CN1329665A

CN1329665A - 具有n末端延伸的葡糖淀粉酶

Info

Publication number: CN1329665A
Application number: CN99814205A
Authority: CN
Inventors: 比贾恩·R·尼尔森; 阿伦·斯文德森; 柯尔斯滕·博杰森; 杰斯珀·文德; 亨里克·佩德森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1999-12-07
Publication date: 2002-01-02
Also published as: WO2000034452A1; EP1137763A1; JP2002531121A; KR20010089885A; AU1648700A; CA2352046A1

Abstract

本发明涉及亲本真菌葡糖淀粉酶的变体,其具有改良的热稳定性。

Description

具有N末端延伸的葡糖淀粉酶

发明领域

本发明涉及亲本葡糖淀粉酶的变体、编码该变体葡糖淀粉酶的DNA序列和利用该变体酶水解淀粉的方法。

更具体而言，本发明涉及改良了热稳定性的葡糖淀粉酶变体。

发明背景

葡糖淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖的非还原末端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由几种丝状真菌和酵母产生，从曲霉属真菌中产生的所述酶在商业上最重要。

在商业上，葡糖淀粉酶被用来将已经被α淀粉酶部分水解的玉米淀粉转变成葡萄糖。葡萄糖异构酶将所述葡萄糖进一步转变成由几乎等量的葡萄糖和果糖组成的混合物。所述混合物，或者进一步富含果糖的混合物，是世界范围内商业最常用的高果糖玉米糖浆。所述糖浆是世界上通过酶加工法制备的最大吨位的产品。涉及将淀粉转变成果糖的三种酶是最重要的工业酶。

葡糖淀粉酶在生产高果糖糖浆的商业应用中，存在的主要问题之一是葡糖淀粉酶相对低的热稳定性。葡糖淀粉酶的热稳定性不如α淀粉酶或葡糖异构酶，并且与α淀粉酶或葡糖异构酶相比，它在较低的pH条件下活性最高且最稳定。因此，它必须在较低的温度和pH条件下在独立的容器中应用。

发明概述

因此，本发明的目的是改良具有葡糖淀粉酶活性的酶的特性，尤其是改良所述酶的热稳定性。

已经意外的发现，通过在酶的N末端连接肽延伸区，有可能显著提高具有葡糖淀粉酶活性的酶的热稳定性。

因此，本发明的第一个方面涉及亲本葡糖淀粉酶的变体，其在N末端具有肽延伸区。

在本文中，术语“肽延伸区”是指将一个或更多的保守氨基酸残基加到所述亲本(成熟)葡糖淀粉酶的N末端。

术语“成熟葡糖淀粉酶”指其传统意思，即指由产生该酶的目的生物进行翻译后加工和分泌后加工(糖基化修饰并且去掉N和/或C末端序列，例如前肽或原肽序列)之后，得到的葡糖淀粉酶的活性形式。更具体而言，指如果存在前肽或原肽序列等氨基酸序列，将其从最初翻译产生的葡糖淀粉酶(即未加工的葡糖淀粉酶)中去除。本定义包括的成熟葡糖淀粉酶是经三肽氨肽酶(TPAP)剪切(加工)的葡糖淀粉酶，所述TPAP在位置3处即Leu和Asp之间剪切黑曲霉葡糖淀粉酶(见SEQ ID NO：1)。

术语“亲本葡糖淀粉酶”指根据本发明待修饰的葡糖淀粉酶。所述亲本葡糖淀粉酶可以是天然产生(野生型)的葡糖淀粉酶，或者可以是通过任何适当方式制备的其变体。例如，亲本葡糖淀粉酶可以是经修饰的天然葡糖淀粉酶的变体，所述修饰是在天然葡糖淀粉酶的氨基酸序列上，通常是在所述葡糖淀粉酶的结构部分中替代、删除或截断一个或更多的氨基酸残基，或者增加或插入一个或更多的氨基酸残基。

本发明的其他方面涉及编码上述葡糖淀粉酶变体的DNA序列、DNA构建体、包括本发明DNA序列的重组表达和携有本发明DNA序列或本发明载体的宿主细胞。

本发明的葡糖淀粉酶变体可以方便用于淀粉转化方法中，因此在另一个方面，本发明涉及将淀粉或部分水解的淀粉转化成含葡萄糖的糖浆的方法，所述方法包括在本发明的葡糖淀粉酶变体存在的条件下，糖化淀粉水解产物的步骤。

在最后一个方面中，本发明提供了通过产生N末端延伸区改良亲本葡糖淀粉酶热稳定性的方法。

本发明的发明者提供了大量的改良了热稳定性的亲本葡糖淀粉酶变体。通过将肽延伸区连接到亲本葡糖淀粉酶可获得所述改良的热稳定性。这在下面将详细叙述。

发明详述

肽延伸区

如上所述，已经意外的发现，当亲本葡糖淀粉酶的N末端能找到适当的肽延伸区时，可以获得葡糖淀粉酶变体，尤其是具有改良的热稳定性的变体。本发明以此发现为基础。

在本文中，“在N末端能找到”意思是成熟的葡糖淀粉酶在N末端具有肽延伸区。在一个实施方案中，所述肽延伸区是所述亲本葡糖淀粉酶固有的，即在翻译后加工去除原肽和/或前肽序列之前存在。因此，所述肽延伸区可以是未加工的亲本葡糖淀粉酶的前肽和/或原肽序列，其在表达和翻译后加工之后通常被除去或剪切掉。

在另一个实施方案中，所述延伸区是一种N末端肽，其等同于供体细胞在加工期间通常被切去的肽序列，例如前肽和/或原肽序列。在大部分情况中，所述肽延伸区不同于所述前肽或原肽序列。这将在下面进一步叙述。

可用本领域已知的任何蛋白工程方法使所述延伸区与N末端连接。

术语“具有改良的热稳定性的葡糖淀粉酶变体”在本发明中是指在温育一定时间之后比相应的亲本葡糖淀粉酶变体具有更高的T_1/2(半衰期)或残留酶活性。热稳定性(例如T_1/2和残留活性)的测定方法，在下面的材料和方法章节中叙述。

术语“适当的肽延伸区”指所用肽延伸区是能够影响上述改良的热稳定性的肽延伸区。通过连接了所述肽延伸区的修饰型葡糖淀粉酶变体与相应亲本葡糖淀粉酶之间热稳定性的比较分析，可以检查所述肽延伸区的“适当性”。例如，通过任何适当的技术，如在本申请中叙述的热稳定性检测方法，可以检测所述热稳定性。

目前认为，肽延伸区提供如改良热稳定性等所需效应的能力依赖于下列特点，例如被修饰的亲本葡糖淀粉酶的特性、所述肽延伸区的结构(包括长度)、肽延伸区对整个葡糖淀粉酶变体的结构的影响、所述肽延伸区的氨基酸的特性或功能等。肽延伸区能够提供所需效应的前提条件当然是包括所述肽延伸区的葡糖淀粉酶变体可以在适当的宿主生物中表达。设计适当肽延伸区时，通常考虑以下几点：

肽延伸区的长度：已经发现氨基酸残基数目各异的肽延伸区能够提供所需作用，因此不可能指定本发明肽延伸区之氨基酸残基的确切数目。考虑根据肽延伸区对所得经修饰之葡糖淀粉酶变体的表达、结构和/或活性的影响，确定氨基酸残基数的上限。

因此所述肽延伸区可以包括1-100个氨基酸残基，优选1-50个氨基酸残基，更优选1-20甚至更优选1-10个氨基酸残基。

稳定性：肽延伸区应当被优先选择的条件是提供具有可接受的稳定性(例如结构稳定性和/或表达稳定性)，或者使得不显著降低葡糖淀粉酶结构稳定性的葡糖淀粉酶变体。虽然认为许多肽延伸区没有给所得葡糖淀粉酶变体提供任何结构不稳定性，但是对肽延伸区的选择可能会受到特定情况，以及特定亲本葡糖淀粉酶(其本身能给修饰型葡糖淀粉酶变体提供结构稳定性)的影响。例如，所述肽延伸区可以增加相互作用的数目，和/或通过在从N末端延伸区到下述的N末端残基之间增加半胱氨酸桥，进行共价结合。

肽延伸区氨基酸残基的特性：

为了改进N末端残基和N末端延伸区之间的相互作用，所述残基应当优选不易形成α螺旋的残基，并因此在本发明中应用。这能够通过下述事实进行合理解释，即如果N-末端的α螺旋向N末端延伸，那么它将伸出结构之外而不与N末端残基接触。本发明的肽延伸区包括通过改良N末端残基和N末端延伸区之间的接触而改良了稳定性的那些。在给定的N末端延伸区之内，残基的主要部分必须选自不形成螺旋的基因。考虑通过利用在螺旋的N末端、和/或螺旋的中间和/或螺旋的C末端部分中具有更低的或相同的α螺旋形成倾向的残基，可使N末端残基和N末端延伸区之间的接触得到最佳改进。当将延伸区放置于葡糖淀粉酶中天然α螺旋的N末端部分时，优选α螺旋的N末端倾向性更低的残基。下述残基可以在本发明中用作非α螺旋形成者残基，即M(甲硫氨酸)、K(赖氨酸)、H(组胺酸)、V(缬氨酸)、I(异亮氨酸)、Y(酪氨酸)、C(半胱氨酸)、F(苯丙氨酸)、T(苏氨酸)、G(甘氨酸)、N(天冬酰胺)、P(脯氨酸)、S(丝氨酸)和D(天冬氨酸)。

