KR20010089885A - Ｎ-말단 연장을 가진 글루코아밀라제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개선된 열 안정성을 나타내는 모 균류 글루코아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

Description

Ｎ-말단 연장을 가진 글루코아밀라제{GLUCOAMYLASES WITH N-TERMINAL EXTENSIONS}

글루코아밀라제(1,4-α디-글루칸 글루코하이드로라제, EC 3.2.1.3)는 녹말이나 관련 올리고당과 다당류분자의 비환원 말단으로부터 D-포도당을 분해하는 반응을 촉매하는 효소이다. 글루코아밀라제는 상업적으로 가장 중요한Aspergillus에서 유래된 것 함께 몇 가지의 사상균과 효모에 의하여 생산된다.

상업적으로는, 글루코아밀라제 효소는 이미 α-아밀라제에 의해 부분적으로 가수분해된 옥수수 녹말을 포도당으로 전환하는데 사용된다. 포도당은 포도당 이성화효소에 의하여 거의 동량의 포도당과 과당으로 구성된 혼합물로 더 전환된다. 이 혼합물 또는 과당이 더 농축된 혼합물은 전세계적으로 상업화된 고과당 옥수수 시럽으로 보통 사용된다. 이 시럽은 세계에서 효소방법에 의해 생산되는 가장 큰 규모의 제품이다. 녹말을 과당으로 전환시키는데 관여하는 세 가지 효소는 생산되는 산업 효소중 가장 중요한 효소의 하나이다.

고과당 옥수수 시럽 생산에서 그루코아밀라아제를 상업적으로 사용하는데 존재하는 주요 문제점 중의 하나는 글루코아밀라제의 상대적으로 낮은 열 안정성이다. 글루코아밀라제는 α-아밀라제나 포도당 이성화효소처럼 열적으로 안정하지 않고 α-아밀라제 또는 포도당 이성화효소보다 낮은 pH에서 가장 활성이 높고 안정하다. 따라서, 글루코아밀라제는 별개의 용기에서 더 낮은 온도와 pH에서 사용하여야 한다.

본 발명은 모 글루코아밀라제의 글루코아밀라제 변이체, 변이체 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열 및 이 같은 변이체 효소를 녹말가수분해에 사용하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 개선된 열 안정성을 가지는 글루코아밀라제 효소의 변이체에 관한 것이다.

발명의 요약

따라서, 본 발명의 목적은 글루코아밀라제 활성을 가지는 효소의 특성을 개선하는 것, 특히 이 같은 열 안정성을 개선하는 것이다.

효소의 N-말단에 펩티드 연장을 연결하여 글루코아밀라제 활성을 가지는 효소의 열 안정성을 현저하게 증가시키는 것이 가능하다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

결과적으로, 본 발명의 제 1의 측면은 N-말단에 펩티드 연장을 가진 모 글루코아밀라제 변이체에 관련된다.

본 문맥에서 용어 "펩티드 연장"은 한 줄의 하나 이상의 연속된 아미노산 잔기가 모 (성숙) 글루코아밀라제의 N-말단에 덧붙여진 것을 나타내려는 의도이다.

용어 "성숙 글루코아밀라제"는 그 통상적 의미로, 즉 문제의 생산자 생체에의한 번역과 분비 후 프로세싱 (글리코실화 배치와 프리(pre)-와 프로(pro)-펩티드 같은 N 및/또는 C-말단 서열의 제거) 후의 결과물인 활성형 글루코아밀라제를 가리키기 위하여 사용된다. 더 구체적으로 이것은 최초의 번역된 글루코아밀라제, 즉, 프로세싱되지 않은 글루코아밀라제로부터 프리-와 프로-펩티드 서열이 만약 있으면 제거된 아미노산 서열을 의미한다. 본 정의에 의하여 포괄되는 성숙 글루코아밀라제는,A. niger글루코아밀라제 (SEQ ID NO: 1)를 위치 3, 즉 Leu와 Asp 사이에서 자르는 트리펩티딜 아미노 펩티다제 (TPAP)에 의하여 잘려진 (프로세싱된) 글루코아밀라제이다.

용어, "모 글루코아밀라제"는 본 발명에 따라 변형되는 글루코아밀라제를 가리키려는 의도이다. 모 글루코아밀라제는 천연-발생 (또는 야생형) 글루코아밀라제 또는 적당한 어떤 수단에 의하여 생산되는 그것의 변이체이다. 예를 들어, 모 글루코아밀라제는, 천연-발생 글루코아밀라제 아미노산 서열에, 전형적으로 글루코아밀라제의 구조 부분에 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 절단 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가 또는 삽입에 의하여 변형된 천연-발생 글루코아밀라제의 변이체이다.

다른 측면에서 본 발명은 상기 정의된 글루코아밀라제 변이체를 코딩하는 DNA 서열, DNA 구조체, 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현, 및 본 발명의 DNA 서열이나 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주세포에 관련된다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 녹말전환을 위한 방법에 편리하게 사용되고 따라서, 본 발명의 다른 측면은 녹말이나 부분적 가수분해된 녹말을 덱스트로스를 함유하는 시럽으로 전환하는 방법으로서, 상기 방법은 본 발명의 글루코아밀라제 변이체 존재 하에 녹말수화물을 당화하는 단계를 포함하는 방법에 관련된다.

최종 측면에서, 본 발명은 N-말단연장을 만들어 모 글루코아밀라제의 열 안정성을 개선하는 방법을 제공한다.

본 발명의 발명자는 개선된 열 안정성을 가지는 다수의 모 글루코아밀라제의 개선된 변이체를 제공하였다. 개선된 열 안정성은 펩티드연장을 모 글루코아밀라제에 연결하여 얻어진다. 이는 아래에 상세하게 기술될 것이다.

발명의 상세한 설명

펩티드 연장

상기된 대로, 모 글루코아밀라제의 N-말단에서 적당한 펩티드 연장이 발견될 수 있는 때, 특히 개선된 열 안정성을 가진 글루코아밀라제 변이체가 얻어질 수 있음이 놀랍게도 발견되었다. 본 발명은 이 발견에 기초한다.

본 발명의 문맥에서 "..N-말단에서 발견될 수 있는.."은 성숙한 글루코아밀라제가 N-말단에서 펩티드 연장을 가지는 것을 의미한다. 한 구체예에서 펩티드 연장은 모 글루코아밀라제 천연의, 즉, 프로- 및/또는 프리-펩티드를 제거하기 위한 번역후 프로세싱 전의 것이다. 그러므로, 펩티드 연장은, 정상적으로는 발현과 번역후 프로세싱 후 제거되거나 잘려지는, 프로세싱되지 않은 모 글루코아밀라제의 프리- 및/또는 프로-펩티드일 수 있다.

다른 구체예에서 연장은 정상적으로는 프로세싱 동안 공여세포에 의하여 잘려지는 펩티드 서열, 예를 들어 프리- 및/또는 프로-펩티드와 동일한 N-말단 펩티드이다. 대부분의 경우 펩티드 연장은 프리- 및/또는 프로-펩티드와 상이하다. 이는 더 하기될 것이다.

연장이 N-말단에 연결되는 경우, 그것은 당업계 주지의 단백질공학의 어떤 수단에 의하여도 행하여질 수 있다.

용어 "개선된 열 안정성을 가지는 글루코아밀라제 변이체"는 본 발명의 문맥에서, 고정된 항온처리 기간 후에, 대응하는 모 글루코아밀라제보다 더 높은 T_1/2(반감기)나 잔류 효소활성을 가지는 글루코아밀라제 변이체를 의미한다. 예를들어 T_1/2와 잔류활성 같은 열 안정성의 결정은 하기 재료와 방법절에서 기술된다.

용어 "적합한 펩티드 연장"은 사용될 펩티드가 상기 정의대로 개선된 열 안정성에 효과를 나타낼 수 있는 펩티드 연장을 가리키는데 사용된다. 펩티드 연장의 "적합성"은, 펩티드 연장이 연결된 변형된 글루코아밀라제 변이체와 대응하는 모 글루코아밀라제 각각의 열 안정성의 비교분석법에 의하여 점검된다. 열 안정성은, 예를 들어 본 발명에 기술된 열 안정성 분석법 같은, 적당한 기술에 의하여 결정된다.

펩티드 연장이 열 안정성의 개선 같은 바람직한 효과를 제공할 수 있는 것은, 예를들어 변형될 모 글루코아밀라제의 본성, 펩티드 연장의 (길이를 포함하는) 구조, 펩티드 연장이 전체 글루코아밀라제 변이체 효소의 구조에 미치는 영향, 펩티드 연장의 아미노산 잔기의 성질과 기능 등에 의존한다고 현재 믿어지고 있다. 바람직한 효과를 제공할 수 있는 펩티드 연장의 필요조건은 당연히 펩티드 연장을함유하는 글루코아밀라제 변이체가 적당한 숙주생체 내에서 발현가능한 것이다. 하기 일반적 고려가 적당한 펩티드 연장의 설계에 알맞다:

펩티드 연장의 길이: 다양한 수의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 연장은 바람직한 효과를 제공할 수 있고, 따라서 본 발명에 따라 사용될 펩티드 연장에 존재할 아미노산 잔기의 정확한 수를 특정하는 것은 불가능함이 발견되었다. 특히, 아미노산 연장의 발현에의 영향, 구조, 및 또는 결과적 변형 글루코아밀라제 변이체의 활성에 대하여 고려하여 아미노산 잔기수의 상한이 결정된다.

펩티드 연장은 따라서 1 내지 100 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 50 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 1 내지 20, 그리고 더욱 더 바람직하게는 1 내지 10 아미노산 잔기를 포함한다.

안정성: 펩티드 연장은 허용되는 안정성 (예를 들어, 구조적 안정성 및/또는 발현 안정성)을 가진 글루코아밀라제 변이체를 제공하거나 글루코아밀라제 변이체의 구조적 안정성을 현저하게 감소시키지 않도록 바람직하게 선택되어야 한다. 많은 펩티드 연장이 결과적 글루코아밀라제 변이체에 실질적 구조적 불안정성을 가져오지 않는다고 믿어지지만, 특정 예에서와 특정 모 글루코아밀라제에게는, 그 자체가 변형된 글루코아밀라제 효소에 구조적 안정성을 줄 수 있는 펩티드 연장을 선택하는 것이 적당하다. 예를 들어, 펩티드 연장은 상호작용의 수를 증가시킬 수 있고/또는 하기된 바와 같이 N-말단 연장에서부터 N-말단 잔기로 시스테인 다리를 첨가하여 공유적으로 결합될 수 있다.

펩티드 연장의 아미노산 잔기의 특성:

N-말단 잔기와 N-말단 연장간 개선된 상호작용을 얻기 위하여, 잔기는 바람직하게 α-헬릭스 형성 선호도가 낮은 잔기로부터 와야 하고, 따라서 본 발명과 관련하여 사용된다. 이것은 만약 N-말단 α-헬릭스가 N-말단 방향으로 연장되면 N-말단 잔기와 접촉없이 구조 밖으로 돌출할 것이라는 사실에 의하여 합리화될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드 연장은 N-말단 연장에 대한 N-말단 잔기의 접촉 개선에 의한 개선된 안정성을 포함한다. 주어진 N-말단 연장내에서, 잔기의 주요 부분은 비-헬릭스 형성자의 군으로부터 와야한다. 헬릭스의 N-말단 및/또는 헬릭스의 중간에 α-헬릭스 성향 (propensity)을 가지는 잔기를 사용하고/또는 헬릭스의 C-말단 부분은 1 이하의 성향인 잔기를 사용하여, N-말단 잔기들과 N-말단 연장간 접촉의 개선이 최적일 것임이 예상된다. 연장이 글루코아밀라제 천연 α-헬릭스의 N-말단부분에 위치할 것이므로 α-헬릭스의 N-말단 부분에 있는 1 이하의 성향을 가지는 잔기는 특히 관심의 대상이다. M(메티오닌), K(리신), H(히스티딘), V(발린), I(이소류신), Y(티로신), C(시스테인), F(페닐알라닌), T(트레오닌), G(글리신), N(아스파라진), P(프롤린), S(세린) 및 D(아스파르트산)을 포함하는 잔기가 비-α-헬릭스 형성자로서 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명과 관련하여, "N-말단 잔기들"은 N-말단 잔기 주위의 잔기들, 즉, N-말단 연장의 일부분은 아니면서 N-말단 잔기의 중심으로부터 18, 12 및/또는 8Å 구 이내에 있는 잔기들을 의미한다. 더 바람직하게는, 연장은 10Å 이내에 있지만 Connelly water accessible surface program ((버전 1988 10월), 참고문헌 W.Kabsch 와 C. Sander, Biopolymers 22 (1983) pp. 2577-2637)을 사용한 접근가능성이 양수를 가지는 잔기로 정의되는 효소의 표면 상에 있다.

