可导致凝血酶原时间、部分凝血酶原时间、出血时间、凝血时间、血小板计数、凝血酶原片段1+2(F1+2)、凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)、D-二聚体、出血发生率、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白和血液中凝血因子浓度等参数的变化。
因此，发现因子VIIa(FVIIa)蛋白质可用于治疗使用FVIII或FIX抑制剂的血友病A或B患者和获得性血友病患者的出血发作，以及预防使用FVIII或FIX抑制剂的血友病A或B患者外科干预或侵入性操作的出血。此外，因子VIIa可以用于治疗先天性因子VII缺乏症患者的出血发作和预防先天性FVII缺乏患者的手术干预或侵入性操作中的出血。然而，静脉注射含有FVIIa的产品可能导致副作用，包括血栓事件、发烧和注射部位反应。此外，因子FVIIa的半衰期短，约为2小时，限制了其应用，可能每2-4小时需要重复注射，以达到止血。因此，仍然需要在作为血友病B的预防和/或治疗方案的一部分施用时具有延长的半衰期和保留活性的因子IX和因子VIIa组合物，以及减少副作用并可通过静脉和皮下途径给药的制剂。
用于包含在本发明BPXTEN内的凝血因子可以包括具有生物学、治疗、预防或诊断意义或功能、可用于预防、治疗、介导或缓解凝血疾病、障碍或缺陷的蛋白质。合适的凝血蛋白包括作为底物、酶或辅因子参与凝血级联的生物活性多肽。
表7提供了本发明的BPXTEN融合蛋白包含的凝血因子序列的非限制列表。用于包含在本发明BPXTEN内的凝血因子是与选自表7的蛋白质序列具有至少约80％的序列同一性或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的蛋白质。
表7：凝血因子多肽序列
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Figure BPA00001431324300771
Figure BPA00001431324300781
“因子IX”(“FIX”)包括人因子IX蛋白质及其物种和序列变体，其具有成熟因子IX的至少一部分生物受体活性。FIX是具有凝血因子IX典型特征的因子IX分子的任何形式。FIX包括来自血浆的FIX和任何形式的重组FIX，只要其能够治愈患者的出血疾病；例如，由FIX缺乏引起的疾病(例如，血友病B)。在一些实施方案中，FIX肽是此处公开的任何FIX肽的结构类似物或肽模拟物，包括表7的序列。不消除多肽生物活性(即降低活性至低于野生型形式(＝100％)的10％或低于5％)的FIX多肽序列氨基酸的小的缺失、添加和/或置换也包括在本发明中作为生物活性衍生物，特别是具有提高的比活性的那些(高于野生型形式的100％活性)。本发明的FIX可来源于任何脊椎动物，如哺乳动物。
在一些实施方案中，FIX肽是此处所述的任何FIX肽的结构类似物或肽模拟物，包括表7的序列。不消除多肽生物活性(即降低活性至低于野生型形式(＝100％)的10％或低于5％)的FIX多肽序列氨基酸的小的缺失、添加和/或置换也包括在本发明中作为生物活性衍生物，特别是具有提高的比活性的那些(高于野生型形式的100％活性)。本发明的FIX可来源于任何脊椎动物，如哺乳动物。在本发明的一个实例中，FIX是人FIX。在另一实施方案中，FIX是来自表7的多肽序列。
人因子IX(FIX)由X-染色体q27.1上的单拷贝基因编码。人FIXmRNA包含205个碱基的5’非翻译区、1383个碱基的前原因子IX、终止密码子和1392个碱基的3’非翻译区。FIX多肽为55kDa，合成为包含三个区的前原多肽链：28个氨基酸的信号肽、需要谷氨酸残基的γ-羧基化的18个氨基酸的原肽、和415个氨基酸的成熟因子IX。成熟因子IX由域组成。N-到C末端结构中的域为Gla域、EGF1域、EGF2域、激活肽域和蛋白酶(或催化)域。蛋白酶域在将FIX激活为FIXa后提供FIX的催化活性。激活后，单链FIX成为2链分子，其中两个链通过二硫键连接，将酶与Gla域连接。激活的因子VIII(FVIIIa)是对于FIXa活性的全面表达特异性的辅因子。如本文使用的“因子IX”和“FIX”意在包括包含以下域的多肽：域Gla，EGF1，EGF2，激活肽，和蛋白酶，或本领域已知的与这些域同义的域。
FIX表达为前体多肽，需要翻译后加工，以产生活性FIX。特别是，FIX的前体多肽需要所谓的γ-羧基谷氨酸域中的某些谷氨酸残基的γ羧基化和前肽的切割。该原肽是一种18个氨基酸残基序列，位于γ-羧基谷氨酸域的N-端。该原肽结合维生素K依赖性的γ羧化酶，然后被内源性蛋白酶从FIX的前体多肽切割，该酶最可能是PACE(成对碱性氨基酸裂解酶)，又称弗林蛋白酶或PCSK3。不经过γ羧基化，Gla域不能结合钙以采用锚定蛋白至带负电荷的磷脂表面所必须的正确构象，从而使因子IX为非组织的。即使经过羧基化，Gla域还取决于适当功能的原肽的切割，因为保留的原肽干扰与钙及磷脂的最佳结合所需的Gla域的构象变化。由此产生的成熟因子IX是415个氨基酸残基的单链蛋白质，包含约17％重量的碳水化合物(Schmidt，A.E.等人，(2003)Trends Cardiovasc Med，13：39)。
成熟的FIX必须被活化的因子XI激活，以产生IXa。在凝血级联反应的内源性途径中，FIX与活化因子VIII、X因子、钙及磷脂的复合物关联。在复合物中，FIX被因子Xia激活。因子IX的激活通过从该分子两步去除激活肽(Ala 146-Arg 180)实现(Bajaj等人，“Human FactorIX and Factor IXa，”in METHODS IN ENZYMOLOGY.1993)。第一个切割在Arg 145-Ala 146位点由因子Xia或因子VIIa/组织因子进行。第二个和限速切割在Arg 180-Val 181进行。激活除去35个残基。激活的人因子作为二硫键连接的重链和轻链的异二聚体存在。因子IXa又与激活的因子VIII协同激活因子X。此外，因子IX和X都可以被通过外源途径产生的与脂化组织因子复合的因子VIIa激活。因子Xa然后参与最终共同途径，从而原凝血酶转化为凝血酶，凝血酶又将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，形成凝块。
在有些情况中，凝血因子是因子IX，因子IX的序列变体，或因子IX部分，如表7示例的序列，以及基本上与之同源的任何蛋白质或多肽，其生物学性质导致因子IX的活性。如本文使用的术语“因子IX部分”包括有意修改的蛋白质，例如，通过定点诱变或故意通过突变，这产生至少保留一定的因子IX活性的因子IX序列。术语“因子IX部分”也包括在蛋白质的N或C末端或在因子IX部分序列的内部具有至少一个另外的氨基酸的衍生物。因子IX部分的非限制性实例包括以下：因子IX；因子IXa；因子IX的截短形式；杂合蛋白质，和具有因子IX活性的肽模拟物。上述任何保留至少一定程度的因子IX活性或激活潜力的生物活性片段、缺失变体、置换变体或添加变体也可作为因子IX序列。
“因子VII”(FVII)是指人蛋白质，其物种和序列变体，具有激活的因子VII的至少一部分生物活性。已经介绍了因子VII和重组人FVIIa用于使用替代凝血因子抑制剂的血友病患者(因子VIII或IX缺乏)无法控制的出血。因子VII可被凝血酶、因子IXa、因子Xa或因子XIIa激活为FVIIa。FVII通过在Arg152-Ile153处单肽键的蛋白水解被转化为其活性形式因子，导致形成两条多肽链：N末端轻链(24kDa)和C末端重链(28kDa)，它们被一个二硫键连接在一起。与其他维生素K依赖性凝血因子相反，对于FVII尚未描述在这些其他维生素K依赖性凝血因子的激活过程中被切除的激活肽。Arg152-Ile153切割位点和下游的一些氨基酸与其他维生素K依赖性多肽的激活切割位点显示同源性。重组人因子VIIa治疗血友病患者(因子VIII或IX缺乏)不可控制的出血，包括使用替代凝血因子抑制剂的患者。FVII是具有凝血因子VII典型特征的因子VII分子的任何形式。FVII应包括来自血浆的FVII和任何形式的重组FVII，只要其能够缓解患者的出血疾病；例如，由FVII/FVIIa缺乏引起的疾病。在一些实施方案中，FVII肽是此处公开的任何FVII肽的激活形式(FVIIa)、结构类似物或肽模拟物，包括表7的序列。因子VII和VIIa已经克隆，如美国专利No.6,806,063和美国专利申请No.20080261886所述。
在一方面，本发明提供FIX的单体BPXTEN融合蛋白，包括共价连接到XTEN的FIX的全长序列，或活性片段，或序列变体，或任何生物活性衍生物，包括表7的FIX序列，以产生嵌合分子。在有些情况中，包含凝血因子如FIX的融合蛋白进一步包含一个或多个蛋白水解切割位点序列。在另一实施方案中，融合蛋白包含第一和第二不同的切割序列。上述的一个实施方案中，切割序列选自表10。在其中XTEN的存在抑制FIX激活为激活形式的FIX(下文称为“FIXa”)的情况中(例如，其中XTEN连接至FIX的C末端)，一个或多个蛋白水解切割位点允许在蛋白酶作用时释放XTEN序列，如以下更全面地描述。在上述的一个特征中，完整FIX-XTEN组合物作为前药，通过蛋白水解从FIX-XTEN分子释放XTEN允许释放的FIX序列转化为FIXa。在一个实施方案中，一个或多个切割序列可以是与来自表10的序列具有至少大约80％的序列同一性或与来自表10的序列具有至少大约85％、或至少大约90％、或至少大约95％、或至少大约96％、或至少大约97％、或至少大约98％、或至少大约99％或100％的序列同一性的序列。
FIX-XTEN融合蛋白可以设计为不同的结构。在一个实施方案中，如图37A所示，融合蛋白包含以下顺序的成分(N-到C末端)：FIX；和XTEN，其中XTEN可包含XTEN序列内部的切割序列。在另一实施方案中，如图37B所示，融合蛋白包含以下顺序的成分(N-到C末端)：FIX；切割序列；和XTEN。在有些情况中，如图37C和37D所示，融合蛋白包含成分，其中XTEN位于FIX多肽内部，插入FIX域之间。在一个实施方案中，XTEN的N末端连接到FIX Gla域的C末端，XTEN的C末端连接到FIX的EGF1域的N末端，产生FIX-XTEN，其中没有引入额外的切割序列，如图37C所示。在另一实施方案中，XTEN的N末端连接至FIX的FIX EGF1域的C末端，XTEN的C末端连接至EGF2域的N末端，产生FIX-XTEN，其中没有引入额外的切割序列，如图37C所示。在另一实施方案中，其中因子IX序列包含激活肽域，该域包含PDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDF(SEQ ID NO：1748)序列，XTEN序列的N和C末端可以插入并连接到激活肽域序列的任两个连续或任两个不连续氨基酸之间，XTEN任选地包含第一和第二切割序列两者，它们可以是相同的或不同的。在上述的另一实施方案中，XTEN可以插入上述序列的连续T和I氨基酸之间，其中XTEN的N末端连接到T氨基酸的C末端，XTEN的C末端连接到I氨基酸的N末端。
在另一实施方案中，如图37E所示，融合蛋白包含两分子的XTEN：第一个位于如上所述的FIX两个域之间，第二XTEN，其中XTEN的N末端连接到FIX的C末端，或者其中第二XTEN的N末端连接到切割序列的C末端，该切割序列连接到FIX的C末端。
在其它情况中，如图37F所示，FIX-XTEN融合蛋白包含成分，其中XTEN位于FIX域的序列内，作为该域中已有的结构环的一部分插入，或者产生域结构以外的环。在一个实施方案中，其中FIX包含EGF2域，其中EGF2域包含KNSADNK(SEQ ID NO：1749)环，XTEN序列可以插入环序列的S和A氨基酸之间，其中XTEN的N末端连接到S的C末端，且XTEN的C末端连接到A的N末端，产生具有延伸到球形凝血蛋白以外的XTEN多肽的环序列，并且其中XTEN可以(任选地)包含第一和第二切割序列两者，它们可以是相同的或不同的。在另一实施方案中，XTEN可以插入KNSADNK环序列的任两个连续或不连续氨基酸之间。在另一实施方案中，其中FIX包含EGF2域，其中EGF2域包含LAEN环，XTEN序列可以插入LAEN环的连续A和E氨基酸之间，其中XTEN的N末端连接到A的C末端，且XTEN的C末端连接到E的N末端，产生环序列LA-XTEN-EN，且XTEN可以(任选地)包含第一和第二切割序列两者，它们可以是相同的或不同的。在另一实施方案中，其中FIX包含Gla域，XTEN可以插入和连接Gla序列的两个连续氨基酸，其中XTEN形成环结构，其中该环结构基本上位于Gla结构外部，且XTEN可以(任选地)包含第一和第二切割序列，它们可以是相同的或不同的。在另一实施方案中，其中FIX包含EGF1域，XTEN可以插入和连接EGF1序列的两个连续氨基酸，其中XTEN形成环结构，其中该环结构基本上位于EGF1结构外部，且XTEN可以(任选地)包含第一和第二切割序列，它们可以是相同的或不同的。
在另一实施方案中，如图37G所示，融合蛋白包含以下顺序的成分：FIX；和XTEN，其中XTEN包含多个切割序列，它们靠近XTEN的N末端的，优选位于XTEN的前144个氨基酸残基内，更优选位于XTEN序列的N末端的大约前80氨基酸内，更优选位于大约前42个氨基酸内，更优选位于大约前18个氨基酸内，甚至更优选位于前12个氨基酸内。
在其它实施方案中，FIX-XTEN可以以结构(N-至C-末端)XTEN-FIX，或XTEN-FIX-XTEN，或XTEN-CS-FIX，或FIX-XTEN-FIX，或FIX-CS-XTEN-CS-XTEN，或上述的多聚体存在。
在一个实施方案中，FIX-XTEN构造为使得FIX-XTEN组合物的FIX可以被凝血蛋白酶激活为FIXa，而不释放一些或全部XTEN。在另一实施方案中，其中FIX-XTEN包含至少两个XTEN，FIX-XTEN构造为使得FIX-XTEN组合物的FIX以被凝血蛋白酶激活为FIXa，而不释放一个XTEN。在另一实施方案中，其中XTEN将在FIX激活为FIXa之前，或者与FIX激活为FIXa同时，从FIX-XTEN上释放，切割序列的位置充分靠近连接到FIX任何部分的XTEN的末端，使得任何剩余的XTEN或切割序列残基不会明显干扰FIX的激活，仍然提供充分的蛋白酶接近，以实现相应的切割序列的切割。在一个实施方案中，其中XTEN连接至FIX的C末端(如上所述)，一个或多个切割位点可以位于XTEN的N末端的大约前100个氨基酸内，更优选XTEN的N末端的前80个氨基酸内，更优选前54个氨基酸内，更优选前42个氨基酸内，更优选前30个氨基酸内，更优选前18个氨基酸内，最优选前6个氨基酸内。在另一实施方案中，其中XTEN内部连接到FIX序列(如上所述)，在两个FIX域之间，或FIX域序列的外部环之内，或域序列的内部，XTEN可包含两个或多个切割序列，其中至少一个切割位点可位于XTEN的N末端的大约前100个氨基酸内，N末端的80、54、42、30、18或6个氨基酸内，XTEN可包含至少第二切割位点，该位点位于XTEN的C末端的最后100个氨基酸内，XTEN的C末端的80、54、42、30、18或6个氨基酸内。
在有些情况中，融合蛋白的蛋白酶切割从FIX序列上释放XTEN，使得FIX序列可能随后被激活。在其它情况中，融合蛋白的蛋白酶切割是凝血级联的蛋白酶作用的结果，使得XTEN在FIX被加工和激活为FIXa的同时释放。因此，在一些实施方案的特定特征中，FIX-XTEN融合蛋白的XTEN和相关切割位点的位置可以使得FIX序列不能被激活，直到XTEN通过蛋白水解切割从融合蛋白上释放。在这样的实施方案中，FIX-XTEN可以用作前药，它一旦被施用到受试者就可以被激活。在一个实施方案中，释放的FIX多肽可以含有全部或部分XTEN，特别是在FIX-XTEN含有两个XTEN序列时。或者，释放的FIX多肽可以不含XTEN或基本上全部的XTEN。
在其它实施方案中，在融合蛋白的合成过程中使用切割位点。例如，融合蛋白可以进一步含有用于在重组生产后分离融合蛋白的亲和标签。识别融合蛋白中的切割位点的蛋白酶可以切除标签，同时得到终产物，即连接到XTEN的FIX。
因此，融合蛋白可能具有切割位点，该切割位点可以在注射之前、注射之后(在血液循环或组织中被蛋白酶)切割，并且其位置可能使得XTEN与治疗产物保留，直到它被内源性蛋白酶释放，或者允许治疗产物被凝血级联激活，或者XTEN被凝血级联的蛋白酶释放。
在一些实施方案中，在循环中或身体组织或体腔内，FIX的融合蛋白被位点特异性蛋白酶从非活性蛋白质转化为活性蛋白质(例如，FIXa)。这种切割可引发药物活性域的效能的增强(前药激活)，或者它可以增强切割产物与其靶标的结合。因此，例如，FIX-XTEN融合蛋白可以在受试者血液中被切割，并且FIX序列可以被凝血级联或被此处公开的另一种蛋白酶激活。FIX融合蛋白的活性形式可能含有或者可能不含至少XTEN的片段。在FIX-XTEN前药实施方案的特征中，与常规FIX治疗剂相比，可以施用较高剂量的FIX-XTEN组合物，因为在可被激活的FIX形式被释放之前，通过切割序列的选择或者改变需要切割的切割位点数，能够控制能够被激活的FIX的释放。本领域技术人员应当理解，此处公开的任何切割位点的序列可以通过向切割序列内引入氨基酸变化修饰，以改变蛋白水解切割的动力学，从而影响FIX释放和随后的激活的动力学。
本发明提供包含凝血蛋白质和XTEN的BPXTEN融合蛋白。在有些情况中，BPXTEN包含与选自表7的凝血蛋白质有至少大约80％的序列同一性或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的凝血蛋白质。在上述的一个实施方案中，BPXTEN还包含与选自表2的XTEN有至少大约80％的序列同一性或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的XTEN序列。在另一实施方案中，BPXTEN包含与选自表43的序列有至少大约80％的序列同一性或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。本发明还涉及来自表7的任何FIX、来自表2的任何XTEN和来自表10的任何切割序列替换表43的相应的成分，或者与上述具有至少90％的序列同一性的序列。
在另一实施方案中，BPXTEN凝固蛋白质是表7的FVII序列，XTEN选自AE864和AM875。在上述的一个实施方案中，BPXTEN在N到C末端结构中包含FVII-AE864。在另一实施方案中，BPXTEN从N到C末端构建为FVII-AM875。在另一实施方案中，构建的BPXTEN包含至少大约70％或80％或90％或至少大约95％或更多的激活FVIIa形式的FVII。在另一实施方案中，包含FVII和XTEN的BPXTEN还可包含切割序列，该切割序列可包括选自表10的序列。
(d)生长激素蛋白质
“生长激素”或“GH”的意思是人生长激素蛋白质及其物种和序列变体，包括但不限于GH的191单链氨基酸人序列。因此，GH可以是天然的、全长的蛋白质，或者可以是保留天然蛋白质的至少一部分生物活性的截短的片段或序列变体。GH对身体组织的效果通常可以描述为是合成代谢的。如同大多数其它蛋白质激素一样，GH通过与特异性血浆膜受体(被称为生长激素受体)相互作用起作用。有两种已知类型的来源于垂体的人GH(下文称为“hGH”)：一种的分子量大约为22,000道尔顿(22kD hGH)，另一种的分子量为大约20,000道尔顿(20kD hGH)。20kDHGH具有对应于由191个氨基酸组成的22kD hGH的氨基酸序列，除了从22kD hGH的第32到第46个共15个氨基酸残基丢失以外。一些报道证实，已经发现20kD hGH显示比22kD hGH更低的危险和更高的活性。本发明也涉及适合作为生物活性多肽用于本发明BPXTEN组合物的20kD hGH的应用。
本发明涉及BPXTEN中包括任何GH同源序列，天然序列片段，如来自灵长类动物、哺乳动物(包括家畜)，和非天然序列变体，其保留GH的至少一部分生物活性或生物功能和/或可用于预防、治疗、介导或缓解GH相关疾病、缺陷、障碍或病症。非哺乳动物GH序列在文献中清楚地记载。例如，鱼GH的序列比对可见Genetics and MolecularBiology 2003 26 p.295-300。鸟GH序列的进化分析可见Journal ofEvolutionary Biology 2006 19 p.844-854。另外，与人GH同源的天然序列可通过标准同源性搜索技术如NCBI BLAST发现。
在一个实施方案中，引入所述组合物的GH可以是具有对应于自然中发现的蛋白质的序列的重组多肽。在另一实施方案中，GH可以是天然序列的序列变体、片段、同源物或模拟物，它们至少保留天然GH的一部分生物活性。表8提供了来自多种哺乳动物种的GH序列的非限制性列表，它们包括在本发明的BPXTEN融合蛋白中。这些GH序列或通过在物种或家族之间改组各突变构建的同源衍生物中的任一个可用于本发明的融合蛋白。可以引入BPXTEN融合蛋白的GH可以包括与选自表8的蛋白质具有至少大约80％序列同一性或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的蛋白质。
表8：来自动物种的生长激素氨基酸序列
Figure BPA00001431324300891
IV).BPXTEN结构和性质
本发明的组合物的BP不限于天然、全长多肽，也包括重组形式以及生物和/或药理活性变体或其片段。例如，应当理解，可以在GP中进行各种氨基酸置换以产生变体，而在BP的生物活性或药理性质方面不背离本发明的范围。多肽序列中氨基酸保守置换的例子如表9所示。然而，在其中与此处公开的具体序列相比BP的序列同一性小于100％的BPXTEN实施方案中，本发明涉及另外19种天然L-氨基酸中的任一种对给定BP的给定氨基酸残基的置换，这可以位于BP序列内的任何位置，包括相邻的氨基酸残基。如果任一置换导致生物活性的不希望的变化，则可以使用替代氨基酸之一，并通过本文所述的方法评价该构建体，或者使用关于保守和非保守突变的任何技术和指导评价，如美国专利No.5,364,934所述，其内容在此引入作为参考，或者使用本领域公知的方法评价。另外，变体可包括，例如，多肽，其中一个或多个氨基酸残基在全长天然BP氨基酸序列的N或C末端添加或缺失，而保留天然肽的至少一部分生物活性。
表9：保守氨基酸置换举例
Figure BPA00001431324300901
(a)BPXTEN融合蛋白结构
本发明提供包含连接到一个或多个XTEN多肽的BP的BPXTEN融合蛋白组合物，可用于预防、治疗、介导或缓解与葡萄糖稳态、胰岛素抗性或肥胖症有关的疾病、障碍或病症。在有些情况中，BPXTEN是具有连接到一个或多个XTEN多肽的BP的单体融合蛋白。在其它情况中，BPXTEN组合物可包括连接到一个或多个XTEN多肽的两个BP分子。本发明涉及BPXTEN，其包含但不限于选自表3-8的BP(或其片段或序列变体)和选自表2的XTEN或其序列变体。在有些情况中，完整BPXTEN保留各自BP的生物活性的至少一部分。在其它情况中，BP成分或者变为生物活性的，或者在通过切割任选的引入BPXTEN间隔序列内的切割序列从XTEN释放后具有活性增加，在下面更全面地描述。
在BPXTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供一种式I的融合蛋白：
(BP)-(S)x-(XTEN)    I
其中对于每次出现独立地，BP是如上所述的生物活性蛋白质；S是间隔序列，具有1至大约50个氨基酸残基，可能任选地包括切割序列(如上所述)；x是0或1；且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽。该实施方案具有特定应用，其中BP的希望的生物活性需要游离的N末端，或者其中BP的C末端与融合蛋白的连接降低了生物活性，并且希望降低施用的BPXTEN的生物活性和/或副作用。
在BPXTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供一种式II的融合蛋白(成分如上所述)：
(XTEN)-(S)x-(BP)    II
其中对于每次出现独立地，BP是如上所述的生物活性蛋白质；S是间隔序列，具有1至大约50个氨基酸残基，可能任选地包括切割序列(如上所述)；x是0或1；且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽。该实施方案具有特定应用，其中BP的希望的生物活性需要游离的C末端，或者其中BP的N末端与融合蛋白的连接降低了生物活性，并且希望降低施用的BPXTEN的生物活性和/或副作用。
因此，具有一个BP和一个XTEN的BPXTEN可以具有至少以下的结构排列，均以N-至C末端的方向列出：BP-XTEN；XTEN-BP；BP-S-XTEN；或XTEN-S-BP。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白是式III：
(BP)-(S)x-(XTEN)-(S)y-(BP)-(S)z-(XTEN)z    III
其中对于每次出现独立地，BP是一种如本文以上所述的生物活性蛋白质，S是间隔序列，具有1至大约50个氨基酸残基，可能任选地包含切割序列(如上所述)；x是0或1；y是0或1；z是0或1；且XTEN是如本文以上所述的延伸重组多肽。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白是式IV(成分如上所述)：
(XTEN)x-(S)y-(BP)-(S)z-(XTEN)-(BP)    IV
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白是式V(成分如上所述)：
(BP)x-(S)x-(BP)-(S)y-(XTEN)    V
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白是式VI(成分如上所述)：
(XTEN)-(S)x-(BP)-(S)y-(BP)     VI
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白是式VII(成分如上所述)：
(XTEN)-(S)x-(BP)-(S)y-(BP)-(XTEN)    VII
在式I-VII的融合蛋白的上述实施方案中，向需要的受试者施用治疗有效剂量的一种实施方案的融合蛋白能够导致治疗窗内经历的时间比以相当剂量施用于受试者的未连接到XTEN的相应BP延长至至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或更多。
任何间隔序列基团在本发明包括的融合蛋白中是任选的。可以提供间隔区以增强从宿主细胞中表达融合蛋白，或降低空间阻碍，使得BP成分可以采用其希望的三级结构和/或适当地与其靶分子相互作用。对于间隔区和鉴定理想的间隔区的方法，参见，例如，George等人，(2003)Protein Engineering 15：871-879，在此引入作为参考。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个肽序列，该肽序列的长度为1-50个氨基酸残基、或大约1-25个残基、或大约1-10个残基。间隔序列，不包括切割位点，可以包含20种天然L氨基酸中的任意氨基酸，并且优选地包含空间上不被阻碍的亲水性氨基酸，可包括但不限于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)。在有些情况中，间隔区可以是聚甘氨酸或聚丙氨酸，或主要是甘氨酸和丙氨酸残基组合的混合物。除切割序列外的间隔多肽主要基本上不含二级结构。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白组合物中的一个或两个间隔序列可各自进一步含有切割序列，它们可以是相同的或可以是不同的，其中该切割序列可以被蛋白酶作用，以从融合蛋白上释放BP。
在有些情况中，设计向BPXTEN中引入切割序列，以允许释放BP，BP变为具有活性或在从XTEN释放后更具活性。切割序列的位置充分接近BP序列，通常在BP序列末端的18或12或6或2个氨基酸内，使得在切割后任何剩余的连接到BP的残基不会明显干扰BP的活性(例如，如结合受体)，而仍然提供充分接近蛋白酶，以能够实现切割序列的切割。在一些实施方案中，切割位点是能够被哺乳动物内源的蛋白酶切割的序列，使得BPXTEN在施用于受试者后能够被切割。在这些情况中，BPXTEN可以作为BP的前药或循环储库。本发明涉及的切割位点的例子包括但不限于可被选自FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20的哺乳动物内源性蛋白酶或被非哺乳动物蛋白酶如TEV、肠激酶、PreScissionTM蛋白酶(鼻病毒3C蛋白酶)和分选酶A切割的多肽序列。已知被上述蛋白酶切割的序列是本领域已知的。示例性的切割序列和序列内的切割位点以及序列变体显示在表10中。例如，凝血酶(激活的凝血因子II)作用于序列LTPRSLLV(SEQ ID NO：222)[Rawlings N.D.等人，(2008)Nucleic Acid Res.，36：D320]，该序列将在该序列第4位的精氨酸后切开。在磷酸和钙的存在下由FXa切割FII产生活性FIIa，其在凝血途径中位于因子IX的下游。一旦激活，其在凝血中的天然作用是切割纤维蛋白原，纤维蛋白原又开始血块形成。FIIa的活性受到严格控制，只在适当止血需要凝血时才发生。然而因为凝血在哺乳动物中是进行中的过程，当生理上需要凝血时，通过向BPXTEN的BP与XTEN之间引入LTPRSLLV(SEQ IDNO：223)序列，XTEN域将从连接的BP上切下，同时激活外源或内源凝血途径，从而随时间释放BP。类似地，向被内源蛋白酶作用的BPXTEN中引入其它序列将提供BP的持续释放，在某些情况下，从BPXTEN的“前药”形式提供BP的较高程度的活性。
在有些情况中，只有两个或三个位于酶切位点两侧的氨基酸(总共4-6个氨基酸)被引入切割序列。在其它情况中，已知的切割序列可以具有一个或多个缺失或插入或对于已知序列中任一个或两个或三个氨基酸的一个或两个或三个氨基酸置换，其中该缺失、插入或置换导致对蛋白酶的敏感性降低或增强，但不缺乏敏感性，导致适应从XTEN释放BP的速率的能力。置换的例子在表10中显示。
表10：蛋白酶切割序列
Figure BPA00001431324300941
↓表示切割位点    NA：不适用
*斜杠之前、之间或之后的多个氨基酸的列表表明可以在该位置置换替代氨基酸；“-“表明任何氨基酸可以替代在中间列中显示的相应氨基酸。
在一个实施方案中，引入BPXTEN融合蛋白中的BP可以具有与来自表3-8的序列显示至少大约80％序列同一性的序列，或者与来自表3-8的序列相比显示至少大约81％、或大约82％、或大约83％、或大约84％、或大约85％、或大约86％、或大约87％、或大约88％、或大约89％、或大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％、或大约100％序列同一性的序列。可以使用如本文所述的试验或使用测量的或确定的参数评价上述实施方案的BP的活性，那些与相应的天然BP序列相比保留至少大约40％、或大约50％、或大约55％、或大约60％、或大约70％、或大约80％、或大约90％、或大约95％或更高活性的序列被认为适合包含在本发明的BPXTEN中。发现保留适当活性水平的BP可以连接到上述的一个或多个XTEN多肽。在一个实施方案中，发现保留适当活性水平的BP可以连接到与来自表2的序列具有至少大约80％序列同一性，或者与表2的序列具有至少大约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大约100％序列同一性的一个或多个XTEN多肽，产生嵌合融合蛋白。
含有连接到单XTEN的单BP的融合蛋白序列的非限制性例子显示在表40、42、43和44中。在一个实施方案中，BPXTEN组合物包含与来自表40、42、43或44的BPXTEN具有至少大约80％序列同一性，或者与来自表40、42、43或44的BPXTEN相比具有至少大约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大约100％序列同一性的融合蛋白。含有连接到一个或多个XTEN的两分子相同BP的融合蛋白序列的非限制性例子在表41中列出，但是本发明也涉及替换连接到一个或两个选自表2的XTEN(它们可以是相同的或不同的)的选自表3-8的其它BP。在本段以上所述的融合蛋白中，BPXTEN融合蛋白可进一步包含来自表10的切割序列；该切割序列位于BP和XTEN之间或相邻的BP之间。在有些情况中，包含切割序列的BPXTEN在BP与切割序列之间或XTEN与切割序列之间也具有一个或多个间隔序列氨基酸，以利于蛋白酶的接近；该间隔氨基酸包含任何天然氨基酸，包括甘氨酸和丙氨酸，作为优选的氨基酸。包含BP、XTEN、切割序列和间隔氨基酸的BPXTEN的非限制性例子在表42和43中列出。然而，本发明也涉及用表3-8的任何BP序列替换表42或43的BP序列，用表2的任何XTEN序列替换表42或43的XTEN序列，以及用表10的任何切割序列替换表42或43的切割序列。
(b)BPXTEN的药代动力学性质
本发明提供具有比未连接到XTEN的BP增强的药代动力学的BPXTEN融合蛋白，当通过本文所述的方法以对该组合物确定的剂量使用时，能够达到一种循环浓度，该循环浓度导致药理学活性，而与相当剂量的未连接到XTEN的BP相比，仍在该组合物生物活性成分的安全范围内停留延长的一段时间。在这种情况下，BPXTEN在融合蛋白组合物的治疗窗内保持延长的一段时间。如本文所用的“相当的剂量”是指以相当的方式施用于受试者的活性BP药效团的当量摩尔/千克的剂量。本领域应当理解，“相当的剂量”的BPXTEN融合蛋白代表更高重量的药剂，但是在融合蛋白的剂量中具有基本相同的摩尔当量的BP，和/或相对于BP将具有相同近似的摩尔浓度。
通过将给定XTEN连接至BP能够增强的BP的药代动力学性质包括终末半衰期、曲线下面积(AUC)、Cmax分布容积和生物利用度。
如涉及包含XTEN的融合蛋白的药代动力学特征的实施例中更全面地描述的，惊奇地发现增加XTEN序列的长度能够使包含XTEN的融合蛋白的终末半衰期不成比例地延长。因此，本发明提供包含XTEN的BPXTEN融合蛋白，其中可以选择所述XTEN以提供施用于受试者的BPXTEN组合物的目标半衰期。在一些实施方案中，本发明提供包含XTEN的单体融合蛋白，其中选择所述XTEN以使施用的BPXTEN比未连接到融合蛋白的相应BP的终末半衰期延长至至少大约2倍、或至少大约3倍、或至少大约4倍、或至少大约5倍、或至少大约6倍、或至少大约7倍、或至少大约8倍、或至少大约9倍、或至少大约10倍、或至少大约15倍、或至少20倍或更高。类似地，BPXTEN融合蛋白的AUC与未连接到融合蛋白的相应BP相比可以增加至少大约50％、或至少大约60％、或至少大约70％、或至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约100％、或至少大约150％、或至少大约200％、或至少大约300％。BPXTEN的药代动力学参数可以通过标准方法确定，该方法包括给药、以时间间隔采集血样、以及使用ELISA、HPLC、放射试验或本领域已知的其它方法测定蛋白质，或者如本文所述，随后对数据进行标准计算，以推导半衰期和其它PK参数。
本发明进一步提供BPXTEN，其包含第一和第二BP分子，该第一和第二BP分子任选地被可进一步包含切割序列的间隔序列隔开，或者被第二XTEN序列隔开。在一个实施方案中，BP当连接到融合蛋白时与未连接到融合蛋白的相应BP相比具有较低的活性。在此情况下，如图38所示，BPXTEN可以被设计为使得在施用于受试者后，BP成分逐渐通过切割序列的切割而释放，因此它重新获得活性或结合其靶受体或配体的能力。因此，上述BPXTEN用作前药或循环储库，导致与未连接到融合蛋白的BP相比更长的终末半衰期。
