JP2003513666A - フンガミル様アルファ−アミラーゼ変異体 - Google Patents

フンガミル様アルファ−アミラーゼ変異体

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ビスゴールド−フランツェン，ヘンリク
スベンゼン，アラン
ペデルセン，スベン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、例えばデンプン加工のために適当な、酸pHにおいて向上した熱安定性を示す親フンガミル様真菌アルファ−アミラーゼの変異体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、特に酸pHにおいて向上した熱安定性を有するフンガミル（Ｆｕｎｇ
ａｍｙｌ（商標））様アルファ−アミラーゼのアルファ−アミラーゼ変異体（突
然変異体）に関する。本発明は更にかかる変異体の使用に関する。
【０００２】 発明の背景 アルファ−アミラーゼ（アルファ−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラ
ーゼ；ＥＣ．３．２．１．１）はデンプン並びにその他の線形及び枝分れした１
，４−グルコシドオリゴ糖及び多糖の加水分解を触媒する酵素の群を構成する。
【０００３】 この工業的に極めて重要な酵素のクラスに関する莫大な数の特許及び科学論文
が存在する。「ターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標））様アルファ−アミ
ラーゼ」と称される数多くのアルファ−アミラーゼ及びその変異体が、例えばＷ
Ｏ９０／１１３５２，ＷＯ９５／１０６０３，ＷＯ９５／２６３９７，ＷＯ９６
／２３８７３及びＷＯ９６／２３８７４から公知にされている。ターマミル様ア
ルファ−アミラーゼは非常に熱安定性であり、それ故高温で実施されるプロセス
、例えばデキストロース生産プロセスにおけるデンプンの液化にとって適当であ
る。
【０００４】 アルファ−アミラーゼの別の群は「フンガミル（Ｆｕｎｇａｍｙｌ）（商標）
様アルファ−アミラーゼ」と称され、それはアスペルギルス・オリザに由来する
アルファ−アミラーゼに近縁するアルファ−アミラーゼである（そしてＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１に示す）。このようなフンガミル様アルファ−アミラーゼは比較
的弱熱安定性であり（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｄｅｎｍａｒｋにより商標名
ＦＵＮＧＡＭＹＬTMで販売されている商品は５５℃付近にて至適を有する）、そ
れ故高温で実施するプロセスには適当でない。フンガミル様アルファ−アミラー
ゼは今日、例えば醸造工業のためのシロップの作製のために利用されている。か
かるプロセスは６０℃付近で行われ、その弱熱安定性を補うために２倍近い酵素
投与量を通常利用しなくてはならないこととなる。更に、５５℃では感染の問題
も生じうる。
【０００５】 このようなプロセスは更に今日では、例えばpH４．５の代わりにpH５．５にて
実施され、pHの調整及びシロップへのナトリウムの添加が必要とされている。
【０００６】 従って、酸pHにて向上した熱安定性を好適に有するフンガミル様アルファ−ア
ミラーゼを提供するのが有利であろう。
【０００７】 発明の簡単な開示 本発明の目的は、特に酸pHにおいて向上した熱安定性を有するフンガミル様ア
ルファ−アミラーゼ変異体の提供にある。
【０００８】 「向上した熱安定性を有するアルファ−アミラーゼ変異体」とは、本発明との
関係において、対応の親アルファ−アミラーゼよりも高い熱安定性を有するアル
ファ−アミラーゼ変異体を意味する。熱安定性の決定は以降の材料と方法の章で
説明する。
【０００９】 本発明者は、以下に説明する通り、向上したフンガミル様アルファ−アミラー
ゼ変異体を提供する。
【００１０】 発明の詳細な開示 本発明の基礎となる研究の目標は、フンガミル様アルファ−アミラーゼの特に
酸pHでの熱安定性の向上を図ることにある。
【００１１】向上した熱安定性を得るために突然変異すべき位置及び／又は領域の同定 分子動力学（ＭＤ）シミュレーションはタンパク質構造におけるアミノ酸の移
動性を示唆する（McCammon, JA and Harvey, SC., (1987)「Dynamics of protei
ns and nucleic acids」Cambridge University Press参照のこと）。かかるタン
パク質の動力学は往々にして結晶学Ｂ因子（Stout, GH and Jensen, LH, (1989)
,「X-ray structure determination」, Wiley 参照のこと）又はＢ因子自体と比