"비-헬릭스 형성자"는 여기에서 상이한 아미노산 잔기에 대한 상이한 성향이 기술된 (Proteins: Creighton T.E. (1993))의 표 6.5로부터 얻어지는 데이타에 의하여 정의된다.

대안으로, 개선된 구조적 안정성은 본 발명의 글루코아밀라제 내에 시스테인 다리의 도입으로 제공된다. 예를 들어, 만약 펩티드 연장의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 시스테인이고 글루코아밀라제 변이체의 성숙부분내 시스테인 잔기에 공유결합을 형성할 수 있도록 위치한다면, 펩티드 연장과 글루코아밀라제의 성숙부분간 시스테인 다리가 도입될 수 있다. 시스테인 다리의 도입의 긍정적 효과는 실시예 3에 기술된다. 만일 성숙 글루코아밀라제내 적당한 시스테인이 존재하지 않는다면, 활성에 중요하지 않다고 생각되는 모 글루코아밀라제 아미노산 잔기를 교체하여 상기 모 글루코아밀라제의 적당한 위치에 시스테인을 편리하게 삽입한다.

일반적으로, 시스테인을 포함하는 펩티드 연장의 아미노산 서열은:

x-C-(x)_n, 으로 나타낼 수 있고, 여기서 x는 한 아미노산, 바람직하게는 상기 비-α-헬릭스 형성자, 더 바람직하게는 짧은 곁사슬을 가진 아미노산을 독립적으로 나타낸다.

Cys의 카르복실-말단쪽과 처리되는 자연적으로 일어나는 N-말단간에, 5 이상, 바람직하게는 5 내지 100, 더 바람직하게는 5 내지 10, 더욱 더 바람직하게는 5 개의 어떤 x 잔기도 있을 수 있다.

그 예는:

ACGPSTS (SEQ ID NO: 25)

ACPGTST (SEQ ID NO: 26)

ACGTGTS (SEQ ID NO: 27)

ACTGSTG (SEQ ID NO: 28)

ACGPSTSG (SEQ ID NO: 29)

ACPGTSTG (SEQ ID NO: 30)

ACGTGTSS (SEQ ID NO: 31)

ACTGSTGT (SEQ ID NO: 32)

글루코아밀라제 (예를 들어,A. nigerG1 또는 G2 AMG)의 천연 프로-펩티드는 kex2-유사 프로테아제 (2염기성 프로테아제)에 의하여 절단된다. 그러므로, kex2 프로테아제는 kex2나 kex2-유사 부위를 절단할 수 있는 프로테아제이다. Kex2 부위 (Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology")와 kex2-유사 부위는 몇몇 단백질의 프로-펩티드 코딩영역과 성숙영역 사이에서 발견되는 2염기성 인지부위(즉, 절단위치)이다.

이 절단위치를 돌연변이시키는 것은 N-말단 프로펩티드를 온전한 채로 남겨둔다.

예:

NVIPPR (SEQ ID NO: 33)

NPPIRP (SEQ ID NO: 34)

NVIPRP (SEQ ID NO: 35)

다른 가능성은 글루코아밀라제 유전자를 발현시키도록 선택된 숙주내 kex2-유사 프로테아제 코딩 유전자를 결실시키거나 불활성시키는 것이다. 이것은 또한 N-A말단 펩티드 연장을 온전한 채로 남겨둔다.

트리펩티딜 아미노펩티다제 코딩 유전자같은 N-말단 프로세싱에 관여하는 프로테아제를 코딩하는 다른 유전자 또한 발현을 위한 관심의 숙주에서 결실시키거나 불활성될 수 있다.

시스테인 변이체에 대한 N-말단 잔기들은 N-말단 잔기 주위의 잔기들, 즉, N-말단 연장의 일부가 아니면서 N-말단 잔기의 중심으로부터 18, 12 및/또는 8Å 구 이내에 있는 잔기들로 정의될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 시스테인 잔기를 포함하는 연장을 위한 아미노산 서열은:

x-C-x-x-x-x-x 로서 표시될 수 있고, x는 독립적으로 상기 비-α-헬릭스 형성자를 나타낸다.

구체적 구체예에서, 글루코아밀라제 변이체는 모 글루코아밀라제의 성숙부분에 공유결합을 형성할 수 있는 펩티드 연장 포함한다. 다른 구체적 구체예에서, 글루코아밀라제 변이체는, 그 시스테인 잔기들이 함께 시스테인 다리를 형성하도록 하는 방식으로 펩티드 연장내에 하나 이상의 시스테인 잔기와 모 글루코아밀라제의 성숙부분내 시스테인 잔기를 포함한다. 또 다른 구체적 구체예에서, 모 글루코아밀라제의 성숙 부분내 시스테인 잔기는 삽입되거나 모 글루코아밀라제의 아미노산과치환되었다. 가장 바람직한 구체예에서,Aspergillus nigerG1 글루코아밀라제의 아미노산 서열내의 위치 375에 대응하는 위치의 아스파르트산 잔기, 위치 299에 대응하는 위치의 글루탐산 잔기, 위치 431에 대응하는 위치의 세린 잔기, 위치 471에 대응하는 위치의 알라닌 잔기, 위치 479에 대응하는 위치의 알라닌 잔기, 위치 480에 대응하는 위치의 트레오닌 잔기, 위치 481에 대응하는 위치의 프롤린 잔기, 또는 위치 8에 대응하는 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환되었다.

구체적으로, 모 글루코아밀라제에 연결되는 펩티드 연장은 바람직하게 하기:

Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg (NVISRR),

Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg (NVIPKR),

Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ASPPSTS),

Ala-Cys-Pro-Prp-Ser-Thr-Ser (ACPPSTS),

Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu (PCSAGE),

Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp (PLALSD),

Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu (LGVTGE),

Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu (AGPLPSE),

Leu-Gly-Pro-Asp (LGPD),

Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg (IFELTPR),

Ile-Ser-Asn (ISN),또는

Met-Asn (MN) 중 하나이다.

본 문맥에서, 트리펩티딜 아미노펩티다제 (TPAP)는 프로호르몬이나 프로엔자임에서 발견되는 연장된 아미노산 서열같은 펩티드나 단백질 서열의 N-말단으로부터 트리펩티드를 절단하는 아미노펩티다제를 나타내려는 의도이다. 펩티드, 올리고펩티드, 또는 단백질의 치환되지 않은 N-말단으로부터 트리펩티드 절편을 절단할 때, 트리펩티딜 아미노펩티다제 (TPAP)는 어떤 경우에 있어서는 안정성을 감소시키는 것으로 나타났다. 더, 구체적으로, N-말단의 트리펩티딜 아미노펩티다제 절단은 글루코아밀라제 효소의 안정성을 감소시킨다. 따라서, 본 발명은 또한 펩티드 연장이 글루코아밀라제 효소의 트리펩티딜 아미노펩티다제 (TPAP) 절단을 방지하는 능력이 있는 모 글루코아밀라제 변이체와 관련된다.

모 글루코아밀라제에 펩티드 연장을 연결하는 방법

본 발명의 변이체는 합성법에 의하여 생산된 펩티드 연장을 문제의 모 글루코아밀라제 내에 부가 (융합이나 삽입)하여서 얻어질 수도 있지만, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체가 i) 모 글루코아밀라제의 N-말단에 적용된 바람직한 펩티드 연장을 코딩하도록 모 글루코아밀라제를 코딩하는 뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA 서열을 변형하고 (예를 들어 모 글루코아밀라제를 코딩하는 핵산 (바람직하게는 DNA)서열내 적당한 위치에서 펩티드 연장을 코딩하는 핵산 (바람직하게는 DNA) 서열을 삽입하여), ii) 변형된 결과적 핵산 (바람직하게는 DNA)서열을 적당한 발현 시스템에서 발현시키고, iii) 결과적 글루코아밀라제 변이체를 회수하여 준비되는 것이 현재 바람직하다.

본 문맥에서, 용어 "에 연결"은 연장이 성숙 글루코아밀라제의 N-말단 (즉, 마지막 아미노산 잔기)에 융합되는 것을 가리키려는 의도이다.

많은 글루코아밀라제가 "프리프로(prepro)-글루코아밀라제" 즉, 성숙 글루코아밀라제를 구성하는 글루코아밀라제, 분비 신호 펩티드 (즉, 프리펩티드) 및 프로펩티드로서 발현된다. 프리프로- 글루코아밀라제는 발효배지내로 분비되도록 세포내적으로 프로세싱되어, 발효배지로부터 성숙 글루코아밀라제가 분리되고/또는 정제될 수 있다. 펩티드 연장을 모 글루코아밀라제에 부가하는 것은, 원하는 (N-말단 펩티드 연장에 대한) 펩티드 연장 상류를 코딩하는 핵산 서열을 모 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열에 연결하여 수행될 수 있다.

삽입은 원하는 (즉, 원하는 펩티드 연장(들)을 가지는) 글루코아밀라제 변이체가 글루코아밀라제 변이체의 전사, 번역, 및 프로세싱 후 숙주세포에 의하여 발현되고 분비되는 방식으로 수행되어야 한다. 용어 "프로세싱"은 이 문맥에서 프리-와 프로-펩티드의 제거를 의미한다 (프로-펩티드가 원하는 펩티드 연장과 동일한 경우는 물론 제외한다. 이것은 아래에서 더 다룬다).

대부분의 경우 펩티드 연장을 코딩하는 DNA를 프로-펩티드나 (만약 프로서열이 없다면) 프리펩티드를 코딩하는 DNA 서열과 성숙 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열 사이에 삽입하여 모 글루코아밀라제를 연장하는 것이 가능하다.

펩티드 연장을 코딩하는 DNA 서열의 삽입/부가는 분자생물학 분야의 어떤 숙련자에게도 알려진 어떤 표준 방법에 의하여도 수행될 수 있다 (참고., 예를 들어 Sambrook et al., 1989). 이것은 예를 들어 US 특허 4,683,202나 R.K. Saiki et al., (1988), Science, 239, 487-491에 기술된 특정 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 포함한다. 인접하는 DNA 발현과 분비를 제공하는 방법은 하기될것이다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체를 생산하기 위한 적당한 발현 시스템을 선택하기 위하여 (특히, 생산을 위하여 변형된 DNA 서열이 사용될 때) 주의가 기울여져야 하지만, 본 발명에 따른 (개선된 열 안정성을 가진) 글루코아밀라제 변이체는, 번역된 폴리펩티드를 정상적 방식으로 프로세싱할 능력이 없고 따라서 성숙 단백질과 관련된 프로펩티드나 유사한 펩티드의 일부나 전체 서열을 포함하는 글루코아밀라제를 생산하게 되는 발현시스템에서, 문제의 모 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열을 발현하여 얻어질 수 있음이 발견되었다. 이 경우, 프로펩티드나 유사한 펩티드 서열은 펩티드 연장을 구성한다. 프로-펩티드나 유사한 펩티드 서열은 모 글루코아밀라제에 상이 또는 상동이고 모 글루코아밀라제의 N-말단에 존재할 수 있다. 이 최근의 기술을 사용하는 본 발명에 따른 글루코아밀라제 변이체의 생산은 더 하기한다.