在本发明中“N末端残基”指N末端残基附近的残基，它们离N末端残基的中心18、12和/或8的范围内，并且不是所述N末端延伸区的一部分。更优选延伸区在10之内但在酶表面上，其为用Connelly水可接近性表达程序((1988年10月版)，参考W.Kabsch和C.Sander，生物多聚体22(1983)pp.2577-2637)所定义的具有可接近性所需数目的残基。

“不形成螺旋的残基”在此由(蛋白质：Creighton T.E.(1983))中表6.5定义，在该表中叙述了不同氨基酸残基的不同倾向性。

或者，通过在本发明的葡糖淀粉酶中引入半胱氨酸桥，可以改良结构稳定性。例如，如果肽延伸区的至少一个氨基酸残基是半胱氨酸残基，其位置致使其能够与葡糖淀粉酶变体之成熟部分中的半胱氨酸残基形成共价结合，那么可以在所述肽延伸区和葡糖淀粉酶变体的成熟部分之间建立半胱氨酸桥。在实施例3中举例说明了引入半胱氨酸桥的积极作用。如果在成熟的葡糖淀粉酶中没有合适的半胱氨酸，通过置换亲本葡糖淀粉酶中被认为对于活性不重要的氨基酸，在所述亲本葡糖淀粉酶的适当位置上可以方便地插入半胱氨酸。

通常，可以将本发明中包含半胱氨酸残基的肽延伸区的氨基酸序列用下式表示：

X-C-X_(n)

其中X各代表一个氨基酸，优选上述不形成α螺旋的氨基酸，更优选具有短侧链的氨基酸。

在Cys的C末端侧和经加工的天然N末端之间，X残基的数目可以是大于或等于5的任何数(n)，优选5到100，更优选5到10，更优选5。

实例有：

ACGPSTS(SEQ ID NO：25)

ACPGTST(SEQ ID NO：26)

ACGTGTS(SEQ ID NO：27)

ACTGSTG(SEQ ID NO：28)

ACGPSTSG(SEQ ID NO：29)

ACPGTSTG(SEQ ID NO：30)

ACGTGTSS(SEQ ID NO：31)

ACTGSTGT(SEQ ID NO：32)

葡糖淀粉酶(如黑曲霉G1或G2 AMG)的天然原肽被kex2样蛋白酶(二元蛋白酶)切割。因此，kex2蛋白酶是能够切割kex2或kex2样位点的蛋白酶。Kex2位点(如见酶学方法，185卷，D.Goeddel主编，Aacademic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，“基因表达技术”)，kex2样位点是在一些蛋白的原肽编码区和成熟区发现的二元识别位点(即切割位点)。

在此切割位点突变可以保持N末端原肽的完整。

实例：

NVIPPR(SEQ ID NO：33)

NPPIRP(SEQ ID NO：34)

NVIPRP(SEQ ID NO：35)

另一个可能性是在选择用来表达葡糖淀粉酶基因的宿主中，删除或灭活kex2样蛋白酶编码基因。这也可以保持N末端肽延伸区的完整。

在用于表达的目的宿主中，也可以删除或灭活其它编码涉及N末端加工的蛋白酶的基因，如三肽氨肽酶编码基因。

半胱氨酸变体的N末端残基是指N末端残基附近的残基，即在离N末端残基的中心18、12和/或8的范围内，并且其不是所述N末端延伸区的一部分。通常，可以将本发明中包含半胱氨酸残基的肽延伸区的氨基酸序列表示为：X-C-X-X-X-X-X，其中X各代表一个上述不形成α螺旋的氨基酸。

在一个具体的实施方案中，所述葡糖淀粉酶变体包括肽延伸区，其能够与亲本葡糖淀粉酶的成熟部分形成共价结合。在另一个具体实施方案中，所述葡糖淀粉酶变体在肽延伸区中包括一个或更多的半胱氨酸残基，并且在所述亲本葡糖淀粉酶的成熟部分中包括一个半胱氨酸残基，而且所述的半胱氨酸残基可以共同形成半胱氨酸桥。在另一个具体实施方案中，所述亲本葡糖淀粉酶的成熟部分中的半胱氨酸残基被亲本葡糖淀粉酶的氨基酸残基插入，或取代。在最优选的具体实施方案中，用半胱氨酸残基替代了黑曲霉G1葡糖淀粉酶氨基酸序列的375位上的天冬氨酸残基、或299位上的谷氨酸残基、或431位上的丝氨酸残基、或471位上的丙氨酸残基、或479位上的丙氨酸残基、或480位上的苏氨酸、或481位上的脯氨酸残基、或8位上的丝氨酸残基。

具体地，与亲本葡糖淀粉酶连接的肽延伸区优选下述延伸区之一：

Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg(NVISRR)，或

Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg(NVIPKR)，或

Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ASPPSTS)，或

Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ACPPSTS)，或

Pro-Cys-Ser-Ala-G1y-Glu(PCSAGE)，或

Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp(PLALSD)，或

Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu(LGVTGE)，或

Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu(AGPLPSE)，或

Leu-Gly-Pro-Asp(LGPD)，或

Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg(IFELTPR)，或

Ile-Ser-Asn(ISN)，或

Met-Asn(MN)。

在本文中，三肽氨肽酶(TPAP)是指从肽或蛋白序列(例如原激素或原酶中延伸的氨基酸序列)的N末端切割三肽的氨肽酶。当三肽氨肽酶(TPAP)从肽、寡核苷酸或蛋白质的未被替代的N末端中切割三肽片段时，有时会导致稳定性降低。更具体而言，三肽氨肽酶对N末端的切割可降低葡糖淀粉酶的稳定性。因此，本发明还涉及一种亲本葡糖淀粉酶的变体，其中所述肽延伸区能够阻止三肽氨肽酶(TPAP)切割所述葡糖淀粉酶。

将肽延伸区与亲本葡糖淀粉酶连接的方法

虽然通过将合成的肽延伸区加入(融合或插入)讨论的所述亲本葡糖淀粉酶中，可以获得本发明的变体，目前优选通过下述方法制备本发明的葡糖淀粉酶变体：i)修饰编码所述亲本葡糖淀粉酶的核苷酸序列(优选DNA序列)，使其编码应用于所述亲本葡糖淀粉酶N末端的肽延伸区(例如，在编码亲本葡糖淀粉酶的核酸序列(优选DNA序列)的相关位置上，插入编码所述肽延伸区的核酸序列(优选DNA序列))，ii)在适当的表达系统中表达所得经修饰的核酸(优选DNA)序列，iii)回收产生的葡糖淀粉酶变体。

在本文中，术语“连接在”是指所述延伸区与成熟葡糖淀粉酶的N末端(例如最后一个氨基酸残基)融合。

许多葡糖淀粉酶表达为“前原葡糖淀粉酶”，即由成熟葡糖淀粉酶、分泌信号肽(即前肽)和原肽组成的葡糖淀粉酶。所述前原葡糖淀粉酶在细胞内进行加工，以分泌入发酵培养基中，从此培养基中可以分离并纯化成熟的葡糖淀粉酶。通过将编码所需肽延伸区的核酸序列连接到编码所述亲本葡糖淀粉酶的DNA序列的上游(指N末端肽延伸区)，可以实现给所述亲本葡糖淀粉酶加入肽延伸区。

所述的插入应该以这样的方式进行，其致使所需葡糖淀粉酶变体(即具有所需肽延伸区)转录、翻译、加工之后，被宿主细胞表达和分泌。在本文中术语“加工”是指去除前肽和原肽(当然，当原肽与所需肽延伸区相同时例外。这在下面将进一步涉及。)

在大部分情况中，通过在编码原肽或前肽(如果不存在原肽序列)的DNA序列和编码成熟葡糖淀粉酶的DNA序列之间插入编码肽延伸区的DNA序列，延伸所述亲本葡糖淀粉酶是可能的。

编码肽延伸区DNA序列的插入/加入可以用分子生物领域技术人员熟知的任何技术(例如，Sambrook等，1989)完成。例如，所述技术包括应用特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)，如在美国专利4683202或RK.Saiki等，(1988)，科学，239，487-491所述。下面将叙述如何表达和分泌邻近DNA序列。

虽然为制备本发明的葡糖淀粉酶变体选择适当表达系统时(尤其是当将经修饰的DNA用于制备时)必须小心注意，已经发现通过下述方法可以获得根据本发明的葡糖淀粉酶变体，即通过在表达系统中表达编码目的亲本葡糖淀粉酶的DNA序列，所述表达系统不能以正常方式加工所翻译的多肽并因此导致产生下述葡糖淀粉酶，其包括部分或全部原肽，或者包括相关于成熟肽加工前的类似肽序列。此时，所述原肽或类似肽序列组成肽延伸区。原肽或类似肽序列可以与亲本葡糖淀粉酶异源或同源，并且可能在亲本葡糖淀粉酶的N末端出现。利用后一种技术生产据本发明葡糖淀粉酶变体的方法见下文。