較される。滴定可能な残基の様々なプロトン化状態でＭＤシミュレーションを実
行することにより、残基のpH関連移動がシミュレーションされる。最大の移動度
又はフレキシビリティー（ここでは、等方性変動という）をランダム突然変異誘
発のために選定する。タンパク質の所定領域において見い出せる高い移動度は、
これらの複数の残基の中の残基を置換することによって熱的に改善されうるもの
と解される。置換はより大きな側鎖を有する残基及び／又は近傍環境における残
基と改善された接触を形成する能力を有する残基に対して向けられる。アスペル
ギルス・オリザに由来するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す親フンガミルアルファ
−アミラーゼ骨格をＭＤシミュレーションのために用いた。
【００１２】 分子動力学（ＭＤ）シミュレーション又はＢ因子検査（Protein Data Base (P
DB) (www. rcsb. org)ファイル６ＴＡＡに同封）（Swift, H.J., Brady, L., De
rewenda, Z.S., Dodson, E.J., Dodson, G.G., Turkenburg, J.P., Wilkinson,
A.J. : Structure and molecular model refinement of Aspergillus oryzae (T
AKA) alpha-amylase : an application of the simulated-annealing method. A
cta Crystallogr B47 pp. 535 (1991)）により、特に高まった熱安定性を獲得す
ることが所望されるときの突然変異に適すると認められた領域は以下の通りであ
る： 領域９８−１１０、 領域１５０−１６０、 領域１６１−１６７、 領域２８０−２８８、 領域４４８−４５５、 領域４６８−４７５。
【００１３】 上記の領域はフレキシブルであることが示されている。これらの領域をより硬
質にすると、分子はより熱安定性となるであろう。
【００１４】 従って、第一の観点において、本発明は以降に詳しく説明する領域及び位置に
おいて１又は複数の突然変異を含んで成る親フンガミル様アルファ−アミラーゼ
の変異体に関する。
【００１５】命名法 本明細書及び請求の範囲において、アミノ酸残基に関する慣用の１文字及び３
文字表記を使用する。便宜上、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体は下記の命
名法を利用して記述する： もとのアミノ酸：位置：置換アミノ酸
【００１６】 この命名法に従うと、例えば３０位でのアラニンのアスパラギンによる置換は
以下の通りに示す： Ａｌａ３０Ａｓｎ又はＡ３０Ｎ 同位置でのアラニンの欠失は以下の通りに示す： Ａｌａ３０* 又はＡ３０* そして追加のアミノ酸残基、例えばリジンの挿入は以下の通りに示す： Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓ又はＡ３０ＡＫ
【００１７】 アミノ酸残基の連続鎖、例えばアミノ酸残基３０〜３３の欠失は、（３０−３
３）* 又はΔ（Ａ３０−Ｎ３３）と示す。
【００１８】 特定のアルファ−アミラーゼが別のアルファ−アミラーゼとの対比において「
欠失」を含み、そしてかかる位置において挿入が施されている場合、これは次の
通りに示す。 *３６Ａｓｐ又は *３６Ｄ （３６位でのアスパラギン酸の挿入）
【００１９】 複数の突然変異はプラス表記で分けている。即ち： Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ これは、３０及び３４位において、アラニン及びグルタミン酸をそれぞれアス
パラギン及びセリンに置換する突然変異を表わす。複数の突然変異は、プラス表
記と同じ意味として、以下の通りに分けられることもある： Ａｌａ３０Ａｓｐ／Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ／Ｅ３４Ｓ
【００２０】 １又は複数個の択一的なアミノ酸残基を所定の位置に挿入してもよい場合、以
下の通りに示す： Ａ３０Ｎ，Ｅ又は Ａ３０ＮもしくはＡ３０Ｅ
【００２１】 更に、修飾のために適当な位置が任意の特定の修飾を示唆することなく特定さ
れている場合、その位置に存在するアミノ酸残基を任意のアミノ酸残基が置換し
てよいものと理解される。従って、例えば３０位のアラニン（Ａ）の修飾を述べ
る場合に、特定していないとき、又は「Ａ３０Ｘ」と特定しているとき、アラニ
ンは欠失していても、任意のその他のアミノ酸、即ち、Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ａ，Ｃ，Ｑ