따라서, 적당한 일련의 아미노산이 이미 모 글루코아밀라제의 프리프로 형태로 코딩되고 이 일련의 아미노산이 주어진 발현 시스템에 의하여 글루코아밀라제의 프로세싱에서 잘리어진다면, 펩티드 연장은 발현숙주 시스템을 상기 일련의 아미노산의 상기 프로세싱이 일어나지 않는 시스템으로 전환함으로써 적용될 수 있다. 그와 같은 경우에, 분비 신호 프리-펩티드는 분비동안이나 이후에 잘리어져, 프로-펩티드나 그것의 일부 또는 대응하는 DNA 서열로 코딩되는 유사한 펩티드 서열을 포함하는 모 글루코아밀라제 (즉, N-말단이 연장된 글루코아밀라제)로 구성되는 변형된 글루코아밀라제를 야기할 것이다.

효모세포는 (프로펩티드나 그것의 일부의 형태로) 펩티드 연장을 모 균류 글루코아밀라제 효소, 특히Aspergillus niger글루코아밀라제 효소에 적용하기에 특히 유용한 것으로 발견되었다.

고도로 바람직한 구체예에서, 하기 원리:

a) 펩티드 연장을 가진 모 글루코아밀라제 효소를 코딩하는 DNA 서열에, 펩티드 연장이나 모 글루코아밀라제의 N-말단의 펩티드연장내에 편재된 무작위돌연변이유발을 수행하는 단계,

b) 단계 a)에서 얻어진 돌연변이된 DNA 서열을 숙주세포에서 발현하는 단계, 및

c) 모 글루코아밀라제에 비하여 개선된 수행능을 가지는 돌연변이된 글루코아밀라제 효소를 발현하는 숙주세포를 스크리닝하는 단계를 따르는 무작위돌연변이유발에 의하여 펩티드 연장이 고안되고 적용된다.

이 접근방법에 의하여 다수의 고도로 유리한 펩티드 부가체가 생산되었다.

편재된 무작위돌연변이유발은 W0 95/22615에 기술된 대로 본질적으로 수행된다. 더 구체적으로, 돌연변이유발은 오직 하나 이상의 상기 영역만 돌연변이유발시키는 조건하에서 수행된다. 특히, 큰 펩티드 연장의 돌연변이유발을 위하여, 돌연변이되어야 할 영역에 인접한 하나 이상의 적당한 올리고뉴클레오티드가 사용되는 (예를 들어 Deshler 1992나 Leung et al., 1989에 의하여 기술된) PCR 생성 돌연변이유발을 사용하는 것이 적당하다. 짧은 펩티드 연장을 위하여는, 도핑이나 스파이킹된 올리고뉴클레오티드를 사용한 편재된 무작위돌연변이유발을 수행하는 것이 더바람직하다. 도핑이나 스파이킹은, 예를 들어 원치 않는 아미노산 잔기를 피하거나 포지티브 전하 또는 소수성 아미노산 잔기 같은 특정 타입의 아미노산 잔기가 원하는 위치에 도입될 가능성을 증가시키기 위하여 사용된다.

돌연변이유발에 이어 DNA 서열을 가지는 적당한 숙주 세포를 발현을 허용하는 조건하에서 배양함에 의하여 돌연변이된 DNA가 발현된다. 이 목적으로 사용되는 숙주세포는 돌연변이된 DNA 서열, 선택적으로는 벡터상에 존재하는 DNA 서열로 형질전환거나, 돌연변이유발 처리 동안 모 효소를 코딩하는 DNA 서열을 가지는 숙주세포이다. 적당한 숙주세포의 예는 하기에 주어지고, 바람직하게는 돌연변이된 효소를 분비할 능력이 있는 (쉬운 스크리닝이 가능한) 숙주세포이다.S. cereviciae의 세포같은 효모가 적당한 효소로 발견되었다.

모 글루코아밀라제

본 발명에 따른 고려된 모 글루코아밀라제는 균류 글루코아밀라제, 특히Aspergillus niger나Aspergillus awamori글루코아밀라제와 그 변이체나 돌연변이 같은Aspergillus균주에서 얻어진 균류 글루코아밀라제, 상동 글루코아밀라제, 및 SEQ ID NO: 1과 구조적 및/또는 기능적으로 유사한 그 외의 글루코아밀라제를 포함한다. 특히 고려된 것은 Boel et al. (1984), "Glucoamylase G1 and G2 fromAspergillus nigerare synthesized from two different but closely related mRNA", EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102에 개시된Aspergillus niger글루코아밀라제 G1과 G2이다. G2 글루코아밀라제는 SEQ ID NO: 1에 개시된다.

시중 모 글루코아밀라제

시중구입 가능한 모 글루코아밀라제는 Novo Nordisk 유래 AMG를 포함하고 또한 미국의 Genencor, Inc. 사와 네덜란드의 Gist-Brocades, Delft사 유래 글루코아밀라제를 포함한다.

모 상동 글루코아밀라제

모 글루코아밀라제의 상동성은 제 2의 서열로부터 제 1의 서열이 파생함을 가리키는 두 단백질 서열 간의 유사성의 정도로서 결정된다. 상동성은 GCG 프로그램 페키지에 제공되는 GAP같은 당업계에 알려진 컴퓨터 프로그램에 의하여 적당하게 결정된다 (Program Manual for Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetic Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B.과 Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p. 443-453). 폴리펩티드 서열 비교를 위한 하기 세팅: GAP 생성 페널티 3.0과 GAP 연장 페널티 0.1으로 GAP를 사용하여, 본 발명의 유사 DNA 서열에 의하여 코딩되는 폴리펩티드의 성숙 부분은 SEQ ID NO :1에 나타낸 아미노산 서열의 성숙 부분과 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 97%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99%의 일치정도를 나타낸다.

바람직한 구체예에서 본 발명의 변이체는 pH4 내지 5, 특히 4.2 내지 4.7에서 예를 들어 말토덱스트로스를 기질로 사용하여, 약 60 내지 80℃, 바람직하게는 63 내지 75℃ 온도 간격 이내에서 개선된 열 안정성을 가진다.

다른 바람직한 구체예에서, 모 상동 글루코아밀라제는 미생물 유래 글루코아밀라제를 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 미생물은 진정세균, 고세균, 균류,조류 및 원생동물을 포함하고 더욱 더 바람직한 구체예에서, 모 상동 글루코아밀라제는 사상균에서 유래한다.

고도로 바람직한 구체예에서, 모 글루코아밀라제는Aspergillus nigerG1 글루코아밀라제 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102)이다. 모 글루코아밀라제는 절단된 글루코아밀라제일 수 있다.

글루코아밀라제 변이체를 생산하는 방법

돌연변이를 유전자에 도입하는 몇몇 방법이 당업계에 알려져 있다. 글루코아밀라제-코딩 DNA 서열의 클로닝의 간단한 논의 후, 글루코아밀라제-코딩 서열내에 특정 부위에서 돌연변이를 생산하는 방법이 논의될 것이다.

글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열의 글로닝

모 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열은 당업계 주지의 다양한 방법을 사용하여 문제의 글루코아밀라제를 생산하는 어떤 세포나 미생물로부터도 분리된다. 우선, 게노믹 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 염색체 DNA나 전령 DNA를 사용하여 연구될 글루코아밀라제를 생산하는 생체로부터 제작되어야 한다. 그 다음, 만약 글루코아밀라제의 아미노산 서열이 알려지면, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 합성되고 글루코아밀라-코딩 클론을 문제의 생체 유래 게노믹 라이브러리로부터 동정하는데 사용된다. 대안으로, 다른 알려진 글루코아밀라제 유전자에 상동인 서열을 함유하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 글루코아밀라제-코딩 클론을 동정하기 위한 프로브로서 더 낮은 긴축의 혼성화와 세척 조건을 사용하여 사용될 수 있다.

글루코아밀라제-코딩 클론 동정의 또 다른 방법은 게노믹 DNA 절편을 플라스미드와 같은 발현벡터에 삽입하고, 글루코아밀라제 네거티브 세균을 결과적 게노믹 DNA 리아브러리로 형질전환하여, 그 다음 형질전환된 세균을 글루코아밀라제의 기질 (즉, 말토스)을 함유하는 한천상에 도말하여 그로 인하여 글루코아밀라제를 발현하는 클론이 동정되도록 허용하는 것과 관련된다.

대안으로, 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열은 확립된 표준 방법, 예를 들어 S.L. Beaucage와 M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869에 기술된 포스포로아미디트 방법이나 Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p. 801-805에 의하여 기술된 방법에 의하여 합성적으로 준비된다. 포스포로아미디트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 어닐되고, 라이게이션되고, 적당한 벡터에 클로닝된다. 마지막으로, DNA 서열은 표준 기술에 따른 합성, 게노믹 또는 cDNA 기원 (적당하도록, 전체 DNA 서열의 다양한 부분에 대응하는 단편)의 라이게이션에 의하여 준비된 게노믹과 합성 혼합 기원, 합성과 cDNA 혼합 기원 또는 게노믹과 cDNA 혼합 기원이다. DNA 서열은 또한 특정 프라이머를 사용한, 예를 들어 US 특허 4,683,202나 R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491에 기술된대로 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의하여 준비된다.

돌연변이유발인자와 항온처리하거나 그것에 노출시킨후, 돌연변이된 DNA 서열은, 발현이 일어나는 것을 허용하는 조건하에서 DNA 서열을 가지는 적당한 숙주세포를 배양하여 발현된다. 이 목적으로 사용되는 숙주세포는 돌연변이된 DNA 서열, 선택적으로는 벡터상에 존재하는 DNA로 형질전환된 것이거나 돌연변이유발 처리동안의 모 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열을 가지는 것이다. 적당한 숙주의 예는 하기의:Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus같은 그램 포지티브 세균;과E. coli같은 그램-네거티브 세균이다. 돌연변이된 DNA 서열은 돌연변이된 DNA 서열의 발현을 허용하는 기능을 코딩하는 DNA 서열을 더 포함한다.

부위특이적 돌연변이 유발

일단 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열이 분리되고, 그리고 돌연변이시키기 바람직한 부위가 동정되면, 합성된 올리고뉴클레오티드을 사용하여 돌연변이가 도입될 수 있다. 이런 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌연변이 부위에 측면을 접한 핵산서열을 포함한다. 한 특정 방법에서는, DNA의 단일가닥으로된 갭(gap), 즉 글루코아밀라제를 코딩하는 서열이, 글루코아밀라제 유전자를 운반하는 벡터안에 만들어진다. 그 다음엔 원하는 돌연변이를 갖는 합성된 뉴클레오티드가 그 단일가닥 DNA의 상동성 부분에 어닐된다. 남은 갭은 그 다음에 DNA 중합효소I (클레노우 단편)으로 채워지고, 그리고 구조체가 T4 리가아제를 사용하여 연결된다. 이 방법의 특이적 예는 Morinaga et al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639에 서술되어 있다. US4,760,025는 사소한 변화를 수행함으로써 다중변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시한다. 그러나, Morinaga 방법에 의하면 다양한 길이의 올리고뉴클레오티드 다수가 도입 될 수 있으므로 어떤 한 번에도 더욱 많은 수의 다양한 돌연변이도 도입될 수 있다.