因此，如果一段适当长度的氨基酸序列已经编码在亲本葡糖淀粉酶的前肽形式中，并且此段氨基酸序列在葡糖淀粉酶加工-过程中被指定的表达系统剪切，那么可以通过将所述表达的宿主系统变为不能对所述氨基酸序列进行所述加工的系统，来应用所述肽延伸区。在这种情况中，分泌信号前肽将在分泌期间或其后被剪切，最终得到经修饰的葡糖淀粉酶，其由包括原肽或其一部分或相应DNA序列编码的相似肽序列的亲本葡糖淀粉酶组成，即葡糖淀粉酶在N末端被延伸。

已经发现酵母细胞对在亲本真菌葡糖淀粉酶尤其是黑曲霉葡糖淀粉酶中应用肽延伸区(以原肽或其一部分的形式)有特殊用途。

在一个高度优选的实施方案中，根据下述原则以随机诱变的方式设计并应用肽延伸区：

a)对编码具有肽延伸区的亲本葡糖淀粉酶的DNA序列在所述亲本葡糖淀粉酶的肽延伸区或N末端进行定域随机诱变，

b)在宿主细胞中表达在步骤a)中获得的突变DNA序列，

c)筛选表达突变型葡糖淀粉酶的宿主细胞，所述突变葡糖淀粉酶与亲本葡糖淀粉酶相比具有改良的效果。

通过这种方法产生了大量高度有利的肽附加区。

可以基本上按WO95/22615中叙述的方法进行定域随机诱变。更具体而言，在使仅仅一个或更多上述区域产生诱变的条件下，进行诱变。尤其对于诱变大的肽延伸区，可涉及PCR诱变(例如，Deshler1992或Leung等，1989中所述)，其中应用一个或更多的适当的寡核苷酸探针，所述探针在被诱变区域的旁侧。对于较短的肽延伸区的诱变，更优选通过应用掺入的寡核苷酸进行定域随机诱变。所述掺入用来避免不想要的氨基酸残基的密码子或用来增加在所需位点引入特殊类型氨基酸的可能性，如带正电荷或疏水性氨基酸残基。

诱变之后，通过在允许表达发生的条件下，培养携带所述DNA序列的适当宿主细胞，表达突变DNA。用于此目的的宿主细胞可以是已用所述任选在载体上的突变DNA序列转化的细胞，或者是在诱变处理期间携带编码亲本酶的DNA序列的细胞。合适的宿主细胞的实例在下面给出，并且优选能分泌突变酶的宿主细胞(以简化筛选)。已经发现酵母细胞，例如酿酒酵母的细胞是合适的宿主细胞。

亲本葡糖淀粉酶

根据本发明考虑的亲本葡糖淀粉酶包括真菌葡糖淀粉酶，尤其是从曲霉菌菌株中获得的真菌葡糖淀粉酶，例如黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶和其变体或突变体、同源葡糖淀粉酶、在结构上和/或功能上与SEQ ID NO：1相似的其它葡糖淀粉酶。尤其黑曲霉葡糖淀粉酶G1和G2，见Boel等，(1984)，“用两种不同但密切相关的mRNAs合成黑曲霉的葡糖淀粉酶G1和G2”，EMBO J3(5)，p.1097-1102。所述G2葡糖淀粉酶在SEQ ID NO：1中给出。

可商购的亲本葡糖淀粉酶

可商购的亲本葡糖淀粉酶包括Novo Nordisk的AMG，还有美国Genencor Inc和荷兰代夫特Gist-Brocades公司的葡糖淀粉酶。

亲本同源性葡糖淀粉酶

根据两个蛋白序列之间的相似程度确定所述亲本葡糖淀粉酶的同源性，表明第一个序列从第二个序列中衍生。利用在本领域中已知的计算机程序例如在GCG软件包中提供的GAP(Wisconsin软件包的程序手册，8版，1994年8月，遗传学计算机组，575 Scienee Drive，Madison，Wisconsin，美国，53711)(Needleman S.B和WunschC.D.，(1970)分子生物学杂志，48，p.443-453)，可以适当地确定所述同源性。利用GAP及以下设置进行多肽序列的比较：GAP产生罚分3.0和GAP延伸罚分0.1，显示由本发明的类似DNA序列编码之多肽的成熟部分与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的成熟部分的同一性程度优选至少为80％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，最优选至少99％。

在一个优选的实施方案中，在约60-80℃(优选63-73℃)和pH4-5(优选4.2-4.7)的条件下，利用麦芽糖糊精作为底物，本发明的变体的热稳定性提高。

在另一个优选实施方案中，所述亲本同源性葡糖淀粉酶包括微生物的葡糖淀粉酶。在更优选的实施方案中，所述微生物包括真细菌、古细菌、真菌、藻类和原生动物，在另一个更优选的实施方案中，亲本同源性葡糖淀粉酶来源于丝状真菌。

在高度优选的实施方案中，所述亲本同源性葡糖淀粉酶是黑曲霉G1葡糖淀粉酶(Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)，p.1079-1102)。所述亲本葡糖淀粉酶可以是被截短的葡糖淀粉酶。

制备葡糖淀粉酶变体的方法

用于向基因中引入突变的几种方法在本领域中已经熟知。在简要讨论编码葡糖淀粉酶的DNA序列的克隆之后，将讨论在葡糖淀粉酶编码序列中特定位点引入突变的方法。

克隆编码葡糖淀粉酶的DNA序列

可使用本领域众所周知的多种方法，从产生目的葡糖淀粉酶的任何细胞或微生物中分离编码亲本葡糖淀粉酶的DNA序列。首先，从可产生目的酶的生物获得染色体DNA或信使RNA，从中构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果所述葡糖淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成标记的寡核苷酸探针，使用该探针从所述生物的基因组文库中鉴定出编码葡糖淀粉酶的克隆。或者，可使标记的寡核苷酸探针包含同源于另一已知的葡糖淀粉酶基因的序列，用该探针通过较低严紧度的杂交和洗涤条件鉴定出编码葡糖淀粉酶的克隆。

鉴定葡糖淀粉酶编码克隆的另一种方法包括将基因组DNA片段插入表达载体如质粒中，用所得基因组DNA文库转化葡糖淀粉酶-阴性细菌，然后将转化的细菌铺于含有葡糖淀粉酶底物(即麦芽糖)的琼脂上，从而鉴定出表达葡糖淀粉酶的克隆。

或者，可以通过现有标准方法，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，四面体通讯22，1859-1869页所述的膦酰胺法或者Matthes等，(1984)，EMBOJ.3，801-805页所述的方法，人工合成编码所述葡糖淀粉酶的DNA序列。在膦酰胺法中，寡核苷酸在自动DNA合成仪中合成，纯化，退火，连接并克隆至适当载体中。最后，DNA序列可以是根据标准技术，通过连接人工合成的，基因组的或cDNA来源的片段(适当时，这些片段对应于完整DNA序列的多个部分)而制备的基因组DNA与合成的DNA的混合序列，合成DNA与cDNA来源的DNA的混合序列，或基因组DNA与cDNA来源的DNA的混合序列。也可按US4,683,202或R.K.Saiki等，(1988)，科学239，1988，487-491页所述，使用特异性引物，通过聚合酶链反应(PCR)制备DNA序列。

在与诱变剂温育或接触之后，在允许表达发生的条件下，通过培养携带所述DNA序列的适当宿主细胞，可表达突变的DNA。用于此目的的宿主细胞可以是已用所述任选在载体上的突变DNA序列转化的细胞，或者是在诱变处理期间携带编码亲本葡糖淀粉酶的DNA序列的细胞。合适的宿主细胞的实例如下：革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌或淡紫青链霉菌或鼠灰链霉菌；和革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。所述突变DNA序列可以进一步包括编码能使突变的DNA序列表达的DNA序列。

定点诱变

一旦分离了编码葡糖淀粉酶的DNA序列并且鉴定了所需突变位点，可以利用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包括在所需突变位点旁侧的核苷酸序列。在具体方法中，在携带葡糖淀粉酶基因的载体中，使编码葡糖淀粉酶基因的DNA产生一个单链缺口。然后，将含有所需突变的合成的核苷酸与该单链DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶I(Klenow片段)将剩余的缺口补齐，并且用T4连接酶连接构建体。在Morinaga等，(1984)，生物技术2，p.646-639中叙述了所述方法的具体实例。美国4760025公开了通过对表达盒的轻微修改，引入编码多突变的寡核苷酸。然而，通过Morinaga法一次可以引入更多的突变，因为大量的长度各异的寡核苷酸可被引入。

在Nelson和Long，(1989)，分析生物化学，180，p.147-151中叙述了用于向编码萄糖淀粉酶的DNA序列中引入突变的另一个方法。其包括PCR片段的三步生成，所述PCR片段包括所需的突变，通过在PCR反应中将化学合成的DNA链用作为引物之一来引入所述突变。通过用限制性内切酶切割的方法，可以从产生的PCR片段中分离携带突变的DNA片段，并且再克隆到表达质粒上。

另外，Sierks等，(1989)“泡盛曲霉葡糖淀粉酶的活性位点TrP120处的定点诱变”，蛋白质工程，2，621-625；Sierks等，(1990)，“通过诱变泡盛曲霉葡糖淀粉酶的Asp176，Glu179和Glu180确定的真菌葡糖淀粉酶催化机理”，蛋白质工程，卷3，193-198也描述了曲霉属葡糖淀粉酶中的定点诱变。