(c)BPXTEN的药理学和药学性质
本发明提供包含共价连接到XTEN的BP的BPXTEN组合物，该共价连接到XTEN的BP可以具有比未连接到XTEN的BP增强的性质，以及提供增强该组合物的相应两种BP成分的治疗和/或生物活性或效果的方法。另外，本发明提供具有比本领域已知的融合蛋白增强的性质的BPXTEN组合物，该融合蛋白包含免疫球蛋白多肽配偶体、较短长度的多肽和/或具有重复序列的多肽配偶体。另外，BPXTEN融合蛋白比化学偶联物如聚乙二醇化的构建体具有显著的优点，尤其是以下事实：重组BPXTEN融合蛋白可以在细菌细胞表达系统中制备，该系统在产品的研究和开发和生产阶段都可以缩短时间和降低费用，以及导致更均质的、确定的产物，BPXTEN的产物和代谢物比聚乙二醇化的偶联物具有更低的毒性。
作为治疗剂，BPXTEN可能具有大量优于不含XTEN的治疗剂的优点，包括，例如，提高的溶解度、提高的热稳定性、降低的免疫原性、增加的表观分子量、降低的肾清除、减少的蛋白水解、减少的代谢、增强的治疗效率、较低的有效治疗剂量、提高的生物利用度、在BP治疗窗内维持血流水平的延长的剂量间时间、“调整的”吸收率、提高的冻干稳定性、增强的血清/血浆稳定性、延长的终末半衰期、提高的血流中溶解度、降低的中和抗体结合、降低的受体介导的清除、减少的副作用、受体/配体结合亲和力或受体/配体激活的保留、降解稳定性、冻融稳定性、对蛋白酶的稳定性、对泛素化的稳定性、易于给药、与其它药物赋形剂或载体的相容性、在受试者中的持续、提高的贮存稳定性(例如，延长的贮存期)、在生物或环境中减少的毒性等。增强的性质的净效应是BPXTEN当施用于患有代谢疾病或障碍的受试者时可导致增强的治疗和/或生物效应。
在希望增强BP的药物或理化性质(如水溶解度或稳定性的程度)的其它情况下，可各自选择第一和第二融合蛋白的第一和第二XTEN序列的长度和/或基序家族组合物，以对各自的融合蛋白提供不同程度的溶解度和/或稳定性，使得BPXTEN组合物的总体药学性质得到增强。可以使用本文所述的方法构建和测定BPXTEN融合蛋白，以证实理化性质，并按需要调整XTEN，以产生希望的性质。在一个实施方案中，选择BPXTEN的XTEN序列，使得融合蛋白的水溶解度比未连接到融合蛋白的BP高至少大约25％以内，或比未连接到融合蛋白的相应BP高至少大约30％、或至少大约40％、或至少大约50％、或至少大约75％、或至少大约100％、或至少大约200％、或至少大约300％、或至少大约400％、或至少大约500％、或至少大约1000％。在本段以上所述的实施方案中，融合蛋白的XTEN可以与选自表2的XTEN具有至少大约80％的序列同一性、或大约90％、或大约91％、或大约92％、或大约93％、或大约94％、或大约95％、或大约96％、或大约97％、或大约98％、或大约99％至大约100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明提供BPXTEN组合物，与相当剂量的未连接到XTEN的相应BP相比，该组合物可以使BP成分在治疗窗内维持较长的一段时间。本领域应当理解，“相当的剂量”的BPXTEN融合蛋白代表更高重量的药剂，但是在融合蛋白的剂量中具有基本相同的摩尔当量的BP，和/或相对于BP将具有相同近似的摩尔浓度。
本发明也提供选择适合偶联的XTEN的方法，以提供希望的药代动力学性质，当与剂量选择匹配时，通过保持BP的循环浓度在治疗窗内一段延长的时间，能够提高施用的组合物的有效性。本文使用的“治疗窗”是指作为血液或血浆浓度范围的药物或生物制剂的量，该量提供了随时间对疾病或病症的效力或希望的药理学效果，而没有不可接受的毒性；在达到任何阳性治疗效果的最小量与导致响应的最大量之间的循环血液浓度范围，该响应是对受试者具有毒性(在较高的剂量或浓度时)之前紧接的响应。另外，治疗窗通常包括时间方面；随时间产生希望的药理学效果、而不产生不可接受的毒性或不良事件的最大和最小浓度。对于受试者保持在治疗窗内的给药的组合物也可以被称为在“安全范围内”。
剂量优化对于所有药物都很重要，特别是对于具有窄治疗窗的药物。例如，许多与葡萄糖稳态有关的肽具有窄治疗窗。对于具有窄治疗窗的BP，如胰高血糖素或胰高血糖素类似物，对于所有表现出多种症状的患者标准化的单剂量可能不总是有效的。由于不同的葡萄糖调节肽通常一起用于治疗糖尿病患者，因此也必须考虑每一种的效能和通过组合和一起给药达到的相互作用效果。考虑这些因素属于本领域技术人员需要考虑的范围，是为了相对于将产生不可接受的毒性因此置于安全范围以外的量，确定治疗或药理学有效量的BPXTEN。
在许多情况下，所述组合物的BP成分的治疗窗已经建立，并且可从发表的文献中获得，或者对于已获批的含有BP的产品，在药物标签中指明。在其它情况中，可以建立治疗窗。为给定组合物建立治疗窗的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，Goodman & Gilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics，11th Edition，McGraw-Hill(2005))。例如，通过在患有目标疾病或障碍的受试者中使用剂量放大研究确定效能或希望的药理学效果、不良事件的出现以及确定循环血液水平，可以确定给定药物或生物制剂或生物制剂或药物的组合对于给定受试者或受试者群体的治疗窗。剂量放大研究可以通过在受试者或受试者组中的代谢研究评估BPXTEN的活性，该研究监测本领域已知的或本文所述的生理或生学参数，一个或多个与代谢疾病或障碍相关的参数，或与特定适应症的有益结果相关的临床参数，以及观察和/或测量的参数，以确定无效果剂量、不良事件、最大耐受剂量等，以及测量建立了确定的或衍生的循环血液水平的药代动力学参数。然后可以将结果与治疗剂的施用剂量和血液浓度相关，它们符合上述测定的参数或效果水平。通过这些方法，剂量范围和血液浓度可以与最小有效剂量以及最大剂量和血液浓度(在该水平时产生希望的效果而在更高水平时产生毒性)相关，由此建立给药的治疗剂的治疗窗。高于最大值的融合蛋白的血液浓度(或通过BP成分测定的)被认为在治疗窗或安全范围之外。因此，通过上述方法，将确定Cmin血液水平，低于该水平时BPXTEN融合蛋白不具有希望的药理学效果，并且确定了Cmax血液水平，该水平代表达到引起不可接受的副作用、毒性或不良事件的浓度之前的最高循环浓度，将其置于BPXTEN的安全范围之外。利用这些确定的浓度，通过测定Cmax和Cmin以提供将融合蛋白保持在治疗窗内的适当剂量和给药频率，可以进一步精选给药频率和剂量。本领域技术人员通过此处公开的手段或通过本领域已知的其它方法能够证实施用的BPXTEN在治疗窗保持希望的时间间隔，或者需要调节XTEN的剂量或长度或序列。此外，确定合适的剂量和给药频率以使BPXTEN保持在治疗窗内建立了治疗有效的剂量方案；向需要的受试者使用治疗有效剂量的融合蛋白的多个连续剂量施用方案导致保持在治疗窗内的连续Cmax波峰和/或Cmin波谷，并且导致与目标疾病、障碍或病症相关的至少一个测量的参数的改善。在有些情况中，向受试者施用适当剂量的BPXTEN可导致BPXTEN融合蛋白的血液浓度保持在治疗窗内的时间是以相当剂量施用的未连接到XTEN的相应BP的至少大约2倍，或至少大约3倍，或至少大约4倍，或至少大约5倍，或至少大约6倍，或至少大约7倍，或至少大约8倍，或至少大约9倍，或至少大约10倍，或更长。本文使用的“适当剂量”是指当药物或生物制剂施用于受试者时导致希望的治疗或药理学效果和治疗窗内的血液浓度的剂量。
在一个实施方案中，与以相当剂量方案施用于受试者的未连接到融合蛋白的其相应生物活性蛋白质相比，以治疗有效剂量方案施用的BPXTEN导致融合蛋白血液水平的至少两个连续Cmax波峰和/或Cmin波谷之间的时间延长至至少大约3倍，或至少大约4倍，或至少大约5倍，或至少大约6倍，或至少大约7倍，或至少大约8倍，或至少大约9倍，或至少大约10倍。在另一实施方案中，与使用BP的治疗有效剂量方案施用于受试者的未连接到融合蛋白的相应生物活性蛋白质成分相比，以治疗有效剂量方案施用的BPXTEN导致使用较低频率的给药或较低的药物组合物中融合蛋白总剂量(摩尔数)，一个或两个或三个或更多测量的参数得到相当的改善。测量的参数可包括此处公开的临床、生化或生理参数中的任一种，或本领域已知用于评估受试者的葡萄糖或胰岛素相关障碍、代谢疾病或障碍、凝血或出血障碍或生长激素相关障碍的其它参数。
本发明的BPXTEN组合物的活性，包括功能特征或生物学和药理学活性和参数，可以通过本领域已知的用于检测希望的特征的任何合适的筛选试验确定。包含BP成分的BPXTEN多肽的活性和结构可以通过此处所述的试验测定；例如，选自表39的一个或多个试验，实施例的试验，或者通过本领域已知的方法以确定溶解度、结构和生物活性的保留。可以进行试验，该试验允许测定BPXTEN对BP受体或配体的结合特征，包括结合常数(Kd)、EC50值以及它们的配体-受体复合物的解离的半衰期(T1/2)。结合亲和力例如可以通过竞争型结合试验来测定，该试验检测特异性结合受体或配体的能力的改变。另外，诸如流式细胞术或表面等离子体共振的技术可以用来检测结合事件。这些试验可以包括可溶性受体分子，或者可以测定与细胞表达的受体的结合。这些试验可以包括基于细胞的试验，包括对增殖、细胞死亡、凋亡和细胞迁移的分析。其它可以的试验可以测定受体与表达的多肽的结合，其中该试验可包括可溶性受体分子，或者可以测定与细胞表达的受体的结合。BPXTEN对相应BP的靶受体或配体的结合亲和力可以使用结合或竞争结合试验测定，例如使用芯片结合受体或结合蛋白质的Biacore试验，或ELISA试验，如美国专利5,534,617所述，本文实施例所述的试验，放射受体试验，或本领域已知的其它试验。另外，可以使用竞争结合ELISA试验将BP序列变体(作为单一成分或作为BPXTEN融合蛋白测定)与天然BP进行比较，以确定它们是否具有与天然BP或其一些部分相同的结合特异性和亲和力，使得它们适合包含在BPXTEN中。
本发明提供分离的BPXTEN，其中BPXTEN对靶受体或配体的结合亲和力可以是未结合到XTEN的天然BP对靶受体或配体的亲和力的至少大约10％、或至少大约20％、或至少大约30％、或至少大约40％、或至少大约50％、或至少大约60％、或至少大约70％、或至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约95％、或至少大约99％、或至少大约100％或以上。在有些情况中，所述BPXTEN与BPXTEN的天然受体或配体之间的结合亲和力Kd为至少大约10-4M，或者至少大约10-5M，或者至少大约10-6M，或至少大约10-7M的BPXTEN与天然受体或配体之间的亲和力。
在其它情况中，本发明提供分离的BPXTEN，其中融合蛋白设计为以高亲和力结合靶受体，从而导致对天然配体的拮抗活性。这种BPXTEN的一个非限制实例为IL-1raXTEN，它构造为结合IL-1受体，使得结合的组合物显著干扰IL-1α和/或IL-1β与IL-1受体的结合。在某些情况中，拮抗剂BPXTEN(例如但不限于IL-1raXTEN)对天然配体结合靶受体的干扰可以是至少大约1％、或大约10％、或大约20％、或大约30％、或大约40％、或大约50％、或大约60％、或大约70％、或大约80％、或大约90％、或大约95％、或大约99％、或大约100％。在其它实施方案中，本发明提供分离的BPXTEN融合蛋白(例如但不限于IL-1raXTEN)，其中与天然配体引起的激活相比，分离的融合蛋白与细胞受体的结合引起低于20％或低于10％或低于5％的结合的BPXTEN拮抗剂对细胞信号途径的激活。在其它情况中，拮抗性BPXTEN组合物以大约10nM或更低、大约5nM或更低、大约1nM或更低、大约500pM或更低、大约250pM或更低、大约100pM或更低、大约50pM或更低、或大约25pM或更低的解离常数结合靶受体。拮抗性BPXTEN的特定构建体的非限制性实例可包括IL-1ra-AM875、IL-1ra-AE864或IL-1ra-AM1296。
在有些情况中，对于已知的或与天然BP在治疗和预防代谢病症和障碍中的应用相关的体外生物活性或药理学效果，本发明的BPXTEN融合蛋白保留至少大约10％、或大约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的未连接到融合蛋白的相应BP的生物活性。在上述实施方案的一些情况中，BP成分的活性可以由完整的BPXTEN融合蛋白表现，而在其它情况中，BP成分的活性将主要在通过蛋白酶的作用从融合蛋白上切割和释放BP后表现，该蛋白酶作用于引入BPXTEN融合蛋白内的切割序列。在上述中，如图3所示，BPXTEN可以设计为当连接到XTEN时降低BP成分对受体或配体的结合亲和力，但是当通过切割引入BPXTEN序列内的切割序列从XTEN释放时，具有降低的亲和力，如以上更详细描述的。
在其它情况中，BPXTEN设计为当连接到XTEN时降低BP成分的结合亲和力，例如，通过减少受体介导的清除来增加施用于受试者的BPXTEN的终末半衰期，或者减少施用的组合物引起的毒性或副作用。在未连接到XTEN的BP的毒理学无效果剂量或血液浓度低时(意味着天然肽具有引起副作用的高潜力)，本发明提供BPXTEN融合蛋白，其中该融合蛋白构造为降低BP成分的生物学能力或活性。
在有些情况中，已经发现与BPXTEN(其中这种结构不导致相应的BP成分的结合亲和力降低)的活性相比，BPXTEN可以构造为具有显著降低的结合亲和力(表示为Kd)和相应的降低的生物活性，并且这种结构在组合物显示长终末半衰期和保持足够的生物活性方面是有利的。在一个实例中，已经发现单XTEN连接到胰高血糖素的C末端导致对其靶受体的显著结合亲和力的保留(参见实施例31)，而与XTEN结合到C末端的构建体相比，XTEN连接到N末端降低其结合亲和力和相应的生物活性。在另一实例中，已经发现如实施例所述，人生长激素(hGH)连接到XTEN分子的C末端基本上不干扰与hGH受体的结合，而向同一分子的C末端添加第二XTEN(将第二XTEN置于hGH的C末端)降低了该分子对hGH受体的亲和力，也导致XTEN-hGH-XTEN结构的终末半衰期比XTEN-hGH结构延长。降低BP对其靶受体的结合亲和力的能力可能取决于特定BP具有游离N末端或C末端的要求。因此，本发明提供一种延长BPXTEN的终末半衰期的方法，包括产生具有成分的特定N至C末端结构的单链融合蛋白构建体，该结构包含至少第一生物活性蛋白质和一个或多个XTEN，其中生物活性蛋白质和XTEN成分的第一N-至C末端结构融合蛋白比第二N-至C末端结构的BPXTEN具有降低的受体介导的清除(RMC)和相应的终末半衰期延长。在上述的一个实施方案中，BPXTEN从N到C末端构造为BP-XTEN。在上述的另一实施方案中，BPXTEN构造为XTEN-BP。在上述的另一实施方案中，BPXTEN构造为XTEN-BP-XTEN。在后一实施方案中，两个XTEN分子可以是相同的，或者它们可以具有不同的序列组成或长度。两个XTEN连接到一个BP的上述实施方案的非限制性实例包括构建体AE921-hGH-AE144(SEQ ID NO：1817)、AE921-hGH-AE288(SEQ ID NO：1818，AE864-hGH-AE144，AM875-hGH-AE144和AM875-hGH-AE288。一个BP连接到一个XTEN的上述实施方案的非限制性实例包括AE144-胰高血糖素(SEQ ID NO：827)、AE288-胰高血糖素(SEQ ID NO：828)、AD576-胰高血糖素(SEQ ID NO：831)、AM923-胰高血糖素(SEQ ID NO：840)、Y72-胰高血糖素(SEQ ID NO：823)、AM875-IL-1ra或AE864-IL-1ra。本发明涉及其它这样的构建体，其中来自表3-8的BP和来自表2的XTEN取代上述实例的相应成分，并且构造为使得构建体具有比相应成分的交替结构降低的受体介导的清除。
在有些情况中，该方法提供构造的BPXTEN，其中降低的受体介导的清除可以导致终末半衰期是其中RMC不降低的第二结构的BPXTEN的半衰期的至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍。本发明利用BP配体，其中结合速率升高或解离速率降低引起的对受体的结合亲和力的降低可以通过阻碍N-或C末端以及使用该末端作为与该组合物另一多肽(另一BP、XTEN或间隔区序列)的连接来实现。BPXTEN融合蛋白的特定结构的选择可以降低对受体的结合亲和力的程度，使得可以达到降低的受体介导的清除率。通常，受体的激活与RMC关联，使得不需要激活，多肽与其受体的结合不导致RMC，而受体的激活导致RMC。然而，在有些情况中，特别是在配体具有提高的解离速率的情况下，配体可能能够充分结合以启动细胞信号传导而不引发受体介导的清除，净结果是BPXTEN仍然生物可用。在这些情况下，构建的BPXTEN具有比导致较高程度RMC的结构更长的半衰期。
在为了减少受体介导的清除而希望降低结合亲和力但希望保留至少一部分生物活性的情况下，将清楚必须保持足以获得希望的受体激活的结合亲和力。因此，在一个实施方案中，本发明提供一种构建的BPXTEN，使得与其中结合亲和力没有降低的结构的相应BPXTEN相比，BPXTEN对靶受体的结合亲和力在大约0.01％-40％、或大约0.1％-30％、或大约1％-20％的范围内。因此，与其中BP成分与靶受体的结合亲和力不降低的结构的相应BPXTEN的结合亲和力相比，或者与未连接到融合蛋白的BP相比，在相当的条件下测定时，构建的BXTEN的结合亲和力优选地降低至少大约80％、或至少大约85％、或至少大约90％、或至少大约95％、或至少大约99％、或至少大约99.9％、或至少大约99.99％。由于差异表达，构建的BPXTEN的BP成分具有的结合亲和力可能小至其中BP成分的结合亲和力不降低的结构的BPXTEN的相应BP成分的大约0.01％、或至少大约0.1％、或至少大约1％、或至少大约2％、或至少大约3％、或至少大约4％、或至少大约5％、或至少大约10％、或至少大约20％。在本段以上描述的实施方案中，构建的BPXTEN对靶受体的结合亲和力将比相应的天然BP或具有其中相应BP成分的结合亲和力不降低的结构的BPXTEN“显著降低”。因此，本发明提供具有降低的RMC的组合物和产生该组合物的方法，这是通过构建BPXTEN，以能够结合和激活足够数量的受体，以获得希望的体内生物应答，而避免比获得这种应答需要的更多受体的激活。在一个实施方案中，BPXTEN构建为使得所述BP位于BPXTEN的N末端，其中施用的BPXTEN的RMC比所述BP连接至XTEN的C末端的构建BPXTEN降低，并且保留天然BP的至少一部分生物活性。在另一实施方案中，BPXTEN构建为使得所述BP位于BPXTEN的C末端，其中施用的BPXTEN的RMC比所述BP位于BPXTEN的N末端的构建BPXTEN降低，并且保留天然BP的至少一部分生物活性。在另一实施方案中，BPXTEN从N-至C末端构建为XTEN-BP-XTEN，其中施用的BPXTEN的RMC比用一个XTEN构建的BPXTEN降低，并且保留天然BP的至少一部分生物活性。本领域技术人员应当明白，本发明也涉及实现该性质的其它结构；例如，添加第二分子BP或间隔区序列。在本段以上所述的实施方案中，BPXTEN的半衰期可以比构建的BPXTEN延长至少大约50％、或至少大约75％，或至少大约100％、或至少大约150％、或至少大约200％、或至少大约300％，在该构建的BPXTEN中，BP成分的结合亲和力和RMC没有降低。在本段以上所述的实施方案中，延长的半衰期可允许比未连接到XTEN的BP或比BPXTEN结构(在该结构中，BP成分保留与天然BP相当的对受体的结合亲和力)更高的剂量和降低的给药频率。
特定的体内和离体生物试验也可以用来评估每种构造的BPXTEN和/或将要并入BPXTEN的BP成分的生物活性。例如，胰岛素分泌和/或从胰岛β细胞转录的增加可以通过本领域已知的方法测定。组织的葡萄糖摄取也可以通过诸如葡萄糖钳夹试验等方法来评估。适合评估施用的BPXTEN融合蛋白在治疗代谢疾病和障碍中的活性的其它体内和离体参数包括空腹葡萄糖水平、峰值餐后葡萄糖水平、葡萄糖稳态、对口服葡萄糖耐量试验的响应、对胰岛素攻击的响应、HAlc、热量摄取、饱腹感、胃排空速率、胰腺分泌、胰岛素分泌、周围组织胰岛素敏感性、β细胞量、β细胞破坏、血脂水平或分布、体重指数或体重。根据这些试验或本领域已知的其它试验的结果，可以证实，或者必要时可以调节和重新测定BPXTEN结构或组合物，以证实靶标结合亲和力或生物活性。
用于检测表达的蛋白质的物理和结构性质的具体试验和方法是本领域已知的，包括确定诸如蛋白质聚集、溶解度、二级和三级结构、熔解性质、污染和含水量等性质的方法。这些方法包括分析离心、EPR、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、HPLC-反相、光散射、毛细管电泳、圆二色性、差式扫描量热法、荧光、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼光谱法、折光法和紫外/可见光谱法。另外的方法在Arnau等人，Prot Expr and Purif(2006)48，1-13中公开。这些方法应用于本发明在本领域技术人员的能力范围内。
V).本发明的组合物的应用
在另一方面，本发明提供一种在BP介导的疾病、障碍或病症中实现有益效果的方法。本发明克服了BP具有相对较短的终末半衰期和/或在最低有效剂量和最大耐受剂量之间的窄治疗窗的缺点和/或限制。
在一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中实现有益效果的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的BPXTEN的步骤。该有效量可以产生帮助治疗疾病或障碍的有益效果。在有些情况中，实现有益效果的方法可以包括施用治疗有效量的BPXTEN融合蛋白组合物以治疗患有葡萄糖相关或代谢疾病、障碍或病症的受试者，包括但不限于1型糖尿病、2型糖尿病、综合征X、胰岛素抗性、超高胰岛素血症、动脉粥样硬化、糖尿病神经病变、血脂异常、肥胖症、进食障碍、妊娠糖尿病、高胆固醇血症、高血压、胰β细胞量不足、肺性高血压或视网膜神经变性过程。可能受益于本发明BPXTEN组合物治疗的葡萄糖相关或代谢疾病或临床病症的其它实例包括但不限于I型糖尿病的“蜜月期”、青少年糖尿病、食欲过盛、饱感不足、代谢紊乱、胰高血糖素瘤、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、其中希望减少食物摄取的障碍、手术后分解代谢变化、冬眠心肌或糖尿病性心肌病、尿钠排出不足、尿钾浓度过高、与中毒性血容量过多有关的病症或障碍、多囊卵巢综合征、肾病、胃肠道病症如腹泻、术后倾倒综合征、肠易激综合征、危重病性多神经病(CIPN)、全身炎症反应综合征(SIRS)、血脂异常、中风、局部缺血后的再灌注损伤，和冠心病危险因素(CHDRF)综合征，或其中希望减少食物摄取的障碍。
在有些情况中，实现有益效果的方法可以包括施用治疗有效量的BPXTEN融合蛋白组合物以治疗具有凝血蛋白缺乏或出血障碍的受试者，包括但不限于因子VII缺乏、因子X缺乏、因子XII缺乏、血友病A、血友病B(Christmas病)、血友病C、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、冯威里氏病(I型和II型)、创伤相关的出血，或手术出血。
在其它情况中，实现有益效果的方法可以包括施用治疗有效量的BPXTEN融合蛋白组合物以治疗具有生长激素相关障碍或病症的患者，该障碍或病症可以包括但不限于成人和儿童的GH缺乏、Turner综合征、Prader-Willi综合征、慢性肾衰竭、宫内发育迟缓、特发性身材矮小、AIDS消耗、肥胖症、多发性硬化、衰老、纤维肌痛、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肌营养不良症或低肌肉量(例如健身)、低骨密度，或使用GH的任何其它适应症。
在一个实施方案中，该方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的包含含有连接到XTEN序列的BP的BPXTEN融合蛋白组合物和至少一种药学可接受的载体的药物组合物，导致BP成分介导的至少一个参数、生理条件或临床结果比以相当剂量施用的包含未连接到XTEN的BP的药物组合物介导的效果有更大改善。在一个实施方案中，药物组合物以治疗有效剂量施用。在另一实施方案中，药物组合物使用多个连续剂量施用，使用治疗有效剂量方案(如本文定义)，持续给药期的时间长度。
由于BPXTEN的PK参数增强，与未连接到XTEN的相应BP相比，可以使用较长的剂量之间的间隔施用BP，以预防、治疗、缓解、逆转或改善代谢疾病、障碍或病症的症状或临床异常，或者延长所治疗的受试者的存活期。
本发明的方法可以包括施用治疗有效量的BPXTEN的连续剂量一段时间，该时间足以实现和/或保持希望的参数或临床效果，并且治疗有效量的这些连续剂量建立了BPXTEN的治疗有效剂量方案；即，融合蛋白组合物的连续施用剂量的时间表，其中该剂量以治疗有效量给予，以导致对代谢疾病状态或病症的任何临床体征或症状、方面、测量的参数或特征的持续有益的效果，包括但不限于本文所述的那些。
治疗有效量的BPXTEN可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重和抗体或抗体部分在个体中引发希望的应答的能力等因素而不同。治疗有效量也是BPXTEN的治疗有益效果超过任何毒性或有害效果的量。预防有效量是指获得希望的预防结果所必需的时间长度所需要的BPXTEN的量。
对于本发明的方法，优选长效BPXTEN组合物，以改善患者的方便性，以延长剂量之间的时间间隔，以及减少实现持续效果所需的药物量。在一个实施方案中，治疗方法包括向需要的受试者施用治疗有效剂量的BPXTEN，导致为该组合物的融合蛋白建立的治疗窗内停留的时间比以相当的剂量向受试者施用的未连接到融合蛋白的相应BP成分的时间延长。在有些情况中，治疗窗内停留的时间是以相当的剂量向受试者施用的未连接到融合蛋白的相应BP成分的至少大约3倍、或至少大约4倍、或至少大约5倍、或至少大约6倍、或至少大约8倍、或至少大约10倍、或至少大约20倍、或至少大约40倍。该方法进一步提供，使用治疗有效剂量方案向需要的受试者施用多个连续剂量的BPXTEN可导致与使用对于该BP建立的剂量方案施用的未连接到融合蛋白的相应BP相比，融合蛋白血液水平的连续Cmax波峰和/或Cmin波谷之间的时间延长。在前述实施方案中，连续Cmax波峰和/或Cmin波谷之间经历的时间的延长可以是使用为该BP建立的剂量方案施用的未连接到融合蛋白的相应BP成分的至少大约3倍、或至少大约4倍、或至少大约5倍、或至少大约6倍、或至少大约8倍、或至少大约10倍、或至少大约20倍、或至少大约40倍。在本段描述的上述实施方案中，与以相当的单位剂量或剂量方案向受试者施用的未连接到融合蛋白的相应BP成分相比，使用较低单位剂量(摩尔数)的融合蛋白，施用融合蛋白可以导致至少一个参数改善(本文中公开为可用于评估所述疾病、病症或障碍)。
在一个实施方案中，BPXTEN可以具有导致临床、生物化学或生理学参数之一改善的活性，该活性高于未连接到XTEN的BP成分的活性，这使用相同的试验或基于测量的临床参数来确定。在另一实施方案中，BPXTEN可以具有两个或多个临床或代谢相关参数的活性(例如，糖尿病患者的葡萄糖稳态和体重控制，或血友病患者减少的凝血酶原和出血时间，或生长激素缺乏患者增加的肌肉量和骨密度)，每个均由不同BP之一介导，这些BP共同导致比未连接到XTEN的BP成分增强的效果，这使用相同的试验或基于测量的临床参数来确定。在另一实施方案中，BPXTEN的施用可导致一个或多个临床或生物化学或生理学参数的活性，该活性比未连接到XTEN的单BP成分之一的活性有更长的持续时间，它们使用相同的试验或基于测量的临床参数来确定。
在一个实施方案中，治疗方法包括使用治疗有效剂量方案施用BPXTEN，以实现一个或多个与糖尿病或胰岛素抗性有关的参数的改善。在前述实施方案中，改善可以根据主要效果或临床终点例如血红蛋白A1c(HbA1c，参见，例如，Reynolds等人，BMJ，333(7568)：586-589，2006)的改善来评估。指示治疗效果的HbA1c的改善可能根据患者的初始基线测量而不同，较大的降低通常对应于较高的初始基线，较小的降低通常对应于较低的初始基线。在一些实施方案中，该方法可以导致HbA1c比剂量前水平降低至少大约0.5％，或至少大约1％，或至少大约1.5％，或至少大约2％，或至少大约2.5％，或至少大约3％，或至少大约3.5％、或至少大约4％或更多。在其它实施方案中，该治疗方法可导致空腹血糖(例如，葡萄糖)水平低于130mg/dL，或者低于125mg/dL，或者低于120mg/dL，或者低于115mg/dL，或者低于110mg/dL，或者低于105mg/dL，或者空腹血糖水平低于100mg/dL。在其它实施方案中，该方法可导致空腹血糖(例如，葡萄糖)水平比剂量前水平降低大于大约20％，更优选大于大约30％，更优选大于大约40％，更优选大于大约50％，更优选大于大约60％，更优选大于大约70％，更优选大于大约80％，最优选大于大约90％。在其它实施方案中，该方法可导致120分钟口服葡萄糖耐量试验(OGTT)葡萄糖水平低于约200mg/dL，更优选低于约190mg/dL，更优选低于约180mg/dL，更优选低于约170mg/dL，更优选低于约160mg/dL，更优选低于约150mg/dL，最优选低于约140mg/dL。根据参数评估的治疗方法的其它实例包括改善血友病患者的凝血酶原时间；例如，施用包含FIX的BPXTEN可导致凝血酶原时间相比正常受试者为至少大约40％，更优选至少大约50％，更优选至少大约60％，更优选至少大约70％，更优选至少大约80％，更优选至少大约90％，或更优选至少大约95％。
本发明进一步涉及根据此处提供的方法使用的BPXTEN可以与可用于治疗糖尿病、胰岛素抗性、代谢性疾病、出血障碍或生长障碍的其它治疗方法和药物组合物一起施用。这些组合物可以包括，例如，DPP-IV抑制剂、胰岛素、胰岛素类似物、PPARγ激动剂、双作用PPAR激动剂、GLP-1激动剂或类似物、PTP1B抑制剂、SGLT抑制剂、胰岛素促分泌剂、RXR激动剂、糖原合酶激酶-3抑制剂、胰岛素致敏剂、免疫调节剂、β-3肾上腺素能受体、Pan-PPAR激动剂、11β-HSD1抑制剂、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、氯茴苯酸类、噻唑烷二酮类、磺脲类和本领域已知的其它糖尿病药物，或抗高血压药物、钙通道阻滞药或凝血因子和相关产物。在有些情况中，BPXTEN的施用可允许使用较低剂量的共同施用的药物组合物，以对于患者的疾病、障碍或病症达到相当的临床效果或测量的参数。
尽管如上所述，在某些实施方案中，根据本发明的方法使用的BPXTEN可以阻止或延迟葡萄糖相关疾病、代谢性疾病或障碍、凝血障碍或生长激素缺乏或生长障碍患者对额外治疗方法或使用药物或其它药物组合物的需要。在其它实施方案中，BPXTEN可减少治疗基础疾病、障碍或病症所需的额外治疗方法或药物或其它药物组合物的量、频率或持续时间。
在另一方面，本发明提供一种设计具有希望的药理学或药学性质的BPXTEN组合物的方法。考虑各种目标设计和制备BPXTEN融合蛋白(与未连接到融合蛋白的BP成分比较)，包括改善治疗效果用于治疗代谢疾病或障碍、与BP相比提高融合蛋白的药代动力学特征、降低达到药理学效果所需的给药剂量或频率、提高BP成分在治疗窗内保持延长的一段时间的能力。
通常，如图4-6所示，设计和生产融合蛋白和本发明组合物的步骤可以包括：(1)选择BP(例如，天然蛋白质、肽激素、具有活性的肽类似物或衍生物、肽片段等)，以治疗特定疾病、障碍或病症；(2)选择将为产生的BPXTEN提供希望的PK和物理化学性质的XTEN(例如，向受试者施用该组合物导致融合蛋白比未连接到XTEN的BP在治疗窗内保持更长的一段时间)；(3)建立希望的BPXTEN的N至C末端结构，以实现希望的效果或PK参数；(4)建立编码构造的BPXTEN的表达载体的设计；(5)用该表达载体转化合适的宿主；和(6)表达和回收得到的融合蛋白。对于那些希望半衰期延长(超过16小时)或在治疗窗内经历的时间段延长的BPXTEN，为引入而选择的XTEN通常具有至少大约500、或大约576、或大约864、或大约875、或大约913、或大约924个氨基酸残基，其中一个XTEN将被引入BPXTEN内。在另一实施方案中，BPXTEN可包含上述长度的第一XTEN和大约144、或大约288、或大约576、或大约864、或大约875、或大约913、或大约924个氨基酸残基的第二XTEN。
在不需要半衰期延长但希望药学性质(例如，溶解度)增加的其它情况中，BPXTEN可以被设计为包括较短长度的XTEN。在上述的一些实施方案中，BPXTEN可以包含连接到具有至少大约24、或大约36、或大约48、或大约60、或大约72、或大约84、或大约96个氨基酸残基的XTEN的BP，其中融合蛋白在生理条件下的溶解度是未连接到XTEN的相应BP的至少3倍，或者是未连接到XTEN的胰高血糖素的至少4倍，或5倍，或6倍，或7倍，或8倍，或9倍，或至少10倍，或至少20倍，或至少30倍，或至少50倍，或至少60倍或更高。在上述的一个实施方案中，BP是胰高血糖素。在上述的另一实施方案中，BPXTEN可包含胰高血糖素和选自表12-15的多肽序列。在另外其它的情况中，其中希望含胰高血糖素的BPXTEN融合蛋白有2-6小时的半衰期(例如，在夜间低血糖症的治疗中)，融合蛋白可以设计为具有中等长度的XTEN，如含胰高血糖素的BPXTEN的XTEN成分中有大约100个氨基酸、或大约144个氨基酸、或大约156个氨基酸、或大约168个氨基酸、或大约180个氨基酸、或大约196个氨基酸。
在另一方面，本发明提供制备BPXTEN组合物的方法，以便与天然BP相比易于制备，导致提高的稳定性、提高的水溶性，和/或易于配制。在一个实施方案中，本发明包括一种提高BP的水溶性的方法，包括以下步骤：连接BP至一个或多个XTEN，使得与非融合状态的BP相比，在生理条件下可以获得更高浓度的可溶形式的BPXTEN。导致XTEN当引入融合蛋白时使BP水溶性提高的性质的因素包括XTEN融合配偶体的高溶解度和在溶液中XTEN分子之间的低自聚集程度。在一些实施方案中，该方法产生BPXTEN融合蛋白，其中在生理条件下水溶性比未融合的BP高至少大约50％、或至少大约60％、或至少大约70％、或至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约100％、或至少大约150％、或至少大约200％、或至少大约400％、或至少大约600％、或至少大约800％、或至少大约1000％、或至少大约2000％、或至少大约4000％、或至少大约6000％。