돌연변이를 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA서열에 도입하는 또 다른 방법은 Nelson and Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151에 서술되어 있다. 그것은 화학적으로 합성된 DNA 가닥을 PCR의 프라이머 중 하나로 사용하여 원하는 돌연변이를 포함하는 PCR단편의 3-단계 생성과 관련되어 있다. PCR로부터 생성된 단편으로부터, 돌연변이를 운반하는 DNA 단편이 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의하여 분리될 수 있고, 발현 벡터에 재삽입될 수 있다.

게다가, Sierks. et al., (1989) "Site-directed mutagenesis at the active site Trp120 ofAspergillus awamoriglucoamylase", Protein Eng., 2, 621-625; Sierks et al., (1990), "Determination ofAspergillus awamoriglucoamylase catalytic mechanism by site-directed mutagenesis at active site Asp176, Glu179, and Glu180", Protein Eng. vol. 3, 193-198; 또한Aspergillus글루코아밀라제에서 부위특이적 돌연변이유발에 대하여 서술한다.

무작위 돌연변이유발

무작위 돌연변이유발은 문제를 나타낸 아미노산 서열로 번역되는 유전자의 적어도 세 부분 또는 유전자 전체 내에 편재된 또는 영역-특이적 무작위 돌연변이로서 적합하게 수행된다. 모 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열의 무작위 돌연변이 유발은 통상적으로 당업계에 알려진 어느 한 방법으로 편리하게 수행된다. 상기와 관련하여, 본 발명의 더 나아간 측면은 그 안에서 변이체가 모 글루코아밀라제에 비하여 상대적으로 증가된 열 안정성을 나타내는 글루코아밀라제 변이체를 생산하는 방법과 관련이 있는데, 그 방법은:

(a) 모 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA 서열에 무작위 돌연변이를 유발하는 단계,

(b) 단계(a)에서 얻어진 돌연변이된 DNA 서열을 숙주세포내로 발현하는 단계, 및

(c) 모 글루코아밀라제에 비하여 상대적으로 변화된 특성 (즉, 열 안정성)을 갖는 글루코아밀라제 변이체를 발현하는 숙주세포를 선별하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 방법의 단계(a)는 바람직하게는 이 안의 작동하는 실시예에서 기술된 바와 같이 도핑된 프라이머를 사용하여 수행된다(아래 참조). 예를 들어, 무작위 돌연변이 유발은 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발물질을 사용하거나, 적합한 올리고뉴클레오티드을 사용하거나, 또는 DNA서열에 PCR에 의하여 생성되는 돌연변이유발을 수행함으로써 수행된다. 더 나아가, 무작위 돌연변이유발은 이런 돌연변이 유발물질의 어떤 조합을 사용하여서도 수행된다. 돌연변이 유발 물질은 예를들면 전이, 전환, 역위, 교차, 결실, 및/또는 삽입을 유발할 수 있는 물질이다. 본 목적에 적합한 물리적 화학적 돌연변이 유발 물질의 예는 자외선(UV) 조사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸 히드록실아민, 질산, 에틸 메탄 설포네이트 (EMS), 아황산 나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이와 같은 물질이 사용될 때에는 돌연변이유발은 전형적으로 돌연변이유발하고자 하는, 선택한 돌연변이 유발 물질 존재 하에서 돌연변이유발이 일어나기 적합한 조건에서 모 효소를 코딩하는 DNA 서열을 항온처리하고, 원하는 성질을 가진 돌연변이된 DNA를 선별함으로써 수행된다. 올리고뉴클레오티드을 사용하여 돌연변이 유발이 수행될 때, 하나의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 합성하는 동안 바뀌어야 할 위치에서 세개의 비-모 뉴클레오티드로 도핑되거나 스파이킹된다. 도핑이나 스파이킹은, 그것을 수행하여, 원하지 아니하는 아미노산에 대한 코돈은 회피되도록 수행된다. 도핑되거나 스파이킹된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 PCR, LCR, 또는 적합하다고 여겨지는 어떤 DNA 중합효소 및 리가아제를 사용하여, 어떠한 공지된 기술에 의하여도 글루코아밀라제 효소를 코딩하는 DNA 속으로 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 도핑은 야생형과 돌연변이의 비율이 미리 정의된 "일정한 무작위 도핑"을 사용하여 수행된다. 더 나아가, 도핑은 어떤 뉴클레오티드의 도입이 우위가 되는, 그리고 그것에 의하여 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 도입되는 것이 우위가 되는 방향으로 나아간다. 도핑은 예를 들어 각 위치에서 90%의 야생형과 10%의 돌연변이가 도입되도록 만들어진다. 도핑 계획의 선택에서 덧붙여 고려할 점은 단백질-구조적 뿐아니라 유전적 제약이다. 도핑 계획은 특히 종결 코돈의 삽입이 회피되는 것을 확실이 하는, DOPE 프로그램을 사용하여 만들어져야 한다. PCR에 의하여 생성되는 돌연변이 유발이 사용될 때에는, 모 글루코아밀라제를 코딩하는 화학적으로 처리 또는 비처리 유전자가 뉴클레오티드의 잘못된 삽입을 증가시키는 조건 하에서 PCR이 수행된다 (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15).E.coli, S. cereviseae, 또는 어떤 다른 미생물의 돌연변이 균주도 모 글리코실라제를 내포하는 플라스미드를 돌연변이 균주내로 형질전환하고, 그 돌연변이 균주를 그 플라스미드와 함께 성장시켜, 그리고 그 변이된 플라스미드를 그 돌연변이 균주으로부터 분리함으로써 글루코아밀라제를 코딩하는 DNA의 무작위 돌연변이 유발에 사용될 수 있다. 돌연변이된 플라스미드는 그 다음에 발현을 위한 생물체내로 형질전환된다. 돌연변이 유발될 DNA 서열은 편리하게도 모 글루코아밀라제를 발현하는 생물체로부터 마련된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리안에 존재한다. 대안으로는, 그 DNA 서열은 플라스미드나 박테리오파지와 같은 적합한 벡터상에 존재하는데, 이와 같은 벡터는 그러지 아니하면 돌연변이 유발 물질에 노출되므로 함께 항온처리된다. 돌연변이 유발될 DNA 서열은 또한 숙주세포의 유전체에 삽입되어 있거나 그 세포안에 정착된 벡터로 존재하면서 숙주세포 안에 존재한다. 마지막으로, 돌연변이 유발될 DNA 서열은 유리된 형태로 존재한다. 무작위 돌연변이 유발의 대상이 될 DNA는 바람직하게는 cDNA나 게놈 DNA라는 것이 이해될 것이다. 어떤 경우에 있어서는 발현 단계 b) 또는 선별 단계 c)를 수행하기 전에 돌연변이된 DNA 서열을 증폭하는 것이 편리하다. 이와 같은 증폭은 당업계에 알려진 방법, 현재에 바람직한 방법은 모 효소의 DNA 또는 아미노산 서열을 바탕으로 마련된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 생성된 증폭에 따라 수행된다. 돌연변이 유발물질과 함께 항온처리 또는 그것에의 노출에 이어서, 돌연변이된 DNA는 발현이 이루어지는 것을 허용하는 조건하에서, DNA서열을 운반하고 있는 적합한 숙주 세포를 배양하는 것에 의하여 발현된다. 이 목적에 사용되는 숙주세포는 선택적으로 벡터안에 존재하는, 돌연변이된 DNA 서열이형질전환된, 또는 돌연변이유발 처리 과정동안 모효소를 코딩하는 DNA 서열을 운반한 숙주세포이다. 적합한 숙주 세포의 예는 다음과 같다:Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans또는Strepetomyces murinus와 같은 그람 양성 세균; 및E.coli같은 그람 음성 세균. 돌연변이된 DNA서열은 더 나아가 변이된 DNA서열의 발현을 용인하는 기능을 코딩하는 DNA서열을 더 포함한다.

편재된 무작위 돌연변이 유발

무작위 돌연변이 유발은 문제의 모 글루코아밀라제의 한 부분에 유리하게 편재된다. 이것은, 예를 들어, 그 효소의 어떤 영역이 그 효소의 주어진 특성에 특히 중요함이 동정된 때, 그리고 변형에 의해 개선된 특성을 갖는 변이의 결과가 예상될 때에 유리하다. 이와 같은 영역은 정상적으로는 모 효소의 4차구조가 밝혀지고 그 효소의 기능과 관련이 된 때에 동정된다.

편재된, 또는 영역-특이적, 무작위 돌연변이유발은 위에 기술된 바와 같은 PCR에 의하여 생성된 돌연변이 유발 기술 또는 당업계에 알려진 적합한 다른 기술을 사용하여 편리하게 수행된다. 대안으로, 변형될 DNA서열의 부분을 코딩하는 DNA서열은 분리되고, 예를 들어, 적합한 벡터 안으로의 삽입에 의하여, 그리고 전기한 부분은 그 다음에 위에 논의된 돌연변이 유발 방법 중 어느 하나를 사용하여 돌연변이 유발의 대상으로 한다.

글루코아밀라제 변이체의 발현

본 발명에 따르면, 전기한 방법, 또는 당업계에서 알려진 대안의 방법 중의 하나에 의하여 생산된 변이체을 코딩하는 DNA서열은, 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 부착 부위, 번역 개시 신호, 및 선택적으로, 억제 유전자나 다양한 활성인자 유전자를 코딩하는 조절 서열을 전형적으로 포함하는 발현벡터를 사용하여 효소의 형태로 발현될 수 있다.

발현벡터

본 발명의 글루코아밀라제 변이체를 코딩하는 DNA서열을 운반하는 재조합 발현벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정의 대상이 되는 벡터 중 어느 하나이고, 벡터의 선택은 종종 그 벡터가 도입될 숙주세포에 의존된다. 벡터는 숙주세포에 도입될 때 숙주세포 유전체에 삽입되어 그 벡터가 삽입된 염색체와 함께 복제되는 벡터이다. 적합한 발현벡터의 예는 pMT838을 포함한다.

프로모터

벡터안에서, DNA서열은 적합한 프로모터 서열과, 작동 가능하도록 연결되어야 한다. 프로모터는 선택적 숙주 내에서 번역 활성을 나타내는 DNA 서열중의 하나이고 숙주세포에 대하여 상동적인, 또는 상이적인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래한다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체를 코딩하는 DNA서열의 전사를 이끌어내기 위한 적합한 프로모터의 예, 특히 세균에서의 예는E.coli의 lac 오페론의 프로모터,Streptomyces coelicolor의 agarase 유전자 dagA 프로모터,Bacilluslicheniformisα-amylase 유전자 (amyL) 의 프로모터,Bacillus strearothermophilus의 말토스합성 아밀라제 유전자 (amyM)의 프로모터,Bacillus amyloliquefaciens a-아밀라제 (amyQ)의 프로모터,Bacillus subtilisxylA와 xlyB 유전자의 프로모터 등이다. 균류 숙주에서의 전사를 위하여는, 유용한 예는A. oryzaeTAKA 아밀라제,S. cerevisiae에서 유래한 TPI (트리오스 포스페이트 이성화효소)프로모터(Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, p.419-434),Rhizomucor miehei아스파르트 프로티나제,A. niger의 중성a-아밀라제, A. niger의 산에 안정한a-아밀라제,A. niger의 글루코아밀라제,Rhizomucor miehei리파제,A. oryzae의 알칼리 프로테아제,A. oryzae의 트리오스 포스페이트 이성화효소, 또는A. nidulans아세트아미다제 등을 코딩하는 유전자에서 유래한 프로모터이다.

발현벡터

본 발명의 발현벡터는 또한 적합한 전사 종결인자로를 포함하고, 진핵세포에서는 다중 아데닐화 서열이 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 코딩하는 DNA서열과 작동 가능하도록 연결되어 있다. 종결과 폴리아데닐화 서열은 적합하게 프로모터와 동일한 기원에서 유래한다.