，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖで置換されていて
もよいものと理解される。
【００２２】フンガミル様アルファ−アミラーゼ 親フンガミル様アルファ−アミラーゼは本発明に従うと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２に示すアルファ−アミラーゼ及び／もしくはアルファ−アミラーゼタンパク
質配列の成熟部をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＤＮＡ配列と少なく
とも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、
更により好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９３％、
更により好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９７％、
更により好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するか、並びに／又はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１及び２に示し、且つＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ (PD
B) (www. rcsb. org）ファイル６ＴＡＡ（Swift, H.J., Brady, L., Derewenda,
Z.S., Dodson, E.J., Dodson, G.G., Turkenburg, J.P., Wilkinson, A.J. : S
tructure and molecular model refinement of Aspergillus oryzae (TAKA) alp
ha-amylase : an application of the simluated-annealing method. Acta Crys
tallogr B47 pp. 535 (1991)）に開示のＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）の三次構
造を構造的に擬態するか、並びに／又は本明細書のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示
すアルファ−アミラーゼの成熟部をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＤ
ＮＡ配列の一部にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる。
【００２３】 「フンガミル様アルファ−アミラーゼ」の定義に網羅されるかかるアルファ−
アミラーゼの特定の例にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアスペルギルス・オリ
ザＴＡＫＡアルファ−アミラーゼ（ＥＰ ２３８ ０２３）及びＥＰ ３８３，
７７９Ｂ２（段落〔００３７〕）に開示のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アルフ
ァ−アミラーゼ（Ｅｘａｍｐｌｅ １に示すＡ．ニガー遺伝子のクローニングも
参照のこと）が挙げられる。
【００２４】 一の態様において、フンガミル様アルファ−アミラーゼは真菌生物、特にアス
ペルギルス属の生物、特にＡ．オリザ又はＡ．ニガーに由来する。
【００２５】商業的に入手可能な親フンガミル様アルファ−アミラーゼ 商業的に入手可能な親フンガミル様アルファ−アミラーゼにはＦｕｎｇａｍｙ
ｌ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ， Ｄｅｎｍａｒｋ由来）が挙げら
れる。Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）はアスペルギルス・オリザの選定された株
から得られた真菌アルファ−アミラーゼである。デンプン工業において、Ｆｕｎ
ｇａｍｙｌ（登録商標）は高マルトースシロップ、４５〜６０％マルトース（２
〜７％グルコース）又は高転化シロップ、ＤＥ ６０−７０、３５〜４３％グル
コース、３０〜３７％マルトースの生産に使用されている。その他の商業的な真
菌アルファ−アミラーゼにはアスペルギルス・オリザ由来のＣｌａｒａｓｅ（商
標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ由来）；及びアスペルギルス・ニガ
ー由来のＭａｌｔｏｍｙｌ（商標）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ由来