在另一实施方案中，本发明包括一种延长BP的贮存期的方法，包括以下步骤：将BP与选择的一个或多个XTEN连接，使得得到的BPXTEN的贮存期比非融合状态的BP延长。本文使用的贮存期是指BP或BPXTEN在溶液中或一些其它贮存制剂中的功能活性保持稳定而没有过度活性损失的一段时间。本文使用的“功能活性”是指药理学效果或生物活性，如结合受体或配体的能力，或酶活性，或显示一个或多个与BP相关的已知的功能活性，如本领域所知。降解或聚集的BP通常比保持在溶液中的BP具有降低的功能活性或降低的生物利用度。引起该方法当引入融合蛋白时延长BP贮存期的能力的因素包括提高的水溶性，溶液中减少的自聚集，以及提高的XTEN融合配偶体的热稳定性。特别是，XTEN的低聚集倾向性有利于配制含有较高药物浓度的BP的药用制剂的方法，并且XTEN的热稳定性有利于BPXTEN融合蛋白长期保持可溶性和功能活性的性质。在一个实施方案中，该方法产生具有“延长的”贮存期的BPXTEN融合蛋白，其比经受相同的贮存和处理条件的标准物显示更高的活性。标准物可以是非融合的全长BP。在一个实施方案中，该方法包括用一种或多种药学可接受的赋形剂配制分离的BPXTEN的步骤，该赋形剂增强XTEN保持其非组织构象的能力和对于BPXTEN在比相应的非融合BP更长的时间内保持在制剂中可溶的能力。在一个实施方案中，该方法包括连接BP至XTEN以产生BPXTEN融合蛋白，当在给定时间点比较，并且当经受与标准物相同的贮存和处理条件时，该融合蛋白在溶液中保持标准物的功能活性的大于大约100％，或功能活性的大于大约105％、110％、120％、130％、150％或200％，从而延长了其贮存期。
贮存期也可以根据对贮存开始时的功能活性标准化的贮存后保留的功能活性进行评估。如延长的或增强的功能活性所显示的，具有延长的贮存期的本发明BPXTEN融合蛋白，相比未连接到XTEN的同等BP，当经受相同条件和相同时间时，可保留大约50％以上的功能活性、或大约60％、70％、80％或90％以上的功能活性。例如，在各种温度条件下，包含融合到XTEN序列的毒蜥外泌肽-4或胰高血糖素的本发明BPXTEN融合蛋白在溶液中可保留其原始活性的大约80％或更多，可达5周的时间或更长。在一些实施方案中，当在80℃加热10分钟时，BPXTEN保留其在溶液中的原活性的至少大约50％、或大约60％、或至少大约70％、或至少大约80％、最优选至少大约90％或更多。在其它实施方案中，BPXTEN当加热或保持在37℃大约7天时保留其在溶液中的原活性的至少大约50％，优选至少大约60％，或至少大约70％，或至少大约80％，或至少大约90％或更多。在另一实施方案中，BPXTEN融合蛋白在暴露于大约30℃至大约70℃的温度大约1小时至大约18小时的一段时间后保留其功能活性的至少大约80％或更多。在本段以上所述的实施方案中，BPXTEN的保留的活性在给定时间点是未连接到融合蛋白的相应BP的至少大约2倍、或至少大约3倍、或至少大约4倍、或至少大约5倍、或至少大约6倍。
VI).本发明的DNA序列
本发明提供编码BPXTEN嵌合多肽的分离的多核酸和互补于编码BPXTEN嵌合多肽的多核酸分子的序列，包括同源变体。在另一方面，本发明包括生产编码BPXTEN嵌合多肽的多核酸和互补于编码BPXTEN嵌合多肽的多核酸分子的序列(包括同源变体)的方法。通常，并且如图4-6所示，生产编码BPXTEN融合蛋白的多核苷酸序列和表达得到的基因产物的方法包括装配编码BP和XTEN的核苷酸，在阅读框内连接这些成分，将编码基因引入适当的表达载体中，用表达载体转化合适的宿主细胞，并且使融合蛋白在转化的宿主细胞中表达，从而产生生物活性BPXTEN多肽。标准分子生物学重组技术可以用来制备本发明的多核苷酸和表达载体。
根据本发明，编码BPXTEN的核酸序列可以用来产生引导BPXTEN融合蛋白在合适的宿主细胞中表达的重组DNA分子。设想几种适合进行本发明的克隆策略，其中许多可以用来产生包含编码本发明BPXTEN组合物的融合蛋白的基因或其互补体的构建体。在一个实施方案中，克隆策略将用来产生编码包含至少第一BP和至少第一XTEN多肽或其互补体的单体BPXTEN的基因。在另一实施方案中，克隆策略将用于产生编码包含一种BP的第一和第二分子和至少第一XTEN(或其互补体)的单体BPXTEN的基因，用来转化宿主细胞用于表达融合蛋白，该融合蛋白用来配制BPXTEN组合物。在本段以上所述的实施方案中，该基因还可以包含编码间隔序列的核苷酸，该序列还可以编码酶切序列。
在设计希望的XTEN序列时，尽管在产生XTEN编码序列中使用
“构件块”分子方法，但发现可以实现本发明组合物的XTEN的非重复性质。这通过利用编码基序的多核苷酸文库，然后多聚化以产生编码XTEN序列的基因来实现(参见图4和5)。因此，表达的XTEN可能由多个单位的少至四个不同基序组成，因为基序本身由非重复氨基酸序列组成，总体XTEN序列是非重复的。因此，在一个实施方案中，编码XTEN的多核苷酸包含多个编码非重复序列或基序的多核苷酸，这些多核苷酸符合读框地有效连接，并且其中得到的表达的XTEN氨基酸序列是非重复的。
在一种方法中，首先制备含有对应于BPXTEN融合蛋白的DNA序列的构建体。编码该组合物的BP的DNA可以从使用标准方法由组织或分离的细胞制备的cDNA文库中获得，据认为该组织或细胞具有BPmRNA并以可检测的水平表达。必要时，编码序列可以使用常规引物延伸方法获得，该方法如同上的Sambrook等人所述，以检测可能尚未逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间体。因此，可以从由这样的来源制备的cDNA文库方便地获得DNA。编码BP的基因也可以从基因组文库获得，或者通过本领域已知的标准合成方法(例如，自动化核酸合成)利用从可公开获得的数据库、专利或参考文献获得的DNA序列产生。这些方法是本领域公知的，并且在科技和专利文献中充分描述。例如，序列可以获自Chemical Abstracts Services(CAS)RegistryNumbers(American Chemical Society出版)和/或GenBank登录号(例如，Locus ID，NP_XXXXX和XP_XXXXX)模型蛋白质标识符，其可通过国家生物技术信息中心(NCBI)网页获得，可见互联网ncbi.nlm.nih.gov，对应于CAS Registry或GenBank数据库的入口，其中含有BAP或BAP的片段或变体的氨基酸序列。对于此处提供的这些序列标识符，与这些CAS和GenBank和GenSeq登录号相关的总结页以及引用的杂志出版物(例如，PubMed ID号(PMID))在此全部引入作为参考，特别是对于本文所述的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码BP的基因编码来自表3-8中任一个的蛋白质或其片段或变体。
在表达的融合蛋白包含单BP的情况中，编码所述BPXTEN蛋白的BP部分的基因或多核苷酸然后可以克隆到构建体中，该构建体可以是在适当转录和翻译序列控制下的用于在生物系统中高水平蛋白质表达的质粒或其它载体。在后一步骤中，编码XTEN的第二基因或多核苷酸遗传学融合到编码BP基因的N和/或C末端的核苷酸上，方法是通过将其克隆到构建体中与编码BP的基因邻近或在阅读框内。该第二步可以通过连接或多聚化步骤进行。在本段描述的上述实施方案中，应当理解产生的基因构建体可以是编码相应融合蛋白的相应基因的互补体。
编码XTEN的基因可以在一步或多步中制备，它们是完全合成的或通过合成结合酶方法，如限制性内切酶介导的克隆、PCR和过夜延伸。XTEN多肽可以构建为使得编码XTEN的基因具有低重复性，而编码的氨基酸序列具有一定程度的重复性。具有非重复序列的编码XTEN的基因可以使用标准基因合成技术从寡核苷酸装配。基因设计可以使用优化密码子应用的算法和氨基酸组合物进行。在本发明的一种方法中，产生然后装配相对短的编码XTEN的多核苷酸构建体的文库，如图4和图5所示。这可以是纯密码子文库，使得每个文库成员具有相同的氨基酸序列，但是许多不同的编码序列是可能的。这种文库可以从部分随机化的寡核苷酸装配，并用来产生包含该基序的XTEN区段的大文库。可以优化随机化方案，以对于每个位点以及密码子应用控制氨基酸选择。
多核苷酸文库
在另一方面，本发明提供编码XTEN序列的多核苷酸的文库，该序列能够用来装配编码理想长度和序列的XTEN的基因。
在一些实施方案中，编码XTEN的文库构建体包含编码固定长度的多肽区段的多核苷酸。作为初始步骤，可以装配编码9-14个氨基酸残基的基序的寡核苷酸的文库。在一个优选实施方案中，装配编码12个氨基酸的基序的寡核苷酸文库。
编码XTEN的序列区段可以二聚化或多聚化为更长的编码序列。二聚化或多聚化可以通过连接、重叠延伸、PCR装配或本领域已知的类似的克隆技术来进行。该过程可以重复多次，直到得到的编码XTEN的序列达到序列组织和希望的长度，产生编码XTEN的基因。应当理解，编码12个氨基酸的多核苷酸的文库可以二聚化为编码36个氨基酸的多核苷酸的文库。随之，编码36个氨基酸的多核苷酸的文库可以连续二聚化为含有连续更长的编码XTEN序列的多核苷酸的文库。在一些实施方案中，文库可以由编码氨基酸的多核苷酸装配，它们限于特定序列XTEN家族；例如，表1的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列。在其它实施方案中，文库可以包含编码表1中两个或多个基序家族序列的序列。编码36mers的文库的代表性、非限制性多核苷酸序列的名称和序列显示在表12-15中，并且它们的生产方法在实施例中更详细地记载。该文库然后可以用于连续二聚化或连接，以获得编码XTEN序列的多核苷酸序列文库，例如，72、144、288、576、864、912、923、1296个氨基酸，或最多总长为大约3000个氨基酸，以及中间长度。在有些情况中，多核苷酸文库序列也可以包括用作“测序岛”的额外的碱基，在下面更详细地描述。
图5是本发明的实施方案中，XTEN多核苷酸构建体和BPXTEN多核苷酸构建体装配中的代表性、非限制性步骤的示意流程图。各寡核苷酸501可以与基序502如12个氨基酸的基序(″12-mer″)退火，随后与含有BbsI和KpnI限制酶切位点503的寡核苷酸连接。来自文库的额外的基序与12-mer退火，直到获得希望长度的XTEN基因504。将XTEN基因克隆到填充载体内。该载体可以任选地编码Flag序列506，其后为填充序列，该填充序列的侧翼为BsaI、BbsI和KpnI位点507，在这种情况下，为单BP基因(在该例子中编码毒蜥外泌肽-4)508，产生编码含有单BP 500的BPXTEN的基因。表11中提供了对于编码XTEN的多核苷酸和前体序列的XTEN名称和SEQ ID NOS的非穷尽列表。
表11：XTEN的DNA序列和前体序列
Figure BPA00001431324301191
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可以将编码XTEN的基因的文库克隆到一个或多个本领域已知的表达载体中。为了促进良好表达的文库成员的鉴定，可以将该文库构建为与报道蛋白质的融合体。合适的报道基因的非限制性例子是绿色荧光蛋白、萤光素酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。通过筛选，可以鉴定能够在选择的宿主生物中高浓度表达的短XTEN序列。随后，可以产生随机XTEN二聚体的文库，并重复该筛选用于高水平表达。随后，可以针对诸如表达水平、蛋白酶稳定性或与抗血清的结合等大量性质筛选得到的构建体。
本发明的一方面是提供编码融合蛋白成分的多核苷酸序列，其中该序列的产生已经经历密码子优化。特别有意义的是以改善多肽组合物的表达和改善编码基因在生产宿主中的遗传稳定性为目的的密码子优化。例如，密码子优化对于富含甘氨酸或具有高度重复的氨基酸序列的XTEN序列是特别重要的。密码子优化可以使用计算机程序进行(Gustafsson，C.等人，(2004)Trends Biotechnol，22：346-53)，其中一些使核糖体中止最小化(Coda Genomics Inc.)。在一个实施方案中，可以通过构建密码子文库进行密码子优化，其中该文库的所有成员编码相同的氨基酸序列，但是密码子使用不同。可以为了特别适合含XTEN产物大规模生产的高度表达和遗传稳定的成员筛查这些文库。当设计XTEN序列时，人们可以考虑许多性质。人们可以使编码DNA序列中的重复性最小化。另外，人们可以避免或最少地使用生产宿主极少使用的密码子(例如AGG和AGA精氨酸密码子和一个亮氨酸密码子，在大肠杆菌中)。在大肠杆菌的情况中，两个甘氨酸密码子GGA和GGG在高度表达的蛋白质中极少使用。因此编码XTEN序列的基因的密码子优化可能是非常希望的。具有高水平甘氨酸的DNA序列倾向于具有高GC含量，这能够导致不稳定性或低表达水平。因此，可能时，优选地选择密码子，使得XTEN编码序列的GC含量适合将用于生产XTEN的生产生物。
任选地，全长XTEN编码基因可以包含一个或多个测序岛。在该环境中，测序岛是短延伸序列，它不同于XTEN文库构建体序列，并且包括不存在于或者预期存在于全长XTEN编码基因中的限制性位点。在一个实施方案中，测序岛是序列
5’-AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGT-3’(SEQ ID NO：261)。在另一实施方案中，测序岛是序列
5’-AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGT-3’(SEQ ID NO：262)。
作为一个备选方案，人们可以构建密码子文库，其中该文库的所有成员编码相同的氨基酸序列，但是密码子使用不同。可以为了特别适合含XTEN产物大规模生产的高度表达和遗传稳定的成员筛查这些文库。
任选地，人们可以对该文库中的克隆进行测序，以清除含有不希望的序列的分离物。短XTEN序列的初始文库可允许氨基酸序列中有一些变化。例如，人们可以随机化一些密码子，使得在特定位置可以存在大量亲水性氨基酸。
在反复多聚化的过程中，人们除了筛查高水平表达外，还可以筛查得到的文库成员的其它特性如溶解度或蛋白酶抗性。
一旦选择了编码具有希望长度和性质的XTEN的基因，就将其遗传融合到编码BP基因的N末端和/或C末端的核苷酸，方法是将其克隆到构建体中与编码BP的基因相邻或符合读框或者与间隔序列相邻。本发明提供上述的多种排列，这取决于将要编码的BPXTEN。例如，编码BPXTEN融合蛋白的基因包含两个BP，如式III或IV所示，如上所述，该基因将具有编码两个BP、至少第一XTEN和任选的第二XTEN和/或间隔序列的多核苷酸。将BP基因克隆到XTEN构建体的步骤可以通过连接或多聚化步骤进行。如图2所示，编码BPXTEN融合蛋白的构建体可以设计为成分XTEN 202、BP 203和间隔序列204的不同结构。在一个实施方案中，如图2A所示，构建体包含互补于或编码以下顺序(5’至3’)BP 203和XTEN 202或相反顺序的成分的单体多肽的多核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2B所示，构建体包含互补于或编码以下顺序(5’至3’)BP 203、间隔序列204和XTEN 202或相反顺序的成分的单体多肽的多核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2C所示，构建体201编码单体BPXTEN，其中包含互补于或编码以下顺序(5’至3’)：两分子BP 203和XTEN 202或相反顺序的成分的单体多肽的多核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2D所示，构建体包含互补于或编码以下顺序(5’至3’)：两分子BP 203、间隔序列204和XTEN 202或相反顺序的成分的单体多肽的多核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2E所示，构建体包含互补于或编码以下顺序(5’至3’)：BP 203、间隔序列204、第二分子BP 203和XTEN 202或相反顺序的成分的单体多肽的多核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2F所示，构建体包含互补于或编码以下顺序(5’至3’)：BP 203、XTEN 202、BP 203和第二XTEN 202或相反顺序的成分的单体多肽的多核苷酸序列。间隔多核苷酸任选地可以包含编码切割序列的序列。本领域技术人员将会明白，上述的其它排列也是可能的。
本发明还包括包含编码XTEN的多核苷酸变体的多核苷酸，该变体与以下序列具有高序列同一性百分比：(a)来自表11的多核苷酸序列，或(b)互补于(a)的多核苷酸的序列。具有高序列同一性百分比的多核苷酸与上述的(a)或(b)具有至少大约80％的核酸序列同一性，或者至少大约81％，或者至少大约82％，或者至少大约83％，或者至少大约84％，或者至少大约85％，或者至少大约86％，或者至少大约87％，或者至少大约88％，或者至少大约89％，或者至少大约90％，或者至少大约91％，或者至少大约92％，或者至少大约93％，或者至少大约94％，或者至少大约95％，或者至少大约96％，或者至少大约97％，或者至少大约98％，或者至少大约99％的核酸序列同一性，或者在严格条件下能够与目标多核苷酸或其互补序列杂交。
核苷酸或氨基酸序列的同源性、序列相似性或序列同一性也可以使用已知的软件或计算机程序如BestFit或Gap逐对比较程序(GCGWisconsin Package，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis.53711)常规确定。BestFit使用Smith和Waterman(Advances inApplied Mathematics.1981.2：482-489)的局部同源性算法，来发现两个序列之间的同一性或相似性的最佳区段。Gap进行全面比对：使用Needleman和Wunsch的方法(Journal of Molecular Biology.1970.48：443-453)将一个序列的全部与另一个相似序列的全部进行比较。当使用序列比对程序如BestFit来确定序列同源性、相似性或同一性程度时，可以使用缺省参数，或者可以选择适当的评分矩阵来优化同一性、相似性或同源性得分。
“互补的”核酸序列是能够根据标准Watson-Crick互补原则碱基配对的序列。本文使用的术语“互补序列”是指基本互补的核酸序列，这可以通过上述相同的核苷酸比较来评估，或者定义为在严格条件下能够与编码BPXTEN序列的多核苷酸杂交，如本文所述。
得到的编码BPXTEN嵌合组合物的多核苷酸然后可以分别克隆到表达载体中。核酸序列可以通过多种操作插入载体中。通常，利用本领域已知的技术将DNA插入合适的限制性内切核酸酶位点中。载体成分通常包括但不限于一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有这些成分中的一个或多个的适当载体的构建使用本领域技术人员已知的标准连接技术。这些技术是本领域公知的，并且在科学和专利文献中详细描述。
多种载体可以公开获得。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。表达和克隆载体含有使得载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。用于多种细菌、酵母和病毒的这些载体序列是公知的。可以使用的有用的表达载体包括，例如，染色体、非染色体和合成DNA序列的区段。合适的载体包括但不限于SV40和pcDNA的衍生物和已知的细菌质粒如Smith等人，Gene 57：31-40(1988)所述的col EI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX，pMB9及其衍生物，质粒如RP4，噬菌体DNA，如噬菌体I的大量衍生物如NM989，以及其它噬菌体DNA如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2微米质粒或2m质粒的衍生物，以及中心体和整合酵母穿梭载体；在真核细胞中有用的载体，如在昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体；来源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体，如已经为了使用噬菌体DNA或表达控制序列而修饰的质粒；等等。要求是该载体在选择的宿主细胞中能够复制和存活。需要时可以使用低拷贝数或高拷贝数载体。
适合用于原核宿主的表达载体的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等人，Nature，275：615(1978)；Goeddel等人，Nature，281：544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel，NucleicAcids Res.，8：4057(1980)；EP 36,776]，和杂合启动子，如tac启动子[deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]。用于细菌系统的启动子也可以包含有效连接到编码BPXTEN多肽的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
例如，在杆状病毒表达系统中，可以使用非融合转移载体，例如但不限于pVL941(BamHI克隆位点，可获自Summers等人，Virology84：390-402(1978))、pVL1393(BamHI、Smal、Xbal、EcoRI、IVotl、Xmalll、BgIII和Pstl克隆位点；Invitrogen)、pVL1392(BgIII、Pstl、NotI、XmaIII、EcoRI、Xball、Smal和BamHI克隆位点；Summers等人，Virology 84：390-402(1978)和Invitrogen)和pBlueBacIII(BamHI、BgIII、Pstl、Ncol和Hindi II克隆位点，具有蓝/白重组筛选，Invitrogen)，和融合转移载体，例如但不限于pAc7 00(BamHI和Kpnl克隆位点，其中BamHI识别位点开始于起始密码子；Summers等人，Virology 84：390-402(1978))、pAc701和pAc70-2(与pAc700相同，具有不同的阅读框)、pAc360[多角体蛋白起始密码子36个碱基对下游的BamHI克隆位点；Invitrogen(1995))和pBlueBacHisA、B、C(三个不同阅读框，具有BamH I、BgI II、Pstl、Nco l和Hind III克隆位点，用于ProBond纯化和噬斑的蓝/白重组筛选的N末端肽；Invitrogen(220)。
哺乳动物表达载体可以包含复制起点、合适的启动子和增强子，也包含任何必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。SV40剪接产生的DNA序列和聚腺苷酸化位点可以用来提供需要的非转录遗传元件。预期用于本发明的哺乳动物表达载体包括具有诱导型启动子如二氢叶酸还原酶启动子的载体，任何具有DHFR表达盒的表达载体或DHFR/氨甲喋呤共扩增载体如pED(Pstl、Sail、Sbal、Smal和EcoRI克隆位点，该载体表达克隆的基因和DHFR；Randal J.Kaufman，1991，Randal J.Kaufman，CurrentProtocols in Molecular Biology，16，12(1991))。或者谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸硫酰亚胺共扩增载体，如pEE14(Hindlll、Xball、Smal、Sbal、EcoRI和Sell克隆位点，其中该载体表达谷氨酰胺合成酶和克隆的基因；Celltech)。可以使用在EB病毒(EBV)或核抗原(EBNA)控制下引导附加型表达的载体，如pREP4(BamHI r SfH、Xhol、NotI、Nhel、Hindi II、NheI、PvuII和Kpnl克隆位点，组成型RSV-LTR启动子，潮霉素选择性标记；Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfH、Xhol、NotI、Nhel、Hindlll、Nhel、PvuII和Kpnl克隆位点、组成型hCMV立即早期基因启动子、潮霉素选择性标记；Invitrogen)、pMEP4(.Kpnl、Pvul、Nhel、Hindlll、NotI、Xhol、Sfil、BamHI克隆位点，诱导型金属硫蛋白H a基因启动子，潮霉素选择性标记，Invitrogen)、pREP8(BamHI、Xhol、NotI、Hindlll、Nhel和Kpnl克隆位点，RSV-LTR启动子，组氨醇选择性标记；Invitrogen)、pREP9(Kpnl、Nhel、Hind lll、NotI、Xhol、Sfi l、BamH I克隆位点，RSV-LTR启动子，G418选择性标记；Invitrogen)和pEBVHis(RSV-LTR启动子，潮霉素选择性标记，可通过ProBond树脂纯化并被肠激酶切割的N末端肽；Invitrogen)。
用于本发明的选择性哺乳动物表达载体包括但不限于pRc/CMV(Hind lll、BstXI、NotI、Sbal和Apal克隆位点，G418选择，Invitrogen)、pRc/RSV(Hind II、Spel、BstXI、NotI、Xbal克隆位点，G418选择，Invitrogen)等。可用于本发明的痘苗病毒哺乳动物表达载体(参见，例如，Randall J.Kaufman，Current Protocols in Molecular Biology16.12(Frederick M.Ausubel等人编.Wiley 1991)包括但不限于pSC11(Smal克隆位点，TK-和β-gal选择)、pMJ601(Sal l、Sma l、A flI、Narl、BspMlI、BamHI、Apal、Nhel、SacII、Kpnl和Hindlll克隆位点；TK-和β-gal选择)、pTKgptFlS(EcoRI、Pstl、SaIII、Accl、HindII、Sbal、BamHI和Hpa克隆位点，TK或XPRT选择)等等。
也可以用于本发明的酵母表达系统包括但不限于非融合pYES2载体(XJbal、Sphl、Shol、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamHI、Sad、Kpnl和Hindlll克隆位点，Invitrogen)、融合pYESHisA、B、C(Xball、Sphl、Shol、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、Sad、Kpnl和Hindi II克隆位点，通过ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N末端肽；Invitrogen)、pRS载体等。
另外，含有编码嵌合BPXTEN融合蛋白的多核苷酸分子的表达载体可以包括药物选择标记。这些标记有助于含有嵌合DNA分子的载体的克隆和选择或鉴定。例如，提供新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制剂、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(GPT)、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择性标记。此外，可以使用酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。也可以使用免疫学标记。可以使用任何已知的选择性标记，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择性标记的其它例子是本领域技术人员公知的，包括报道蛋白，如增强绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
在一个实施方案中，编码BPXTEN融合蛋白组合物的多核苷酸可以在C末端融合到适合表达宿主系统的N末端信号序列。在易位和分泌过程中，信号序列一般从蛋白质上蛋白水解切除，产生确定的N末端。对于大多数表达系统，包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物系统，已经描述了多种信号序列。每种表达系统的优选实例的非限制性列表如下所述。优选的信号序列是用于大肠杆菌表达的OmpA、PhoA和DsbA。酵母表达优选的信号肽是ppL-alpha、DEX4、转化酶信号肽、酸性磷酸酶信号肽、CPY或INU1。对于昆虫细胞表达，优选的信号序列是sexta激脂激素前体，CP1、CP2、CP3、CP4、TPA、PAP或gp67。对于哺乳动物表达，优选的信号序列是IL2L、SV40、IgGκ和IgGλ。
在另一实施方案中，前导序列，可能包含良好表达的、独立的蛋白质域，可以融合到BPXTEN序列的N末端，被蛋白酶酶切位点分隔。尽管可以使用不抑制在指定蛋白水解位点切割的任何前导肽序列，但优选实施方案中的序列将包含稳定的、良好表达的序列，使得整个组合物的表达和折叠不会被显著不利地影响，并且优选地表达、溶解度和/或折叠效率显著改善。文献中已经描述了多种合适的前导序列。合适的序列的非限制性列表包括麦芽糖结合蛋白质、纤维素结合域、谷胱甘肽S-转移酶、6xHis标签(SEQ ID NO：263)、FLAG标签、血凝素标签和绿色荧光蛋白质。前导序列也可以通过密码子优化进一步改善，特别是在ATG起始密码子之后的第二密码子位置，通过文献和以上所述的方法进行。
已知在特定位点酶切蛋白质的各种体外酶学方法。这些方法包括使用肠激酶(DDDK(SEQ ID NO：264))、因子Xa(IDGR(SEQ ID NO：265))、凝血酶(LVPRGS(SEQ ID NO：266))、PreScissionTM(LEVLFQGP(SEQ ID NO：267))、TEV蛋白酶(EQLYFQG(SEQ ID NO：268))、3C蛋白酶(ETLFQGP(SEQ ID NO：269))、分选酶A(LPETG)、粒酶B(D/X、N/X、M/N或S/X)、内含肽、SUMO、DAPase(TAGZymeTM)、气单胞菌氨肽酶、氨肽酶M和羧肽酶A和B。另外的方法在Arnau等人，Protein Expression and Purification 48：1-13(2006)中公开。
在其它实施方案中，优化的编码具有XTEN特征的、至少大约20至大约60个氨基酸的多核苷酸序列可以包括在XTEN序列的N末端，以促进翻译起始，以允许在不存在辅助域的情况下在蛋白质N末端的XTEN融合体的表达。在上述的一个优点中，序列不需要后续切割，从而减少了生产含XTEN组合物的步骤数。如实施例中更详细描述的，优化的N末端序列具有非组织蛋白质的属性，但是可包括为其促进翻译起始和增强表达的能力选择的编码氨基酸的核苷酸碱基。在上述的一个实施方案中，优化的多核苷酸编码与AE912(SEQ ID NO：217)有至少大约90％序列同一性的XTEN序列。在上述的另一实施方案中，优化的多核苷酸编码与AM923(SEQ ID NO：218)有至少大约90％序列同一性的XTEN序列。
在另一实施方案中，选择前导序列构建体的蛋白酶位点，使得它被体内蛋白酶识别。在该实施方案中，从表达系统中纯化蛋白质，同时通过避免接触适当的蛋白酶保留前导区。然后将全长构建体注射到患者体内。注射后，构建体接触酶切位点特异性蛋白酶，并且被该蛋白酶切割。在未酶切的蛋白质比酶切形式的活性大大降低的情况下，该方法具有允许较高的起始剂量而避免毒性的有益效果，因为该活性形式在体内缓慢产生。可用于本申请的体内蛋白酶的一些非限制性例子包括组织激肽释放酶、血浆激肽释放酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶和基质金属蛋白酶，或表10的蛋白酶。
以这种方式，在构建体内产生编码单体BPXTEN融合蛋白的嵌合DNA分子。任选地，该嵌合DNA分子可以转移或克隆到是更合适的表达载体的另一构建体中。在这点上，能够表达嵌合DNA分子的宿主细胞可以用嵌合DNA分子转化。可以根据细胞宿主的类型，通过众所周知的方法，将含有目标DNA区段的载体转移到宿主细胞内。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、脂转染或电穿孔可以用于其它细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。概括性地参见，Sambrook等人，同上。
转化可以使用或不使用载体如表达载体进行。然后，转化的宿主细胞在适合表达编码BPXTEN的嵌合DNA分子的条件下培养。
本发明也提供了用于表达此处公开的单体融合蛋白组合物的宿主细胞。合适的真核宿主细胞的例子包括但不限于哺乳动物细胞，如VERO细胞、HELA细胞如ATCC No.CCL2、CHO细胞系、COS细胞、WI38细胞、BHK细胞、HepG2细胞、3T3细胞、A549细胞、PC12细胞、K562细胞、293细胞、Sf9细胞和CvI细胞。合适的非哺乳动物真核细胞的例子包括真核微生物，如丝状真菌或酵母是用于编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种常用的低等真核宿主微生物。其它包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse，Nature，290：140[1981]；EP 139,383，1985年5月2日公布)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利No.4,943,529；Fleer等人，Bio/Technology，9：968-975(1991))，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等人，J.Bacteriol.，737[1983])、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等人，Bio/Technology，8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等人，J.Basic Microbiol.，28：265-278[1988])；假丝酵母(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)(Case等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263[1979])；许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(EP394,538，1990年10月31日公布)；和丝状真菌，例如，脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO 91/00357，1991年1月10日公布)，和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284-289[1983]；Tilburn等人，Gene，26：205-221[1983]；Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474[1984])和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.，4：475-479[1985])。甲基营养酵母适用于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母，选自以下属：汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。作为此类酵母的典型的具体种的列表可见C.Anthony，The Biochemistry ofMethylotrophs，269(1982)。