벡터는 벡터가 문제의 숙주 세포에서 복제되는 것을 가능하게 하는 DNA 서열을 더 포함한다. 이와 같은 서열의 예는 플라스미드인 pUS19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제 개시점이다.

벡터는 또한B. subtilis또는B. licheniformis의 dal 유전자, 또는 엠피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 지니는 유전자와 같은 선택마커, 즉 숙주세포의 결함을 보충하는 산물의 유전자를 포함한다. 더 나아가, 벡터는 amdS, argB, niaD, 및 하이그로마이신(hygromycin) 내성을 일으키는 마커인 sC와 같은Aspergillus선택마커를 포함하거나, 또는 WO 91/17243에 기술된 바와 같이, 공-형질전환에 의하여 선택성이 획득된다.

본 발명의, 글루코아밀라제 변이체, 프로모터, 종결인자, 및 다른 인자들 각각을 코딩하는 DNA제작물을 연결하고, 이를 복제에 필수적인 정보를 포함하는 적합한 벡터에 삽입하는데 사용되는 방법은 당업계에서 숙련된 자에게 주지되어 있다 (참고., 예를 들어, Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2판, Cold Spring Harbor, 1989).

숙주세포

위에 정의한 바대로 DNA 구조체 또는 본 발명의 발현벡터로 이루어져 있는 본 발명의 세포는 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 재조합의 생산에, 숙주세포로서 유리하게 사용된다. 세포는 DNA 구조체(하나 또는 그 이상의 복제본)을 숙주세포 염새체 안으로 삽입함에 의하여, 변이체를 코딩하는 본발명의 DNA 구조체와 함께 형질전환된다. 이 삽입은 DNA 서열이 세포 내에서 안정하게 유지될 가능성이 높다는 잇점이 있는 것으로 일반적으로 생각되고 있다. DNA 구조체들의 숙주 염색체 안으로의 삽입은 통상적 방법, 예를 들면 상동적 또는 상이적 재조합 방법에 따라 수행된다. 대안으로는, 세포는 다른 종류의 숙주세포와 관련하여 위에 기술된 바와 같이 발현벡터를 사용하여 형질전환된다.

본 발명의 세포는 포유류나 곤충과 같은 고등 생물의 세포가 되기도 하지만, 바람직하게는 미생물 세포, 예를 들면 세균 또는 곰팡이 (효모 포함) 세포이다.

적합한 세균의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, 또는Streptomyces lividans, 또는Streptomyces murinus과 같은 그람 양성 세균, 또는E. coli같은 그람 음성 세균이다. 박테리아의 형질전환은 원형질체 형질전환에 의해, 또는 수용(competent) 세포를 사용함에 의하여 그 자체로 알려진 바대로 달성된다.

효모 생물체는 예를 들어Saccharomyces cerevisiae같은Saccharomyces또는Schizosaccharomyces의 종으로 부터 호의적으로 선택된다.

숙주세포는 또한 사상균, 예를 들어Aspergillus의 종, 가장 바람직하게는Aspergillus oryzae또는Aspergillus niger에 속하는 균주, 또는Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum(완전한 상태에서는Gribberella zeae라 명명하고, 이전에는Gibberella roseumf. sp.cerealis), 또는Fusarium sulphureum(완전한 상태에서는Gibberella puricaris라고 명명하고,Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, 및Fusarium roseum var. graminearum과 동의어),Fusarium cerealis(Fusarium cokkwellnse와 동의어), 또는Fusarium venenatum의 균주와 같은Fusarium의 균주이다.

발명의 한 바람직한 구체예에서는 숙주세포는 프로테아제가 결핍되거나 또는결손된 균주이다.

이것은 예를 들어 "alp"라 명명되는 유전자가 결실된 염기성 프로테아제를 갖는, 프로테아제 결핍 균주인Aspergillus oryzaeJal 125이 된다. 이 균주은 WO 97/35956 (Novo Nordisk)에 서술되어 있다.

사상균 세포는 원형질체 제작과그 자체로알려진 방법에 따라, 세포벽의 재생산이 후속되는 원형질체의 형질전환과 관련된 과정에 의하여 형질전환된다.Aspergillus를 숙주 미생물로 사용하는 것은 EP 238 023 (Novo Nordisk A/S)에 기술되어 있고, 그 내용은 참고문헌으로써 여기에 삽입되어 있다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 생산방법

좀더 나아간 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 글루코아밀라제의 변이체를 생산하는 방법과 관련이 있는데, 그 방법은 그 변이체를 생산하는데 도움이 되는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것과 그 변이체를 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수하는 것을 포함한다.

숙주세포를 배양하는데 사용된 배지는 문제의 숙주세포를 성장시키고 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 발현을 얻는데 적합한 통상적 배지 중의 하나이다. 적합한 배지는 상업적 공급자로부터 구입 가능하거나 또는 공지된 방법에 따라서 준비될 수 있다(예를 들어 American Type Culture Collection 의 카탈로그에 기술되 바에 따라).

숙주세포로부터 분비된 글루코아밀라제 변이체는 세포를 원심분리 또는 여과를 통하여 배지로부터 분리하는 것과, 그리고 배지에서 단백질을 포함하는 구성물을 황산 암모늄과 같은 염을 이용하여 침전시키는 것을 포함하는 주지된 과정에 따라 배지로부터 편리하게 회수되며, 이 과정은 이온교환수지, 친화성 크로마토그래피, 또는 이와 유사한 과정과 같은 크로마토그래피 과정의 사용으로 이행된다.

녹말 전환

본 발명은 포도당 등을 녹말로부터 생산함에 본 발명의 글루코아밀라제 변이체를 사용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 방법은 α-아밀라제의 존재하의 전구체 녹말을 부분적으로 가수분해하는 단계와 그 다음으로 글루코아밀라제 존재하에서 α-(1→4) 및 α-(1→6) 글루코시딕 결합의 절단을 통한 녹말 또는 연관된 올리고당과 다당 분자의 비환원말단으로부터 D-포도당의 방출물을 더 가수분해하는 단계를 포함한다.

α-아밀라제를 이용한 전구체 녹말의 부분적 가수분해는 녹말 분자의 내부의 α-(1→4)-결합의 가수분해를 통한 첫 분해를 제공한다. 상업적 응용에서는, α-아밀라제를 사용한 첫 가수분해는 약 105℃의 온도에서 수행된다. 통상적으로 30% 내지 40% 고체의 매우 높은 녹말 농도가 처리된다. 첫 가수분해는 통상적으로 이런 고온에서 5분간 수행된다. 부분적으로 가수분해된 녹말은 제 2의 용기로 옮겨지고 10 내지 15의 덱스트로스 평형체(D.E.)를 만들기 위해 85℃ 내지 98℃의 온도에서 대략 1 내지 2시간동안 항온처리될 수 있다.

글루코아밀라제 존재 하에서의 녹말 또는 연관된 올리고당과 다당 분자의 비환원 말단으로부터 D-포도당의 분출물을 더 가수분해하는 단계는 보통 30℃와 62℃사이의 저온 하에서 분리된 용기에서 수행된다. 바람직하게는 기질 용액의 온도는55℃ 내지 60℃로 떨어진다. 용액의 pH는 약 5.5 내지 6.5으로부터 3 내지 5.5 사이 범위로 떨어진다. 바람직하게는, 용액의 pH는 4 내지 4.5이다. 글루코아밀라제가 용액에 첨가되고 24 내지 72 시간동안, 바람직하게는 36 내지 48 시간동안 반응이 수행된다.

본 발명의 내열성 글루코아밀라제 변이체를 사용하여 전통적 회분식 당화공정보다 더 고온에서 당화공정들이 수행된다. 본 발명에 따르면 당화공정은 60℃ 내지 80℃ 범위의 온도들, 바람직하게는 63℃ 내지 75℃ 에서 수행될 수 있다. 이것은 (상기한 바) 전통적 회분식 공 및 연속식 당화공정 양자 모두에 적용한다.

실제적으로, 하나 이상의 막분리 공정들을 포함하는 연속 당화 공정, 즉 여과단계는 막을 통한 합당한 높은 유입률을 유지할 수 있기 위하여 또는 세균의 오염을 최소화하기 위하여, 60℃이상의 온도에서 수행되어야 한다. 그러므로, 본 발명의 내열성 변이들은 공업적인 당화 공정에서 받아들일 수 있는 시간의 기간내에, 낮은 비용 및/또는 더 낮은 효소 단백질의 양으로도 대규모 연속 당화 공정들을 수행할 수 있는 가능성을 제공한다. 본 발명에 따르면, 당화시간은 더 단축될 수 있다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체 (예를 들어 AMG 변이체)의 활성은 전통적으로 사용되는 30℃ 내지 60℃사이의 온도에서보다 60℃ 내지 80℃ 사이의 범위에서 일반적으로 충분히 더 높다. 그러므로, 글루코아밀라제가 작동하는 온도를 높임으로써 당화공정은 더 짧은 시간의 기간동안 수행된다.

게다가, 열 안정성을 개선함으로써 T_1/2(반감기, 재료 및 방법 편에 정의된 대로)는 개선될 수 있다. 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 열 안정성이 개선되어서, 당화공정동안 불활성화된 글루코아밀라제와 교체하기 위하여 소량의 글루코아밀라제만 첨가되면 된다. 본 발명에 따르면 당화공정동안 더 많은 글루코아밀라제가 활성이 유지된다. 더 나아가, 63℃이상의 온도에서 당화공정이 수행되는 동안 미생물에 의한 오염의 위험 또한 줄어든다.

그 안에 본 발명의 글루코아밀라제 변이체들이 사용되는 당화과정의 실시예는 JP 3-224493; JP 1-191693; JP 62-272987 및 EP452,238에 기술된 과정들을 포함한다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체(들)은 본 발명의 과정에서는 오직 4개 이상의 포도당 잔기 분자내의 α-(1→6)-글리코시딕 결합만 가수분해하는 효소와 조합하여 사용된다. 선호적으로는, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 풀루란나제 또는 이소아밀라제와 조합하여 사용될 수 있다. 탈분지를 위한 이소아밀라제와 풀루란나제의 사용, 그 효소들의 분자적 특성, 및 효소들의 글루코아밀라아제와의 잠재적 사용은 G.M.A. van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142에 설명되어 있다.

더 나아간 측면에서는 본 발명은 녹말 전환 과정에서의 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 사용과 관련이 있다.

게다가, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 연속 당화 단계들을 포함하는연속 녹말 전환방법에 사용된다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 또한 고정화된 형태로 사용될 수 있다. 이것은 말토스 시럽과 같은 특화된 시럽들을 생산 하는데, 및 나아가 과당 시럽의 생산과 관련된 올리고당의 추출 찌꺼기 흐름에 적합하고 자주 사용된다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 또한 연료 또는 음료로서의 에탄올을 생산하는 방법에 사용되거나 또는 시트르산, 아스코르브산, 라이신, 글루탐산과 같은 유기 화합물들을 생산하기 위한 발효공정에 사용된다.

마지막으로, 본 발명은 또한 N-말단에 연장을 만들어 모 글루코아밀라제의 열 안정성을 개선하는 방법과 관련된다. 중요한 구체예에서, 연장은 펩티드 연장을 포함한다.

재료 및 방법

재료:

효소들:AMG G1: Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), 1097-1102, 및 SEQ ID NO: 13 에 개시된Aspergillus niger글루코아밀라제 G1, Novo Nordisk로부터 구입가능. AMG G2: SEQ ID NO: 1에 나타난 절단된Aspergillus niger의 글루코아밀라제, G1 Novo Nordisk로부터 구입가능.