）が挙げられる。
【００２６】 醸造工業において、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）（及び類似の製品）が麦汁
の発酵率を高めるために発酵の際に添加される。
【００２７】 アルコール工業において、既存の装置が低温液化（５５〜６０℃）を好むなら
、蒸留マッシュの中でのデンプンの液化のためにＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）
が利用されうる。ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）（及び類似の製品）はベーキン
グのためにも利用され、そしてあらゆるタイプのパン及びベーカリー製品に使用
されうる。例えば、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）はドウの安定性を向上させ、
より良いパン体積をもたらし、パンのしんの柔軟性を向上させ、そしてパンの皮
を濃い色にする。
【００２８】 本発明のアルファ−アミラーゼ変異体 第一の観点において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列に
おいて以下の位置又は領域にて１又は複数の突然変異を含んで成る親フンガミル
様アルファ−アミラーゼの変異体に関する： 領域９８−１１０、 領域１５０−１６０、 領域１６１−１６７、 領域２８０−２８８、 領域４４８−４５５、 領域４６８−４７５、 及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％の
同一性を示す相同フンガミル様アルファ−アミラーゼにおける対応の位置又は領
域。
【００２９】 一の態様において、突然変異した領域は領域９８−１１０である。
【００３０】 一の態様において、突然変異した領域は領域９８−１１０、より詳しくは下記
の位置のうちの１又は複数である： ９８，９９，１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１
０７，１０８，１０９，１１０。
【００３１】 特定の置換は以下の通りである： ９８Ｘ、好ましくはＴ； ９９Ｘ、好ましくはＴ； １００Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｉ，Ｍ；好ましくはＹ； １０１Ｒ； １０２Ｓ，Ｔ，Ｖ； １０３Ｉ，Ｆ，Ｖ、好ましくはＩ； １０４Ｔ，Ｖ，Ｉ； １０５Ｘ、好ましくはＡ； １０６Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ、好ましくはＶ； １０７Ｖ，Ｉ，Ｍ； １０８Ｙ，Ｒ，Ｋ； １０９Ｄ，Ｎ，Ｑ； １１０Ｑ。
【００３２】 一の態様において、突然変異した領域は領域１５０−１６０、より詳しくは以
下の位置のうちの１又は複数である： １５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５７，１５８
，１５９，１６０。
【００３３】 特定の置換は以下の通りである： １５１Ｙ，Ｑ，Ｌ，Ｉ，Ｒ、好ましくはＹ； １５２Ｖ，Ｌ； １５３Ｔ，Ｎ，Ｓ、好ましくはＳ； １５４Ｌ，Ｙ，Ｖ，Ｔ，Ｓ、好ましくはＬ； １５５Ｆ，Ｎ，Ｌ； １５６Ｘ、好ましくはＤ，Ｎ，Ｓ，Ｔ； １５７Ｓ，Ｔ，Ｎ； １５８Ｅ，Ｙ １５９Ｘ、好ましくはＳ，Ａ； １６０Ｘ、好ましくはＮ。
【００３４】 一の態様において、突然変異した領域は領域１６１−１６７、より詳しくは以
下の位置のうちの１又は複数である： １６１，１６２，１６３，１６４，１６５，１６６，１６７。
【００３５】 特定の置換は以下の通りである： １６１Ｉ，Ｓ，Ｔ； １６２Ｄ，Ｎ，Ｑ，Ｙ； １６３Ｅ，Ｑ，Ｎ； １６６Ｖ，Ｆ，Ｙ，Ｉ，Ｓ，Ｔ、好ましくはＶ，Ｆ，Ｙ； １６７Ａ。
【００３６】 一の態様において、突然変異した領域は領域２８０−２８８、より詳しくは以
下の位置のうちの１又は複数である： ２８０，２８１，２８２，２８３，２８４，２８５，２８６，２８７，２８８
。
【００３７】 特定の置換は以下の通りである： ２８０Ｑ，Ｙ，Ｒ； ２８１Ｘ、好ましくはＴ，Ａ； ２８２Ｘ、好ましくはＳ，Ｔ； ２８５Ｌ，Ｎ； ２８６Ｘ、好ましくはＤ； ２８７Ｖ，Ｓ，Ａ； ２８８Ｎ，Ｆ，Ｙ，Ｅ，Ｄ、好ましくはＮ。
【００３８】 一の態様において、突然変異した領域は領域４４８−４５５、より詳しくは以
下の位置のうちの１又は複数である： ４４８，４４９，４５０，４５１，４５２，４５３，４５４，４５５。
【００３９】 特定の置換は以下の通りである： ４４８Ｘ、好ましくはＡ，Ｌ，Ｙ，Ｓ，Ｔ； ４４９Ｘ、好ましくはＬ，Ｖ，Ｓ，Ｔ； ４５０Ｉ，Ｔ，Ｌ； ４５２Ｉ，Ｌ； ４５４Ｉ，Ｌ； ４５５Ｄ，Ｅ，Ｓ，Ｔ。