可以在本发明中使用的其它合适的细胞包括但不限于原核宿主细胞株，如大肠杆菌(例如，DH5-a株)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，或假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的菌株。合适的原核生物的非限制性例子包括来自以下属的菌株：游动放线菌属(Actinoplanes)；古生球菌属(Archaeoglobus)；蛭弧菌属(Bdellovibrio)；疏螺旋体属(Borrelia)；绿屈挠菌属(Chloroflexus)；肠球菌属(Enterococcus)；埃希氏菌属(Escherichia)；乳杆菌属(Lactobacillus)；李斯特菌属(Listeria)；大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)；副球菌属(Paracoccus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；葡萄球菌属(Staphylococcus)；链球菌属(Streptococcus)；链霉菌属(Streptomyces)；热原体属(Thermoplasma)和弧菌属(Vibrio)。具体菌株的非限定性的例子包括：闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)；食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)；布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)，橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)；约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；无害李斯特菌(Listeria innocua)；单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)；伊平屋桥大洋芽孢杆菌(Oceanobacillusiheyensis)；Paracoccus zeaxanthinifaciens；Pseudomonas mevalonii；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；Streptomycesgriseolosporeus；变异链球菌(Streptococcus mutans)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)；嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)；火山热原体(Thermoplasma volcanium)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)；和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。
含有目标多核苷酸的宿主细胞可以在为了激活启动子、选择转化体或扩增基因而适当改变的常规营养培养基(例如，Ham′s营养混合物)中培养。诸如温度、pH等培养条件是以前用于为了表达而选择的宿主细胞的条件，并且是普通技术人员所清楚的。细胞一般通过离心收集，通过物理或化学手段破碎，并且保留获得的粗提物用于进一步纯化。对于宿主细胞分泌的组合物，分离离心上清液，并保留用于进一步纯化。蛋白质表达中使用的微生物细胞可以通过任何常规方法破碎，包括冻融循环、超声处理、机械破碎或者使用细胞裂解剂，这些都是本领域技术人员公知的。涉及细胞裂解的实施方案可能需要使用含有蛋白酶抑制剂的缓冲液，该蛋白酶抑制剂限制嵌合DNA分子表达后的降解。合适的蛋白酶抑制剂包括但不限于亮抑酶肽、胃酶抑素或抑肽酶。上清液然后可以在浓度继续提高的饱和硫酸铵中沉淀。
基因表达可以在样品中直接检测，例如，通过常规Southern印迹法、定量mRNA转录的Northern印迹法([Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)])、斑点印迹法(DNA分析)或原位杂交，其中使用适当标记的探针，基于此处提供的序列进行。或者，可以使用能够识别特异性双链体(包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体)的抗体。该抗体又可以标记，并且可以进行分析，该分析中双链体结合到表面上，使得在表面上形成双链体时，可以检测与该双链体结合的抗体的存在。
或者，基因表达可以根据荧光法的免疫学检测，例如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的分析或选择性标记的检测，以直接定量基因产物的表达。可用于免疫组化染色和/或样品流体分析的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以在任何哺乳动物中制备。常规地，可以制备针对天然序列BP多肽或针对基于此处提供的DNA序列的合成肽或针对与BP融合并编码特异性抗体表位的外源序列的抗体。选择性标记的其它例子是本领域技术人员公知的，包括报道蛋白，如增强绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
表达的BPXTEN多肽产物可以通过本领域已知的方法或通过本文公开的方法纯化。可以使用诸如凝胶过滤、亲和纯化、盐分级分离、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、羟磷灰石吸附色谱法、疏水相互作用色谱法和凝胶电泳等方法；每一种都为回收和纯化各自宿主细胞产生的融合蛋白而调整。一些表达的BPXTEN在分离和纯化过程中可能需要重折叠。纯化方法记载在Robert K.Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Charles R.Castor(ed.)，Springer-Verlag 1994和Sambrook等人，同上。多步纯化分离也在Baron等人，Crit.Rev.Biotechnol.10：179-90(1990)和Below等人，J.Chromatogr.A.679：67-83(1994)中记载。
VII).药物组合物
本发明提供包含BPXTEN的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含BPXTEN融合蛋白和至少一种药学可接受的载体。本发明的BPXTEN多肽可以根据已知的方法配制，以制备药学可用的组合物，从而该多肽与药学可接受的载体如水溶液或缓冲液、药学可接受的悬浮液和乳液混合。非水性溶剂的例子包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。为了贮存，通过混合具有希望的纯度的活性成分与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，制备冻干制剂或水溶液形式的治疗性制剂，如Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)所述。
药物组合物可以口服、鼻内、肠胃外或通过吸入治疗施用，并且可以采用片剂、锭剂、颗粒、胶囊、丸剂、安瓿、栓剂或气雾剂的形式。它们也可以采用活性成分在水或非水稀释剂中的悬浮液、溶液和乳剂，糖浆，颗粒或粉末的形式。另外，药物组合物也可以含有其它药学活性化合物或多种本发明的化合物。
更特别地，本发明的药物组合物可以通过任何合适的途径施用治疗，包括口服、直肠、鼻、局部(包括经皮、气雾剂、口腔和舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、通过输注泵皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)、玻璃体内和经肺途径。也应当理解，优选的途径将随接受者的状态和年龄以及所治疗的疾病而不同。
在一个实施方案中，药物组合物皮下施用。在该实施方案中，组合物可以作为冻干粉末提供，在施用前重配。组合物也可以以能够直接施用于患者的液体形式提供。在一个实施方案中，组合物作为液体在预装注射器中提供，使得患者能够容易地自我施用该组合物。
在本发明中有用的延长释放制剂可以是含有基质和包衣组合物的口服制剂。合适的基质材料可包括蜡(例如，棕榈蜡、蜂蜡、石蜡、地蜡、虫胶蜡、脂肪酸和脂肪醇)、油、硬化油或脂肪(例如，硬化菜籽油、蓖麻油、牛油、棕榈油和豆油)和聚合物(例如，羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素和聚乙二醇)。其它合适的基质压片材料有微晶纤维素、粉状纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素，与其它载体和填料。片剂也可以含有颗粒、包衣粉末或小丸。片剂也只可以是多层的。当活性成分具有显著不同的药代动力学类型时，多层片剂是特别优选的。任选地，制成的片剂可以是包衣的或未包衣的。
包衣组合物可以包含不溶性基质聚合物和/或水溶性材料。水溶性材料可以是聚合物如聚乙二醇、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇，或单体材料如糖类(例如，乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇等)、盐类(例如，氯化钠、氯化钾等)、有机酸类(例如，富马酸、琥珀酸、乳酸和酒石酸)及其混合物。任选地，肠聚合物可以引入包衣组合物中。合适的肠聚合物包括羟丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙烯醋酸酯邻苯二甲酸酯，邻苯二甲酸醋酸纤维素，偏苯三酸醋酸纤维素酯，虫胶，玉米醇溶蛋白，和含有羧基的聚甲基丙烯酸酯。包衣组合物可以通过添加合适的增塑剂塑化，例如，邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸酯、聚乙二醇、甘油、乙酰化甘油酯、乙酰化柠檬酸酯、癸二酸二丁酯和蓖麻油。包衣组合物也可以包括填料，该填料可以是不溶性材料如二氧化硅、二氧化钛、滑石、高岭土、矾土、淀粉、粉状纤维素、MCC或聚克立林钾。包衣组合物可以作为有机溶剂或水溶剂或其混合物中的溶液或乳液应用。可以使用诸如水、低级醇、低级氯化烃、酮或其混合物等溶剂。
本发明的组合物可以使用多种赋形剂配制。合适的赋形剂包括微晶纤维素例如Avicel PH102，Avicel PH101)、聚甲基丙烯酸酯、聚(丙烯酸酯乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸三甲基氨基乙基酯氯化物)(如Eudragit RS-30D)、羟丙基甲基纤维素(Methocel K100M、Premium CRMethocel K100M、Methocel E5、Opadry
Figure BPA00001431324301431
)、硬脂酸镁、滑石、柠檬酸三乙酯、乙基纤维素水分散液(Surelease
Figure BPA00001431324301432
)和硫酸鱼精蛋白。缓释剂也可以包含载体，该载体可包括例如溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。药学可接受的盐也可以用于这些缓释剂中，例如，无机盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。该组合物也可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇，以及诸如湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂等物质。脂质体也可以用作载体。
在另一实施方案中，本发明的组合物包封在脂质体中，已经证明脂质体可用于以控制的方式在延长的时间内递送有益的活性剂。脂质体是封闭的双层膜，含有捕获的水性体积。脂质体也可以是具有单膜双层的单层囊泡，或具有多膜双层的多层囊泡，各自被水层与下一个分隔。得到的膜双层的结构使得脂质的疏水性(非极性)尾朝向双层的中心，而亲水性(极性)头朝向水相。在一个实施方案中，脂质体可以涂覆有柔性水溶性聚合物，以避免被单核吞噬细胞系统的器官(主要是肝和脾)摄取。用于围绕脂质体的合适的亲水性聚合物包括但不限于PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列，如美国专利Nos.6,316,024；6,126,966；6,056,973；6,043,094所述，其内容全文引入作为参考。
脂质体可以包含本领域已知的任何脂质或脂质组合。例如，囊泡形成脂质可以是天然存在的或合成的脂质，包括磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，如美国专利Nos.6,056,973和5,874,104公开的。囊泡形成脂质也可以是糖脂类、脑苷脂类或阳离子脂质，如1，2-二油基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；N-[1-(2，3，-双十四烷基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)；N-[1[(2，3，-二油基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DORIE)；N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲氯化铵(DOTMA)；3[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲酰]胆固醇(DC-Chol)；或者二甲基双十八烷基铵(DDAB)也在美国专利No.6,056,973中公开。也可以存在适当范围的胆固醇，以使囊泡具有稳定性，如美国专利Nos.5,916,588和5,874,104所公开的。
其它脂质体技术在美国专利Nos.6,759,057；6,406,713；6,352,716；6,316,024；6,294,191；6,126,966；6,056,973；6,043,094；5,965,156；5,916,588；5,874,104；5,215,680；和4,684,479中记载，其内容在此引入作为参考。它们描述了脂质体和脂质包被的微泡，以及它们的生产方法。因此，本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其它专利的公开内容，能够生产用于延长释放本发明的多肽的脂质体。
对于液体制剂，一种希望的性质是该制剂以一种形式提供，该形式能够通过25、28、30、31、32号针头，用于静脉内、肌肉内、关节内或皮下施用。
通过透皮制剂的施用可以使用本领域已知的方法进行，包括在例如美国专利Nos.5,186,938和6,183,770、4,861,800、6,743,211、6,945,952、4,284,444和WO 89/09051中一般性描述的方法，这些专利在此全文引入作为参考。透皮贴剂是具有吸收问题的多肽的特别有用的实施方案。贴剂可以制备为控制可渗透皮肤的活性成分在12小时、24小时、3天和7天时间的释放。在一个实例中，每日2倍过量的本发明的多肽置于非挥发性流体中。本发明的组合物以粘性、非挥发性液体的形式提供。特定制剂通过皮肤的渗透可以通过本领域的标准方法测量(例如，Franz等人，J.Invest.Derm.64：194-195(1975))。合适的贴剂的例子是被动转移皮肤贴剂、离子电渗皮肤贴剂或具有微针的皮肤贴剂如Nicoderm。
在其它实施方案中，组合物可以通过鼻内、口腔或舌下途径递送至脑，以能够通过嗅觉通道转移活性剂至CNS并减少全身施用。常用于该施用途径的装置包括在美国专利No.6,715,485中。通过该途径递送的组合物能够增加CNS给药或减少全身负荷量，减少与某些药物有关的全身毒性风险。用于在皮下可植入装置中递送的药物组合物的制备可以使用本领域已知的方法进行，例如，美国专利Nos.3,992,518、5,660,848和5,756,115中描述的方法。
渗透泵可以用作片剂、丸剂、胶囊或可植入装置形式的缓释剂。渗透泵是本领域公知的，本领域技术人员容易从专业提供用于延长释放药物递送的渗透泵的公司获得。例子有ALZA的DUROSTM；ALZA的OROSTM；Osmotica Pharmaceutical的OsmodexTM系统；Shire Laboratories的EnSoTrolTM系统；和AlzetTM。描述渗透泵技术的专利有美国专利Nos.6,890,918；6,838,093；6,814,979；6,713,086；6,534,090；6,514,532；6,361,796；6,352,721；6,294,201；6,284,276；6,110,498；5,573,776；4,200,0984；和4,088,864，其内容在此引入作为参考。本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其它专利的公开内容，将能够生产用于延长释放本发明的多肽的渗透泵。
注射泵也可以用作缓释剂。这样的装置在美国专利Nos.4,976,696；4,933,185；5,017,378；6,309,370；6,254,573；4,435,173；4,398,908；6,572,585；5,298,022；5,176,502；5,492,534；5,318,540；和4,988,337中描述，它们的内容在此引入作为参考。本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其它专利的公开内容，将能够生产用于延长释放本发明的组合物的注射泵。
VIII).药物试剂盒
在另一方面，本发明提供一种有利于使用BPXTEN多肽的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒在至少第一容器中包含：(a)一定量的BPXTEN融合蛋白组合物，其在施用于需要的受试者后足以治疗疾病、病症或障碍；和(b)一定量的药学可接受的载体；一起在准备注射或用于以无菌水、缓冲液或右旋糖重配的制剂中；以及标识BPXTEN药物和贮存和处理条件的标签，和该药物获得批准的说明、用于重配和/或施用BPXTEN药物以用于预防和/或治疗批准的适应症、适当的剂量和安全信息和标识药物的批号和有效期的信息的说明书。在上述的另一实施方案中，该试剂盒可包括第二容器，该第二容器可具有适用于BPXTEN组合物的稀释剂，该稀释剂将为使用者提供适合递送至受试者的BPXTEN浓度。
实施例
实施例1：XTEN_AD36基序区段的构建
下列实施例描述了编码36个氨基酸的基序的密码子优化的基因集合的构建。在第一步，基于pET载体构建填充载体pCW0359，该载体包含T7启动子。pCW0359编码纤维素结合域(CBD)和TEV异氟醚识别位点，该位点之后为填充序列。填充序列的侧翼为BsaI、BbsI和KpnI位点。插入BsaI和BbsI位点，使得它们在消化后产生相容的突出端。该填充序列之后为GFP基因的截短形式和His标签。该填充序列含有终止密码子，因此携带填充质粒pCW0359的大肠杆菌细胞形成非荧光菌落。用BsaI和KpnI消化填充载体pCW0359，以除去填充区段，得到的载体片段通过琼脂糖凝胶纯化来分离。将序列命名为XTEN_AD36，反映基序的AD家族。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是12mer肽，序列为：GESPGGSSGSES(SEQ ID NO：270)、GSEGSSGPGESS(SEQ ID NO：271)、GSSESGSSEGGP(SEQ ID NO：272)或GSGGEPSESGSS(SEQ ID NO：273)。通过将以下磷酸化合成寡核苷酸对退火获得插入片段：
AD1for：AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC(SEQ ID NO：274)
AD1rev：ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC(SEQ ID NO：275)
AD2for：AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC(SEQ ID NO：276)
AD2rev：ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT(SEQ ID NO：277)
AD3for：AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC(SEQ ID NO：278)
AD3rev：ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA(SEQ ID NO：279)
AD4for：AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC(SEQ ID NO：280)
我们也将磷酸化寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：281)和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA(SEQ ID NO：282)退火。连接退火的寡核苷酸对，产生具有不同长度的产物的混合物，该不同的长度代表连接到BbsI/KpnI区段的不同数目的12mer重复片段。通过制备型琼脂糖凝胶电泳从该混合物中分离出对应于36个氨基酸的长度的产物，并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。得到的文库被命名为LCW0401，其中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AD36的序列已经与GFP基因符合读框地连接，并且大多数XTEN_AD36序列具有良好的表达水平。
我们通过将其转印到含有IPTG的琼脂平板上从文库LCW0401中筛选了96个高荧光水平的分离物。通过PCR评价了这些分离物，鉴定出48个含有36个氨基酸的区段以及强荧光的分离物。对这些分离物进行测序，鉴定出39个含有正确的XTEN_AD36区段的克隆。核苷酸和氨基酸构建体的文件名和这些区段的SEQ ID NO在表12中列出。
表12：36-mer基序的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001431324301491
Figure BPA00001431324301501
实施例2：XTEN_AE36区段的构建
构建编码长度为36个氨基酸的XTEN序列的密码子文库。将该XTEN序列命名为XTEN_AE36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是12mer肽，序列为：GSPAGSPTSTEE(SEQ ID NO：359)、GSEPATSGSE TP(SEQ ID NO：360)、GTSESA TPESGP(SEQ ID NO：361)或GTSTEPSEGSAP(SEQ ID NO：362)。通过将以下磷酸化合成寡核苷酸对退火获得插入片段：
AE1for：AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA(SEQ ID NO：363)
AE1rev：ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT(SEQ ID NO：364)
AE2for：AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC(SEQ ID NO：365)
AE2rev：ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT(SEQ ID NO：366)
AE3for：AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC(SEQ ID NO：367)
AE3rev：ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT(SEQ ID NO：368)
AE4for：AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC(SEQ ID NO：369)
AE4rev：ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT(SEQ ID NO：370)
我们也将磷酸化寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：371)和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA(SEQ ID NO：372)退火。连接退火的寡核苷酸对，产生具有不同长度的产物的混合物，该不同的长度代表连接到BbsI/KpnI区段的不同数目的12mer重复片段。通过制备型琼脂糖凝胶电泳从该混合物中分离出对应于36个氨基酸的长度的产物，并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。得到的文库被命名为LCW0402，其中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AE36的序列已经与GFP基因符合读框地连接，并且大多数XTEN_AE36序列显示良好的表达。
我们通过将其转印到含有IPTG的琼脂平板上从文库LCW0402中筛选了96个高荧光水平的分离物。通过PCR评价了这些分离物，鉴定出48个含有36个氨基酸的区段以及强荧光的分离物。对这些分离物进行测序，鉴定出37个含有正确的XTEN_AE36区段的克隆。核苷酸和氨基酸构建体的文件名和这些区段的SEQ ID NO在表13中列出。
表13：36-mer基序的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001431324301511
Figure BPA00001431324301521
Figure BPA00001431324301531
Figure BPA00001431324301541
实施例3：XTEN_AF36区段的构建
构建编码长度为36个氨基酸的序列的密码子文库。将该序列命名为XTEN_AF36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是12mer肽，序列为：GSTSESPSGTAP(SEQ ID NO：447)、GTSTPESGSASP(SEQ IDNO：448)、GTSPSGESSTAP(SEQ ID NO：449)或GSTSSTAESPGP(SEQID NO：450)。通过将以下磷酸化合成寡核苷酸对退火获得插入片段：
AF1for：AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC(SEQ ID NO：451)
AF1rev：ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA(SEQ ID NO：452)
AF2for：AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC(SEQ ID NO：453)
AF2rev：ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT(SEQ ID NO：454)
AF3for：AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC(SEQ ID NO：455)
AF3rev：ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT(SEQ ID NO：456)
AF4for：AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC(SEQ ID NO：457)
AF4rev：ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA(SEQ ID NO：458)
我们也将磷酸化寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：459)和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA(SEQ ID NO：460)退火。连接退火的寡核苷酸对，产生具有不同长度的产物的混合物，该不同的长度代表连接到BbsI/KpnI区段的不同数目的12mer重复片段。通过制备型琼脂糖凝胶电泳从该混合物中分离出对应于36个氨基酸的长度的产物，并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。得到的文库被命名为LCW0403，其中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AF36的序列已经与GFP基因符合读框地连接，并且大多数XTEN_AF36序列显示良好的表达。
我们通过将其转印到含有IPTG的琼脂平板上从文库LCW0403中筛选了96个高荧光水平的分离物。通过PCR评价了这些分离物，鉴定出48个含有36个氨基酸的区段以及强荧光的分离物。对这些分离物进行测序，鉴定出44个含有正确的XTEN_AF36区段的克隆。核苷酸和氨基酸构建体的文件名和这些区段的SEQ ID NO在表14中列出。
表14：36-mer基序的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001431324301551
Figure BPA00001431324301561
Figure BPA00001431324301581
实施例4：XTEN_AG36区段的构建
构建编码长度为36个氨基酸的序列的密码子文库。将该序列命名为XTEN_AG36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是12mer肽，序列为：GTPGSGTASSSP(SEQ ID NO：549)、GSSTPSGATGSP(SEQ IDNO：550)、GSSPSASTGTGP(SEQ ID NO：551)或GASPGTSSTGSP(SEQ ID NO：552)。通过将以下磷酸化合成寡核苷酸对退火获得插入片段：
AG1for：AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC(SEQ ID NO：553)
AG1rev：ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT(SEQ ID NO：554)
AG2for：AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC(SEQ ID NO：555)
AG2rev：ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT(SEQ ID NO：556)
AG3for：AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC(SEQ ID NO：557)
AG3rev：ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA(SEQ ID NO：558)
AG4for：AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC(SEQ ID NO：559)
AG4rev：ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC(SEQ ID NO：560)
我们也将磷酸化寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：561)和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA(SEQ ID NO：562)退火。连接退火的寡核苷酸对，产生具有不同长度的产物的混合物，该不同的长度代表连接到BbsI/KpnI区段的不同数目的12mer重复片段。通过制备型琼脂糖凝胶电泳从该混合物中分离出对应于36个氨基酸的长度的产物，并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。得到的文库被命名为LCW0404，其中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AG36的序列已经与GFP基因符合读框地连接，并且大多数XTEN_AG36序列显示良好的表达。
我们通过将其转印到含有IPTG的琼脂平板上从文库LCW0404中筛选了96个高荧光水平的分离物。通过PCR评价了这些分离物，鉴定出48个含有36个氨基酸的区段以及强荧光的分离物。对这些分离物进行测序，鉴定出44个含有正确的XTEN_AG36区段的克隆。核苷酸和氨基酸构建体的文件名和这些区段的SEQ ID NO在表15中列出。
表15：36-mer基序的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001431324301611
Figure BPA00001431324301621
Figure BPA00001431324301631
实施例5：XTEN_AE864的构建
通过XTEN_AE36至AE72、144、288、576和864的系列二聚化构建XTEN_AE864。从37个不同的XTEN_AE36区段构建XTEN_AE72区段的集合。混合携带全部37个不同的36氨基酸区段的大肠杆菌的培养物，并分离质粒。该质粒合并物用BsaI/NcoI消化，产生作为插入片段的小片段。同一质粒合并物用BbsI/NcoI消化，以产生作为载体的大片段。连接该插入片段和载体片段，导致长度加倍，将连接混合物转化BL21Gold(DE3)细胞，获得XTEN_AE72菌落。
该XTEN_AE72区段的文库被命名为LCW0406。合并来自LCW0406的所有克隆，再次使用如上所述相同的方法二聚化，产生XTEN_AE144的文库LCW0410。合并来自LCW0410的所有克隆，再次使用如上所述相同的方法二聚化，产生XTEN_AE288的文库LCW0414。从该文库中随机挑选两个分离物LCW0414.001和LCW0414.002，并测序，以证实其身份。合并来自LCW0414的所有克隆，再次使用如上所述相同的方法二聚化，产生XTEN_AE576的文库LCW0418。我们从文库LCW0418中筛选出96个高GFP荧光水平的分离物。对8个经PCR证实具有正确插入大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择两个分离物(LCW0418.018和LCW0418.052)供以后使用。