숙주 세포:

A. oryzaeJaL 125: Institute for Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku, Osaka, Japan으로부터 구입가능하고,A. oryzaepyrG 유전자를 마커로 사용하여 1단계 유전자 교환방법(G. May에 의하여 "Applied MolecularGenetics of Filamentous Fungi" (1992), p.1-25. Eds. J. R. Kinghorn 및 G. Turner; Blackie Academic and Professional에 서술됨)에 의하여 결실된 "alp"(Murakami K et al., (1991), Agric. Biol. Chem. 55, p. 2807-2811에 서술됨)라 칭하는 알칼리성 프로테아제 유전자를 가진Aspergillus oryzaeIFO 4177. 균주 JaL 125는 더 나아가 WO 97/35956 (Novo Nordisk)에 개시되었다.

미생물들:

균주:Saccharomyces cerevisiaeYNG318: MATαleu2-△2 ura3-52 his4-539 pep4-△1[cir+]

플라스미드들:

pLaC103: 절단된Aspergillus niger글루코아밀라제 G2를 코딩하는 플라스미드. pJSO026 (S. cerevisiae발현 플라스미드) (J.S.Okkels, (1996) " pYES벡터내의 URA3-프로모터의 결실은S. cerevisae에서 균류 리파제의 발현 수준을 증가시킨다." Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, Annals of the New York Academy of Sciences의 vol. 782) 더 구체적으로, 발현 플라스미드 pJSO26은 pYES 2.0의 유도가능 GAL1프로모터를Saccharomyces cerevisiae로부터 유래한 구성적-발현성 TPI프로모터(트리오스 포스페이트 이성화효소)(Albert와 Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1, 419-434)로 교체하고 URA3 프로모터의 일부분을 결실함에 의하여 pYES2.0로부터 유도되었다.

방법:

Saccharomyces cerevisiae YNG318의 형질전환

DNA단편들 및 열린 벡터들은 혼합되어 표준 방법에 의하여 효모인Saccharomyces cerevisaeYNG318로 형질전환된다.

AGU 활성의 결정

Novo Amyloglucosidase Unit (AGU)가 하기 표준조건 하에서 1분당 1마이크로몰 말토스을 가수분해하는 효소량으로 정의되었다:

기질. . . . . . . . 말토스

온도. . . . . . . . 25℃

pH. . . . . . . . . 4.3 (아세테이트 완충액)

반응시간. . . . . . 30분

분석적 방법 (AF22)의 상세한 설명이 요구에 따라 이용가능하다.

Aspergillus oryzae의 형질전환 (일반 과정)

100ml의 YPD (Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory)는A. oryzae의 포자로 접종되고, 약 24시간 동안 진탕 배양되었다. 균사는 미라글로스(miracloth)를 통하여 여과에 의하여 수집되고 200ml의 0.6M MgSO₄로 세척되었다. 균사는 15ml의 1.2M MgSO_4,10mM NaH₂PO₄, pH 5.8내에 현탁되었다. 그 현탁액은 얼음위에서 냉각되고 1ml의 120mg의 Novozyme^TM234을 포함하는 완충액이 첨가 되었다. 5분 경과 후, 1ml의 12mg/ml의 BSA (Sigma 타입 H25)가 첨가되고 현미경 아래에서 조사한 표본 안에 많은 수의 원형질체가 관찰될때까지 1.5 내지 2.5시간동안 37℃에서 온화하게 교반하면서 항온처리가 이어졌다.

현탁액은 미라클로스(miracloth)를 통하여 여과되었고, 여과물은 살균된 시험관 내로 옮겨졌고, 그리고 5ml의 0.6M 솔비톨, 100mM Tris-HCl, pH7.0로 뒤덮여 졌다. 원심분리가 1000g에서 15분간 수행되었고 원형질체는 MgSO₄완화액의 상층으로부터 수집된다. 2부피의 STC (1.2M 솔비톨, 10mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM CaCl₂)가 원형질체 현탁액에 첨가되었고 혼합액은 1000g에서 5분간 원심분리되었다. 원형질체 응집체(pellet)는 3ml의 STC로 다시 현탁되고 다시 응집되었다. 이 과정은 반복되었다. 마지막으로, 원형질체는 0.2-1ml의 STC안에 다시 현탁되었다.

100㎕의 원형질체 현탁액은 10㎕의 STC에, 5-25㎍의 p3SR2 ( Hynes et al., Mol. and Cel. Biol. Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Aug. 1983에 기술된A. nidulansamdS 유전자를 운반하는 플라스미드)와 함께 혼합되었다. 그 혼합액은 0.2ml의 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10mM CaCl₂에 방치되고 그리고 10ml의 Tris-HCl, pH7.5가 첨가되고 주의깊게 혼합되었고(두 차례) 그리고 마지막으로 0.85ml의 같은 용액이 첨가되고 주의깊게 혼합된다. 그 혼합액은 실온에서 25분동안 방치되고, 2,500g에서 15분간 돌리고, 그리고 응집체는 2ml의 1.2M 솔비톨에 재현탁되었다. 한 번 더 침전시킨후 원형질체들은 백그라운드 성장을 저해하기 위하여 1.0M 수크로스, pH 7.0, 질소원으로 10mM 아세트아미드, 및 20mM CsCl를 함유한 최소평판(Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56)에 도말되었다. 4 내지 7일간 37℃에서 배양한 후 포자들은 선택되고, 멸균수에 현탁되고 하나의 콜로니로 퍼졌다. 이과정은 반복되며 두번째 재분리 후의 콜로니의 포자들은 정의된 형질전환체로서 보관되었다.

유가식 발효

말토덱스트로스를 탄소원으로하고, 요소를 질소원으로하고, 효모추출물을 포함하는 배지에서 유가식 발효가 수행된다. 유가식 발효는A. oryzae의 문제의 숙주세포의 진탕 플라스크 배양액을 3.5%의 탄소원과 0.5%의 질소원으로 구성된 배지에 접종함으로써 수행된다. pH5.0 및 34℃에서 24시간동안 배양한 후 부가적 탄소 및 질소원의 연속적 공급이 시작된다. 탄소원이 제한인자로 유지되고 충분한 산소공급이 보장된다. 유가식 배양은 4일간 지속되며, 그 후에 효소들은 원심분리, 한외여과, 청정 여과 및 무균여과로 회수된다.

정제

배양 육즙은 여과되고 1.7M AMS의 농도로 황산암모늄(AMS)이 첨가되고 pH는 pH5로 조정된다. 침전된 물질은 원심분리로 제거되고 글루코아밀라제 활성을 포함하는 용액은 미리 1.7M AMS, 20mM 아세트산나트륨, pH5로 평형화된 Toyo Pearl Butyl 컬럼에 적용한다. 결합되지 않은 물질들은 평형완충액으로 세척된다. 부착된 단백질은 컬럼부피의 10배 이상의 1.7 내지 0M AMS 선형구배를 사용하여 10mM 아세트산나트륨, pH 4.5로 용출한다. 글루코아밀라제를 포함하는 분획들은 수집되고 20mM 아세트산 나트륨, pH4.5에 대하여 투석된다.

본 발명의 변이체의 열 안정성 결정

변이체들의 열 안정성은 하기 방법을 사용하여 T_1/2로서 시험된다: 950 ㎕의 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH4.3) (NaOAc)가 5분간 68℃ 또는 70℃에서 5분간 항온처리된다. 50㎕의 완충액(4AGU/ml) 안의 효소가 첨가된다. 2x40㎕의 표본들이 0, 5, 10, 20, 및/또는 40분 각각에 취하여지고 얼음 위에서 냉각된다. 항온처리 이전(0분)에 측정된 활성(AGU/ml)은 대조군(100%)으로 사용된다. 안정성의 기울기(퍼세트로서)가 항온처리시간에 대한 함수로 계산된다.

글루코아밀라제의 T _1/2 (반감기)

T_1/2는 글루코아밀라제 (0.18 내지 0.36 AG/g DS)를 pH4.5에서와 문제의 온도(예를 들어 70℃)에서 30% 10DE 말토덱스트린 내에서 항온처리함으로써 측정된다. 샘플들은 각 주어진 시간 간격에서 취하여지고 말토덱스트린이 활성분석에 영향을 미칠수도 있으므로 모든 기질이 가수분해된것을 보장하기 위하여 50℃에서 24시간동안 더 항온처리되었다. 50℃에서 24시간동안의 항온처리는 효소활성을 현저하게 감소시키지 않을 것이다. 항온처리 후 샘플은 냉각되었고 잔류된 효소 활성은 pNPG 방법(아래 서술한 대로)에 의하여 측정되었다.

%잔류 글루코아밀라제 활성은 다른 시간들에서 결정된다. T_1/2은 그 때까지의 남은 활성의 %가 50%로 줄어든 경우의 시간의 간격이다.

잔류된 효소 활성(pNPG 방법)

pNPG 시약:

0.2g의 pNPG (p-니트로페닐글루코피라노시드)는 0.1M 아세테이트완충액(pH4.3)에 용해되어 100ml로 만들어진다.

보레이트 용액:

3.8g의 Na₂B₄O₇10H₂O 는 Milli-Q 물에 용해되어 100ml로 만들어 진다.

AMG 표준:

0.04 AGU/ml에 해당하는 기지의 양의 효소를 함유하는 수성 효소용액.

샘플은 분석에 앞서 (물로 1:1 내지 1:2로) 희석될 수 있다. 하기 용액:

HS: 0.5ml 샘플 + 1ml AMG 표준 + 3ml pNPG 시약

H: 0.5ml 샘플 + 1ml 물 + 3ml pNPG 시약

B: 0.5ml 샘플 + 1ml AMG 표준 + 3ml 보레이트 용액

이 준비되었다.

HS와 H를 50℃ 수조에 놓는다. 2시간 후, 3ml 보레이트 용액이 각 바이알에 첨가되었다. B가 실온에 놓여졌고 2시간후 2ml pNPG 시약이 첨가되었다. 세 용액 모두의 광학밀도가 400nm에서 측정되었고 활성이 계산되었다:

활성= 2 * AGU_st* (H-B)/(HS-H)

HS, H, 및 B는 분석된 용액의 OD이고 AGU_st는 사용된 AMG 표준의 활성이다.

pAMGY의 제작

pAMGY벡터는 이하와 같이 제작된다: pJSO026 내의 리파제 유전자는 AMG유전자로 교체되었는데, 그것은 순방향 프라이머인; FG2:5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3'과 역방향 프라이머인; RG2: 5'-CTC AAA CGA CTCACC AGC CTC TAGAGT-3'과 함께 주형 플라스미드로 AMG유전자를 포함하는 pLAC103를 사용한 PCR 증폭되었다. pJSO026은 XbaI과 SmaI에 의하여 37℃에서 2시간동안 가수분해되었고 PCR 증폭물은 클레나우(Klenow)절편의 사용과 XbaI에 의한 가수분해에 의하여 평활말단화 되었다. 벡터 단편과 PCR 증폭물은 연결된 후 전기적형질전환에 의하여E.coli내로 형질전환되었다. 결과적 벡터는 pAMGY로 표시된다.

발현 플라스미드 pJSO37은 WO 97/04079와 WO 97/07205에 기술된다. 그것은 pYES 2.0의 GAL1-프로모터가,Saccharomyces cerevisiae유래의 구성적으로 발현되는 TPI(트리오스 포스페이트 이소머라제)-프로모터 (Albert와 Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1, 419-434)로 교체되고 URA3 프로모터의 일부가 결실된 pYES 2.0에서 유래한다.

pLaC103의 제작

A. niger의 AMGII cDNA 클론 (Boel et al. (1984), supra)은 AMG의 GII형태의S. cerevisiae에서의 발현을 목적으로 하는 pLaC103 제조의 기원으로 사용된다.

제조는 아래 개략적으로 서술된 몇몇 단계로 이루어진다.

pT7-212 (EP37856/ 미국 특허 번호. 5162498)은 XbaI으로 절단되고 클레노우 DNA 중합효소 및 dNTP로 평활말단화된다. EcoRI으로 절단된 후 결과물인 벡터 단편은 한천 전기영동겔로부터 정제되고 2.05kb 길이의 pBoel53의 EcoRI-EcoRV 단편과 라이게이션되어 그것에 의하여 결과적 플라스미드인 pG2x안의 AMG를 코딩하는 단편의 EcoRI 말단에 XbaI부위를 재생산한다.