随机诱变

优选对可译为所示目的氨基酸序列的基因中至少三个部分或整个基因进行适当的定域随机诱变或区域特异性随机诱变。对编码亲本葡糖淀粉酶之DNA序列的随机诱变可通过本领域已知的任何方法方便地进行。相应地，本发明进一步涉及制备亲本葡糖淀粉酶变体的方法，其中相对于所述亲本，所述变体显示增加的热稳定性，此方法包括：

(a)对编码亲本葡糖淀粉酶的DNA序列进行随机诱变，

(b)在宿主细胞中表达在步骤(a)中获得的突变DNA序列，并且

(c)筛选表达葡糖淀粉酶变体的宿主细胞，所述葡糖淀粉酶变体相对于亲本葡糖淀粉酶具有改变的特性(即热热稳定性)。

本发明上述方法的步骤(a)优选用掺入型引物进行，与下文工作实例(见下)一样。例如，利用适当的物理或化学诱变剂、利用适当的寡核苷酸、或通过对所述DNA序列进行PCR诱变，可以进行随机诱变。而且，可以利用这些诱变剂的任意组合进行随机诱变。诱变剂可以是诱导转换、颠换、倒位、转频、缺失和/或插入的诱变剂。适合于本发明目的的物理或化学诱变的实例包括紫外(UV)照射、羟胺、N-甲基-N-氮-N-亚硝基胍(MNNG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。在应用这些试剂时，通常在适于诱变发生的条件下在有所选诱变剂存在的条件下，通过温育编码将要诱变的所述亲本酶的DNA序列来进行诱变，并且筛选具有所需特性的突变DNA。当应用寡核苷酸进行诱变时，在合成寡核苷酸期间，可在所述寡核苷酸将要改变的位点上掺入三个非亲本核苷酸。进行掺入，目的是避免不需要的氨基酸的密码子。利用公开的技术，例如PCR、LCR或认为适当的任何DNA聚合酶和连接酶，可以将所述掺入型寡核苷酸掺入到编码葡糖淀粉酶的DNA中。优选用“恒定随机掺入”进行掺入，其中每个位点上的野生型和突变的百分率被预先定义。而且，所述的掺入可以指导特定核的优先引入，并且由此优先引入一个或更多特定氨基酸残基。例如，所述的掺入可以被如此进行，以便使得在每个位点上引入90％的野生型和10％的突变型。在选择掺入方案时的另一考虑是基于遗传学以及蛋白结构的限制。可以通过利用DOPE程序制定所述掺入方案，所述DOPE程序尤其可确保避免掺入终止密码子。当应用PCR诱变时，在增加核苷酸错误掺入的条件下，对化学处理的或非化学处理的编码亲本葡糖淀粉酶的基因进行PCR(Deshler1992；Leung等，技术，第1卷，1989，11-15页)。大肠杆菌突变者菌株(Fowler等，分子普通遗传学，133：1974，PP.179-191)、酿酒酵母、或任何其他微生物的突变体可以被用于编码葡糖淀粉酶的DNA的随机诱变，例如通过用含有所述亲本葡糖淀粉酶的质粒转化突变菌株，培养带有所述质粒的突变菌并且从所述突变菌中分离突变质粒。随后用所述突变质粒转化表达型生物。被诱变的DNA序列可以方便的呈现于从表达亲本葡糖淀粉酶的生物中制备的基因组或cDAN文库中。或者，所述DNA序列可以出现在适当的载体上，例如质粒或噬菌体，将这样的载体与诱变剂温育或暴露于诱变剂。通过整合到宿主细胞的基因组或通过存在于宿主细胞含有的载体上，也可以将待诱变的DNA呈现于宿主细胞中。最后，待诱变的DNA可以是分离的形式。应该明白进行随机诱变的DNA序列优选cDNA或基因组DNA序列。在一些情况中，在进行表达步骤b)或筛选步骤c)之前，先扩增所述突变DNA序列较为有利。这类扩增可用本领域已知的方法实施，优选根据亲本酶的DNA或氨基酸序列制备寡核苷酸引物，用其进行PCR扩增。在与诱变剂温育或暴露之后，在允许表达发生的条件下，通过培养携带所述DNA序列的适当宿主细胞，可表达突变DNA。用于此目的的所述宿主细胞可以是用所述任选在载体上的突变DNA序列转化的细胞，或者是在诱变处理期间携带编码亲本葡糖淀粉酶的DNA序列的细胞。合适的宿主细胞的实例如下：革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌或淡紫青链霉菌或鼠灰链霉菌；和革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。所述突变DNA序列可以进一步包括编码能使突变的DNA序列表达的DNA序列。

定域随机诱变

所述随机诱变可方便的定位于目的亲本葡糖淀粉酶的一个部分中。例如当鉴定了酶的某些区域对酶的指定特性非常重要时，以及当预计修饰后可以获得具有改良特性的变体时，进行随机诱变可能有益。当阐明了所述亲本酶的三级结构并且其与所述酶的功能有关时，通常可以鉴定出这样的区域。

利用上述PCR诱变技术或任何本领域已知的适当技术，可以方便地进行定域诱变或区域特异性诱变。或者，例如通过插入到适当地载体，可以分离到编码DNA序列中待修饰部分的DNA序列，并且随后可利用任何上述诱变方法对所述部分进行诱变。

葡糖淀粉酶变体的表达

根据本发明，可以使用表达载体，以酶的形式表达编码所述变体的DNA序列，所述变体是通过上述方法或通过本领域已知的任何其它方法产生的，所述表达载体一般包括编码启动子，操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号的控制序列，并任选包括阻抑蛋白基因或多种激活子基因。

表达载体

携有编码本发明葡糖淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于待导入载体的宿主细胞。载体可以是当导入宿主细胞时能整合至宿主细胞基因组，并能随整合有该载体的染色体一起复制的载体。适当表达载体的例子包括pMT838。

启动子

在载体中，DNA序列应该与适当启动子序列可操作相连。启动子可以是在所选宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，启动子可得自编码蛋白质的基因，所述蛋白质可以与宿主细胞同源或异源。

介导编码本发明葡糖淀粉酶变体的DNA序列的转录，尤其是在细菌宿主中的转录的适当启动子有：大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因的dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖的淀粉酶基因(amyM)的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。为了在真菌宿主中转录，有用的启动子有：得自编码米曲霉TAKA淀粉酶的基因的启动子，酿酒酵母TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Alber等，(1982)，J.Mo1.Appl.Genet 1，p.419-434)，和米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的启动子。

表达载体

本发明的表达载体也可含有适当的转录终止子，在真核生物中，所述载体还含有聚腺苷酸化序列，该序列与编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列可操作相连。终止序列和聚腺苷酸化序列优选与启动子有相同的来源。

载体也可进一步含有能使该载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。所述序列的例子是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体也可以含有选择标记，例如产生可补偿宿主细胞缺陷的产物的基因，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者能赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性。另外，载体也可含有曲霉属的选择标记，如amdS，argB，niaD和sC，产生潮霉素抗性的一种标记，或可通过WO91/17243所述的共转化完成选择。

用于分别连接编码酶变体的本发明DNA构建体，启动子，终止子和其它元件的方法，和用于将它们插入含有复制所需信息的适当载体的方法是本领域技术人员众所周知的(例见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，1989)。

宿主细胞

含有如上所述的本发明DNA构建体或表达载体的本发明细胞，可以有利地用作重组生产本发明葡糖淀粉酶变体的宿主细胞。通过将编码所述变体的本发明DNA构建体(一个或多个拷贝)整合至宿主染色体，可以方便地转化细胞。一般认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定维持。可以根据常规方法，例如通过同源或异源重组将DNA构建体整合至宿主染色体。或者，可以用与不同类型的宿主细胞有关的上述表达载体转化细胞。

本发明的细胞可以是高等生物的细胞，例如哺乳动物或昆虫的细胞，但也可以是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。

适当细菌的例子是革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌或淡紫青链霉菌或鼠灰链霉菌，或者革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。可通过原生质体转化，或通过使用感受态细胞以本身已知的方法转化细菌。

酵母优选糖酵母属或裂殖糖酵母属的种，例如酿酒酵母。

宿主细胞也可以是丝状真菌，例如曲霉属的菌株，如米曲霉或黑曲霉，或镰孢属的菌株，如尖孢镰孢，禾谷镰孢(最佳状态称为玉米赤霉，以前被称为Sphaeria zeae，与Gibberella roseum和Gibberella roseumf.sp.cerealis是同义词)，或硫色镰孢(最佳状态称为虱状赤霉，与Fusarium trichothecioides，杆孢状镰孢，接骨木镰孢，玫瑰色镰孢和玫瑰色镰孢禾谷变种是同义词)，Fusarium cerealis(与Fusarium crokkwellnse是同义词)，或Fusariumvenenatum。

在本发明的一个优选实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺损的蛋白酶阴性菌株。

例如，宿主细胞可以是蛋白酶缺损的米曲霉菌株JaL125，其碱性蛋白酶基因(被称为“alp”)缺失。该菌株描述于WO97/35956(Novo Nordisk)。

可通过形成原生质体，转化原生质体，接着以其原有方式再生细胞壁，而转化丝状真菌细胞。曲霉属作为宿主微生物的用途描述于EP238023(Novo Nordisk A/S)，其内容列入本文作为参考。