通过使用如上所述相同的二聚化方法组合XTEN_AE576的LCW0418.018和XTEN_AE288的LCW0414.002，构建XTEN_AE864的具体克隆pCW0432。
实施例6：XTEN_AM144的构建
从XTEN_AE36的37个不同区段、XTEN_AF36的44个区段和XTEN_AG36的44个区段开始构建XTEN_AM144区段的集合。
混合携带全部125个不同的36氨基酸区段的大肠杆菌的培养物，并分离质粒。该质粒合并物用BsaI/NcoI消化，产生作为插入片段的小片段。同一质粒合并物用BbsI/NcoI消化，以产生作为载体的大片段。连接该插入片段和载体片段，导致长度加倍，将连接混合物转化BL21Gold(DE3)细胞，获得XTEN_AM72菌落。
该XTEN_AM72区段的文库被命名为LCW0461。合并来自LCW0461的所有克隆，再次使用如上所述相同的方法二聚化，产生文库LCW0462。从文库LCW0462中筛选1512个分离物用于蛋白质表达。将各菌落转移到96孔板上，并且培养过夜作为起始培养物。将这些起始培养物稀释到新鲜的自诱导培养基中，并培养20-30小时。利用具有395nm激发和510nm发射的荧光读板器检测表达。192个分离物显示高水平表达，并且进行DNA测序。文库LCW0462中的大多数克隆显示良好的表达和相似的物理化学性质，提示XTEN_AM36区段的大多数组合产生有用的XTEN序列。选择来自LCW0462的30个分离物作为XTEN_AM144区段的优选集合，用于构建含有多个XTEN区段的多功能蛋白质。核苷酸和氨基酸构建体的文件名和这些区段的SEQID NO在表16中列出。
表16：AM144区段的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001431324301641
Figure BPA00001431324301661
Figure BPA00001431324301681
Figure BPA00001431324301691
Figure BPA00001431324301701
Figure BPA00001431324301711
Figure BPA00001431324301731
Figure BPA00001431324301741
实施例7：XTEN_AM288的构建
完整文库LCW0462如实施例6所述二聚化，产生被命名为LCW0463的XTEN_AM288克隆的文库。使用实施例6所述的方案筛选来自文库LCW0463的1512个分离物。对176个高度表达的克隆测序，选择40个优选的XTEN_AM288区段，用于构建含有具有288个氨基酸残基的多个XTEN区段的多功能蛋白质。
实施例8：XTEN_AM432的构建
我们通过重组来自XTEN_AM144区段的文库LCW0462的区段和来自XTEN_AM288区段的文库LCW0463的区段产生了XTEN_AM432区段的文库。XTEN_AM432区段的这种新文库被命名为LCW0464。从分别携带LCW0462和LCW0463的大肠杆菌培养物中分离质粒。使用实施例6所述的方案筛选来自文库LCW0464的1512个分离物。对176个高度表达的克隆进行测序，并且选择39个优选的XTEN_AM432区段用于构建较长的XTEN以及构建含有具有432个氨基酸残基的多个XTEN区段的多功能蛋白质。
我们使用XTEN_AM144和XTEN_AM288的优选区段平行地构建了XTEN_AM432区段的文库LMS0100。筛选该文库产生了4个分离物，选择它们用于进一步的构建。
实施例9：XTEN_AM875的构建
用BsaI和KpnI消化填充载体pCW0359，以除去填充区段，通过琼脂糖凝胶纯化分离得到的载体片段。
我们退火磷酸化的寡核苷酸BsaI-AscI-KpnIforP：AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：717)和非磷酸化的寡核苷酸BsaI-AscI-KpnIrev：CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCCGTGCTTGGCGCGCCGCTTGCGCTTGC(SEQ ID NO：718)，用于引入测序岛A(SI-A)，后者编码氨基酸GASASGAPSTG(SEQ ID NO：719)并且在内部具有限制酶AscI识别核苷酸序列GGCGCGCC。退火的寡核苷酸对与BsaI和KpnI消化的以上制备的填充载体pCW0359连接，产生含有SI-A的pCW0466。我们然后使用实施例5所述的相同二聚化方法，通过在C末端重组来自实施例8的43个优选XTEN_AM432区段和来自pCW0466的SI-A区段，产生了XTEN_AM443区段的文库。XTEN_AM443区段的这种新文库被命名为LCW0479。
我们使用实施例5所述的相同二聚化方法，通过重组来自XTEN_AM443区段的文库LCW0479的区段和来自实施例8的43个优选XTEN_AM432区段，产生了XTEN_AM875区段的文库。XTEN_AM875区段的这种新的文库被命名为LCW0481。
实施例10：XTEN_AM1318的构建
我们退火了磷酸化的寡核苷酸BsaI-FseI-KpnIforP：AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：720)和非磷酸化的寡核苷酸BsaI-FseI-KpnIrev：CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCCCGTTGGTTCTGG(SEQ ID NO：721)，用于引入测序岛B(SI-B)，后者编码氨基酸GPEPTGPAPSG(SEQ ID NO：722)并且在内部具有限制酶FseI识别核苷酸序列GGCCGGCC。退火的寡核苷酸对与BsaI和KpnI消化的实施例9使用的填充载体pCW0359连接，产生含有SI-B的pCW0467。我们然后使用实施例5所述的相同二聚化方法，通过在C末端重组来自实施例8的43个优选XTEN_AM432区段和来自pCW0467的SI-B区段，产生了XTEN_AM443区段的文库。XTEN_AM443区段的这种新文库被命名为LCW0480。
我们使用实施例5所述的相同二聚化方法，通过重组来自XTEN_AM443区段的文库LCW0480的区段和来自XTEN_AM875区段的文库LCW0481的区段，产生了XTEN_AM1318区段的文库。XTEN_AM1318区段的这种新的文库被命名为LCW0487。
实施例11：XTEN_AD864的构建
使用连续几轮二聚化，我们从实施例1列出的XTEN_AD36的区段开始，装配了XTEN_AD864序列的集合。这些序列如实施例5所述装配。评价来自XTEN_AD864的几个分离物，发现它们在生理条件下显示良好的表达和出色的溶解度。对XTEN_AD576的一种中间构建体进行测序。在食蟹猴的PK实验中评估该克隆，并测得大约20小时的半衰期。
实施例12：XTEN_AF864的构建
使用连续几轮二聚化，我们从实施例3列出的XTEN_AF36的区段开始，装配了XTEN_AF864序列的集合。这些序列如实施例5所述装配。评价来自XTEN_AF864的几个分离物，发现它们在生理条件下显示良好的表达和出色的溶解度。对XTEN_AF540的一种中间构建体进行测序。在食蟹猴的PK实验中评估该克隆，并测得大约20小时的半衰期。XTEN_AF864的全长克隆具有出色的溶解度并且在食蟹猴中显示超过60小时的半衰期。装配第二组XTEN_AF序列，包括如实施例9所述的测序岛。
实施例13：XTEN_AG864的构建
使用连续几轮二聚化，我们从实施例1列出的XTEN_AD36的区段开始，装配了XTEN_AG864序列的集合。这些序列如实施例5所述装配。评价来自XTEN_AG864的几个分离物，发现它们在生理条件下显示良好的表达和出色的溶解度。XTEN_AG864的全长克隆具有出色的溶解度并且在食蟹猴中显示超过60小时的半衰期。
实施例14：XTEN-构建的N末端延伸的构建和12mer增加文库的筛选
该实施例详细记载了XTEN蛋白的N末端的优化中的步骤，其促进翻译开始，以允许在不存在辅助域的情况下在融合蛋白N末端的XTEN融合体的表达。为了在密码子水平上产生多样性，选择了7个氨基酸序列并用多样化的密码子制备。设计了7对寡核苷酸，它们编码具有密码子多样性的12个氨基酸，将其退火，并连接到NdeI/BsaI限制酶消化的填充载体pCW0551(Stuffer-XTEN_AM875-GFP)，转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，以获得7个文库的菌落。得到的克隆具有与XTEN_AM875-GFP框内融合的N末端XTEN 12mers，以允许使用GFP荧光筛选表达。挑取来自产生的7个文库的各个克隆，在96深孔板的500μl超级肉汤培养基中过夜生长至饱和。挑取的菌落数为文库的理论多样性的大约一半到三分之一(参见表17)。
表17：12mer增加文库的理论多样性和采样数。具有随机化密码 子的氨基酸残基以下划线标出。
Figure BPA00001431324301781
饱和的过夜培养物用来在自诱导培养基中接种新鲜的500μl培养物，它们在其中26℃生长过夜。这些表达培养物然后利用荧光读板器(激发395nm，发射510nm)测定，以确定存在的GFP报道分子的量。结果表明表达水平中值大约是具有CBD N末端辅助域的表达水平的一半。但是，来自该文库的最佳克隆更接近于基准，并且表明这些序列周围的进一步优化得到保证。也清楚开始于氨基酸MA的文库比开始于ME的文库产生更好的表达。当观察最佳克隆时这是最明显的，这些最佳克隆更接近于基准，因为它们大多开始于MA。在CBD-AM875基准的33％内的176个克隆中，87％开始于MA，而该文库中只有75％的序列开始于MA，这是在最高表达水平上开始于MA的克隆的表示。对最佳克隆中的96个进行测序，以证实其身份，选择12个序列(参见表18)进一步优化，其中4个来自LCW546，4个来自LCW547，4个来自LCW552。
表18：选择的12mer DNA序列
Figure BPA00001431324301791
实施例15：XTEN-构建的N末端延伸的构建和优化密码子3和4的文库的筛选
本实施例详细记载了XTEN蛋白的N末端的优化中的步骤，其促进翻译开始，以允许在不存在辅助域的情况下在蛋白质N末端的XTEN融合体的表达。使用确定的对前两个密码子的偏好(参见上述实施例)，将第三个和第四个密码子随机化以确定偏好。基于来自LCW546、LCW547和LCW552的最佳克隆，使用第三个和第四个修饰的残基设计三个文库，使得允许的XTEN密码子的所有组合存在于这些位置。为了包括每个文库所有允许的XTEN密码子，设计了9对寡核苷酸，它们编码12个氨基酸，第三和第四个残基具有密码子多样性，将其退火，并连接到NdeI/BsaI限制酶消化的填充载体pCW0551(Stuffer-XTEN_AM875-GFP)，并转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，以获得三个文库LCW0569-571的菌落。使用24个XTEN密码子，每个文库的理论多样性为576个独特克隆。从产生的三个文库中挑取总共504个菌落，在96深孔板的500μl超级肉汤培养基中过夜生长至饱和。这提供足以了解相对文库表现和序列偏好的覆盖。饱和的过夜培养物用来在自诱导培养基中接种新的500μl培养物，它们在其中26℃生长过夜。这些表达培养物然后利用荧光读板器(激发395nm，发射510nm)测定，以确定存在的GFP报道分子的量。对筛选获得的前75个克隆进行测序，重新检测相对于基准样品的GFP报道分子的表达。52个克隆产生可用的测序数据，用于后续分析。结果按文库分解，表明LCW546是最佳的文库。这些结果示于表19中。
表19：第三和第四密码子优化文库比较
  LCW569   LCW570   LCW571
  N   21   15   16
  平均荧光(AU)   628   491   537
  SD   173   71   232
  CV   28％   15％   43％
在数据中发现进一步的趋势，在第三和第四位置显示对特定密码子的偏好。如表20所见，在LCW569文库内，第三位置的谷氨酸密码子GAA和苏氨酸密码子ACT与较高表达有关。
表20：LCW569中优选的第三和第四密码子
  3＝GAA   其余   4＝ACT   其余
  N   8   13   4   17
  平均荧光(AU)   749   554   744   601
  SD   234   47   197   162
  CV   31％   9％   26％   27％
另外，前75个克隆的重新检测表明现在有几个优于基准克隆。
实施例16：XTEN-构建的N末端延伸的构建和组合12mer和36mer文库的筛选
本实施例详细记载了XTEN蛋白的N末端的优化中的步骤，其促进翻译开始，以允许在不存在辅助域的情况下在蛋白质N末端的XTEN融合体的表达。使用确定的对前两个密码子的偏好(参见上述实施例)，通过以组合方式在极N末端组合12个选择的12mer序列(参见上述实施例)然后是125个以前构建的36mer区段(参见上述实施例)，在较宽的范围内检测了N末端。这样在XTEN蛋白的N末端产生了新的48mers，并且允许评估N末端的较长范围相互作用对较长序列的表达的影响(图11)。类似于用来装配36mers的二聚化过程(参见上述实施例)，用限制酶BbsI/NcoI消化含有125个选择的36mer区段的质粒，并且凝胶纯化合适的片段。来自克隆AC94的质粒(CBD-XTEN_AM875-GFP)也用BsaI/NcoI消化，并凝胶纯化合适的片段。将这些片段连接在一起，并转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，以获得文库LCW0579的菌落，它也作为用于在极N末端进一步克隆12个选择的12mers的载体。LCW0579的质粒用NdeI/EcoRI/BsaI消化，并且凝胶纯化合适的片段。设计12对寡核苷酸，它们编码选择的12个12mer序列，退火并连接至NdeI/EcoRI/BsaI消化的LCW0579载体，转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，以获得文库LCW0580的菌落。利用1500个独特克隆的理论多样性，从产生的文库中挑选总共1512个菌落，在96深孔板的500μl超级肉汤培养基中过夜生长至饱和。这提供足以了解相对文库表现和序列偏好的覆盖。饱和的过夜培养物用来在自诱导培养基中接种新的500μl培养物，它们在其中26℃生长过夜。这些表达培养物然后利用荧光读板器(激发395nm，发射510nm)测定，以确定存在的GFP报道分子的量。对筛选获得的前90个克隆进行测序，重新检测GFP报道分子的表达。83个克隆产生可用的测序数据，用于后续分析。该测序数据用于确定每个克隆中存在的先导12mer，并评估每个12mer对表达的影响。克隆LCW546_06和LCW546_09表现出为优异的N末端(参见表21)。
表21：开始于LCW546_06和LCW459_09的克隆的相对表现
 LCW546_06   其它所有  LCW546_09   其它所有
  N   11   72   9   74
  平均荧光(AU)   1100   752   988   775
  SD   275   154   179   202
  CV   25％   20％   18％   26％
测序和重新检测也显示了产生类似结果的数据中相同序列的独立重复的几个例子，从而提高了试验的置信度。另外，具有6个独特序列的10个克隆优于基准克隆。它们显示在表22中。注意这些只是这些序列的仅有的出现，在任何情况下都不会出现这些序列之一，并且不能打击基准克隆。选择这6个序列用于进一步优化。
表22：优于基准克隆的组合12mer和36mer克隆
Figure BPA00001431324301821
实施例17：XTEN-构建的N末端延伸的构建和对于XTEN-AM875和XTEN-AE864的组合12mer和36mer文库的筛选
本实施例详细记载了XTEN蛋白的N末端的优化中的步骤，其促进翻译开始，以允许在不存在辅助域的情况下在蛋白质N末端的XTEN融合体的表达。使用确定的对前4个密码子的偏好(参见上述实施例)以及对N末端12mers和36mers的最佳配对的偏好(参见上述实施例)，进行了组合方法，以检查这些偏好的统一。这在XTEN蛋白的N末端产生新的48mers，并且允许检验以前的结论。另外，通过将新的48mers置于XTEN-AE864和XTEN-AM875之前，评估了这些前导序列成为所有XTEN蛋白的通用方案的能力。不使用36mer区段的全部125个克隆，来自在组合文库中具有最佳GFP表达的36mer区段的选择的6个克隆的质粒用NdeI/EcoRI/BsaI消化，并凝胶纯化合适的片段。来自克隆AC94(CBD-XTEN_AM875-GFP)和AC104(CBD-XTEN_AE864-GFP)的质粒用NdeI/EcoRI/BsaI消化，并凝胶纯化合适的片段。将这些片段连接在一起，并转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，以获得文库LCW0585(-XTEN_AM875-GFP)和LCW0586(-XTEN_AE864-GFP)的菌落，它们也能够用作在极N末端进一步克隆8个选择的12mers的载体。LCW0585和LCW0586的质粒用NdeI/EcoRI/BsaI消化，并凝胶纯化合适的片段。设计8对寡核苷酸，它们编码选择的8个在以前的(第2代)筛选中具有最佳GFP表达的12mer序列，退火，并连接到NdeI/EcoRI/BsaI消化的LCW0585和LCW0586载体，并转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，以获得终文库LCW0587(XTEN_AM923-GFP)和LCW0588(XTEN_AE912-GFP)的菌落。使用48个独特克隆的理论多样性，从产生的文库中总共挑选252个菌落，在96深孔板的500μl超级肉汤培养基中过夜生长至饱和。这提供足以了解相对文库表现和序列偏好的覆盖。饱和的过夜培养物用来在自诱导培养基中接种新的500μl培养物，它们在其中26℃生长过夜。这些表达培养物然后利用荧光读板器(激发395nm，发射510nm)测定，以确定存在的GFP报道分子的量。对前36个克隆进行测序，重新检测GFP报道分子的表达。36个克隆产生可用的测序数据，这36个用于后续分析。该测序数据确定了克隆中存在12mer、第三个密码子、第四个密码子和36mer，并且揭示许多克隆是同一序列的独立重复。另外，这些克隆的重新检测结果在数值上接近，表明该筛选过程是可靠的。观察到某些组合在N末端的偏好，一致地产生比基准对照更高的荧光值(参见表23和24)。
表23：对于XTEN-AM875优选的N末端组合
  克隆名称   重复数   12mer   36mer   平均值   SD   CV
  CBD-AM875   NA   NA   NA   1715   418   16％
  LCW587_08   7   LCW546_06_3＝GAA   LCW404_40   2333   572   18％
  LCW587_17   5   LCW546_09_3＝GAA   LCW403_64   2172   293   10％
表24：对于XTEN-AE864优选的N末端组合
  克隆名称   重复数   12mer   36mer   平均值   SD   CV
  AC82   NA   NA   NA   1979   679   24％
  LCW588_14   8   LCW546_06_opt3   LCW404_31   2801   240   6％
  LCW588_27   2   LCW546_06_opt34   LCW404_40   2839   556   15％
值得注意的是，XTEN-AM875的N末端的优选组合和XTEN-AE864的优选组合不相同(表23和24)，表明比来自初始位点的150个碱基更复杂的相互作用影响表达水平。优选的核苷酸序列在表25中列出，通过SDS-PAGE分析优选的克隆，以独立地证实表达。选择XTEN_AM923和XTEN_AE912的完整序列用于进一步分析。
表25：对于N末端XTEN-AM875和XTEN-AE864的前48个氨基 酸残基优选的DNA序列
Figure BPA00001431324301851
Figure BPA00001431324301861
实施例18：产生和评价BPXTEN的方法；以XTEN-Ex4为例
用于生产和评价BPXTEN组合物的一般方案在图6中显示，并且构成了本实施例的一般性说明的基础。使用公开的方法和本领域普通技术人员已知的方法，结合说明性实施例提供的指导，本领域技术人员能够产生和评价一定范围的包含XTENs、BP和本领域已知的BP变体的BPXTEN融合蛋白。因此本实施例被解释为只是说明性的，并非以任何方式限制所述方法；许多变化对于本领域技术人员是明显的。在本实施例中，将产生连接到AE基序家族的XTEN上的毒蜥外泌肽-4(“Ex4”)的BPXTEN。
用于生产编码XTEN的多核苷酸的一般方案在图4和5中显示。图5是本发明一个实施方案的XTEN多核苷酸构建体装配的代表性步骤的示意流程图。各个寡核苷酸501退火至基序502如12氨基酸的基序(“12-mer”)，随后与含有BbsI和KpnI限制酶切位点503的寡核苷酸连接。基序文库可以限于特定序列XTEN家族；例如，表1的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列。在此情况中，AE家族的基序(SEQ IDNOS：186-189)将用作基序文库，它们与12-mer退火，产生“构件块”长度；例如，编码36个氨基酸的区段。编码XTEN序列的基因可以通过连接和多聚化“构件块”直到达到XTEN基因504的希望的长度来装配。如图5所示，此情况中的XTEN长度为48个氨基酸残基，但是通过该方法可以达到更长的长度。例如，通过连接、重叠延伸、PCR装配或本领域已知的类似的克隆技术可以进行多聚化。XTEN基因可以克隆到填充载体中。在图5所示的实施例中，载体可以编码标志序列506，其后为填充序列，该填充序列的侧翼为BsaI、BbsI和KpnI位点507和BP基因(例如，毒蜥外泌肽-4)508，产生编码BPXTEN 500的基因，在此情况中该基因编码N至C末端结构为XTEN-Ex4的融合蛋白。
编码Ex4(或另一候选BP)的DNA序列可以通过本领域已知的标准方法从由适当细胞来源、由基因组文库制备的cDNA文库方便地获得，或者可以使用从公开数据库、专利或参考文献中获得的DNA序列合成产生(例如，自动化核酸合成)。编码该蛋白质的Ex4部分的基因或多核苷酸然后可以克隆到构建体如本文所述的构建体内，该构建体可以是在适当转录和翻译序列控制下的质粒或其它载体，用于在生物系统中高水平蛋白质表达。编码XTEN部分的第二基因或多核苷酸(在图5的情况下表示为具有48个氨基酸残基的AE)可以遗传融合到编码Ex4基因N末端的核苷酸，方法是通过连接或多聚化步骤，将其克隆到构建体内邻近或与编码Ex4的基因符合读框。以这种方式，编码(或互补于)XTEN-Ex4 BPXTEN融合蛋白的嵌合DNA分子将在该构建体内产生。构建体可以设计为不同的结构，以编码融合配偶体的各种排列，作为单体多肽。例如，可以产生编码以下顺序的融合蛋白的基因(N-到C末端)：Ex4-XTEN；XTEN-Ex4；Ex4-XTEN-Ex4；XTEN-Ex4-XTEN；以及上述的多聚体。任选地，该嵌合DNA分子可以转移或克隆到作为更合适的表达载体的另一构建体中。在这点上，能够表达该嵌合DNA分子的宿主细胞将用该嵌合DNA分子转化。含有目标DNA区段的载体可以通过众所周知的方法被转移到合适的宿主细胞中，这取决于细胞宿主的类型，如上文所述。
含有XTEN-Ex4表达载体的宿主细胞在常规营养培养基中培养，该培养基经适当地改良以用于激活启动子。培养条件如温度、pH等是以前用于为表达选择的宿主细胞的条件，对于本领域技术人员来说是明显的。在融合蛋白表达后，通过离心收集细胞，通过物理或化学手段破碎，保留得到的粗提物用于如以下所述纯化融合蛋白。对于宿主细胞分泌的BPXTEN组合物，分离并保留离心上清液，用于进一步纯化。
在样品中直接测定基因表达，例如，通过常规Southern印迹法、定量mRNA的转录的Northern印迹法[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、斑点印迹法(DNA分析)或原位杂交，其中使用适当标记的探针，基于此处提供的序列进行。或者，通过荧光方法的免疫学测定基因表达，如细胞的免疫组化染色以直接定量基因产物的表达。可用于免疫组化染色和/或测定样品流体的抗体可以是单克隆或多克隆抗体，并且可以在任何哺乳动物中制备。常规地，可以基于此处提供的序列使用合成肽制备针对Ex4序列多肽的抗体，或者制备针对融合到Ex4并编码特异性抗体表位的外源序列的抗体。选择性标记的实例是本领域技术人员公知的，包括报道蛋白如增强绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
XTEN-Ex4多肽产物通过本领域已知的方法纯化。诸如凝胶过滤、亲和纯化、盐分级分离、离子交换层析、尺寸排阻色谱法、羟磷灰石吸附色谱法、疏水相互作用色谱法或凝胶电泳等操作都是可以在纯化中使用的技术。具体的纯化方法记载在Robert K.Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Charles R.Castor，ed.，Springer-Verlag 1994和Sambrook等人，同上。多步纯化分离也记载在Baron等人，Crit.Rev.Biotechnol.10：179-90(1990)和Below等人，J.Chromatogr.A.679：67-83(1994)中。
如图6所示，然后表征分离的XTEN-Ex4融合蛋白的化学和活性性质。例如，将使用本领域已知的方法表征分离的融合蛋白的序列、纯度、表观分子量、溶解度和稳定性。然后评价满足预期标准的融合蛋白的活性，这可以使用一种或多种本文公开的分析，例如，实施例或表39的分析，在体外或在体内检测。
另外，XTEN-Ex4融合蛋白将施用于一个或多个动物种，以确定标准药代动力学参数，如实施例25所述。
通过反复的生产、表达和回收XTEN-Ex4构建体的过程，然后使用此处公开的方法或本领域已知的其它方法对其表征，可以产生包含Ex4和XTEN的BPXTEN组合物，并由本领域普通技术人员评价，以证实预期的性质，如比相应的未融合的Ex4提高的溶解度、提高的稳定性、改善的药代动力学和降低的免疫原性，导致全面增强的治疗活性。对于这些不具有理想性质的融合蛋白，可以通过这些方法构建、表达、分离和评价不同的序列，以获得具有这些性质的组合物。
实施例19：XTEN融合蛋白的分析型尺寸排阻色谱分析
对含有各种长度逐渐增加的治疗性蛋白质和非组织重组蛋白质的融合蛋白进行尺寸排阻色谱分析。试验的一个例子使用TSKGel-G4000SWXL(7.8mm x 30cm)柱，其中40μg浓度为1mg/ml的纯化的胰高血糖素融合蛋白在20mM磷酸盐pH 6.8，114mM NaCl中以0.6ml/min的流速分离。使用OD214nm和OD280nm监测色谱图。对于所有试验使用来自BioRad的尺寸排阻标准进行柱的校准；标准包括甲状腺球蛋白(670kDa)、牛γ-球蛋白(158kDa)、鸡卵白蛋白(44kDa)、马肌球蛋白(17kDa)和维生素B12(1.35kDa)。胰高血糖素-Y288、胰高血糖素-Y144、胰高血糖素-Y72、胰高血糖素-Y36的代表性的色谱图在图15中显示为覆盖层。数据表明每种化合物的表观分子量与连接的rPEG序列的长度成比例。但是，数据也表明，每个构建体的表观分子量显著大于球形蛋白质的预期分子量(如通过在相同试验中与标准蛋白质比较显示)。基于对评价的所有构建体的SEC分析，表观分子量、表观分子量因数(表示为表观分子量与计算分子量的比值)和流体动力学半径(RH，nM)在表26中显示。结果表明，引入576个氨基酸或更大的不同的XTEN使融合蛋白的表观分子量为大约339kDa至760，而864个氨基酸或更大的XTEN使表观分子量大于大约800kDA。对于产生的具有来自几个不同基序家族即AD、AE、AF、AG和AM的XTEN的融合蛋白，表观分子量与实际分子量比成比例增加的结果一致，增加至少4倍，比值高达大约17倍。另外，向具有葡萄糖调节肽的融合蛋白引入576个氨基酸或更多的XTEN融合配偶体导致流体动力学半径为7nm或更大；超出了大约3-5nm的肾小球孔径。因此，推断包含葡萄糖调节肽和XTEN的融合蛋白相对于相应的未融合的生物活性蛋白质将具有降低的肾清除率，导致终末半衰期延长，并且改善了治疗或生物效果。
表26：各种多肽的SEC分析
Figure BPA00001431324301901
实施例20：融合到GFP的延伸多肽在食蟹猴中的药代动力学
在食蟹猴中检测GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTEN_Y576和XTEN_AD836-GFP的药代动力学，以确定非组织多肽的组成和长度对PK参数的影响。在注射后的不同时间分析血液样品，通过ELISA测定血浆中GFP的浓度，其中使用抗GFP的多克隆抗体用于捕获，使用同一多克隆抗体的生物素化制品用于检测。结果总结在图23中。它们显示随着XTEN序列长度增加，半衰期惊人地增加。例如，确定GFP-XTEN_L288(在XTEN中具有288个氨基酸残基)具有10小时的半衰期。对于多融合蛋白构建体，即GFP-XTEN_L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTEN_Y576，非组织多肽融合配偶体的长度加倍到576个氨基酸使半衰期延长到20-22小时。对于XTEN_AD836-GFP，非组织多肽融合配偶体的长度进一步增加到836个残基导致半衰期为72-75小时。因此，聚合物长度从288到576个残基增加288个残基使体内半衰期延长了大约10小时。然而，多肽长度从576个残基到836个残基增加260个残基使半衰期延长超过50小时。这些结果显示非组织多肽长度具有惊人的阈值，它导致体内半衰期高于比例的延长。因此，预期包含延伸的非组织多肽的融合蛋白具有与较短长度的多肽相比增强药代动力学的性质。
实施例21：XTEN的血清稳定性
含有融合到GFP的N末端的XTEN_AE864的融合蛋白在猴血浆和大鼠肾裂解物中37℃孵育最多7天。在第0天、第1天、第7天取样，并通过SDS PAGE分析，然后使用Western分析检测并使用抗GFP抗体检测，如图13所示。XTEN_AE864的序列在血浆中7天显示可忽略的降解迹象。然而，XTEN_AE864在大鼠肾裂解物中在3天内快速降解。融合蛋白的体内稳定性在血浆样品中检测，其中将GFP_AE864免疫沉淀并通过如上所述的SDS PAGE分析。注射后最多7天获取的样品显示非常少的降解迹象。这些结果证明了BPXTEN对血清蛋白酶引起的降解的抗性；这是BPXTEN融合蛋白的药代动力学性质增强的一个因素。
实施例22：BPXTEN成分XTEN_IL-1ra基因和载体的构建
通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码153aa的人IL-1ra的基因，其中使用引物5’ATAAAGGGTCTCCAGGTCGTCCGTCCGGTCGTAAATC(SEQ ID NO：756)和5’-AACTCGAAGCTTTTATTCGTCCTCCTGGAAGTAAAA(SEQ ID NO：757)，其引入侧翼BsaI和HindIII(下划线表示)限制酶切位点，该位点与XTEN目标载体中填充序列侧翼的BbsI和HindIII位点匹配(图7C)。XTEN目标载体含有卡那霉素抗性基因，是来自Novagen的pET30衍生物，其形式为纤维素结合域(CBD)-XTEN-绿色荧光蛋白(GFP)，其中GFP是在C末端克隆有效负荷的填充片段。通过将XTEN目标载体中的GFP替换为IL-1ra编码片段产生构建体(图7)。XTEN目标载体的特征是CBD上游的T7启动子，其后为填充GFP序列上游的框内融合的XTEN序列。使用的XTEN序列是AM875、AM1318、AF875和AE864，它们的长度分别为875、1318、875和864个氨基酸。使用BbsI和HindIII内切核酸酶限制性消化除去该填充GFP片段。使用T4DNA连接酶将BsaI和HindIII限制性消化的IL-1ra DNA片段连接到BbsI和HindIII消化的XTEN目标载体内，并通过电穿孔用连接混合物转化大肠杆菌株BL21(DE3)Gold(Stratagene)。根据在含有抗生素卡那霉素的LB平板上生长的能力鉴定转化子。从选择的克隆中分离质粒DNA，通过限制酶分析和DNA测序证实。最终载体产生在T7启动子控制下的CBD_XTEN_IL-1ra基因，通过在末端工程化的TEV切割位点切割CBD以产生XTEN_IL1-ra。具有在C末端融合到不同XTEN的IL-1ra的各种构建体包括AC1723(CBD-XTEN_AM875-IL-1ra)、AC175(CBD-XTEN_AM1318-IL-1ra)、AC180(CBD-XTEN_AF875-IL-1ra)和AC182(CBD-XTEN_AE864-IL-1ra)。
实施例23：融合到XTEN_AM875和XTEN_AE864的人白介素-1受体激动剂的表达、纯化和表征
细胞培养生产
通过向含有40μg/mL卡那霉素的100mL 2xYT培养基中接种大肠杆菌的甘油母液制备起始培养物，该大肠杆菌携带编码融合到AE864、AM875或AM1296的IL-1ra的质粒。然后在37℃振摇培养物过夜。用100mL起始培养物接种25升含有40μg/mL卡那霉素的2xYT，并在37℃振摇到OD600达到大约1.0(5小时)。然后使温度降至26℃，用1.0mM终浓度的IPTG诱导蛋白质表达。然后在26℃振摇培养物过夜。离心收集细胞，产生总共200克细胞糊。将细胞糊冻存在-80℃直到使用。
包含IL-1ra-XTEN_AE864或IL-1ra-AM875的BPXTEN的纯化
以每克细胞糊4ml缓冲液的比例将细胞糊悬浮在20mM Tris pH6.8，50mM NaCl中。然后使用顶部搅拌器匀浆细胞糊。于20000psi使样品通过微流化床一次实现细胞裂解。通过在Sorvall G3A转子中于12000rpm离心20分钟澄清裂解液。
澄清的裂解液直接加到已经用20mM Tris pH 6.8，50mM NaCl平衡的800ml Macrocap Q阴离子交换树脂(GE Life Sciences)上。该柱用含有50mM，100mM和150mM NaCl的Tris pH 6.8缓冲液连续洗涤。产物用20mM Tris pH 6.8，250mM NaCl洗脱。
250mL辛基Sepharose FF柱用平衡缓冲液(20mM Tris pH 6.8，1.0M Na2SO4)平衡。将固体Na2SO4加至Macrocap Q洗脱物池，以达到1.0M的终浓度。过滤(0.22微米)得到的溶液并加到HIC柱上。然后用平衡缓冲液洗柱10个柱体积，以除去未结合的蛋白质和宿主细胞DNA。然后用20mM Tris pH 6.8，0.5M Na2SO4洗脱产物。
合并的HIC洗脱物组分然后用20mM Tris pH 7.5稀释，以达到小于5.0mOhms的电导率。稀释产物加到已经用20mM Tris pH 7.5，50mM NaCl平衡的300ml Q Sepharose FF阴离子交换柱上。