AMG cdc의 상류 DNA를 제거하기 위하여와 적합한 제한 엔도뉴클라제 인식부위를 갖는 AMG를 코딩하는 DNA를 만들기 위하여 다음의 구조체가 만들어졌다: p53의 930bp EcoRI-PstI 단편이 분리되어 AluI로 절단되었고, 결과적 771bp Alu-PstI 단편은 평활말단 EcoRI 부위를 갖는(위 참조) pBR322에 라이게이션되었고 PstI으로 절단되었다. 결과적 플라스미드 pBR-AMG'에서, EcoRI 부위는 AMG cds의 개시 코돈으로부터 단 34bp에서 재생산된다.

pBR-AMG'로부터 775bp EcoRI-PstI 단편은 분리되었고 pT7-212의 XbaI-EcoRI벡터 단편을 포함하는 라이게이션 반응에 의하여 pG2x에서 유래한 1151bp의 PstI-XbaI 단편과 연결되었다.

결과적인 플라스미드 pT7GII는 탈인산가수분해효소 존재하에서 BamHI절단을 받고 인산가수분해효소의 불활성화 후에 부분적 SphI절단이 수행되었다. 이 반응으로부터 2489bp SphI-BamHI 단편은 AMGII cds에 연결된 S.c.TPI 프로모터를 애워싸게 되었다.

위 단편은 pT7GII의 1052bp BamHI단편과 함께 탈인산가수분해효소 처리된 pMT743(EP37856/US 5162498)의 벡터단편에 연결되는데 이 pMT743은 SphI-BamHI절단의 결과물이다. 결과적 플라스미드는 pLaC103이다.

열 안정성 AMG 변이체의 선별

라이브러리는 하기된 내열성 여과지 분석에 의하여 스크리닝되었다.

열안적성에 대한 여과지 분석법

효모 라이브러리가 30℃에서 최소한 72시간동안 100 ㎍/ml암피실린을 포함하는 SC ura 한천평판 상의 아세트산셀룰로스 여과지(OE 67, Schleicher & Schuell,Dassel, 독일)에 도말된다. 콜로니들은 니트로셀룰로스 여과지(Protran-Ba 85, Schleicher & Scchuell, Dassel, 독일)로 레플리카(replica)되고 실온에서 1시간동안 항온처리된다. 콜로니들은 Protran 여과지로부터 수도물로 세척된다. 각 여과지는, 스크리닝 후에 여과지 상의 포지티브 변이체를 위치결정할 수 있게 하기 위하여 항온처리 이전에 바늘을 이용하여 특정적으로 표지된다. 부착된 변이체와 함께있는 Protran 여과지들은 0.1M NaAc, pH4.5가 담겨 있는 용기에 옮겨지고 55 내지 75℃에서 15분간 항온처리된다. SC ura-한천 평판 상의 아세트산셀룰로스 여과지는 사용시까지 실온에 보관된다. 항온처리 후에, 잔류 활성은 5% 말토스, 1% 한천, 50mM NaAc, pH4.5를 포함하는 평판위에서 검출된다. Protran 여과지와 함께 분석 평판은 아세트산셀루로스 여과지와 같은 방법으로 표지되고, 2시간동안 50℃에서 항온처리된다. Protran여과지를 제거한 후 분석평판은 포도당 GOD-Perid( Boehringer Mannheim GmbH, 독일)로 염색된다. 잔류 활성이 있는 변이체들은 분석평판에서 하얀 배경에 짙은 녹색의 점으로 검출된다. 개선된 변이체들은 보관 평판에 위치된다. 개선된 변이체는 처음 스크리닝과 같은 조건하에서 두 차례 재스크리닝된다.

DOPE 프로그램을 사용한 무작위 돌연변이유발을 위한 일반적 방법

무작위 돌연변이 유발은 하기의 단계에 의하여 수행된다:

1. 모 효소에서 변형을 위한 관심의 영역을 선택한다,

2. 선택된 영역에서 돌연변이 부위와 변이되지 않는 부위를 결정한다,

3. 예를 들어, 원하는 안정성 및/또는 제작되어야 하는 변이의 수행의 관점에서, 어떤 종류들의 돌연변이들이 수행되어야 하는지 결정한다,

4. 구조적으로 합당한 변이체를 선택한다.

5. 단계 3에서 선택된 잔기들을 단계 4를 고려하여 조정한다.

6. 뉴클레오티드 분포를 적합한 DOPE 알고리즘을 사용하여 분석한다.

7. 필요하다면, 원하는 잔기들을 유전자 코드 리얼리즘(realism)에 조정한다, 예를 들어 정지 코드의 도입을 피하기 위하여; 예를 들어 유전코드로부터의 제약들을 계산한다, 숙련된 자들은 어떤 코돈 조합들은 실제로는 사용될 수 없고 적응시킬 필요가 있다는 것을 인지할 것이다.

8. 프라이머를 제작한다,

9. 무작위 돌연변이유발을 프라이머를 사용하여 수행한다.

10. 개선된 특성에 대한 스크리닝을 통하여 결과적 글루코아밀라제 변이체를 선택한다.

Dope 알고리즘

단계 6에서 사용할 적합한 도프 알고리즘은 당업계에서 주지되어 있다. 이와 같은 알고리즘의 하나는 Tomandl, D. et al., 1997, Journal. of Computer-Aided Molecular Design 11:29-38에 서술되어있다. 또 다른 알고리즘은 DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, 및 Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26:697-702) 이다.

실시예 1

N-말단 연장을 가진 글루코아밀라제의 제작

무작위 돌연변이유발

코딩 부위에서 약 75bp 바깥 양쪽의 서열에 대응하는 두 프라이머 5' (4244: 5'-TCA AGA ATA GTT CAA ACA AGA AGA-3')과 3'말단 (KB14: 5'-CTT TTC GGT TAG AGC GGA TG-3')와 함께 올리고뉴클레오티드 AM11-18 (KexII부위 뒤와 성숙 단백질 앞에 1 내지 7개의 여분 아미노산을 삽입할 가능성을 두고)와 AM18가 오버랩 연장 방법 (Horton et al., Gene, 77 (1989), pp. 61-68)에 의한 PCR-라이브러리-절편을 생산하는데 사용되었다.

하기 PCR 반응이 수행되었다:

PCR 반응 1: 5'primer로서 4244와 3'primer로서 AM18.

PCR 반응 2: 5'primer로서 AM11 3'primer로서 KB14 (7 여분 aa).

PCR 반응 3: 5'primer로서 AM12 와 3'primer로서 KB14 (6 여분 aa).

PCR 반응 4: 5'primer로서 AM13 와 3'primer로서 KB14 (5 여분 aa).

PCR 반응 5: 5'primer로서 AM14 와 3'primer로서 KB14 (4 여분 aa).

PCR 반응 6: 5'primer로서 AM15 와 3'primer로서 KB14 (3 여분 aa).

PCR 반응 7: 5'primer로서 AM16 와 3'primer로서 KB14 (2 여분 aa).

PCR 반응 8: 5'primer로서 AM17 와 3'primer로서 KB14 (1 여분 aa).

반응 1의 주형: pAMGY, 반응 2 내지 8의 주형: pAMGY나 동일 벡터내에 클로닝된 개선된 변이체.

PCR 반응 9 내지15: PCR 반응 2 내지 8 유래 DNA 중 어느 하나와 함께 PCR반응 1 유래 DNA가, 5'primer로서 4244와 3'primer로서 KB14를 사용한 PCR 반응의 주형으로 사용되었다.

이들 최종적 PCR 단편이, (코딩영역을 제거하고 동시에 각 말단에 약 75bp의 오버랩을 생성하여 재조합이 일어나는 것을 가능케하기 위하여) 제한효소 SmaI (또는 BamHI)과 XbaI으로 잘린 pJSO026과 함께 효모 내에서 생체내 재조합에 사용되었다.

AM11: 5'-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS

GCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3' (SEQ ID NO: 2)

AM12: 5'-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS GCG

ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3' (SEQ ID NO: 3)

AM13: 5'-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS GCG ACC

TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3' (SEQ ID NO: 4)

AM14: 5'-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS GCG ACC TTG

GAT TCA TGG TTG AGC-3' (SEQ ID NO: 5)

AM15: 5'-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS GCG ACC TTG GAT

TCA TGG TTG AGC-3' (SEQ ID NO: 6)

AM16: 5'-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS GCG ACC TTG GAT TCA

TGG TTG AGC-3' (SEQ ID NO: 7)

AM17: 5'-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS GCG ACC TTG GAT TCA TGG

TTG AGC-3' (SEQ ID NO: 8)

AM18: 5'-GCG CTT GGA AAT CAC ATT TGC-3' (SEQ ID NO: 9)

4244: 5'-TCA AGA ATA GTT CAA ACA AGA AGA-3' (SEQ ID NO: 10)

KB14: 5'-CTT TTC GGT TAG AGC GGA TG-3' (SEQ ID NO: 11)

실시예 2

KexII 인지부위 변경에 의한 N-말단 연장의 도입

N-말단 연장은 성숙 단백질 앞의 KexII 인지부위 "KR"을 제거하거나 변경하여 도입될 수 있다. 6 아미노산의 연장이 그 다음 6 아미노산으로 구성된 프로-서열로서 도입될 수 있다. 효모에서 KR이 KexII에 대한 최적 인지부위이다. RR로 변경은 절단된 분자의 %를 감소시킬 것이다 (Bevan, A, Brenner, C 및 Fuller, R. S. 1998, PNAS 95 (18): 10384-10389). 대안으로, KR 앞에 P를 도입하는 것은 절단된 분자의 %를 감소시킬 것이다.

프로-서열은 NVISKR로부터 NVISRR 또는 NVIPKR로 변경되었고 대략 50%의 연장 NIVSRR이나 NIVPKR를 가진 AMG 분자와 50%의 정상 프로세싱된 성숙 AMG 분자를 부여하였다.

실시예 3

시스테인 다리를 함유하는 글루코아밀라제 (AMG 2) 변이체의 제조

본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 하기 돌연변이: A479C, T480C, P481C, A471C, S431C, S8C, E299C 또는 D375C와 펩티드 연장 ACPPSTS와 ASPPSTS를 함유한다. 모 글루코아밀라제 (AMG 2)는 하기 돌연변이: A479C, T480C, P481C, A471C, S431C, S8C, E299C 또는 D375C를 함유한다.

시스테인 다리는 하기와 같이 제조되었다:

부위특이적 돌연변이유발

AMG G2 효소 (SEQ ID NO: 11)의 변이체를 제조하기 위하여 시중 키트인 카멜레온(Chameleon) 이중-가닥, 부위특이적 돌연변이유발 키트가 제조자의 지시에 따라 사용되었다.