产生本发明酶变体的方法

在另一方面，本发明涉及产生本发明葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括在适于产生所述变体的条件下培养宿主细胞，和从细胞和/或培养物中回收所述变体。

用于培养所述细胞的培养基可以是适于培养目的宿主细胞并表达本发明葡糖淀粉酶变体的任何常规培养基。适当的培养基可以商购，或可根据公开的配方(例如描述于美国典型培养物保藏中心目录中的配方)制备。

可通过众所周知的方法从培养基中方便地回收宿主细胞分泌的葡糖淀粉酶变体，所述方法包括通过离心或过滤使细胞与培养基分开，利用盐(如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质组分，接着使用层析法，如离子交换层析，亲和层析等。

淀粉转化

本发明提供了用本发明的葡糖淀粉酶变体从淀粉中生产葡萄糖的方法。总之，该方法包括如下步骤，即有α淀粉酶时部分水解前体淀粉，然后在葡糖淀粉酶存在的条件下，通过切割α-(1→4)和α-(1→6)糖苷键，从淀粉或相关的寡糖和多糖的非还原末端进一步水解释放D葡萄糖。

利用α淀粉酶部分水解前体淀粉，因水解内部α-(1→4)连接而初步裂解淀粉分子。在商业应用中，所述初步水解用α淀粉酶在约105℃条件下进行。很高浓度的淀粉被加工，通常30％-40％为固体。所述初步水解在此高温下通常进行5分钟。然后将部分水解的淀粉转入第二个罐子中，并且在85-90℃温育大约1小时，得到葡萄糖当量(D.E.)为10-15。

在葡糖淀粉酶存在的条件下从淀粉或相关的寡糖和多糖的非还原末端进一步水解释放D葡萄糖的步骤，一般在降低的温度条件下，即在30℃到60℃之间，在单独的罐子中进行。底物液体的温度优选降至55-60℃之间。溶液的pH值范围从6-6.5降到3-5.5之间。溶液的pH值优选4-4.5。将葡糖淀粉酶加入该溶液，并且反应24-72小时，优选36-48小时。

通过利用本发明的热稳定性葡糖淀粉酶，可以在比传统的批量糖化法更高的温度下进行糖化。根据本发明，糖化可以在上述60-80℃的温度范围内进行，优选63-75℃。这对传统的批量方法(见上述)和连续糖化法均适用。

事实上，包括一步或多步膜分离步骤(即过滤步骤)的连续糖化法必须在60℃以上的温度条件下进行，以便能维持膜的很高流通量，或将微生物污染降低到最低。因此本发明的热稳定变体提供了在工业规模的糖化操作可接受的时间段之内，在合理的价格和/或更低的酶蛋白用量下进行大规模连续糖化操作的可能性。根据本发明，糖化时间甚至可缩短。

本发明的葡糖淀粉酶变体(例如AMG变体)通常在60-80℃时比传统在30-60℃时的活性更高。因此通过升高葡糖淀粉酶的工作温度，可使糖化在更短的时间内完成。

而且，通过改良热稳定性，T_1/2(在“材料和方法”章节中定义的半衰期)被改良。因为本发明的葡糖淀粉酶变体的热稳定性被改良，在糖化期间仅需要加入较少量的葡糖淀粉酶来替代被灭活的葡糖淀粉酶。在根据本发明的糖化期间，更多的葡糖淀粉酶保持活性。而且，当在63℃以上糖化时，发生微生物污染的危险性也降低了。

可用本发明葡糖淀粉酶变体进行的糖化方法有JP3-224493、JP1-191693、JP62-272987和EP 452238所述方法。

本发明的葡糖淀粉酶变体可以与仅水解含至少四个糖基的分子中α-(1→6)糖苷键的酶联合用于本发明方法。本发明的葡糖淀粉酶变体优选与支链淀粉酶或异淀粉酶联合应用。异淀粉酶和支链淀粉酶的脱支链应用、这些酶的分子特性、以及这些酶与葡糖淀粉酶联合的潜在应用见G.M.A.vanBeynum等，淀粉转化技术，Marcel Dekker，纽约，1985，101-142。

本发明另一方面涉及本发明葡糖淀粉酶变体在淀粉转化过程中的应用。

此外，本发明的葡糖淀粉酶变体可以用于包括连续糖化步骤的连续淀粉转化过程中。

本发明的葡糖淀粉酶变体还可以以固定化形式使用。这适合于并且经常用于生产专用(speciality)糖浆，例如麦芽糖糖浆，还可用于与果糖糖浆的生产有关的寡糖残液流。

本发明的葡糖淀粉酶还可以用于作为燃料或饮料的酒精的生产过程中，或者可以用于生产柠檬酸、抗坏血酸、赖氨酸和谷氨酸等有机化合物的发酵过程中。

最后，本发明还涉及改良亲本葡糖淀粉酶的热稳定性的方法，其为在N末端产生延伸区。在一重要实施方案中，所述延伸区包括肽延伸区。

材料和方法

材料：

酶：AMGG1：黑曲霉葡糖淀粉酶G1公开于Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)，1079-1102，得自NovoNordisk。AMGG2：截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G1，见SEQ ID NO：1中所示，得自Novo Nordisk。

宿主细胞

米曲霉JaL125：米曲霉IFO4177，得自发酵研究所，Osaka；17-25 JusoHammachi 2’-Chome Yodogawa-ku，Osaka，日本，通过一步基因置换方法(见G.May，“丝状真菌的应用分子遗传学”(1992)，p.1-25，J.R.Kinghorn和G.Tumer编；Blackie Academic and Professional)删除了其命名为“alp”的碱性蛋白酶基因(见Murakami K等，(1991)，农业生物化学.55，p.2807-2811)，利用米曲霉pryG基因作为标记物。JaL125菌株在WO97/35956(NovoNordisk)中被进一步公开。

微生物

菌株：酿酒酵母YNG318：MATαleu2-Δ2 ura3-52 his4-539 pep4-Δ1[cir⁺]。

质粒：

pLaC103：编码截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G2.pJSO026的质粒：(酿酒表达质粒)(J.S.Okkels，(1996)“pYES载体中URA3-启动子缺失可提高酿酒酵母中真菌脂肪酶的表达水平。重组DNA生物技术III：生物和工程科学的结合，Annals of the New York Academy of Sciences的782卷”)。更具体而言，通过用酿酒酵母中组成型表达的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子取代pYES2.0的诱导型GAL1启动子(Albert和Karwasaki，(1982)，J Mol.Appl.Genet.，1，419-434)，并删除URA3启动子的一部分，可从pYES2.0衍生出表达质粒pJSO026。

方法

酿酒酵母YNG318的转化

将DNA片段和打开的载体混合，并且通过标准方法将其转入酿酒酵母YNG318中。

AGU活性的确定：

一个Novo淀粉葡萄糖苷酶单位(AGU)定义为在下述条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖所需的酶量：

底物………………麦芽糖

温度……………………25℃

pH……………………4.3(醋酸缓冲液)

反应时间………………30分钟

可以索要分析方法(AF22)的详细叙述。

米曲霉的转化(常规方法)

用米曲霉的孢子接种100ml YPD(Sherman等，(1981)，酵母遗传学方法，冷泉港实验室)，摇菌培养约24小时。通过miracloth过滤，收获菌丝体，并且用200ml 0.6M MgSO₄洗涤。将菌丝体重悬于15ml 1.2M MgSO₄，10mMNaH₂PO₄，pH5.8。在冰上冷却悬浮液，并加入1ml含120mg Novozym^TM234的缓冲液。5分钟之后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma Type H25)，37℃轻微搅拌培养，连续1.5-2.5小时，直到在显微镜下观察到样品中有大量的原生质体。

通过miracloth过滤所述悬浮液，将过滤液转到无菌的试管中，并且用5ml含0.6山梨醇、pH7.0的100mM Tris-HCl溶液覆盖。1000g离心15分钟，收集MgSO₄层顶层的原生质体。向原生质体悬浮液中加入2倍体积的STC(1.2M山梨醇，pH7.5的10mM Tris-HCl、10mM CaCl₂)，并将混合物1000g离心5分钟。将原生质体沉淀重悬于3ml STC中，并再离心沉淀。重复此过程。最后，将原生质体重悬于0.2-1ml STC中。

用5-25μg溶于10μl STC的p3SR2(携带构巢曲霉amdS基因的质粒，见Hynes等，分子和细胞生物学，第3卷第8期，1430-1439，1983年8月)混合100μl原生质体悬浮液。将所述混合物在室温下放置25分钟，加入0.2ml含60％PEG 4000(BDH29576)、10mM CaCl₂和pH7.5 10mM Tris-HCl的溶液，小心地进行混合(两次)，最后加入0.85ml相同的溶液并小心地进行混合。将所述混合物在室温下放置25分钟，2500g离心15分钟，并将沉淀重悬于2ml 1.2M山梨醇中。再一次沉淀之后，将原生质体涂于基本培养板，所述基本培养板含有1.0M蔗糖和作为氮源的pH7.0 10mM乙酰胺和用来抑制背景生长的20mM CsCl。在37℃培养4-7天后，挑出孢子，重悬于无菌水中，并涂布培养以形成单菌落。重复此过程，将第二次再分离之后的单菌落的孢子作为转化体保存。