然后使用Pellicon XL Biomax 30000 mwco柱，通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩缓冲液交换的蛋白质至大于30mg/ml。浓缩物使用0.22微米注射器过滤器无菌过滤。等分最终溶液并贮存于-80℃，用于下面的后续实验。
SDS-PAGE分析
使用来自Invitrogen的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶，按照厂商说明，对2和10mcg最终纯化蛋白质进行非还原SDS-PAGE。结果(图14)表明，通过上述方法回收IL-1ra-XTEN_AE864组合物，近似分子量为大约160kDa。
分析型尺寸排阻色谱法
使用Phenomenex BioSEP SEC S4000(7.8x 300mm)柱进行尺寸排阻色谱分析。20μg浓度为1mg/ml的纯化的蛋白质在20mM Tris-ClpH 7.5，300mM NaCl中以0.5ml/min的流速分离。根据214和280nm的吸光度监测色谱图。使用来自BioRad的尺寸排阻校准标准进行柱的校准；标准包括甲状腺球蛋白(670kDa)、牛γ-球蛋白(158kDa)、鸡卵白蛋白(44kDa)、马肌球蛋白(17kDa)和维生素B12(1.35kDa)。IL-1ra-XTEN_AM875的代表性的色谱图如图15所示，其中校准标准以虚线表示，IL-1ra-XTEN_AM875以实线表示。数据表明每种化合物的表观分子量显著大于球形蛋白质的预期分子量(如通过在相同试验中与标准蛋白质比较显示)，并且表观分子量显著大于如上所述通过SDS-PAGE确定的分子量。
分析型RP-HPLC
使用Vydac蛋白C4(4.6x 150mm)柱进行分析型RP-HPLC色谱分析。该柱用HPLC级水中的0.1％三氟乙酸以1ml/min的流速平衡。分别注入0.2mg/ml的10微克纯化的蛋白质。用0.1％TFA中5％至90％乙腈的线性梯度洗脱蛋白质。使用OD214nm和OD280nm监测色谱图。代表性的一批IL-1ra-XTEN_AM875的色谱图在图16中示出。
IL-1受体结合
为了评估含IL-1ra的XTEN融合蛋白的活性，使用基于ELISA的受体结合试验。Costar 3690测定板的孔用每孔50ng融合到人IgG Fc域的小鼠IL-1受体(IL-1R/Fc，R&D Systems)包被过夜。随后，各孔用3％BSA封闭，以阻止与固相的非特异性相互作用。充分洗孔后，将一系列稀释度的IL-1ra-XTEN_AM875、XTEN_AM875-IL-1ra或IL-1ra(阿那白滞素)加至孔中。使结合反应在室温下进行2小时。通过反复洗涤除去未结合的Il-1ra。结合的IL-1ra和IL-1ra-XTEn融合体用生物素化的抗人II-1ra抗体和辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素检测。反应物用TMB底物在室温下显色20分钟。加入0.2N硫酸终止显色。在SpectrMaX 384Plus分光光度计上记录每孔在450nm和570nm的吸光度。校正的吸光度信号(Abscorr＝Abs450nm-Abs570nm)对IL-1ra-XTEN或IL-1ra浓度作图，以产生如图17所示的结合等温线。
为了估计每种融合蛋白对IL-1受体的结合亲和力，将结合数据与S形剂量-反应曲线拟合。从数据拟合确定每种构建体的EC50(信号为最大值一半时的IL-1ra或IL-1ra-XTEN的浓度)。如图17所示，其中有效负荷连接到XTEN的N末端的IL-1ra-XTEN_AM875的EC50与未修饰的IL-1ra(阿那白滞素EC50＝0.013nM，IL-1ra-XTEN_AM875 EC50＝0.019nM)相当。其中有效负荷连接到XTEN的C末端的XTEN_AM875-IL-1ra显示较弱的结合，EC50(0.204nM)为IL-1ra的大约15倍。阴性对照XTEN_hGH构建体显示在实验条件下没有结合。
XTEN对IL-1ra的热稳定化
除了延长蛋白质治疗剂的血清半衰期以外，XTEN多肽还具有改善它所融合的有效负荷的热稳定性的性质。例如，XTEN多肽的亲水性性质可以减少或阻止聚集，并且因此有利于有效负荷蛋白质的重折叠。XTEN的该特征可有助于开发多种蛋白质治疗剂的室温稳定的制剂。
为了证明XTEN偶联对IL-1ra的热稳定化，每升200微摩尔IL-1ra-XTEN和重组IL-1ra在25℃和85℃孵育15分钟，此时通过离心快速除去任何不溶性蛋白质。然后通过SDS-PAGE分析可溶性级分，如图18所示。注意只有IL-1ra-XTEN在加热后保持可溶性，而相反，重组IL-1ra(不含作为融合配偶体的XTEN)在加热后完全沉淀。
上述加热处理后评价了IL-1ra-XTEN的IL-1受体结合活性。如上所述进行受体结合。通过热处理完全变性的重组IL-1ra在热处理后保留小于0.1％的受体活性。然而，IL-1ra-XTEN保留大约40％的受体结合活性(图19)。这些数据结合起来证明了XTEN多肽能够阻止其有效负荷融合配偶体的热诱导的变性，并且支持XTEN具有稳定化性质的结论。
实施例24：包含IL-1ra和XTEN的融合蛋白的PK分析
在食蟹猴中评价BPXTEN融合蛋白IL-1ra_AE864、IL-1ra_AM875和IL-1ra_AM1296，以确定各融合蛋白的体内药代动力学参数。所有组合物都在水性缓冲液中提供，并且使用1mg/kg和/或10mg/kg单剂量通过皮下(SC)途径施用于单独的动物(n＝4/组)。在施用后的不同的时间点采集血浆样品，并分析测试物的浓度。使用夹心ELISA形式进行分析。将兔多克隆抗-XTEN抗体包被到ELISA板的孔上。封闭孔，洗涤，然后血浆样品以不同的稀释度在孔中孵育，以允许由包被抗体捕获化合物。充分洗孔，使用生物素化的多克隆抗IL-1ra抗体和链霉亲和素HRP制品检测结合的蛋白质。在每个时间点通过比较每个血清稀释度的比色反应与标准曲线计算测试物的浓度。使用WinNonLin软件包计算药代动力学参数。
图20显示四种含IL-1ra构建体的浓度分布，计算的PK参数在表27中显示。在皮下施用后，在336小时内对各种制品计算的终末半衰期为大约15-28小时。作为参考，在文献中记载的未修饰IL-1ra的公开半衰期为在成人中4-6小时。
结论：不同XTEN序列向包含IL-1ra的BPXTEN融合蛋白内的引入导致所有三种组合物的药代动力学参数显著改善，这在灵长类动物模型中得到证实，证明了这样的融合蛋白组合物的应用。
表27：包含IL-1ra和XTEN的BPXTEN组合物的PK参数
Figure BPA00001431324301961
实施例25：包含毒蜥外泌肽-4和XTEN的融合蛋白的PK分析
在食蟹猴中评价BPXTEN融合蛋白Ex4_AE864，以在单次皮下剂量后确定该融合蛋白的体内药代动力学参数。
方法：BPXTEN融合蛋白以两个不同的浓度配制在20mM Tris，pH7.5，135mM NaCl中：8mg/mL和40mg/mL。三组各4只猴(2雄2雌，2-6kg)各通过弹丸注射在每只动物背部肩胛区的皮肤和组织下层之间给药1mg/kg(组1，0.125mL/kg)、1mg/kg(组2，0.025mL/kg)或5mg/kg(组3，0.125mL/kg)。在14天中从预先适应的动物的股静脉或动脉通过注射器抽取系列血液样品(1ml±0.5ml)，不使用麻醉，而是使用椅子束缚。必要时，椅子束缚使用最多30分钟。所有动物在给药前整夜和前4小时的血样采集过程中都空腹(适用时，在4小时采样期采集最后血样后30分钟内重新给予食物)。将每个血样收集到肝素血浆分离器中，并保持在冰上(2℃到8℃)大约5分钟等待离心。离心血样(8,000x g，5min)并将其转移到聚丙烯管中。急骤冷冻血浆样品，并贮存在大约-70℃直到测定。使用夹心ELISA形式进行分析。
结果：对猴计算药代动力学参数，结果在表28中列出。使用所有动物的原始集合和使用标准两阶段分析来分析药代动力学参数。结果显示了融合蛋白的吸收的差异，基于在组1相对于组2中施用的剂量体积，通过Tmax、Cmax、AUC和分布体积(Vz)值得到证明。但是，计算的半衰期值在三组中是相当的，大大超过艾塞那肽报告的2.4小时的终末半衰期。
表28：对于施用的BPXTEN，从组平均值计算的药代动力学参数
  参数   组1平均值   组2平均值   组3平均值
  Tmax   96   24   48
  Cmax   4,860   3,879   18,713
  Lambda_z_lower   96   96   96
  Lambda_z_upper   336   336   336
  t1/2_Lambda_z   83.8   76.8   74.0
  AUCall   739,850   524,615   2,445,751
  Vz(实测)/F   579   871   986
  Cl(实测)/F   4.8   7.9   9.2
  Vz(实测)/F   148   199   207
结论：对于所有三种制剂，毒蜥外泌肽-4连接至XTEN产生BPXTEN融合体导致药代动力学参数显著改善，这在灵长类动物模型中得到证明，半衰期延长至至少30倍，证明了这些融合蛋白组合物的应用。
实施例26：BPXTEN在饮食诱导的肥胖小鼠模型中的应用
在饮食诱导的肥胖症的小鼠模型中评价了连接到XTEN的葡萄糖调节肽的联合治疗的效果，以证实作为单BPXTEN组合物的单体融合蛋白的固定组合的应用。
方法：连接至Y-288-XTEN的胰高血糖素(“Gcg-XTEN”)和连接至AE576-XTEN的艾塞那肽(“Ex4-XTEN”)或单独的艾塞那肽的联合治疗的效果在10周龄的雄性C57BL/6J饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中检测。以60％高脂饮食饲养的小鼠随机分为治疗组(每组n＝10)Ex4-XTEN864(10mg/kg IP Q2D)、Ex4-XTEN864(20mg/kg IP Q4D)、Ex4-XTEN864(10mg/kg IP Q2D)+Gcg-XTEN288(20μg/kg IP BID)、和Ex4-XTEN864(20mg/kg IP Q4D)+Gcg-XTEN288(40μg/kg IP Q1D)。用20mM TrispH 7.5，135mM NaCl IP Q1D处理的安慰剂组(n＝10)平行检测。所有组都连续给药28天。在整个研究过程中定期监测体重，并在治疗期之前和之后测定空腹血液葡萄糖。这些组在28天的治疗期继续给药。在整个研究过程中继续监测体重，并在治疗期之前和之后测定空腹血液葡萄糖，在治疗期之后测定血脂水平。
结果：结果显示在图21-22中。数据表明连续给药一个月导致在研究过程中，相对于安慰剂组，用单独的Gcg-XTEN和单独的Ex4-XTEN治疗的动物的体重增加显著减少。另外，与单独施用的Gcg-XTEN相比，以及与安慰剂相比，同时给予Ex4-XTEN或Gcg-XTEN和Ex4-XTEN的动物显示统计学显著更大的体重减轻。施用的胰高血糖素的毒性作用得到良好的证明。最近已经报道胰高血糖素在大鼠和比格犬中的最大无效果剂量为1mg/kg/天，这被认为是在两种物种中的明显无毒性作用水平(Eistrup C，Glucagon produced by recombinant DNA technology：repeated dose toxicity studies，intravenous administration to CD rats andbeagle dogs for four weeks.Pharmacol Toxicol.1993 Aug；73(2)：103-108)。
数据也表明，对于单独用Ex4-XTEN治疗的动物，相对于安慰剂，连续给药一个月导致空腹葡萄糖显著减少，但是对于单独用Gcg-XTEN治疗的动物则不是这样。但是，与单独施用葡萄糖调节肽相比，同时给予Gcg-XTEN和艾塞那肽两者的动物显示统计学显著更大的空腹血液葡萄糖水平降低。需要注意，与Ex4-XTEN联合导致有益效果的Gcg-XTEN组合物的剂量为20和40μg/kg(完整融合蛋白组合物重量)；这比在啮齿动物中单独施用胰高血糖素报告的无效果剂量至少低25倍。
结论：数据支持以下结论：与连接到XTEN的葡萄糖调节肽的两种融合蛋白的联合治疗可以导致超过一种葡萄糖调节肽所见的协同有益效果，因此可以调整联合组合物的施用，以相对于单生物制品的施用减少给药频率或剂量，从而减少毒性或不可接受的副作用的威胁。
实施例27：Ex4-XTEN BPXTEN在食蟹猴中的PK分析
通过在1分钟期间以0.5mg/kg皮下或静脉注射BPXTEN施用的BPXTEN，在食蟹猴(每组3只)中测定Ex4-AE864 BPXTEN的药代动力学。注射后在不同时间点采集血浆样品，最多达14天，并通过ELISA分析，用于确定测试物的血清浓度和免疫原性。对于Ex4-AE864，施用后在任何动物中都没有观察到抗测试物抗体反应。进行夹心法ELISA：向聚苯乙烯微量滴定板(Costar 3690，Corning Inc，Corning，N.Y.)的每孔中固定100ng捕获抗体(兔抗-艾塞那肽，Peninsula Laboratories，San Carlos，CA)＞12小时，然后用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭。用PBS洗涤3次后，在板上用含有1％BSA和0.5％Tween 20的PBS系列滴定血浆样品。孵育2小时并洗涤后，通过向每孔中添加生物素化的IgG(在室内生物素化的兔抗-艾塞那肽，Peninsula Laboratories，San Carlos，CA)探查样品。孵育和洗涤后，通过与辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)孵育，然后与四甲基联苯胺底物(Neogen Corporation，Lexington，KY)孵育，使板显色，然后用0.2NH2SO4终止，并在450nm读取。使用WinNonLin程序2.1版(PharsightCorporation，Mt.View，CA)计算非房室药代动力学参数。
结果显示在图25中。构建体的该制剂的终末半衰期为60小时，皮下注射的生物利用度为80％。这与报道的Byetta
Figure BPA00001431324301991
的半衰期2.4小时相比，Byetta
Figure BPA00001431324301992
是商品形式的毒蜥外泌肽-4。重要的是，在皮下注射后注意到慢吸收期，这似乎是XTEN融合蛋白的特征。该吸收期导致注射后24-48小时之间的Cmax，以及达到线性清除期之前约100小时的基本平的血清浓度分布。
结论：从该结果可以得出以下结论：与未连接到XTEN的肽相比，向葡萄糖调节肽如毒蜥外泌肽-4增加XTEN能够大大延长终末半衰期，并且也改善了其它药代动力学参数。
实施例28：Ex4-XTEN BPXTEN在多个物种中的PK分析和预测的人半衰期
为了确定融合到XTEN的治疗性蛋白质在人体中的预测的药代动力学谱，使用融合到AE864 XTEN的毒蜥外泌肽-4作为单融合多肽进行了研究。以0.5-1.0mg/kg向四个不同的动物种皮下和静脉内施用Ex4-XTEN构建体。在施用后间隔采集血清样品，使用标准方法测定血清浓度。确定每个物种的半衰期，并在表29中列出。结果用来使用终末半衰期的类比、分布容量和基于平均体重的清除率预测人半衰期。图26A显示动物种中测定的终末半衰期相对于体重的图，在75kg人中预测的T1/2为140小时，与之相比，报告的艾塞那肽的半衰期为2.4小时(Bond，A.Proc(Bayl Univ Med Cent)19(3)：281-284.(2006))。图26B显示相对于体重的测定的药物清除率，在75kg人中预测的清除率值为30ml/h。图26C显示相对于体重的测定的分布容量，在75kg人中预测的值为5970ml。
结论：从该结果可以得出以下结论：与未连接到XTEN的肽相比，向葡萄糖调节肽如毒蜥外泌肽-4增加XTEN能够大大延长终末半衰期，并且与目前使用的葡萄糖调节肽商品相比，具有相当的半衰期的BPXTEN制剂将允许频率大大降低的给药，其以每周、每两周或每月间隔给药。
表29：Ex4-XTEN的半衰期
  物种   半衰期(hr)
  小鼠   13.5
  大鼠   31.7
  猴   60.7
  狗   72.8
  人   140*
*根据类比法预测的值
实施例29：通过连接到XTEN提高BP的溶解度和稳定性
为了评价XTEN增强溶解度和稳定性的物理/化学性质的能力，制备并评价了胰高血糖素+较短长度的XTEN的融合蛋白。在中性pH的Tris-缓冲盐水中制备测试物，Gcg-XTEN溶液的表征通过反相HPLC和尺寸排阻色谱法进行，以证实该蛋白质在溶液中是均质的和非聚集的。数据显示在表30中。为了比较目的，在60μM(0.2mg/mL)测量未修饰的胰高血糖素在相同缓冲液中的溶解度限度，结果证明对于添加的所有长度的XTEN，获得溶解度的实质增加。重要的是，在大多数情况下，制备胰高血糖素-XTEN融合蛋白，以达到目标浓度，并且不进行评价，以确定给定构建体的最大溶解度限度。然而，对于连接到AF-144XTEN的胰高血糖素，确定溶解度限度，结果是与未连接到XTEN的胰高血糖素相比，溶解度增加至60倍。另外，评价了胰高血糖素-AF144 BPXTEN的稳定性，发现在液体制剂中在冷藏条件下至少稳定6个月，在37℃稳定大约1个月(数据未显示)。
结论：数据支持以下结论：短长度XTEN多肽连接至生物活性蛋白质如胰高血糖素可以显著提高得到的融合蛋白的蛋白质的溶解度性质，以及提供在较高蛋白质浓度下的稳定性。
表30：胰高血糖素-XTEN构建体的溶解度
  测试物   溶解度
  胰高血糖素   60μM
  胰高血糖素-Y36   ＞370μM
  胰高血糖素-Y72   ＞293μM
  胰高血糖素-AF108   ＞145μM
  胰高血糖素-AF120   ＞160μM
  胰高血糖素-Y144   ＞497μM
  胰高血糖素-AE144   ＞467μM
  胰高血糖素-AF144   ＞3600μM
  胰高血糖素-Y288   ＞163μM
实施例30：BPXTEN二级结构的表征
通过圆二色谱法评价BPXTEN Ex4-AE864的二级结构程度。CD光谱法在配备有Jasco Peltier温度控制器(TPC-348WI)的Jasco J-715(JascoCorporation，Tokyo，Japan)分光偏振计上进行。将蛋白质浓度在20mM磷酸钠pH 7.0，50mM NaCl中调节为0.2mg/mL。使用光路长度为0.1cm的HELLMA石英试池进行实验。在5°、25°、45°和65℃获得CD谱，并使用Windows版J-700 version 1.08.01(Build 1)Jasco软件处理。在进行CD测量之前在每个温度平衡样品5分钟。使用1nm的带宽和2sec的时间常数，以100nm/min的扫描速度，从300nm到185nm一式两份记录所有谱。图24所示的CD谱未显示稳定的二级结构的证据，与非组织多肽一致。
实施例31：胰高血糖素和Ex4 BPXTEN构建体的生物活性
纯化的胰高血糖素和毒蜥外泌肽-3，均连接至Y288作为BPXTEN融合蛋白，使用体外细胞试验测定其生物活性。简要地说，ChemiScreen稳定钙优化的胰高血糖素受体细胞系用于胰高血糖素和胰高血糖素-XTEN构建体的实时钙动员分析，而优化的表达天然GLP-1受体的毒蜥外泌肽-4受体细胞系用于毒蜥外泌肽-4和Ex4构建体。在该系统中，细胞表达天然受体，并且该受体的激活导致细胞内的钙流出，这可以利用FLIPR装置检测到。如图27所示，天然胰高血糖素导致信号以剂量依赖的方式增强。发现该系统中天然胰高血糖素的EC50为4.1nM。胰高血糖素-Y288构建体的滴定产生相当的响应曲线，EC50为72nM。如图28所示，来自两个不同商业来源(Anaspec和Tocris)的天然毒蜥外泌肽-4导致信号以剂量依赖的方式增强，EC50(以虚线表示)分别为75pM和110pM。毒蜥外泌肽-4-Y576构建体的滴定产生相应的响应曲线，EC50为98pM，表明辅助蛋白的融合保留全部的生物活性。
结论：结果表明，葡萄糖调节肽与未截短的重组蛋白的融合导致组合物保留生物活性。
实施例32：hGH_XTEN-AE和hGH_XTEN-AM基因和载体的构建
通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码hGH的基因，引入与位于XTEN目标载体中填充片段侧翼的NdeI和BbsI位点匹配的NdeI和BbsI限制酶切位点。pXTEN质粒是来自Novagen的pET30衍生物，形式为填充片段-XTEN，其中填充片段可以是绿色荧光蛋白(GFP)或CBD，XTEN可以是36至576或更长的任何长度。通过将pXTEN中的填充序列替换为编码hGH的片段产生构建体。pXTEN的特征是在CBD上游的T7启动子，其后为填充序列上游的框内融合的XTEN序列。使用的XTEN序列属于XTEN_AE和XTEN_AM家族，并且编码包括36、72、144、288、576、864和1296个氨基酸的长度。使用NdeI和BsaI内切核酸酶限制性消化除去该填充片段。使用T4 DNA连接酶将限制性消化的hGH DNA片段连接到酶切的pXTEN载体内，并电穿孔到BL21(DE3)Gold(Stratagene)中。通过DNA miniprep筛选转化子，并通过DNA测序证实理想的构建体。最终载体产生在T7启动子控制下的hGH_XTEN基因。
实施例33：XTEN-AE_hGH和XTEN-AM_hGH基因和载体的构建
通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码hGH的基因，引入与位于XTEN目标载体中填充片段侧翼的BbsI和HindIII位点匹配的BbsI和HindIII限制酶切位点。pCBD-XTEN质粒是来自Novagen的pET30衍生物，形式为纤维素结合域(CBD)-XTEN-填充片段，其中填充片段是绿色荧光蛋白(GFP)，XTEN可以是36至576或更长的任何长度。通过将pCBD-XTEN中的填充序列替换为编码hGH的片段产生构建体。pCBD-XTEN的特征是在CBD上游的T7启动子，其后为填充序列上游的框内融合的XTEN序列。使用的XTEN序列属于XTEN_AE和XTEN_AM家族，并且编码包括36、72、144、288、576、864和1296个氨基酸的长度。使用BbsI和HindIII内切核酸酶限制性消化除去该填充片段。使用T4 DNA连接酶将限制性消化的hGH DNA片段连接到酶切的pCBD-XTEN载体内，并电穿孔到BL21(DE3)Gold(Stratagene)中。通过DNAminiprep筛选转化子，并通过DNA测序证实理想的构建体。最终载体产生在T7启动子控制下的CBD_XTEN_hGH基因。
实施例34：XTEN-AE_hGH_XTEN-AE hGH基因和载体的构建
通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码hGH的基因，引入与位于XTEN目标载体中填充片段侧翼的BbsI和BsaI位点匹配的BbsI和BsaI限制酶切位点。pNTS-XTEN质粒是来自Novagen的pET30衍生物，形式为48个氨基酸的N末端XTEN表达序列，其中填充片段是绿色荧光蛋白(GFP)，XTEN可以是36至576或更长的任何长度。通过将pCBD-XTEN中的填充序列替换为编码hGH的片段产生构建体。pNTS-XTEN的特征是在NTS上游的T7启动子，其后为填充序列上游的框内融合的XTEN序列。使用的XTEN序列属于XTEN_AE家族，并且编码包括36、72、144、288、576、864和1296个氨基酸的长度。使用BbsI和BsaI内切核酸酶限制性消化除去该填充片段。使用T4 DNA连接酶将限制性消化的hGH DNA片段连接到酶切的pNTS-XTEN载体内，并电穿孔到BL21(DE3)Gold(Stratagene)中。在有些情况下，将144或288个氨基酸的第二XTEN_AE序列连接到hGH基因的C末端。通过DNAminiprep筛选转化子，并通过DNA测序证实理想的构建体。最终载体产生在T7启动子控制下的NTS_XTEN_hGH或NTS_XTEN_hGH_XTEN基因。
实施例35：GH_XTEN构建体的纯化
蛋白质表达
上述质粒转化至BL21(DE3)-Gold大肠杆菌株(Novagen)，并平板接种至含有适当抗生素的LB-琼脂平板上，在37℃生长过夜。将单菌落接种至5ml TB125培养基并于37℃生长过夜。次日将接种物转化至具有500ml TB125的2L的管，生长，直到OD＝0.6，然后在0.1mM IPTG的存在下于26℃继续生长16小时。
离心收集细胞，将细胞沉淀重悬浮于50ml含有5mM Tris pH＝8.0，100mM NaCl的缓冲液中。使用超声细胞破碎器破碎细胞，在4℃下以15000RPM离心除去细胞碎片。然后使用乙酸调节裂解液的pH至pH4.5，以沉淀污染的宿主细胞蛋白质，然后通过离心澄清。然后将澄清的、酸处理的裂解液加到DE52阴离子交换色谱柱上，用NaCl洗脱。然后进一步酸化洗脱的级分至pH 4.0，并加到MacroCapSP阳离子交换色谱柱上。使用NaCl连续洗脱来洗脱下产物。
估计蛋白质纯度为98％以上。通过SDS-PAGE分析及通过检测总蛋白质浓度确定洗脱的融合蛋白的量。大量洗脱的融合蛋白反映融合蛋白相对于单独的hGH较高的溶解度。
最终制剂和贮存
缓冲液交换的蛋白质然后使用10K MWCO Ultrafree浓缩器浓缩至终体积为2mL。浓缩物用0.22um注射过滤器无菌过滤。等分最终溶液，贮存于-80℃。
实施例36：基于ELISA的结合分析
在基于ELISA的标准分析中检测XTEN与GH的融合体，以估计它们结合GH受体的能力。使用夹心ELISA形式进行分析，其中重组hGH受体(hGHR-Fc)包被到ELISA板的孔上。然后将孔封闭，洗涤，然后将BPXTEN样品以不同的稀释度在孔中孵育，以允许捕获BPXTEN。充分洗孔，使用生物素化的多克隆或单克隆抗GH或抗XTEN抗体和链霉亲和素HRP制品检测结合的蛋白质。可以通过比较每个血清稀释度的比色反应与未修饰的GH的标准曲线计算结合的蛋白质的级分。如图30所示的结果表明天然hGH的表观EC50值为0.0701nM，AM864_hGH为0.3905，hGH_AM864为2.733。
结论：结果表明，XTEN融合体在融合后保留大部分的受体结合活性，在C末端具有hGH的BPXTEN融合蛋白比在N末端具有hGH的融合蛋白保留更多的结合亲和力。
实施例37：hGH XTEN融合多肽在大鼠中的PK分析
BPXTEN融合蛋白AE912-hGH、AM864-hGH(在本实施例和以下实施例中与AM875-hGH同义)、AE912-hGH-AE144和AE912-hGH-AE288在大鼠中进行评价，以确定hGHXTEN多肽的体内药代动力学参数。所有组合物都在水性缓冲液中提供，并且使用1.5mg/kg单剂量通过皮下(SC)途径施用于单独的动物。在施用后的不同的时间点采集血浆样品，并分析测试物的浓度。使用夹心ELISA形式进行分析。将重组hGHR-Fc包被到ELISA板的孔上。封闭孔，洗涤，然后血浆样品以不同的稀释度孵育，以允许由包被抗体捕获化合物。充分洗孔，使用生物素化的多克隆抗hGH抗体和链霉亲和素HRP制品检测结合的蛋白质。在每个时间点通过比较每个血清稀释度的比色反应与标准曲线计算测试物的浓度。使用WinNonLin软件包计算药代动力学参数。
图32显示四种hGH XTEN构建体在皮下施用后的浓度分布。AE912-hGH的计算的终末半衰期为7.5h，AM864-hGH(与AM875-hGH相同)为6.8h，AE912-hGH-AE144为12.4h，AE912-hGH-AE288为13.1h。为了比较，在相同的实验中平行运行未修饰的hGH，其显示显著更短的血浆半衰期。
结论：不同XTEN序列向包含hGH的融合蛋白内的引入导致所有四种组合物的药代动力学参数比未修饰的hGH显著提高，这在啮齿动物模型中得到证实，证明了这样的融合蛋白组合物的应用。向AE-hGH构建体的C末端增加第二XTEN蛋白导致终末半衰期比具有单XTEN的构建体进一步增强；这可能是由于受体介导的清除减少。
实施例38：hGH XTEN融合多肽在食蟹猴中的PK分析
含有一个或两个XTEN分子的BPXTEN融合蛋白(AE912-hGH、AM864-hGH和AE912-hGH-AE144)在食蟹猴中进行评价，以确定包含第二XTEN对hGHXTEN多肽的体内药代动力学参数的影响。所有组合物都在水性缓冲液中提供，并且使用1.5mg/kg单剂量通过皮下(SC)途径施用于单独的动物。在施用后的不同的时间点采集血浆样品，并分析测试物的浓度。使用夹心ELISA形式进行分析。将重组hGHR-Fc包被到ELISA板的孔上。封闭孔，洗涤，然后血浆样品以不同的稀释度孵育，以允许由包被抗体捕获化合物。充分洗孔，使用生物素化的多克隆抗hGH抗体和链霉亲和素HRP制品检测结合的蛋白质。在每个时间点通过比较每个血清稀释度的比色反应与标准曲线计算测试物的浓度。使用WinNonLin软件包计算药代动力学参数。融合蛋白的平均终末半衰期：AM864-hGH为33h，AE912-hGH为44h，AE912-hGH-AE144(含有连接到hGH的N末端和C末端的两个XTEN)为110h。
图33显示三种hGH XTEN构建体在皮下施用后的浓度分布，并显示计算的PK参数。皮下施用后，各种制品在336小时的时间内计算的终末半衰期为大约33-110小时。
结论：不同XTEN序列向包含hGH的融合蛋白内的引入导致所有三种组合物的药代动力学参数显著提高，这在食蟹猴模型中得到证实，证明了这样的融合蛋白组合物的应用，含有连接到hGH的C末端的第二XTEN的构建体显示终末半衰期延长至两倍。
实施例39：hGH和AM864-hGH对体重增加的比较效果
在hypox大鼠中，使用测量的响应于施用的化合物的体重增加参数，估计BPXTEN AM864-hGH保留药理学效能的能力。图34显示在hypox大鼠中以指定剂量和剂量频率施用hGH或AM864-hGH对体重的影响。结果表明在效力上与相当剂量的hGH等同、但是给药频率较低的BPXTEN构建体保留生物活性。AM864-hGH的剂量水平增加导致在实验期间体重增加。
实施例40：hGH和AM864-hGH对软骨的比较效果
在hypox大鼠中，使用测量的胫骨骺板增加的参数，估计连接到hGH的AM864的BPXTEN保留药理学效能的能力。图35显示施用安慰剂、hGH和AM864-hGH的比较效果，以治疗9天后的大鼠胫骨的组织横切面显示，边缘用点线表示。分组与图35所示相同。图35A显示安慰剂组在9天后具有344±38.6μm板的平均横切面宽度。图35B显示hGH组(每日10μg)在9天后具有598±8.5μm的平均横切面宽度。图35C显示AM864-hGH(15mg/kg q3d)在9天后具有944±8.5μm的平均横切面宽度。结果表明GHUPR构建体有提高的活性，尽管以频率较低的间隔给药。