문제의 AMG G2 효소를 코딩하는 유전자, 플라스미드 pIVI9를 BamHI/XhoI로 잘라서 (Coprinus 페르옥시다제 유전자를 절단하여), 주형으로서 (G2 cDNA를 함유하는) pLaC103과 두가지 프라이머로서 139123 (CGCACGAGATCTGCAATGTCGTTCCGATCTCTA) (SEQ ID NO: 12)와 139124 (CAGCCGGTCGACTCACAGTGACATACCAGAGCG) (SEQ ID NO: 13)를 사용하여 만든, (BglII/SalI로 잘린) pcr 절편을 가진 AMG G2 내에 클로닝하여 준비된 pENI1542 상에 위치한다. 이것은, 변이체와 마찬가지로 DNA 서열결정에 의하여 확인되었다. 제조자의 지시에 따라 하기 프라이머:

7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3' (SEQ ID NO. 14)의 사용에 의하여 pNEI1542의 암피실린 유전자의 ScaI 부위가 MluI 부위로 변경되었다. (따라서 암피실린 내성 유전자에서 발견되는 ScaI 부위는 변경되어 MluI 부위에서 잘리는데 사용된다). 문제의 AMG 유전자를 포함하는 pENI1542 벡터는 그 다음 DNA 중합효소와 올리고 7258 (SEQ ID NO. 14)와 21401 (SEQ ID NO. 15)의 주형으로 사용되었다. 프라이머 번호 21401 (SEQ ID NO. 15)는 선택 프라이머로 사용되었다. 21401: 5'p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg ccttgg acc tgc gtt ata gcc 3' (SEQ ID NO: 15)

시스테인 잔기의 도입은 하기와 같이 원하는 돌연변이를 포함하는 적당한 올리고의 부가에 의하여 문제의 AMG 유전자 내로 도입된다:

돌연변이유발 올리고:

ACPPSTS 137767 (SEQ ID NO: 16)

(5'P-GTGATTTCCAGCGGTGCCCGCCGTCCACGTCCGCGACCTTGGATTCATGG 3')

ASPPSTS 137766 (SEQ ID NO: 17)

(5'P-GTGATTTCCAGCGGTCCCCGCCGTCCACGTCCGCGACCTTGGATTCATGG 3')

D375C 137765 (SEQ ID NO: 18)

(5'P-GTAGCATTGTATGTGCCGTGAAGAC 3')

S431C 146826 (SEQ ID NO: 19)

(5'P-ACCGTCGTAACTGCGTCGTGCCTGC 3')

E299C 146828 (SEQ ID NO: 20)

(5'P-GTCTCAGTGACAGCTGCGCTGTTGCGGTG 3')

A479C 146829 (SEQ ID NO: 21)

(5'P-CCACTACGACGTGCACCCCCACTGG 3')

T480C 146830 (SEQ ID NO: 22)

(5'P-CTACGACGGCTTGCCCCACTGGATCC 3')

P481C 146831 (SEQ ID NO: 23)

(5'P-CGACGGCTACCTGCACTGGATCCGGC 3')

S8C 146827 (SEQ ID NO: 24)

(5'P-TGGATTCATGGTTGTGTAACGAAGCGACC 3')

생산된 돌연변이

ACPPSTS, D375C

ACPPSTS, S431C

ACPPSTS, E299C

ACPPSTS, A479C

ACPPSTS, T480C

ACPPSTS, P481C

ASPPSTS

S8C+A479C

S8C+T480C

S8C+P481C

돌연변이는 전체 유전자의 서열결정에 의하여 확인된다. 플라스미드는 상기 "재료와 방법" 절에 기술된 방법을 사용하여A. oryzae내로 형질전환되었다. 변이체는 상기 "재료와 방법" 절에 기술된대로 발효되고 정제되었다.

스크리닝

라이브러리는 상기 "재료와 방법" 절에서 기술된 열 안정성 여과지분석법에서 스크리닝된다.

실시예 4

증가된 열 안정성을 가지는 글루코아밀라제 변이체

열 안정성 활성은 상기 방법절에 기술된 대로 pH 4.5, 70℃에서 측정되었다.

70℃, pH 4.5 에서의 열 안정성

Enzyme Residual activity (%)

5 min 20 min 40 min

AMG, G2 (wt) 71 21 2

NVIPKR 85 31 8

PLALSD 73 26 8

결과는 본 발명에 따른 글루코아밀라제의 N-말단에 연장을 연결하여 열 안정성을 증가시키는 것이 가능함을 나타낸다.

실시예 6

증가된 열 안정성을 가지는 글루코아밀라제 변이체

A. niger에서 발현된 개선된 변이체의 열 안정성 활성이 상기 방법 절에 기술된대로 미처리 샘플상 pH 4.5, 70℃에서 측정되었다.

Variant	Residual activity (%)40 min
G2ACPPSTS+E299CACPPSTS+A479CACPPSTS+T480C	4191124

변이체 ACPPSTS+E299C의 N-말단 분석은 이 변이체의 N-말단내에는 자유 시스테인이나 산화형 시스테인이 존재하지 않는 것을 나타냈고 이는 N-말단의 시스테인과 위치 299내 시스테인 간에 -SS- 결합이 형성되었음을 나타낸다.

Claims (38)

1. N-말단에 펩티드 연장을 가지는 모 글루코아밀라제의 변이체.
2. 제 1 항에 있어서, 펩티드 연장은 N-말단에 연결된 것을 특징으로 하는 변이체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 펩티드 연장은 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장은 일반식:

   x - C - (x)_n을 가지는며, x는 독립적으로 한 개의 아미노산을 나타내는 것을 특징으로 하는 변이체.
5. 제 4 항에 있어서, x는 비-α-헬릭스 형성자인 것을 특징으로 하는 변이체.
6. 제 5 항에 있어서, 펩티드 연장은 M, K, H, V, I, Y, C, F, T, G, N, P, S 또는 D로 구성되는 군에서 선택되는 비-α-헬릭스 형성자를 포함하는 것 을 특징으로 하는 변이체.
7. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장의 길이는 1 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1내지 50개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 1 내지 20개의 아미노산 잔기 그리고 더욱 바람직하게는 1내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장은 모 글루코아밀라제 변이체 성숙 부분과 공유결합을 형성할 능력이 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서, 그 시스테인 잔기들이 함께 시스테인 다리를 형성하도록 하는 방식으로 펩티드 연장 내에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하고 모 글루코아밀라제의 성숙 부분에 한 개의 시스테인 잔기를 포함하는 변이체.
10. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장은 글루코아밀라제 효소의 트리펩티딜 아미노펩티다제 절단을 막을 능력이 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
11. 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 모 상동성 글루코아밀라제는미생물 유래 글루코아밀라제를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
12. 제 11 항에 있어서, 미생물은 진성세균, 고세균, 균류, 조류 및 원생생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
13. 제 12 항에 있어서, 모 상동성 글루코아밀라제는 사상균에서 유래하는 것을 특징으로 하는 변이체.
14. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 모 상동성 글루코아밀라제는Aspergillus nigerG1이나 G2 글루코아밀라제인 것을 특징으로 하는 변이체.
15. 제 1 항 내지 제 14 항중 어느 한항에 있어서, 펩티드 연장은 하기 펩티드 연장:

    Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg (NVISRR),

    Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg (NVIPKR),

    Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ASPPSTS),

    Ala-Cys-Pro-Prp-Ser-Thr-Ser (ACPPSTS),

    Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu (PCSAGE),

    Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp (PLALSD),

    Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu (LGVTGE),

    Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu (AGPLPSE),

    Leu-Gly-Pro-Asp (LGPD),

    Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg (IFELTPR),

    Ile-Ser-Asn (ISN),또는

    Met-Asn (MN) 중 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
16. 제 3 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 있어서, 모 글루코아밀라제의 성숙 부분내 시스테인 잔기는 삽입된 것이거나 모 글루코아밀라제의 아미노산 잔기를 치환한 것임을 특징으로 하는 변이체.
17. 제 1 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서,Aspergillus nigerG1 글루코아밀라제내의 위치 375에 대응하는 위치의 아스파르트산 잔기, 위치 299에 대응하는 위치의 글루탐산 잔기, 위치 431에 대응하는 위치의 세린 잔기, 위치 471에 대응하는 위치의 알라닌 잔기, 위치 479에 대응하는 위치의 알라닌 잔기, 위치 480에 대응하는 위치의 트레오닌 잔기, 위치 481에 대응하는 위치의 프롤린 잔기, 또는 위치 8에 대응하는 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 변이체.
18. 제 1 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서, 변이체는 모 글루코아밀라제에 비하여 개선된 열 안정성을 가지는 변이체.
19. 제 1 항 내지 제 18 항중 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 변이체를 코딩하는 DNA 서열.
20. 제 1 항 내지 제 18 항중 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조체.
21. 제 20 항에 따르는 DNA 구조체을 가지는 재조합 발현 벡터.
22. 제 11 항에 따르는 DNA 구조체 또는 제 21 항에 따르는 벡터로 형질전환된 세포.
23. 제 22 항에 있어서, 세포는 세균이나 균류같은 미생물인 것을 특징으로 하는 세포.
24. 제 23 항에 있어서, 세포는 프로테아제 결핍Aspergillus oryzae또는Aspergillus niger인 것을 특징으로 하는 세포.
25. 녹말이나 부분적으로 가수분해된 녹말을 덱스트로스를 함유하는 시럽으로 전환하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제 1 항 내지 제 18 항중 어느 한 항에 따른글루코아밀라제 변이체의 존재 하에 녹말 가수분해물을 당화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 글루코아밀라제 변이체는 연료나 음료를 위한 알콜을 생산하는 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 25 항에 있어서, 글루코아밀라제 변이체는 음료를 생산하기 위한 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 25 항에 있어서, 글루코아밀라제 변이체는 시트르산, 아스코르브산, 라이신, 글루탐산과 같은 유기화합물을 생산하는 발효방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. N-말단에 연장을 만들어 모 글루코아밀라제의 열 안정성을 개선시키는 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 연장은 펩티드 연장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 펩티드 연장은 비-α-헬릭스 형성자, 바람직하게는 M, K, H, V, I, Y, C, F, T, G, N, P, S 또는 D 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는방법.
32. 제 29 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장의 길이는 1 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1내지 50개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 1 내지 20개의 아미노산 잔기 그리고 더욱 바람직하게는 1내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 29 항 내지 제 32 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장은 모 글루코아밀라제 변이체 성숙 부분과 공유결합을 형성할 능력이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 29 항 내지 제 33 항중 어느 한 항에 있어서, 그 시스테인 잔기들이 함께 시스테인 다리를 형성하도록 하는 방식으로 펩티드 연장 내에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하고 모 글루코아밀라제의 성숙 부분에 한 개의 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 29 항 내지 제 34 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장은 하기 펩티드 연장:

    Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg (NVISRR),

    Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg (NVIPKR),

    Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ASPPSTS),

    Ala-Cys-Pro-Prp-Ser-Thr-Ser (ACPPSTS),

    Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu (PCSAGE),

    Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp (PLALSD),

    Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu (LGVTGE),

    Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu (AGPLPSE),

    Leu-Gly-Pro-Asp (LGPD),

    Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg (IFELTPR),

    Ile-Ser-Asn (ISN),또는

    Met-Asn (MN) 중 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 29 항 내지 제 35 항중 어느 한 항에 있어서, 모 글루코아밀라제의 성숙 부분내 시스테인 잔기는 삽입된 것이거나 모 글루코아밀라제의 아미노산 잔기를 치환한 것임을 특징으로 하는 방법.
37. 제 29 항 내지 제 36 항중 어느 한 항에 있어서,Aspergillus nigerG1 글루코아밀라제내의 위치 375에 대응하는 위치의 아스파르트산 잔기, 위치 299에 대응하는 위치의 글루탐산 잔기, 위치 431에 대응하는 위치의 세린 잔기, 위치 471에 대응하는 위치의 알라닌 잔기, 위치 479에 대응하는 위치의 알라닌 잔기, 위치 480에 대응하는 위치의 트레오닌 잔기, 위치 481에 대응하는 위치의 프롤린 잔기, 또는 위치 8에 대응하는 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 29 항 내지 제 37 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장은 글루코아밀라제 효소의 트리펩티딜 아미노펩티다제 절단을 막을 능력이 있는 것을 특징으로 하는 방법.