补料分批发酵

在以麦芽糖糊精为碳源、以尿素为氮源并含有酵母提取物的培养基中进行补料分批发酵。通过将目的米曲霉宿主细胞的摇瓶培养物接种到含3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中，进行所述补料分批发酵。在pH5.0和34℃条件下培养24小时之后，开始连续补充碳源和氮源。保持碳源作为限制因子，并保证存在过量的氧。所述补料分批培养持续4天，在这之后可以通过离心、超滤、clear filtration和过滤除菌回收所述的酶。通过在本领域中已知的阴离子交换层析法进行进一步纯化。

纯化

过滤培养液并加入硫酸铵(AMS)至浓度1.7M，调节pH值至5。通过离心除去沉淀物质，将含有葡糖淀粉酶活性的溶液上样于已用1.7M AMS、pH为5的20mM醋酸钠预平衡的Toyo Pearl Butyl柱上。用平衡缓冲液洗去未结合的物质。利用1.7-0M AMS线性梯度溶液和pH4.5的10mM醋酸钠以超过10倍柱体积洗脱结合的蛋白质。收集含葡糖淀粉酶的组分并对pH4.5的20mM醋酸钠透析。

本发明变体的热稳定性检测

用如下方法检测本发明变体的热稳定性：将950微升50mM醋酸钠缓冲液(pH4.3)(NaOAC)在70℃温育5分钟。加入50微升酶液(4AGU/ml)。分别在0、5、20和/或40分钟时取出2×40微升样品，并置于冰上冷冻。将在温育前(0分钟)测定的活性(AGU/ml)作为参考(100％)。计算百分率的下降对温育时间的函数。

葡糖淀粉酶的T_1/2(半衰期)

通过在指定温度(例如70℃)和pH4.5的条件下，在30％10 DE糊精麦芽糖中温育所述葡糖淀粉酶(0.18-0.36AG/g DS)，测定T_1/2。在设定的时间间隔点上收回样品，并且在50℃进一步温育24小时，以确保所有的底物均被水解，因为麦芽糖糊精可能影响活性检测。在50℃温育24小时不会显著降低酶的活性。温育之后，将所述样品冷却，并用pNPG法测定残余的酶活性(见下述)。

测定不同时间点上的残余酶活性的百分率。T_1/2为相对活性降低到50％所需的时间。

残余酶活性(pNPG法)

pNPG试剂：

将0.2g pNPG(对硝基苯葡萄糖吡喃糖苷)溶于0.1M醋酸缓冲液(pH4.3)中，终体积为100ml。

硼酸盐缓冲液：

将3.8g Na₂B₄O₇.10H₂O溶于Milli-Q水中，终体积为100ml。

AMG标准品：

已知含0.04AGU/ml酶的水溶液。

在分析前可以将样品稀释(用水1∶1-1∶2稀释)。制备下述溶液：

HS：0.5ml样品+1ml AMG标准品+3ml pNPG试剂

H：0.5ml样品+1ml水+3mlpNPG试剂

B：0.5ml样品+1ml AMG标准品+3ml pNPG试剂

将HS和H置于50℃水浴。2小时之后，每个小瓶中加入3ml硼酸盐缓冲液。将B置于室温下并在2小时后加入3ml pNPG试剂。在400nm测定所有上述三种溶液的光密度，用下述公式计算活性：

活性＝2^*AGU_st ^*(H-B)/(HS-H)

其中HS、H和B是所分析的溶液的OD值，AGU。是所用AMG标准品的活性。

pAMGY的构建

按如下方法构建pAMGY载体：用PCR扩增的AMG基因替代pJSO026上的脂肪酶基因，所述PCR中正向引物为FG2：5’-CAT CCC CAG GATCCT TAC TCA GCA ATG-3’；反向引物为RG2：5’-CTC AAA CGA CTCACC AGC CTC TAG AGT-3’，所用的模板为含AMG基因的质粒pLAC103。将pJSO026用XbaI和SmaI37℃消化2小时，并且用Klenow片段钝化PCR扩增片段的末端，然后用XbaI消化。连接所述载体片段和PCR扩增片段，并用电转化法将其转化入大肠杆菌中。将所得载体命名为pAMGY。

表达质粒pJSO37见WO97/04079和WO97/07205中所述。通过用酿酒酵母的组成型表达的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Albert和Karwasaki，(1982)，J.Mol.Appl.Genet.，1，419-434)置换pYES2.0的诱导型GAL1启动子，并且删除URA3启动子的一部分，便可从pYES2.0得到pJSO37。

pLaC103的构建

用黑曲霉AMGII cDNA克隆(Boel等，(1984)，出处同上)作为构建pLaC103的来源，所述pLaC103用于在酿酒酵母中表达AMG的GII形式。

构建分几步骤进行，概括如下。

用XbaI切割pT7-212(EP37856/美国专利5162498)，用KlenowDNA聚合酶和dNTP钝化末端。在用EcoRI切割之后，所得载体片段经琼脂糖凝胶电泳纯化，并与pBoe153的2.05kb EcoRJ-EcoRV片段连接，因此在所得质粒pG2x中，在AMG编码片段的EcoRV末端重新生成了XbaI位点。

为了除去AMG cds的上游DNA，并使AMG编码DNA携带一个适当的限制性内切酶识别位点，制备下述构建体：分离p53的930bp EcoRJ-PstI片段，用AluI切割，将所得771bp的Alu-PstI片段与末端钝化的EcoRI位点(见上)连接至pBR322，并用PstI切割。在所得质粒pBR-AMG’中，在离AMG cds的起始密码子仅34bp处重新生成EcoRI位点。

从pBR-AMG中分离775bp的EcoRI-PstI片段，并与pG2x的1151bpPstI-XbaI片段，及pT7-212的XbaI-EcoRI载体片段进行连接。

将所得质粒pT7GII在碱性磷酸酶存在的条件下用BamHI切割，随后在灭活磷酸酶之后用SphI部分切割。从该反应中得到2489bp的SphI-BamI片段，其包括与AMGII cds连接的S.c.TPI启动子。

将上述片段、pT7GII的1052pb BamHI片段、以及pMT743(EP37856/US5162498)中用碱性磷酸酶处理的SphI-BamHI载体片段进行连接。所得质粒是pLaC103。

筛选热稳定性葡糖淀粉酶变体

在下述热稳定性滤膜试验中筛选文库。

热稳定性滤膜试验

将酵母文库铺于含100μg/ml氨苄青霉素的SC ura^-琼脂平板上的醋酸纤维素滤膜(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，德国)上，30℃温育至少72小时。将菌落复制在硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德国)上，室温温育1小时。用自来水从Protran滤膜上洗下菌落。为了在筛选之后能够在滤膜上定位阳性变体，在温育之前将每个滤膜用针做特殊的标记。将结合了变体的Protran滤膜转移入含pH4.5的0.1M NaAC的容器中，并且在55-75℃温育15分钟。SC ura-琼脂平板上的所述醋酸纤维素滤膜在室温下存放备用。在温育之后，在含5％麦芽糖、1％琼脂糖、pH4.5的50mM NaAC的平板中检测残余酶活性。用与标记醋酸纤维素滤膜相同的方法标记带有Protran滤膜的试验板，并于50℃温育2小时。在去掉Protran滤膜后，用葡萄糖GOD perid(Boehringer Mannheim GmbH，德国)染色试验板。具有残余活性的变体在试验板上为白色背景上的暗绿色斑点。在储存板上定位改良的变体。用与第一次筛选相同的条件再对改良的变体筛选2次。

利用DOPE程序进行随机诱变的常规方法

用下述步骤进行随机诱变：

1.在亲本酶中选择用于修饰的目的区域，

2.在所选区域中确定突变位点和非突变位点，

3.根据诸如所需稳定性和/或待构建的变体的功能，确定进行哪一种突变，

4.选择结构上合理的突变，

5.根据步骤4调整步骤3中所选残基，

6.利用适当的掺入算法分析核苷酸分布，

7.必要时，使所需残基符合遗传密码真实性，例如考虑来自遗传密码的限制以避免引入终止密码子；技术人员应该知道在实践中一些密码子组合不能应用，其需要调整，

8.合成引物，

9.用所述引物进行随机诱变，

10.通过筛选所要改良的特性，筛选得到葡糖淀粉酶变体。

掺入算法

用于步骤6的适当的掺入算法在本领域众所周知。这类算法之一如Tomandl D.等，1997，Journal of Computer-Aided Mo1ecular Design 11：29-38中所述。另一个算法是DOPE (Jensen LJ，Andersen KV，Svendsen A和Kretzschmar T，(1998)，核酸研究26：697-702)。

实施例

实施例1

构建具有N末端延伸区的葡糖淀粉酶变体

随机诱变

通过重叠延伸法(Horton等，基因，77(1989)，61-68页)制备PCR-文库片段，所用引物包括：寡核苷酸AM11-18(可在KexII位点后、成熟蛋白、前插入1-7个额外的氨基酸)，引物AM18，以及下述2种引物，它们对应于编码区5’和3’外侧约75bp处的序列(5’端为4244：5’-TCA AGA ATA GTTCAA ACA AGA AGA-3’，3’端为KB14：5’-CTT TTC GGT TAG AGCGGA TG-3’)。