实施例41：可被FXIa释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点切割序列可以引入含有可被FXIa蛋白酶(EC 3.4.21.27，Uniprot P03951)识别和切割的氨基酸序列的FIX-XTEN中。具体地，氨基酸序列KLTR↓VVGG(SEQ ID NO：224)[Rawlings N.D.等人，(2008)NucleicAcids Res.，36：D320]将被FXIa蛋白酶在序列的精氨酸之后切割。FXI是促凝蛋白酶，在内源性或接触激活的凝血途径中直接位于FIX之前。活性FXIa通过FXIIa蛋白水解切割酶原由FXI产生。一旦被激活，其在凝血中的天然作用是通过在FIX的位点R191和R226切割蛋白质从酶原上切割肽从而激活FIX，然后保持凝血途径。FXIa的产生受到严格控制，只在适当止血需要凝血时才发生。因此，通过引入切割序列，将只在激活内源性凝血途径的同时以及在生理上需要凝血时，XTEN域从FIX上移除。这产生了这样一种状况：FIX-XTEN融合蛋白在内源性途径激活过程中以一种另外的方式加工。除了在FIX域的R191和R226发生的被FXIa天然切割以外，在XTEN释放位点将发生第三切割，这将使现在激活的FIXa与XTEN蛋白分离。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例42：可被FXIIa释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，XTEN释放位点序列可以含有可被FXIIa蛋白酶(EC 3.4.21.38，Uniprot P00748)识别和切割的氨基酸序列。具体地，氨基酸序列TMTR↓IVGG(SEQ IDNO：225)将在序列第4位的精氨酸之后切割。FXII是促凝蛋白酶，在内源性或接触激活的凝血途径中位于FIX之前。活性FXIIa通过接触非自体表面以及被激肽释放酶切割由FXII产生。一旦被激活，其在凝血中的天然作用是通过蛋白水解切割酶原激活FIX，然后保持凝血途径。FXIIa的产生受到严格控制，只在适当止血需要凝血时才发生。因此，通过引入切割序列，将只在激活内源性凝血途径的同时以及在生理上需要凝血时，XTEN域从FIX上移除。这产生了这样一种状况：FIX-XTEN融合蛋白在内源性途径激活过程中以一种另外的方式加工。除了在FIX域的R191和R226发生的被FXIa天然切割以外，在XTEN释放位点将发生第三切割，这将使现在激活的FIXa与XTEN蛋白分离。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例43：可被激肽释放酶释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，XTEN释放位点序列可以含有可被激肽释放酶蛋白酶(EC 3.4.21.34，UniprotP03952)识别和切割的氨基酸序列。具体地，氨基酸序列SPFR↓STGG(SEQ ID NO：226)[Rawlings N.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在序列第4位的精氨酸之后切割。激肽释放酶是促凝蛋白酶，在内源性或接触激活的凝血途径中位于FIX之前。活性激肽释放酶通过接触非自体表面由血浆激肽释放酶产生。一旦被激活，其在凝血中的天然作用是通过蛋白水解切割酶原激活FXII(图39)，然后保持凝血途径。激肽释放酶的产生受到严格控制，只在适当止血需要凝血时才发生。因此，通过引入切割序列，将只在激活内源性凝血途径的同时以及在生理上需要凝血时，XTEN域从FIX上移除。这产生了这样一种状况：FIX-XTEN融合蛋白在内源性途径激活过程中以一种另外的方式加工。除了在FIX域的R191和R226发生的被FXIa天然切割以外，在XTEN释放位点将发生第三切割，这将使现在激活的FIXa与XTEN蛋白分离。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例44：可被FVIIa释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点序列含有可被FVIIa蛋白酶(EC 3.4.21.21，Uniprot P08709)识别和切割的氨基酸序列。具体地，氨基酸序列LQVR↓IVGG(SEQ ID NO：227)[Rawlings N.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在序列第4位的精氨酸之后切割。FVIIa是促凝蛋白酶，在内源性或接触激活的凝血途径中位于FIX之前。活性FVIIa在结合组织因子、磷脂和钙辅助的自催化过程中由FVII产生。一旦被激活，其在凝血中的天然作用是通过蛋白水解切割酶原激活FIX和FX(图39)，然后保持凝血途径。FVIIa活性受到严格控制，只在适当止血需要凝血时才发生。因此，通过引入切割序列，将只在激活内源性凝血途径的同时以及在生理上需要凝血时，XTEN域从FIX上移除。这产生了这样一种状况：FIX-XTEN融合蛋白在内源性途径激活过程中以一种另外的方式加工。除了在FIX域的R191和R226发生的被FVIIa天然切割以外，在XTEN释放位点将发生第三切割，这将使现在激活的FIXa与XTEN蛋白分离。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例45：可被FIXa释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点切割序列含有可被FIXa蛋白酶(EC 3.4.21.22，Uniprot P00740)识别和切割的氨基酸序列。具体地，氨基酸序列PLGR↓IVGG(SEQ ID NO：228)[Rawlings N.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在序列第4位的精氨酸之后切割。活性FIXa通过在磷脂和钙的存在下由FXIa或FVIIa切割FIX而产生。一旦被激活，其在凝血中的天然作用是通过蛋白水解切割酶原激活FX(图39)，然后保持凝血途径。FIXa活性受到严格控制，只在适当止血需要凝血时才发生。因此，通过引入切割序列，将只在激活内源性凝血途径的同时以及在生理上需要凝血时，XTEN域从FIX上移除。这产生了这样一种状况：FIX-XTEN融合蛋白在内源性途径激活过程中以一种另外的方式加工。除了在FIX域的R191和R226发生的被FVIIa或FXIa天然切割以外，在XTEN释放位点将发生第三切割，这将使现在激活的FIXa与XTEN蛋白分离。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例46：可被FXa释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点含有可被FXa蛋白酶(EC 3.4.21.6，Uniprot P00742)识别和切割的氨基酸序列。具体地，序列IEGR↓TVGG(SEQ ID NO：229)[Rawlings N.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在序列第4位的精氨酸之后切割。活性FXa通过在磷脂和钙的存在下由FXIa切割FIX而产生，并且是凝血途径中因子IX下游紧接的步骤。一旦被激活，其在凝血中的天然作用是通过蛋白水解切割酶原激活FII(图39)，然后保持凝血途径。FXa活性受到严格控制，只在适当止血需要凝血时才发生。因此，通过引入切割序列，将只在激活内源性凝血途径的同时以及在生理上需要凝血时，XTEN域从FIX上移除。这产生了这样一种状况：FIX-XTEN融合蛋白在凝血激活过程中以一种另外的方式加工。除了在FIX域的R191和R226发生的被FVIIa或FXIa天然切割以外，在XTEN释放位点将发生第三切割，这将使现在激活的FIXa与XTEN蛋白分离。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例47：可被FIIa(凝血酶)释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点含有可被FIIa蛋白酶(EC 3.4.21.5，Uniprot P00734)识别和切割的氨基酸序列。具体地，序列LTPR↓SLLV(SEQ ID NO：230)[Rawlings N.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在序列第4位的精氨酸之后切割。活性FIIa通过在磷脂和钙的存在下由FXa切割FII而产生，并且是凝血途径中因子IX下游的步骤。一旦被激活，其在凝血中的天然作用是切割纤维蛋白原(fibringin)(图39)，这又开始了凝块形成。FIIa活性受到严格控制，只在适当止血需要凝血时才发生。因此，通过引入切割序列，将只在激活内源性凝血途径的同时以及在生理上需要凝血时，XTEN域从FIX上移除。这产生了这样一种状况：FIX-XTEN融合蛋白在凝血激活过程中以一种另外的方式加工。除了在FIX域的R191和R226发生的被FVIIa或FXIa天然切割以外，在XTEN释放位点将发生第三切割，这将使现在激活的FIXa与XTEN蛋白分离。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例48：可被弹性蛋白酶-2释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点含有可被弹性蛋白酶-2蛋白酶(EC 3.4.21.37，Uniprot P08246)识别和切割的氨基酸序列。具体地，序列LGPV↓SGVP(SEQ ID NO：231)[Rawlings N.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在序列第4位之后切割。弹性蛋白酶由嗜中性粒细胞组成型表达，并且在所有时间均存在于循环中。其活性受到丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的严格控制，因此在大多数时间活性最低。因此，当长期FIX-XTEN循环时，其一部分将被切割，产生将在凝血中使用的短期FIX的集合。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了不断释放预防量的FIX的循环前药储库。
实施例49：可被MMP-12释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点含有可被MMP-12蛋白酶(EC 3.4.24.65，Uniprot P39900)识别和切割的氨基酸序列。具体地，序列GPAG↓LGGA(SEQ ID NO：233)[RawlingsN.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在序列第4位之后切割。MMP-12在全血中组成型表达。因此，当长期FIX-XTEN循环时，其一部分将被切割，产生将在凝血中使用的短期FIX的集合。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了不断释放预防量的FIX的循环前药储库。
实施例50：可被MMP-13释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点含有可被MMP-13蛋白酶(EC 3.4.24.-，Uniprot P45452)识别和切割的氨基酸序列。具体地，序列GPAG↓LRGA(SEQ ID NO：234)[RawlingsN.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在第4位后切割(箭头所示)。MMP-13在全血中组成型表达。因此，当长期FIX-XTEN循环时，其一部分将被切割，产生将在凝血中使用的短期FIX的集合。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了不断释放预防量的FIX的循环前药储库。
实施例51：可被MMP-17释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点含有可被MMP-20蛋白酶(EC.3.4.24.-，Uniprot Q9ULZ9)识别和切割的氨基酸序列。具体地，序列APLG↓LRLR(SEQ ID NO：235)[RawlingsN.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在该序列的第4位后切割。MMP-17在全血中组成型表达。因此，当长期FIX-XTEN循环时，其一部分将被切割，产生将在凝血中使用的短期FIX的集合。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了不断释放预防量的FIX的循环前药储库。
实施例52：可被MMP-20释放的C末端XTEN
可以产生由融合到FIX的C末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，在FIX和XTEN成分之间设有XTEN释放位点切割序列，如图36B所示。示例性的序列在表43中提供。在此情况中，释放位点含有可被MMP-20蛋白酶(EC.3.4.24.-，Uniprot O60882)识别和切割的氨基酸序列。具体地，序列PALP↓LVAQ(SEQ ID NO：236)[Rawlings N.D.等人，(2008)Nuleic Acids Res.，36：D320]将在第4位后切割(箭头指示)。MMP-20在全血中组成型表达。因此，当长期FIX-XTEN循环时，其一部分将被切割，产生将在凝血中使用的短期FIX的集合。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了不断释放预防量的FIX的循环前药储库。
实施例53：向KNSADK环内的内部XTEN融合
可以产生由插入FIX的环内的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，如图37F所示。具体地，XTEN序列将插入EGF2域的KNSADNK(SEQ ID NO：1749)环(残基146-152)作为融合体，它没有已知的血友病B突变，并且在FIX晶体结构中没有高度组织。在此情况下，通过使天然序列在环序列的SA键处分裂，并将XTEN序列融合到缺口中，以此完成插入。这将产生环序列，其中XTEN将在FIX序列的内部，但是在球蛋白的外部。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa-XTEN，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例54：向LAEN环内的内部XTEN融合
可以产生由插入FIX的环内的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，如图37F所示。具体地，XTEN序列将插入EGF2域的LAEN(SEQ ID NO：1778)环(残基163-166)作为融合体，它没有已知的血友病B突变，并且在FIX晶体结构中没有高度组织。在此情况下，通过使天然序列在序列的AE键处分裂，并将XTEN序列融合到缺口中，以此完成插入。这将产生环序列LA-XTEN-EN。在本发明的组合物的一个理想特征中，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生游离的FIXa-XTEN，后者重建或增强了需要的受试者中的凝血功能。
实施例55：向激活肽内的内部XTEN融合
可以产生由插入FIX的环内的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，如图37D所示。具体地，XTEN融合将置于激活肽内(残基192-226)，使得两个天然FXIa切割位点都不被破坏。通过使天然序列在序列的T209-I210键(以↓指示)处分裂，并将XTEN序列融合到缺口中，以此完成插入。这产生了在激活肽的残基188处开始插入XTEN的序列。FXI是促凝蛋白酶，在内源性或接触激活的凝血途径中直接位于FIX之前。活性FXIa通过FXIIa对酶原的蛋白水解切割由FXI产生。一旦被激活，其在凝血中的天然作用是通过在位点R191和R226切割蛋白质从FIX酶原切割激活肽，以激活FIX(图39)。这些切割位点以箭头指示，序列设计为使P4-P4’位点不改变，以在凝血级联过程中允许天然切割活性。因此，XTEN域将只从FIX切除，作为内源性凝血途径的正常激活过程的一部分。
实施例56：在FIX EGF域之间的内部XTEN融合
可以产生由插入FIX的环内的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，如图37C所示。具体地，XTEN融合将置于FIX的两个EGF样结构域之间(残基129和130之间的接点)。通过使天然序列在E129-L130键处分裂，并将XTEN序列融合到缺口中，以此完成插入。这将产生在残基121处开始插入的XTEN的序列。特别地，这产生了这样一种情况：FIX-XTEN将作为前药保持完整，直到凝血激活，此时该分子将被加工以产生FIXa-XTEN，后者重建或增强了个体的凝血功能。
实施例57：C末端XTEN的释放速率的优化
可以产生上述实施例41-57的变体，其中C末端XTEN的释放速率改变。由于XTEN释放蛋白酶释放XTEN的速率取决于XTEN释放位点的序列，通过改变XTEN释放位点的氨基酸序列，人们可以控制XTEN释放速率。许多蛋白酶的序列特异性是本领域公知的，并且记录在几个数据库中。在此情况下，使用底物的组合文库对蛋白酶的氨基酸特异性作图[Harris，J.L.等人，(2000)Proc Natl Acad Sci U S A，97：7754]，或者在切割底物混合物后作图，如[Schellenberger，V.等人，(1993)Biochemistry，32：4344]所述。一种替代方案是通过噬菌体展示鉴定希望的蛋白酶切割序列[Matthews，D.等人，(1993)Science，260：1113]。制备具有变异序列的构建体，并使用检测XTEN多肽的标准试验分析XTEN释放。
实施例58：FIX-XTEN的凝血酶激活
将FXI特异性XTEN释放位点插入FIX-XTEN_AE864中，产生构建体AC299。将凝血酶特异性XTEN释放位点插入FIX-XTEN_AE864中，产生构建体AC300。使用缺乏XTEN释放位点的构建体AC296作为对照。使用FuGene6转染试剂(Roche)将表达质粒转染到BHK-21细胞(1.2x10e6细胞，在10ml来自Invitrogen的OptiMEM培养基中)。4天后收集培养基，使用Amicon Ultra离心过滤器(Ultracel_30K，Millipore)浓缩器浓缩40倍。将67μl浓缩培养基稀释到10x凝血酶缓冲液中，并与25μl固定的凝血酶(Thrombin CleanCleave Kit，RECOM-T，Sigma)室温孵育8小时。使用抗体(cat#FIX-EIA，Affinity Biologicals inc.Canada)通过ELISA确定所有样品中FIX的浓度。凝固活性使用aPPT试验(Thermo Scientific Pacific Hemostasis，Fisher)确定，并且假定1mUFIX等于4.5ng/ml，将活性转化为FIX的浓度。结果总结在以下表31中。数据显示凝血酶孵育对ELISA信号和AC296和AC299的凝固活性没有显著影响，这与两个构建体都缺乏凝血酶位点的事实相符。相反，凝血酶处理导致AC300的凝血活性增加至27倍。凝血酶处理使AC300的凝血活性恢复到游离FIX的80％。这些数据证明XTEN融合至FIX的C末端导致凝血活性降低50至100倍。支持这些C末端FIX-XTEN构建体的前药性质的概念，XTEN的蛋白水解释放恢复了大部分凝血活性。
表31：FIX-XTEN融合蛋白的ELISA和凝血活性
Figure BPA00001431324302181
实施例59：基于外显子结构，XTEN向FIX中的插入
蛋白质的外显子结构提供了关于结构域边界的有价值的信息，该信息可以指导将XTEN插入哺乳动物蛋白质中[Kolkman，J.A.等人，(2001)Nat Biotechnol，19：423]。图40显示了如何应用该方法产生FIX-XTEN组合物的几个实例，示出了用于在外显子边界之间插入XTEN的示例性的位点。
实施例60：基于工程化FIX序列的FIX-XTEN
为了改善活性已经工程构建了FIX的许多突变体。特别有用的是具有提高的蛋白酶活性的突变体。但是，Gla和/或EGF域改善的突变体也可以用于治疗血友病B，使得在实验或临床评价后，它们能够用来代替天然FIX序列。有用的FIX突变体的实例在表7中列出。
实施例61：FIX-XTEN的产生
FIX-XTEN融合蛋白可以在多种哺乳动物表达载体中表达。一种示例性的基于pSecTag2的载体pCW05090(Invitrogen)在图42中示出。表达构建体含有表达盒，该表达盒包含CMV启动子、FIX的信号肽、FIX的前肽、融合到编码XTEN_AE864的基因的成熟FIX基因，之后是聚腺苷酸化位点。该载体含有用于在哺乳动物细胞中选择的zeosin标记、用于大肠杆菌的pUC复制起点、用于大肠杆菌中选择的氨苄青霉素标记。表达载体可以转染用于表达的CHO细胞、PER.C6细胞或BHK细胞。可以通过ELISA或凝集试验监测表达。FIX-XTEN融合蛋白可以通过离子交换，特别是阴离子交换纯化。为了该实验，它转染CHO细胞。
通过阴离子交换层析的初始过程捕获
来自转染细胞的培养物的细胞培养基直接加到已经用20mM TrispH 6.8，50mM NaCl平衡的800ml Macrocap Q阴离子交换树脂(GE LifeSciences)上。该柱用含有50mM、100mM和150mM NaCl的Tris pH6.8缓冲液连续洗涤。用20mM Tris pH 6.8，250mM NaCl洗脱产物。
使用辛基Sepharose FF的疏水相互作用层析(HIC)
250mL辛基Sepharose FF柱用平衡缓冲液(20mM Tris pH 6.8，1.0M Na2SO4)平衡。将固体Na2SO4加到Macrocap Q洗脱物池，以达到1.0M的终浓度。过滤(0.22微米)得到的溶液，并加到HIC柱上。然后用平衡缓冲液洗柱10个柱体积，以除去未结合的蛋白质和宿主细胞DNA。然后用20mM Tris pH 6.8，0.5M Na2SO4洗脱产物。
通过阴离子交换层析精制的产物
然后用20mM Tris pH 7.5稀释合并的HIC洗脱级分，以达到小于5.0mOhms的电导率。将稀释的产物加到已经用20mM Tris pH 7.5，50mM NaCl平衡的300ml Q Sepharose FF阴离子交换柱上。
最终制剂和贮存
然后使用Pellicon XL Biomax 30000mwco柱，通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩缓冲液交换的蛋白质至大于30mg/ml。浓缩物使用0.22微米注射器过滤器无菌过滤。等分最终溶液并贮存于-80℃。
实施例62：FIX-XTEN的密码子优化
密码子优化可以用来提高FIX-XTEN的表达。这可以使用考虑在人基因中的密码子偏性的计算机算法、RNA结构预测以及内部重复预测进行。
实施例63：FIX-XTEN的储库制剂
可以选择具有特定配制性质的XTEN，以在注射部位形成储库。这将导致从注射部位缓慢释放FIX-XTEN，并且延长了给药间隔之间的时间。用与FIX-XTEN相互作用的赋形剂配制FIX-XTEN可以促进储库形成，并且导致复合物或聚集物的形成。有用的赋形剂的例子有锌、鱼精蛋白、PEG、聚阳离子、聚合物、聚精氨酸、聚赖氨酸。储库也可以通过将FIX-XTEN加载到诸如海藻酸盐、壳多糖、聚乳酸、PLGA、透明质酸、羟磷灰石或其它本领域技术人员已知的聚合物等颗粒上形成。
实施例64：稳定性提高的FIX-XTEN
游离FIX易于聚集，这使蛋白质的配制变得复杂。该特征也妨碍了开发允许皮下注射所需的小注射体积的高浓度制剂。由于XTEN在减少融合配偶体聚集方面的性质，可以产生FIX-XTEN的组合物，它1)防止FIX聚集；且2)允许皮下或肌肉内给药。
实施例65：FVII-XTEN_AE864
编码因子VII(“FVII”)的基因符合读框地融合到XTEN_AE864，并插入表达载体pCW0590中。用表达载体转染CHO-K1细胞，使用zeocin选择稳定的集合体，并回收表达的蛋白质。表达的因子VII-XTEN_AE864的氨基酸序列在表43中列出。通过ELISA检测159ng/ml FVII当量的表达水平，使用PPT凝集试验(Thermo ScientificPacific Hemostasis，Fisher)检测214ng/ml FVII当量。这证明了XTEN_AE864与FVII融合产生BPXTEN导致融合蛋白保留FVII的凝固活性。
实施例66：FVIIa-XTEN的生产
FVIIa-XTEN可以基本上如实施例61对于FIX-XTEN所述生产。将增加激活步骤以将FVII-XTEN转化为FVIIa-XTEN。或者，可以使用双顺反子载体，使得FVIIa的两条蛋白质链分别表达，并直接装配为激活的FVIIa-XTEN。
实施例67：因子VII-评估FVII-XTEN融合多肽的活性
通过用FVII缺乏的血浆(100070)将正常对照血浆(PacificHemostasis 100595)稀释10倍，然后再次用因子VII缺乏的血浆进行4，5倍连续稀释，准备标准曲线。这样产生了具有100、20、4、0.8和0.16mU/ml的活性点的标准曲线，其中一个活性单位被定义为在1ml正常人血浆中FVII活性的量。也包括缺乏FVII的血浆，以在空血浆中确定活性的背景水平。通过以1∶10的体积比向缺乏FVII的血浆添加HEK293细胞在细胞生长条件培养基中分泌的FVII-XTEN准备样品，该细胞用含有FVII-XTEN编码序列的载体瞬时转染。为了补偿条件培养基的可能的干扰，用空载体转染HEK293细胞产生的条件培养基以1∶10的体积比添加到标准曲线样品中。使用如下的促凝血酶时间分析检测该样品。样品在molecular devices读板器分光光度计中在37℃孵育3分钟，此时每一体积样品添加2倍体积的促凝血酶原激酶(Dade Innovin，B4212-50)启动凝固反应。在405nm监测浊度5分钟，以产生反应谱。PT时间，或凝固活性开始前时间，被定义为OD405nm比基线高0.06的第一时间。log-线性标准曲线使用与PT时间线性相关的活性的对数产生。由此确定平板中样品的活性，然后通过乘以11确定样品的活性，以补偿在缺乏FVII的血浆中的稀释。基于重复的测量，FVII-XTEN融合体的活性为203mU/ml。反应谱在图9中显示，其中缺乏FVII的血浆显示为粗虚线，来自标准的三个样品显示为虚线，FVII-XTEN样品显示为粗线。
实施例68：因子VII-XTEN融合蛋白的纯化
FVII-XTEN融合蛋白可以在多种哺乳动物表达载体中表达。基于pSecTag2(Invitrogen)的载体pCW05090在图46中显示。表达构建体含有表达盒，该表达盒包含CMV启动子、FVII的信号肽、FVII的前肽、融合到编码XTEN_AE864的基因的成熟FVII基因，之后是聚腺苷酸化位点。该载体含有用于在哺乳动物细胞中选择的zeosin标记、用于大肠杆菌的pUC复制起点、用于大肠杆菌中选择的氨苄青霉素标记。该表达载体可以转染用于表达的CHO细胞、HEK293、PER.C6细胞或BHK细胞。可以通过ELISA或凝集试验监测表达。FVII-XTEN融合蛋白可以通过离子交换，特别是阴离子交换纯化。
通过阴离子交换层析的初始过程捕获
将细胞培养基直接加到已经用20mM Tris pH 6.8，50mM NaCl平衡的800ml Macrocap Q阴离子交换树脂(GE Life Sciences)上。该柱用含有50mM、100mM和150mM NaCl的Tris pH 6.8缓冲液连续洗涤。产物用20mM Tris pH 6.8，250mM NaCl洗脱，并用实施例67的方法证实。
实施例69：用于FIX活性测定的aPTT分析
因子IX属于内源性的或接触激活凝血途径。该凝血途径的活性用来利用激活部分促凝血酶原激酶时间试验(aPTT)估计FIX-XTEN和蛋白水解副产物的活性。FIX活性具体如下测定：通过用缺乏FIX的血浆(cat#100900)将正常对照血浆(Pacific Hemostasis cat# 100595)稀释2倍，然后再用缺乏因子IX的血浆进行6，4倍系列稀释，准备标准曲线。这产生具有500、130、31、7.8、2.0、0.5和0.1mU/ml活性点的标准曲线，其中一个活性单位被定义为在1ml正常人血浆中FIX活性的量。也包括缺乏FIX的血浆，以在空血浆中确定活性的背景水平。通过以1∶10的体积比向缺乏FIX的血浆添加CHO细胞在细胞生长条件培养基中分泌的FIX-XTEN准备样品，该细胞用含有FIX-XTEN编码序列的载体瞬时转染。为了补偿条件培养基的可能的干扰，用空载体转染CHO细胞产生的条件培养基以1∶10的体积比添加到标准曲线样品中。使用如下的aPTT试验检测该样品。样品在molecular devices读板器分光光度计中在37C孵育2分钟，此时添加等体积的aPTT试剂(PacificHemostasis cat# 100402)，再进行3分钟的37C孵育。孵育后，通过加入一倍体积的氯化钙(Pacific Hemostasis cat# 100304)激活试验。在450nm监测浊度5分钟，以产生谱。aPTT时间，或凝固活性开始前时间，被定义为OD405nm比基线高0.06的第一时间。log-线性标准曲线使用与aPTT时间线性相关的活性的对数产生。由此确定平板中样品的活性，然后通过乘以11确定样品的活性，以补偿在缺乏FIX的血浆中的稀释。
实施例70：用于FIX浓度测定的ELISA试验
使用特定的匹配抗体对，利用ELISA试验确定各种FIX-XTEN组合物和蛋白水解副产物的因子IX浓度，其中检测抗体偶联到HRP上以简化检测(Affinity Biologicals cat# FIX-EIA)。捕获抗体在4℃包被到高结合96孔测定板(Corning 3690)上过夜。该板用PBS中的3％BSA在室温下封闭1小时。用洗板器以PBST洗板6次。在PBST中稀释的样品或标准然后在室温下结合到适当的孔中2小时。标准曲线的范围为25ng/ml至＜1pg/ml，通过在PBST中系列稀释已知浓度的商业FIX(Abcam Cat# ab62544)来准备。再用洗板器以PBST洗板6次。然后使用检测抗体检测FIX，该检测抗体在37℃结合1小时。再用洗板器以PBST洗板6次，并用水再洗一次。然后使用TMB底物显示信号，通过使用molecular devices读板器分光光度计在405nm读取来定量。然后在标准上进行四参数拟合，并通过与标准曲线比较确定样品的浓度。
实施例71：用于评估BPXTEN的人临床试验设计
可以设计临床试验，使得BPXTEN组合物相对于单生物制品的效能和优点能够在人体中得到证实。例如，如上述实施例所述包含胰高血糖素和艾塞那肽的BPXTEN融合构建体可以用于临床试验中，用于表征该组合物的效能。这些试验能够对施用胰高血糖素和艾塞那肽能够改善、缓解或抑制的一种或多种代谢疾病、障碍或病症进行。这些在成人患者中进行的研究包括三个阶段。首先，在成人患者中进行I期安全性和药代动力学研究，以确定在人体中的最大耐受剂量和药代动力学和药效学(正常受试者或患有代谢疾病或病症的患者)，并且确定在未来的研究中将要追踪的潜在毒性和不良反应。将进行该研究，其中施用单个提高剂量的连接到胰高血糖素和艾塞那肽的XTEN的融合蛋白的组合物，并测定生物化学、PK和临床参数。这将允许测定最大耐受剂量和建立剂量的阈值和最大浓度和构成相应成分的治疗窗的循环药物。之后，在患有疾病、障碍或病症的患者中进行临床试验。
糖尿病临床试验
在糖尿病患者中进行II期定量研究，其中血清葡萄糖药效学和适合糖尿病、胰岛素抗性和肥胖状况的其它生理学、PK、安全性和临床参数(如以下所列)将随着含有连接到胰高血糖素和艾塞那肽的XTEN的融合蛋白的给药进行测定，产生关于适合III期试验的剂量的剂量范围的信息，以及收集与不良反应有关的安全性数据。PK参数将与生理、临床和安全性参数相关联，以建立BPXTEN组合物的每个成分的治疗窗，允许医生建立两成分融合蛋白(每个含有一种葡萄糖调节肽)的适当比例，或者确定包含两种葡萄糖调节肽的单体BPXTEN的单剂量。最后，进行III期有效性研究，其中给糖尿病患者施用BPXTEN组合物、阳性对照或安慰剂，每天、每两周或每周一次(或其它认为对于BPXTEN组合物的药代动力学和药效学性质合适的给药方案)，持续延长的时间。有效性的主要结果标准包括HbA1c浓度，次要结果标准包括研究过程中的胰岛素需要、受刺激的C肽和胰岛素浓度、空腹血浆葡萄糖(FPG)、血清细胞因子水平、CRP水平、来自于胰岛素和葡萄糖检测的OGTT的胰岛素分泌和胰岛素敏感指数，以及体重、食物消耗和其它将要相对于安慰剂或阳性对照组追踪的可接受的糖尿病标志。有效性结果将使用标准统计学方法确定。毒性和不良反应标志也将在该研究中追踪，以证实该化合物在以所述方式使用时是安全的。
关节炎临床试验
对关节炎患者进行人类患者的II期临床研究，对其施用包含连接到IL-1ra的XTEN的BPXTEN和/或抗-IL-2、抗-CD3或合适的抗炎蛋白质，以确定缓解至少一个与类风湿性关节炎相关的症状(包括减轻关节肿胀、关节压痛、炎症、晨僵和疼痛)或至少一个与类风湿性关节炎相关的生物学替代指标(包括减少红细胞沉降率和C反应蛋白和/或IL2受体血清水平)的合适的剂量。另外，将收集与不良反应有关的安全性数据。将进行III期有效性研究，其中给关节炎患者施用BPXTEN、阳性对照或安慰剂，每天、每两周或每周一次(或其它认为对于该化合物的药代动力学和药效学性质合适的给药方案)，持续延长的时间。评价患者在接受任何治疗前的疾病活动性的基线症状，包括关节肿胀、关节压痛、炎症、晨僵、由患者和医生评价的疾病活动性，以及例如根据标准化健康问卷调查评估(HAQ)评价的失能，以及疼痛。另外的基线评价包括红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)和/或IL-2受体(IL-2r)血清水平。对治疗的临床反应可以使用美国风湿病学会(ACR)建立的标准如ACR20标准评价；即，如果压痛和肿胀关节计数有20％的改善，和检测的其余5个症状中的3个有20％的改善，如患者和医生总体疾病变化、疼痛、失能和急性期反应物(Felson，D.T.等人，1993 Arthritis andRheumatism 36：729-740；Felson，D.T.等人，1995 Arthritis and Rheumatism38：1-9)。同样，如果压痛和肿胀关节计数分别有50％或70％的改善，以及检测的其余5个症状中的3个分别有50％或70％的改善(如患者和医生总体疾病变化、疼痛、残疾和急性期反应物如CRP或ESR)，则受试者将满足ACR50或ACR70标准。另外，可以检测疾病活动性的潜在的生物标志，包括类风湿因子、CRP、ESR、可溶性IL-2R、可溶性ICAM-1、可溶性E-选择素和MMP-3。有效性结果将使用标准统计学方法确定。毒性和不良反应标志也将在该研究中追踪，以证实该化合物在以所述方式使用时是安全的。
急性冠脉综合征和急性心肌梗死的临床试验
进行急性冠脉综合征(ACS)和/或急性心肌梗死(AMI)的III期试验，其中向被诊断为ACS和/或AMI的患者施用例如包含IL-1ra和BNP的BPXTEN融合蛋白、阳性对照、BPXTEN融合蛋白+阳性对照物的组合，或安慰剂，每天、每两周或每周一次(或其它认为对于该化合物的药代动力学和药效学性质合适的给药方案)，持续延长的时间。进行该研究以确定BPXTEN在预防患有近期急性冠脉综合征的受试者的心血管死亡、非致死性心肌梗死或缺血性发作方面是否优于其它治疗方案。评价患者在接受任何治疗前的疾病活动性的基线症状，包括以下体征或症状：不稳定型心绞痛、围绕胸部放射至左臂和左下颌角的紧张的胸痛、出汗、恶心和呕吐、呼吸困难，以及非-Q-波心肌梗死和Q-波心肌梗死的心电图(ECG)证据。另外的基线评价包括测定生物标志，包括缺血变性白蛋白(IMA)、髓过氧化物酶(MPO)、糖原磷酸化酶同工酶BB-(GPBB)、肌钙蛋白、促尿钠排泄肽(B-型促尿钠排泄肽(BNP)和N末端Pro BNP)，和单核细胞化学趋化蛋白(MCP)-1。对治疗的临床反应将使用第一次发生心血管死亡、心肌梗死或缺血性发作前的时间作为主要结果标准，使用首次发生不稳定型心绞痛、出血性中风或致死性出血或出现前的时间作为次要结果标准来估计。有效性结果将使用标准统计学方法确定。毒性和不良反应标志也将在该研究中追踪，以证实该化合物在以所述方式使用时是安全的。
实施例72：通过预测算法对二级结构的序列分析
氨基酸序列可以通过某些计算机程序或算法评估二级结构，如众所周知的Chou-Fasman算法(Chou，P.Y.等人，(1974)Biochemistry，13：222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson，或“GOR”方法(Garnier J，Gibrat JF，Robson B.(1996).GOR methodfor predicting protein secondary structurefrom amino acid sequence.Methods Enzymol 266：540-553)。对于给定的序列，该算法可以预测是否存在一些二级结构或根本没有二级结构，表示为形成α-螺旋或β-折叠的序列残基的总数和/或百分比，或者预测导致无规卷曲形成的序列残基的百分比。
使用用于Chou-Fasman和GOR方法的两种算法工具评价来自XTEN“家族”的几个代表性序列，以评价这些序列中二级结构的程度。Chou-Fasman工具由William R.Pearson和University of Virginia在“Biosupport”互联网网站提供，URL位于www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝misc1，出现于2009年6月19日。GOR工具由Pole Informatique Lyonnais在网络蛋白质序列分析互联网网站提供，URL位于www.npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl，出现于2008年6月19日。
在分析的第一步，使用两种算法分析一种XTEN序列。AE864组合物是具有864个氨基酸残基的XTEN，它由多个拷贝的四个由氨基酸G、S、T、E、P和A组成的12氨基酸序列基序产生。该基序的特征在于在基序和总序列内重复性有限，因为在任一个12氨基酸基序中任两个连续氨基酸的序列不重复两次以上，并且XTEN全长上没有三个连续氨基酸是相同的。接着，通过Chou-Fasman和GOR算法(后者需要最小长度为17个氨基酸)从N末端分析AF 864序列的更长部分。通过将FASTA形式序列输入预测工具内并运行该分析，分析该序列。分析结果显示在表32中。
结果表明，通过Chou-Fasman计算，AE家族的四个基序(表1)没有α-螺旋或β-折叠。同样地发现最多达288个残基的序列没有α-螺旋或β-折叠。预测432个残基的序列具有少量的二级结构，只有2个氨基酸贡献于α-螺旋，总百分比为0.5％。全长AF864多肽具有相同的两个氨基酸贡献于α-螺旋，总百分比为0.2％。无规卷曲形成的计算揭示随着长度增加，无规卷曲形成的百分比增加。该序列的前24个氨基酸具有91％的无规卷曲形成，其随着长度增加而提高，对于全长序列最多达99.77％的值。
也分析了来自其它基序家族的大量500个氨基酸或更长的XTEN序列，揭示大多数具有高于95％的无规卷曲形成。例外的是具有一个或多个存在三个连续丝氨酸残基的情况的序列，这导致预测的β-折叠形成。但是，甚至这些序列仍具有大约99％的无规卷曲形成。
相反，限于A、S和P氨基酸的84个残基的多肽序列通过Chou-Fasman算法进行估计，它预测了高度的预测的α-螺旋。该序列具有多个重复“AA”和“AAA”序列，具有总预测百分比为69％的α-螺旋结构。GOR算法预测了78.57％的无规卷曲形成；远低于在本实施例中分析的任何由12氨基酸基序组成的序列(由氨基酸G、S、T、E、P组成)。