PCR反应进行如下：

PCR反应1：4244作为5’引物，AM18作为3’引物。

PCR反应2：AM11为5’引物，KB14为3’引物(7个额外氨基酸)。

PCR反应3：AM12为5’引物，KB14为3’引物(6个额外氨基酸)。

PCR反应4：AM13为5’引物，KB14为3’引物(5个额外氨基酸)。

PCR反应5：AM14为5’引物，KB14为3’引物(4个额外氨基酸)。

PCR反应6：AM15为5’引物，KB14为3’引物(3个额外氨基酸)。

PCR反应7：AM16为5’引物，KB14为3’引物(2个额外氨基酸)。

PCR反应8：AM17为5’引物，KB14为3’引物(1个额外氨基酸)。

第一个反应的模板：pAMGY；反应2-8的模板：pAMGY或克隆于相同载体的经改良的变体。

PCR反应9-15：来自PCR反应1的DNA和来自PCR反应2-8的任一DNA为模板，用4244为5’引物，KB14为3’引物，进行PCR反应。将这些最终得到的PCR片段与经限制性内切酶SamI(或BamHI)和XbaI切割的pJSO026(除去编码区，同时在每个末端产生一个75bp的重叠区，使得重组成为可能)一起用于酵母体内重组。AMll：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNSGCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO：2)AM12：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS GCGACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO：3)AM13：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS GCG ACCTTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO：4)AM14：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS GCG ACC TTGGAT TCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO：5)AM15：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS GCG ACC TTG GATTCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO：6)AM16：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS GCG ACC TTG GAT TCATGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO：7)AM17：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS GCG ACC TTG GAT TCA TGGTTG AGC-3′(SEQ ID NO：8)AM18：5′-GCG CTT GGA AAT CAC ATT TGC-3′(SEQ ID NO：9)4244：5′-TCA AGA ATA GTT CAA ACA AGA AGA-3′(SEQ ID NO：10)KB14：5′- CTT TTC GGT TAG AGC GGA TG-3′(SEQ ID NO：11)

实施例2

通过改变KexII识别位点而引入N末端延伸区

通过除去或改变成熟蛋白前面的KexII识别位点“KR”，可以引入N末端延伸区。然后可引入6个氨基酸的延伸区作为由6个氨基酸组成的原序列。在酵母中，KR是KexII的最佳识别位点。将其改变为RR将降低被切割的分子的百分率(Bevan A，Brenner C和Fuller RS，1998，PNAS 95(18)：10384-10389)。或者在KR前引入P也将降低被切割的分子的百分率。

将原序列由NVISKR变为NVISRR或NVIPKR，并给出约50％的具有NVISRR或NVIPKR延伸区的AMG分子和50％正常加工的成熟AMG分子。

实施例3

构建含半胱氨酸轿的葡糖淀粉酶(AMG2)变体

本发明的葡糖淀粉酶变体包括如下的突变：A479C或T480C或P481C或A471C或S431C或S8C或E299C或D375C以及肽延伸区ACPPSTS和ASPPSTS。亲本葡糖淀粉酶(AMG2)包括如下的突变：A479C或T480C或P481C或A471C或S431C或S8C或E299C或D375C。

半胱氨酸桥构建如下：

定点诱变

为了构建AMG G2酶的变体(SEQ ID NO：11)，按说明书使用Chameleon双链定点诱变试剂盒。

编码所述AMG G2酶的基因位于pENI1542上，该质粒通过用BamHI/XhoI切割质粒pIVI9(切除鬼伞过氧化物酶基因)，并克隆至含有AMG G2的pcr片段(用BglII/SalI切割)而得到，所述PCR的模板为pLaC103(含G2cDNA)，2个引物为引物139123(CGCACGAGATCTGCAATGTCGTTCCGATCTCTA)(SEQ ID NO：12)和引物139124(CAGCCGGTCGACTCACAGTGACATACCAGAGCG)(SEQ ID NO：13)。通过DNA测序证实其为所述变体。根据说明书，可用下述引物将pNEI1542的氨苄青霉素基因的ScaI位点变为MluI位点：7258：5’pgaatga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac3’(SEQ ID NO：14)。(这样改变了在氨苄青霉素抗性基因中发现的ScaI位点并且用于MluI位点的切割)。然后将含所述AMG基因的pENI1542载体作为DNA聚合酶和寡核苷酸7258(SEQ ID NO：14)和21401(SEQID NO：15)的模板。引物21401(SEQID NO：15)作为选择引物。21401：5’p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tgaagg gca tat acc acg cct tgg acc tgc ggt ata gcc3’(SEQ ID NO：15)。

通过加入含所需突变的适当的寡核苷酸，将半胱氨酸残基引入目的AMG基因中，所述寡核苷酸如下

诱变寡核苷酸：

ACPPSTS 137767(SEQ ID NO：16)

(5′P-GTGATTTCCAGCGGTGCCCGCCGTCCACGTCCGCGACCTTGGATTCATGG3′)

ASPPSTS 137766(SEQ ID NO：17)

(5′P-GTGATTTCCAGCGGTCCCCGCCGTCCACGTCCGCGACCTTGGATTCATGG3′)

D375C 137765(SEQ ID NO：18)

(5′P-GTAGCATTGTATGTGCCGTGAAGAC3′)

S431C 146826(SEQ ID NO：19)

(5′P-ACCGTCGTAACTGCGTCGTGCCTGC3′)

E299C 146828(SEQ ID NO：20)

(5′P-GTCTCAGTGACAGCTGCGCTGTTGCGGTG3′)

A479C 146829(SEQ ID NO：21)

(5′P-CCACTACGACGTGCACCCCCACTGG3′)

T480C 146830(SEQ ID NO：22)

(5′P-CTACGACGGCTTGCCCCACTGGATCC3′)

P481C 146831(SEQ ID NO：23)

(5′P-CGACGGCTACCTGCACTGGATCCGGC3′)

S8C 146827(SEQ ID NO：24)

(5′P-TGGATTCATGGTTGTGTAACGAAGCGACC3′)

产生的突变体：

ACPPSTS，D375C

ACPPSTS，S431C

ACPPSTS，E299C

ACPPSTS，A479C

ACPPSTS，T480C

ACPPSTS，P481C

ASPPSTS

S8C＋A479C

S8C＋T480C

S8C＋P481C

通过测定整个基因的序列，证实所述突变。按在上面“材料和方法”章节中所述方法，将所述质粒转化至米曲霉。按在上面“材料和方法”章节中所述方法，发酵并纯化所述变体。

筛选

按上文“材料和方法”章节中所述热稳定性滤膜试验筛选该文库。

实施例4

热稳定性增加的葡糖淀粉酶变体

用上文方法章节中的方法，在pH4.5，70℃的条件下测定热稳定活性。

70℃，pH4.5的热稳定性

酶残余活性(％)

5min 20min 40min

AMGG2(wt) 71 21 2

NVIPKR 85 31 8

PLALSD 73 26 8

结果表明，可通过在本发明葡糖淀粉酶的N末端连接一个延伸区而增强热稳定性。

实施例5

热稳定性增强了的葡糖淀粉酶变体

按上文方法章节中所述，于pH4.5，68℃在粗制样品中测定酵母所表达的改良变体的热稳定活性。

68℃，pH4.5的热稳定性

酶残余活性(％)

5min 20min 40min

AMGG2(wt) 57 29 16

ISN 65 39 28

MN 65 39 28

MPGRLP 56 34 23

IFELTPR 55 38 22

LGPD 62 28 23

LGVTGE 55 32 22

AGPLTPR 50 33 22

PCSAGE 57 26 21

PLASD 67 47 36

NVIPKR 57 35 23

实施例6

热稳定性增强了的葡糖淀粉酶变体

按上文方法章节中所述，于pH4.5，70℃在粗制样品中测定黑曲霉所表达的改良变体的热稳定活性。

变体	残留活性(％)，40min
变体	残留活性(％)，40min	G2ACPPSTS＋E299CACPPSTS＋A479CACPPSTS＋T480C	4191124

变体ACPPSTS＋E299C的N末端分析表明，在该变体的N末端不存在游离或氧化的半胱氨酸，表明在该N末端半胱氨酸和299位上的半胱氨酸之间已经形成了-SS-键。

序列表(1)：一般信息：(i)申请者：(A)名称：NOVO NORDISK A/S(B)街道：NOVOAllé(C)城市：DK-2880 Bagsvaerd(D)国家：丹麦(E)邮编：DK-2880(F)电话：+45 4444 8888(G)传真：+45 4449 3256(ii)发明题目：葡糖淀粉酶变体(ii)序列数量：35(iv)计算机可读形式：(A) 介质类型：软盘(B) 计算机：IBM PC兼容机(C) 操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D) 软件：PatentIn Release#1.0，version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特点：(A)长度：534个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓朴构型：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)生物：黑曲霉(xi)序列描述：SEQ IN NO：1Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-24 -20 -15 -10Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser

-5 1 5Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala

10 15 20Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25 30 35 40Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser

45 50 55Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr

60 65 70Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val

75 80 85Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu

90 95 100Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105 110 115 120Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile

125 130 135Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr

140 145 150Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln

155 160 165Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser

170 175 180Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185 190 195 200Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln

205 210 215Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe

220 225 230Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr

235 240 245Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp

250 255 260Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265 270 275 280Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser

285 290 295Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr

300 305 310Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu

315 320 325Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr

330 335 340Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345 350 355 360Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala

365 370 375Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala

380 385 390Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu

395 400 405Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr

410 415 420Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425 430 435 440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly

445 450 455Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr

460 465 470Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr

475 480 485Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr

490 495 500Arg Ser Gly Met Ser Leu505 510(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特点：(A)长度：66个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴构型：线性(ii)分子类型：合成序列(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)其它信息：/desc＝“AA11”(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)位置：22-42(D)其它信息：/注释：N＝A、C、G或T

S＝G或C(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS NNSNNSNNSN NSGcGACCTT GGATTCATGG TTGAGC 66(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特点：(A)长度：63个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴构型：线性(ii)分子类型：合成序列(ix)特点：(A)NAME/KEY：misG-特征(B)其它信息：/desc＝“AA12”(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)位置：22-39(D)其它信息：/注释：N＝A、C、G或T

S＝G或C(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS NNSNNSNNSG CGACCTTGGA TTCATGG TTG AGC 63(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特点：(A)长度：60个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴构型：线性(ii)分子类型：合成序列(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)其它信息：/desc＝“AA13”(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)位置：22-36(D)其它信息：/注释：N＝A、C、G或T

S＝G或C(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS NNSNNSGCGA CCTTGGATTC ATGGTTGAGC 60(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特点：(A)长度：66个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴构型：线性(ii)分子类型：合成序列(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)其它信息：/desc＝“AA14”(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)位置：22-33(D)其它信息：/注释：N＝A、C、G或T

S＝G或C(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS NNSGCGACCT TGGATTCATGG TTGAGC 66(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特点：(A)长度：54个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴构型：线性(ii)分子类型：合成序列(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)其它信息：/desc＝“AA15”(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)位置：22-30(D)其它信息：/注：N＝A、C、G或T

S＝G或C(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS GCGACCTTGG ATTCATGGTT GAGC 54(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特点：(A)长度：51个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴构型：线性(ii)分子类型：合成序列(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)其它信息：/desc＝“AA16”(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)位置：22-27(D)其它信息：/注：N＝A、C、G或T

S＝G或C(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSGCG ACCTTGGATT CATGGTTGAG C 51(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特点：(A)长度：48个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴构型：线性(ii)分子类型：合成序列(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)其它信息：/desc＝“AA17”(ix)特点：(A)NAME/KEY：misc-特征(B)位置：22-24(D)其它信息：/注：N＝A、C、G或T

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Claims

1.在N末端具有肽延伸区的亲本葡糖淀粉酶的变体。

2.权利要求1的变体，其中所述肽延伸区连接在N末端。

3.权利要求1或2的变体，其中所述肽延伸区含一个半胱氨酸残基。

4.权利要求1-3中何一项的变体，其中所述肽延伸区具有下述通式：

x-C-(x)_n

其中x各代表一个氨基酸。

5.权利要求4的变体，其中所述x为一种非α螺旋标记。

6.权利要求5的变体，其中肽延伸区包括选自M、K、H、V、I、Y、C、F、T、G、N、P、S或D残基的非α螺旋标记。

7.权利要求1-5中任何一项的变体，其中肽延伸区的长度包括1-100个氨基酸残基，优选1-50个氨基酸残基，更优选1-20个氨基酸残基，甚至更优选1-10个氨基酸残基。

8.权利要求1-7中任何一项的变体，其中所述肽延伸区能够与亲本葡糖淀粉酶的成熟部分形成共价连接。

9.权利要求1-8中任一项的变体，所述变体在所述肽延伸区中包括一个或更多的半胱氨酸残基，并且在所述亲本葡糖淀粉酶的成熟部分中包括一个半胱氨酸残基，该残基以使所述半胱氨酸残基可以共同形成半胱氨酸桥的方式存在。

10.权利要求1-9中任何一项的变体，其中所述肽延伸区能够阻止三肽氨肽酶对葡糖淀粉酶的切割。

11.权利要求1-10中任何一项的变体，其中亲本同源性葡糖淀粉酶包括来自微生物的葡糖淀粉酶。

12.权利要求11的变体，其中所述微生物包括真细菌、古细菌、真菌、藻类和原生动物。

13.权利要求12的变体，其中亲本同源性葡糖淀粉酶来自丝状真菌。

14.权利要求1-13中任何一项的变体，其中亲本同源性葡糖淀粉酶是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶。

15.权利要求1-14中任何一项的变体，其中肽延伸区包括下述肽延伸区之一：

Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg(NVISRR)，或

Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg(NVIPKR)，或

Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ASPPSTS)，或

Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ACPPSTS)，或

Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu(PCSAGE)，或

Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp(PLALSD)，或

Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu(LGVTGE)，或

Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu(AGPLPSE)，或

Leu-Gly-Pro-Asp(LGPD)，或

Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg(IFELTPR)，或

Ile-Ser-Asn(ISN)，或

Met-Asn(MN)。

16.权利要求3-15中任何一项的变体，其中亲本葡糖淀粉酶成熟部分中的半胱氨酸残基被插入，或其替代了亲本葡糖淀粉酶的一个氨基酸残基。

17.权利要求1-16中任一项的变体，其中用半胱氨酸残基取代了黑曲霉G1葡糖淀粉酶氨基酸序列中375位的天冬氨酸残基、或299位的谷氨酸残基、或431位的丝氨酸残基、或471位的丙氨酸残基、或479位的丙氨酸残基、或480位的苏氨酸、或481位的脯氨酸残基、或8位的丝氨酸残基。

18.权利要求1-17中任何一项的变体，其中所述变体与亲本葡糖淀粉酶相比具有改良的热稳定性。

19.编码权利要求1-18中任何一项的葡糖淀粉酶变体的DNA序列。

20.包括编码权利要求1-18中任何一项的葡糖淀粉酶变体之DNA序列的DNA构建体。

21.携带权利要求20的DNA构建体的重组表达载体。

22.用权利要求11的DNA构建体或权利要求21的载体转化的细胞。

23.权利要求22的细胞，所述细胞是微生物，例如细菌或真菌。

24.权利要求23的细胞，所述细胞是蛋白酶缺陷的米曲霉或黑曲霉。

25.用于将淀粉或部分水解的淀粉转化成含葡萄糖的糖浆的方法，所述方法包括在权利要求1-18中任一项的葡糖淀粉酶变体存在的条件下，糖化淀粉水解产物的步骤。

26.权利要求25的方法，其中所述葡糖淀粉酶变体被用于生产作为燃料或饮料的乙醇的方法中。

27.权利要求25的方法，其中所述葡糖淀粉酶变体被用于生产饮料的方法中。

28.权利要求25的方法，其中所述葡糖淀粉酶变体被用于生产柠檬酸、抗坏血酸、赖氨酸和谷氨酸等有机化合物的发酵方法中。

29.通过在N末端产生延伸区，改良亲本葡糖淀粉酶热稳定性的方法。

30.权利要求29的方法，其中所述延伸区包括肽延伸区。

31.权利要求30的方法，其中所述肽延伸区包括非螺旋标记，优选M、K、H、V、I、Y、C、F、T、G、N、P、S或D残基。

32.权利要求29-31的方法，其中所述肽延伸区的长度包括1-100个氨基酸残基，优选1-50个氨基酸残基、更优选1-20个氨基酸残基，甚至更优选1-10个氨基酸残基。

33.权利要求29-32的方法，其中所述肽延伸区能够与亲本葡糖淀粉酶的成熟部分形成共价连接。

34.权利要求29-33的方法，该方法包括在所述肽延伸区中含一个半胱氨酸残基，并且在所述亲本葡糖淀粉酶的成熟部分中含一个半胱氨酸，其以使所述半胱氨酸残基可以共同形成半胱氨酸桥的方式存在。

35.权利要求29-34的方法，其中所述肽延伸区包括下述肽延伸区：

Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg(NVISRR)，或

Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg(NVIPKR)，或

Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ASPPSTS)，或

Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ACPPSTS)，或

Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu(PCSAGE)，或

Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp(PLALSD)，或

Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu(LGVTGE)，或

Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu(AGPLPSE)，或

Leu-Gly-Pro-Asp(LGPD)，或

Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg(IFELTPR)，或

Ile-Ser-Asn(ISN)，或

Met-Asn(MN)。

36.权利要求29-34中任何一项的方法，其中亲本葡糖淀粉酶成熟部分中的半胱氨酸残基被插入，或其替代了亲本葡糖淀粉酶的一个氨基酸残基。

37.权利要求29-35中任何一项的变体，其中用半胱氨酸残基替代了黑曲霉G1葡糖淀粉酶的氨基酸序列中375位上的天冬氨酸残基、或299位上的谷氨酸残基、或431位上的丝氨酸残基、或471位上的丙氨酸残基、或479位上的丙氨酸残基、或480位上的苏氨酸、或481位上的脯氨酸残基、或8位上的丝氨酸残基。

38.权利要求29-36中任何一项的方法，其中所述肽延伸区能够阻止三肽氨肽酶对葡糖淀粉酶的切割。