结论：分析支持了以下结论：1)据预测，由多个G、S、T、E、P和A的基序产生的、具有有限连续氨基酸重复性的XTEN具有极少量的α-螺旋和β-折叠；2)延长XTEN的长度不会显著增加形成α-螺旋或β-折叠的可能性；和3)通过增加由氨基酸G、S、T、E、P和A组成的非重复12-mers逐渐延长XTEN序列的长度导致增加的无规卷曲形成百分比。相反，预测由限于A、S和P的氨基酸产生的、具有较高程度内部重复性的多肽具有高百分比的α-螺旋(如通过Chou-Fasman算法确定的)，以及无规卷曲形成。基于通过这些方法评价的大量序列，通常预期，由G、S、T、E、P和A的基序产生的、具有长度大于大约400个氨基酸残基的有限重复性(定义为在任一个基序中不超过两个相同的连续氨基酸)的XTEN具有非常有限的二级结构。例外是含有三个连续丝氨酸的基序，据认为来自表1的基序的任何顺序或组合可以用来产生长度大于大约400个残基的XTEN多肽，将导致XTEN序列基本不含二级结构。预期这些序列具有此处公开的本发明BPXTEN实施方案所述的特征。
表32：多肽序列的CHOU-FASMAN和GOR预测计算
Figure BPA00001431324302281
Figure BPA00001431324302301
Figure BPA00001431324302311
Figure BPA00001431324302321
Figure BPA00001431324302331
Figure BPA00001431324302351
Figure BPA00001431324302361
Figure BPA00001431324302371
Figure BPA00001431324302381
*H：α-螺旋E：β-折叠
实施例73：多肽序列的重复性的分析
可以通过定量整个多肽内出现较短亚序列的次数来估计多肽氨基酸序列的重复性。例如，200个氨基酸残基的多肽具有192个重叠9-氨基酸亚序列(或9-mer“框”)，但是独特的9-mer亚序列数将取决于序列内的重复性程度。在本分析中，通过以下方法估计了不同的序列的重复性：将聚合物部分前200个氨基酸上每个3氨基酸框的所有独特3-mer亚序列的出现加起来，除以200个氨基酸序列内独特3-mer亚序列的绝对数。得到的亚序列得分反映了该多肽内的重复性的程度。
表33所示的结果表明，由2或3个氨基酸类型组成的未截短的多肽具有高亚序列得分，而具有低内部重复性程度、由6种氨基酸G、S、T、E、P和A的12氨基酸基序组成的多肽具有小于10的亚序列得分，在有些情况下小于5。例如，L288序列具有两种氨基酸类型，并且具有短的、高度重复的序列，导致亚序列得分为50.0。多肽J288具有三种氨基酸类型，但也具有短的、重复序列，导致亚序列得分为33.3。Y576也具有三种氨基酸类型，但是不是由内部重复片段组成，反映在前200个氨基酸上的亚序列得分为15.7。W576由4种类型的氨基酸组成，但是具有高度的内部重复性，例如，“GGSG”(SEQ ID NO：782)，导致亚序列得分为23.4。AD576由4种类型的12氨基酸基序组成，每个基序由4种类型的氨基酸组成。由于各基序具有低度的内部重复性，前200个氨基酸上的总亚序列得分为13.6。相反，由4种基序组成的XTEN含有6种类型的氨基酸，具有低度内部重复性的每一个具有较低的亚序列得分；即，AE864(6.1)，AF864(7.5)，和AM875(4.5)。
结论：结果表明，各自由4-6种氨基酸类型组成的、基本不重复的12氨基酸亚基序组合为较长的XTEN多肽导致总序列是非重复的。尽管事实是每个亚序列基序在该序列上都可以多次使用。相反，由数量较少的氨基酸类型产生的聚合物导致较高的亚序列得分，尽管可以定制实际序列，以降低重复性程度，从而导致较低的亚序列得分。
表33：多肽序列的亚序列得分计算
Figure BPA00001431324302391
Figure BPA00001431324302401
Figure BPA00001431324302411
Figure BPA00001431324302421
Figure BPA00001431324302431
实施例74：TEPITOPE得分的计算
9mer肽序列的TEPITOPE得分可以通过增加口袋电势来计算，如Sturniolo[Sturniolo，T.等人，(1999)Nat Biotechnol，17：555]所述。在本实施例中，为各个HLA等位基因计算单独的Tepitope得分。表34显示HLA*0101B的口袋电势作为一个实例，HLA*0101B在高加索人群中高频率出现。为了计算序列为P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9的TEPITOPE肽的得分，增加表34中相应的各个口袋电势。序列为FDKLPRTSG(SEQ ID NO：800)的9mer肽的HLA*0101B得分将是0、-1.3、0、0.9、0、-1.8、0.09、0、0的总和。
为了评价长肽的TEPITOPE得分，人们可以为这些序列的所有9mer亚序列重复该过程。可以为其它HLA等位基因编码的蛋白质重复该过程。表35-38给出了在高加索人群中高频率出现的HLA等位基因的蛋白质产物的口袋电势。
通过该方法计算的TEPITOPE得分从大约-10到+10。然而，在P1位置缺乏疏水性氨基酸(FKLMVWY(SEQ ID NO：801))的9mer肽具有范围为-1009至-989的计算的TEPITOPE得分。该值在生物学上没有意义，反映了如下事实：疏水性氨基酸作为HLA结合的锚定残基，在P1缺乏疏水性残基的肽被认为不是HLA的结合剂。因为大多数XTEN序列缺乏疏水性残基，9mer亚序列的所有组合将具有在-1009至-989范围内的TEPITOPE。该方法证实了XTEN多肽可能具有极少的或者没有预测的T细胞表位。
表34：HLA*0101B等位基因的口袋电势
  氨基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9
  A   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  C   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  D   -999   -1.3   -1.3   -2.4   -   -2.7   -2   -   -1.9
  E   -999   0.1   -1.2   -0.4   -   -2.4   -0.6   -   -1.9
  F   0   0.8   0.8   0.08   -   -2.1   0.3   -   -0.4
  G   -999   0.5   0.2   -0.7   -   -0.3   -1.1   -   -0.8
  H   -999   0.8   0.2   -0.7   -   -2.2   0.1   -   -1.1
  I   -1   1.1   1.5   0.5   -   -1.9   0.6   -   0.7
  K   -999   1.1   0   -2.1   -   -2   -0.2   -   -1.7
  L   -1   1   1   0.9   -   -2   0.3   -   0.5
M -1 1.1 1.4 0.8 - -1.8 0.09 - 0.08
  N   -999   0.8   0.5   0.04   -   -1.1   0.1   -   -1.2
  P   -999   -0.5   0.3   -1.9   -   -0.2   0.07   -   -1.1
  Q   -999   1.2   0   0.1   -   -1.8   0.2   -   -1.6
  R   -999   2.2   0.7   -2.1   -   -1.8   0.09   -   -1
  S   -999   -0.3   0.2   -0.7   -   -0.6   -0.2   -   -0.3
  T   -999   0   0   -1   -   -1.2   0.09   -   -0.2
  V   -1   2.1   0.5   -0.1   -   -1.1   0.7   -   0.3
  W   0   -0.1   0   -1.8   -   -2.4   -0.1   -   -1.4
  Y   0   0.9   0.8   -1.1   -   -2   0.5   -   -0.9
表35：HLA*0301B等位基因的口袋电势
  氨基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9
  A   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  C   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  D   -999   -1.3   -1.3   2.3   -   -2.4   -0.6   -   -0.6
E -999 0.1 -1.2 -1 - -1.4 -0.2 - -0.3
  F   -1   0.8   0.8   -1   -   -1.4   0.5   -   0.9
  G   -999   0.5   0.2   0.5   -   -0.7   0.1   -   0.4
  H   -999   0.8   0.2   0   -   -0.1   -0.8   -   -0.5
  I   0   1.1   1.5   0.5   -   0.7   0.4   -   0.6
  氨基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9
  K   -999   1.1   0   -1   -   1.3   -0.9   -   -0.2
  L   0   1   1   0   -   0.2   0.2   -   -0
  M   0   1.1   1.4   0   -   -0.9   1.1   -   1.1
  N   -999   0.8   0.5   0.2   -   -0.6   -0.1   -   -0.6
  P   -999   -0.5   0.3   -1   -   0.5   0.7   -   -0.3
  Q   -999   1.2   0   0   -   -0.3   -0.1   -   -0.2
  R   -999   2.2   0.7   -1   -   1   -0.9   -   0.5
  S   -999   -0.3   0.2   0.7   -   -0.1   0.07   -   1.1
  T   -999   0   0   -1   -   0.8   -0.1   -   -0.5
  V   0   2.1   0.5   0   -   1.2   0.2   -   0.3
  W   -1   -0.1   0   -1   -   -1.4   -0.6   -   -1
  Y   -1   0.9   0.8   -1   -   -1.4   -0.1   -   0.3
表36：HLA*0401B等位基因的口袋电势
  氨基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9
  A   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  C   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  D   -999   -1.3   -1.3   1.4   -   -1.1   -0.3   -   -1.7
  E   -999   0.1   -1.2   1.5   -   -2.4   0.2   -   -1.7
  F   0   0.8   0.8   -0.9   -   -1.1   -1   -   -1
  G   -999   0.5   0.2   -1.6   -   -1.5   -1.3   -   -1
  H   -999   0.8   0.2   1.1   -   -1.4   0   -   0.08
  I   -1   1.1   1.5   0.8   -   -0.1   0.08   -   -0.3
  K   -999   1.1   0   -1.7   -   -2.4   -0.3   -   -0.3
  L   -1   1   1   0.8   -   -1.1   0.7   -   -1
  M   -1   1.1   1.4   0.9   -   -1.1   0.8   -   -0.4
  N   -999   0.8   0.5   0.9   -   1.3   0.6   -   -1.4
  P   -999   -0.5   0.3   -1.6   -   0   -0.7   -   -1.3
  Q   -999   1.2   0   0.8   -   -1.5   0   -   0.5
  R   -999   2.2   0.7   -1.9   -   -2.4   -1.2   -   -1
  S   -999   -0.3   0.2   0.8   -   1   -0.2   -   0.7
  T   -999   0   0   0.7   -   1.9   -0.1   -   -1.2
  V   -1   2.1   0.5   -0.9   -   0.9   0.08   -   -0.7
  W   0   -0.1   0   -1.2   -   -1   -1.4   -   -1
  Y   0   0.9   0.8   -1.6   -   -1.5   -1.2   -   -1
表37：HLA*0701B等位基因的口袋电势
  氨基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9
  A   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  C   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  氨基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9
  D   -999   -1.3   -1.3   -1.6   -   -2.5   -1.3   -   -1.2
  E   -999   0.1   -1.2   -1.4   -   -2.5   0.9   -   -0.3
  F   0   0.8   0.8   0.2   -   -0.8   2.1   -   2.1
  G   -999   0.5   0.2   -1.1   -   -0.6   0   -   -0.6
  H   -999   0.8   0.2   0.1   -   -0.8   0.9   -   -0.2
  I   -1   1.1   1.5   1.1   -   -0.5   2.4   -   3.4
  K   -999   1.1   0   -1.3   -   -1.1   0.5   -   -1.1
  L   -1   1   1   -0.8   -   -0.9   2.2   -   3.4
  M   -1   1.1   1.4   -0.4   -   -0.8   1.8   -   2
  N   -999   0.8   0.5   -1.1   -   -0.6   1.4   -   -0.5
  P   -999   -0.5   0.3   -1.2   -   -0.5   -0.2   -   -0.6
  Q   -999   1.2   0   -1.5   -   -1.1   1.1   -   -0.9
  R   -999   2.2   0.7   -1.1   -   -1.1   0.7   -   -0.8
  S   -999   -0.3   0.2   1.5   -   0.6   0.4   -   -0.3
  T   -999   0   0   1.4   -   -0.1   0.9   -   0.4
  V   -1   2.1   0.5   0.9   -   0.1   1.6   -   2
  W   0   -0.1   0   -1.1   -   -0.9   1.4   -   0.8
  Y   0   0.9   0.8   -0.9   -   -1   1.7   -   1.1
表38：HLA*1501B等位基因的口袋电势
  氨基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9
  A   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  C   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  D   -999   -1.3   -1.3   -0.4   -   -0.4   -0.7   -   -1.9
  E   -999   0.1   -1.2   -0.6   -   -1   -0.7   -   -1.9
  F   -1   0.8   0.8   2.4   -   -0.3   1.4   -   -0.4
  G   -999   0.5   0.2   0   -   0.5   0   -   -0.8
  H   -999   0.8   0.2   1.1   -   -0.5   0.6   -   -1.1
  I   0   1.1   1.5   0.6   -   0.05   1.5   -   0.7
  K   -999   1.1   0   -0.7   -   -0.3   -0.3   -   -1.7
  L   0   1   1   0.5   -   0.2   1.9   -   0.5
  M   0   1.1   1.4   1   -   0.1   1.7   -   0.08
  N   -999   0.8   0.5   -0.2   -   0.7   0.7   -   -1.2
  P   -999   -0.5   0.3   -0.3   -   -0.2   0.3   -   -1.1
  Q   -999   1.2   0   -0.8   -   -0.8   -0.3   -   -1.6
  R   -999   2.2   0.7   0.2   -   1   -0.5   -   -1
  S   -999   -0.3   0.2   -0.3   -   0.6   0.3   -   -0.3
  T   -999   0   0   -0.3   -   -0   0.2   -   -0.2
  V   0   2.1   0.5   0.2   -   -0.3   0.3   -   0.3
  W   -1   -0.1   0   0.4   -   -0.4   0.6   -   -1.4
  Y   -1   0.9   0.8   2.5   -   0.4   0.7   -   -0.9
表39：BP的示例性的生物活性、示例性的分析和优选的适应症
Figure BPA00001431324302471
Figure BPA00001431324302481
Figure BPA00001431324302491
表40：连接到XTEN的单葡萄糖调节肽或代谢蛋白质的示例性 BPXTEN
Figure BPA00001431324302501
Figure BPA00001431324302511
Figure BPA00001431324302521
Figure BPA00001431324302531
Figure BPA00001431324302541
Figure BPA00001431324302551
Figure BPA00001431324302571
Figure BPA00001431324302581
Figure BPA00001431324302601
Figure BPA00001431324302611
Figure BPA00001431324302621
Figure BPA00001431324302641
Figure BPA00001431324302651
Figure BPA00001431324302661
Figure BPA00001431324302671
Figure BPA00001431324302691
Figure BPA00001431324302701
Figure BPA00001431324302721
Figure BPA00001431324302731
Figure BPA00001431324302741
Figure BPA00001431324302761
Figure BPA00001431324302781
Figure BPA00001431324302791
Figure BPA00001431324302801
Figure BPA00001431324302811
Figure BPA00001431324302821
Figure BPA00001431324302831
Figure BPA00001431324302841
Figure BPA00001431324302861
Figure BPA00001431324302871
Figure BPA00001431324302881
Figure BPA00001431324302901
Figure BPA00001431324302911
Figure BPA00001431324302921
Figure BPA00001431324302931
Figure BPA00001431324302941
Figure BPA00001431324302951
Figure BPA00001431324302961
Figure BPA00001431324302971
Figure BPA00001431324302981
Figure BPA00001431324302991
Figure BPA00001431324303001
Figure BPA00001431324303011
Figure BPA00001431324303021
Figure BPA00001431324303031
Figure BPA00001431324303041
Figure BPA00001431324303051
Figure BPA00001431324303071
Figure BPA00001431324303091
Figure BPA00001431324303101
Figure BPA00001431324303111
Figure BPA00001431324303131
Figure BPA00001431324303141
Figure BPA00001431324303161
Figure BPA00001431324303171
Figure BPA00001431324303181
Figure BPA00001431324303191
Figure BPA00001431324303201
Figure BPA00001431324303211
Figure BPA00001431324303221
Figure BPA00001431324303241
Figure BPA00001431324303251
Figure BPA00001431324303271
Figure BPA00001431324303281
Figure BPA00001431324303301
Figure BPA00001431324303311
Figure BPA00001431324303321
Figure BPA00001431324303331
Figure BPA00001431324303341
Figure BPA00001431324303361
Figure BPA00001431324303371
Figure BPA00001431324303391
Figure BPA00001431324303401
Figure BPA00001431324303411
Figure BPA00001431324303421
Figure BPA00001431324303441
Figure BPA00001431324303451
Figure BPA00001431324303461
Figure BPA00001431324303471
Figure BPA00001431324303491
Figure BPA00001431324303501
Figure BPA00001431324303511
Figure BPA00001431324303521
Figure BPA00001431324303551
Figure BPA00001431324303561
Figure BPA00001431324303571
Figure BPA00001431324303581
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Figure BPA00001431324304701
*序列名称名称反映BP和XTEN成分的N至C末端结构
表41：包含连接到一个或两个XTEN的两个葡萄糖调节肽的示例 性BPXTEN融合蛋白
Figure BPA00001431324304702
Figure BPA00001431324304721
Figure BPA00001431324304741
*序列名称反映BP和XTEN成分的N至C末端结构
表42：包含葡萄糖调节肽、XTEN和切割序列的示例性BPXTEN
Figure BPA00001431324304742
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Figure BPA00001431324304761
*序列名称反映BP、XTEN和切割序列(命名为切割该序列的蛋白酶)成分的N至C末端结构
表43：包含凝血蛋白的示例性的BPXTEN
Figure BPA00001431324304771
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*序列名称反映凝血因子、切割序列(如果有，命名为切割该序列的蛋白酶)和XTEN成分的N至C末端结构
表44：包含生长激素和XTEN的示例性的BPXTEN
Figure BPA00001431324304882
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*序列名称反映生长因子、切割序列和XTEN成分的N至C末端结构

Claims (34)

1.一种分离的延伸重组多肽(XTEN)，包含超过大约400至大约3000个氨基酸残基，其中该XTEN的特征在于：
(a)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和占XTEN的总氨基酸序列的超过大约80％；
(b)该XTEN序列基本是非重复的；
(c)当通过TEPITOPE算法分析时，该XTEN序列缺乏预测的T细胞表位，其中对XTEN序列内表位的TEPITOPE算法预测是基于-9或更高的得分；
(d)通过GOR算法确定，该XTEN序列具有超过90％的无规卷曲形成；和
(e)通过Chou-Fasman算法确定，该XTEN序列具有少于2％的α螺旋和少于2％的β-折叠。
2.一种分离的延伸重组多肽(XTEN)，包含超过大约400至大约3000个氨基酸残基，其中该XTEN的特征在于：
(a)天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和低于XTEN的总氨基酸序列的10％；
(b)甲硫氨酸和色氨酸残基的总和低于XTEN的总氨基酸序列的2％；
(c)该XTEN序列具有低于5％的带正电荷的氨基酸残基；
(d)通过GOR算法确定，该XTEN序列具有超过90％的无规卷曲形成；和
(e)通过Chou-Fasman算法确定，该XTEN序列具有少于2％的α螺旋和少于2％的β-折叠。
3.一种分离的延伸重组多肽(XTEN)，包含超过大约400至大约3000个氨基酸残基，其中该XTEN的特征在于：
(a)XTEN序列的至少大约80％由非重叠基序组成，其中每个基序具有大约9至大约14个氨基酸残基，并且其中任两个连续氨基酸残基的序列在每个基序中出现不超过两次；
(b)该基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸组成；和
(c)该XTEN连接到生物活性蛋白质时增强生物活性蛋白质的药代动力学性质，其中该药代动力学性质通过测量生物活性蛋白质的终末半衰期并与连接到该生物活性蛋白质的XTEN相比较来确定。
4.权利要求3的分离的XTEN，其中所述连接到生物活性蛋白质的XTEN在受试者中的终末半衰期是在等同条件下施用的该生物活性蛋白质的至少大约2倍。
5.前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，其中该XTEN当连接到生物活性蛋白质时提高生物活性蛋白质的热稳定性，其中热稳定性通过测量生物活性蛋白质暴露于大约37℃的温度至少大约7天后的生物活性保留并与连接到该生物活性蛋白质的XTEN相比较来确定。
6.权利要求5所述的分离的XTEN，其中在连接到XTEN后，得到的包含生物活性蛋白质和XTEN的融合体保留未连接到XTEN的该生物活性蛋白质的生物活性的至少80％。
7.前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，其中甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)残基的总和占XTEN的总氨基酸序列的超过大约90％。
8.前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，其中没有一种类型的氨基酸占所述XTEN序列的超过30％。
9.前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，包含一种序列，其中没有三个连续氨基酸是相同的，除非该氨基酸为丝氨酸，在此情况下不超过3个连续氨基酸是丝氨酸残基。
10.前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，其中该XTEN序列具有小于10的亚序列得分。
11.前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，其中该XTEN序列的至少大约80％由非重叠基序组成，其中每个基序具有12个氨基酸残基。
12.前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，其中该XTEN序列由非重叠基序组成，其中每个基序具有12个氨基酸残基。
13.前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，其中该XTEN序列的至少大约80％由非重叠基序组成，其中该基序是来自表1的一个或多个序列。
14.一种分离的融合蛋白，包含前述权利要求中任一项所述的分离的XTEN，和生物活性蛋白质，其中该XTEN连接到该生物活性蛋白质。
15.权利要求14的分离的融合蛋白，其中所述生物活性蛋白质显示与选自表3-8的序列有至少90％的序列同一性。
16.权利要求14的分离的融合蛋白，其中该融合蛋白的终末半衰期是未连接到XTEN的生物活性蛋白质的至少大约2倍。
17.权利要求14的分离的融合蛋白，其中该融合蛋白的免疫原性低于未连接到XTEN的生物活性蛋白质，其中该免疫原性通过在向受试者施用等同剂量后测定选择性结合生物活性蛋白质的IgG抗体的产生来确定。
18.权利要求14的分离的融合蛋白，其中该融合蛋白在生理条件显示大于大约6的表观分子量因数。
19.权利要求14的分离的融合蛋白，进一步包含至少第二生物活性蛋白质。
20.权利要求15的分离的融合蛋白，进一步包含至少第二XTEN多肽，其中XTEN氨基酸残基的累计总数大于大约400至大约3000个残基。
21.权利要求14的分离的融合蛋白，其中与以等同方式施用于受试者的未连接到XTEN的生物活性蛋白质相比，该融合蛋白需要较低频率的给药或降低的相当剂量，以在受试者中实现或保持循环血液水平。
22.权利要求14的分离的融合蛋白，其中所述生物活性蛋白质是葡萄糖调节肽。
23.权利要求22的分离的融合蛋白，其中所述葡萄糖调节肽是毒蜥外泌肽-4。
24.权利要求22的分离的融合蛋白，其中所述葡萄糖调节肽是胰高血糖素。
25.权利要求14的分离的融合蛋白，其中所述生物活性蛋白质是代谢蛋白质。
26.权利要求25的分离的融合蛋白，其中所述代谢蛋白质是IL-1ra。
27.权利要求14的分离的融合蛋白，其中所述代谢蛋白质是一种凝血因子。
28.权利要求27的分离的融合蛋白，其中所述凝血因子是因子IX。
29.权利要求27的分离的融合蛋白，其中所述凝血因子是因子VII。
30.权利要求14的分离的融合蛋白，其中所述生物活性蛋白质是生长激素。
31.一种组合物，包含权利要求14-30中任一项所述的分离的融合蛋白和至少一种药学可接受的载体。
32.权利要求31的组合物在制备用于治疗需要的受试者的疾病状态的药物中的用途。
33.权利要求32的用途，其中所述疾病选自1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖症、高血糖症、超高胰岛素血症、胰岛素产生减少、胰岛素抗性、综合征X、食欲过盛、饱感不足、胰高血糖素瘤、血脂异常、视网膜神经变性过程、因子VII缺乏、因子X缺乏、因子XII缺乏、血友病A、血友病B、冯威里氏病、高血压、急性冠脉综合征、类风湿性关节炎、局部缺血后再灌注损伤，生长激素缺乏、Turner综合征、Prader-Willi综合征、特发性身材矮小、AIDS消耗、多发性硬化、克罗恩病、溃疡性结肠炎或肌营养不良症。
34.一种改善生物活性蛋白质的性质的方法，包括将生物活性蛋白质连接到权利要求1-13的XTEN以实现一种性质的步骤，该性质的特征在于：(a)连接到XTEN的生物活性蛋白质的终末半衰期比未连接到XTEN的生物活性蛋白质的终末半衰期长；(b)连接到XTEN的生物活性蛋白质的贮存期比未连接到XTEN的生物活性蛋白质的贮存期长，其中该贮存期根据一定时间间隔后与基线样品相比生物活性的保留来确定；(c)连接到XTEN的生物活性蛋白质在生理条件下的溶解度比未连接到XTEN的生物活性蛋白质的溶解度提高；(d)当施用于受试者时选择性结合连接到XTEN的生物活性蛋白质的IgG抗体的产生比当以相当的剂量向受试者施用未连接到XTEN的生物活性蛋白质时IgG的产生减少；和/或(e)连接到XTEN的生物活性蛋白质当施用于受试者时在治疗窗内经历的时间比未连接到XTEN的生物活性蛋白质施用于受试者时的时间长。
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