【００４０】 一の態様において、突然変異した領域は領域４６８−４７５、より詳しくは以
下のうちの１又は複数である： ４６８，４６９，４７０，４７１，４７２，４７３，４７４，４７５。
【００４１】 特定の置換は以下の通りである： ４６８Ｆ，Ｙ，Ｈ； ４６９Ｅ，Ｄ，Ｑ，Ｎ； ４７０Ｘ、好ましくはＡ，Ｓ，Ｔ； ４７１Ｎ，Ｔ，Ｋ，Ｒ，Ｆ，Ｙ好ましくはＮ，Ｔ，Ｙ； ４７２Ｒ； ４７３Ｌ，Ｎ，Ｙ； ４７５Ｘ、好ましくはＴ，Ｒ。
【００４２】 酸pHでの向上した安定性 本発明の一の目的はフンガミル様アルファ−アミラーゼを親アルファ−アミラ
ーゼ（即ち、対応の突然変異していないアルファ−アミラーゼ）と比較して一段
と酸性にすることにある。
【００４３】 フンガミル様アルファ−アミラーゼ変異体が親フンガミル様アルファ−アミラ
ーゼよりも一段と酸性であるということは、酸pHでの安定性がその対応の親アル
ファ−アミラーゼよりも高いことを意味する。アミラーゼが一段と酸性であるか
は「材料と方法」の章に記載の通りにして決定されうる。
【００４４】 「酸pH」とは、少なくとも本発明との関連では、４〜６、例えば４〜５、特に
４．２〜４．７の範囲のpHを意味する。
【００４５】 一段と酸性な真菌アルファ−アミラーゼの提供は、それが真菌アルファ−アミ
ラーゼ変異体を適当なグルコアミラーゼと一緒に又は同時に、例えばデンプン加
工における（デキストリン化）糖化工程の際に使用できる可能性を開くことを理
由に、所望される。
【００４６】 熱安定性 本発明の一の目的は一段と熱安定的なフンガミル様アルファ−アミラーゼを提
供することにある。
【００４７】 フンガミル様アルファ−アミラーゼ変異体が親フンガミル様アルファ−アミラ
ーゼよりも熱安定的であるということは、その至適温度が一段と高い温度へと押
し上げられたことを意味する。アミラーゼが一段と熱安定的であるかは「材料と
方法」の章に記載の通りにして決定されうる。
【００４８】 一段と熱安定的な真菌アルファ−アミラーゼの提供は、それが一段と効率的な
及び／又は迅速な液化工程を可能にすることを理由に、所望される。更に、液化
温度は感受性が弱まり、そして更に高めてもよい場合がある（即ち、冷却の必要
性が少なくなる）。更に、感染のおそれも少なくなる。
【００４９】 本発明の変異体は酸pHにおいての一段と高い安定性及び特に酸pHでの一段と高
い熱安定性の双方を有しうる。
【００５０】 相同性（同一性） 親アルファ−アミラーゼの上述した相同性（同一性）は２本のタンパク質又は
ＤＮＡ配列間での、第一配列の第二配列からの派生を示唆する同一性の度合いと
して決定される。相同性（同一性）は当業界公知のコンピュータープログラム、
例えばＧＣＧプログラムパッケージに供されているＧＡＰ（Program Manual for
the Wisconsin Package, Version 8, 1994年８月、Genetics Computer Group,
575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and W
unsch, C.D., (1970) Journal of Molecular Biology, 48. p. 443-453）を介し
て適当に決定されうる。核酸配列対比のための（デフォルト）ＧＡＰクリエーシ
ョンペナルティーは５．０とし、そしてＧＡＰ伸長ペナルティーは０．３とする
；そして、タンパク質配列対比のための（デフォルト）ＧＡＰクリエーションペ
ナルティーは３．０とし、そしてＧＡＰ伸長ペナルティーは０．１とする。ＧＡ
Ｐはアラインメントの作成及び同一性の算出のためにNeedleman and Wunsch (19
70), J. Mol. Biol. 48, p. 443-453 の方法を利用する。
【００５１】 ポリペプチド又はＤＮＡ配列についての上記の設定値によるＧＡＰを利用し、
親フンガミル様アルファ−アミラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸
配列の成熟部及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＤＮＡ配列のコード部と好まし
くは少なくとも６０％、例えば７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、そして最
も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性の度合いを有する。
【００５２】 好適な態様において、本発明の変異体は特に酸pHにおいて向上した熱安定性を
有する。
【００５３】ハイブリダイゼーション フンガミル様アルファーアミラーゼの特性決定に利用するオリゴヌクレオチド
プローブは注目のアルファーアミラーゼの全長又は部分ヌクレオチド又はアミノ
酸配列を基準に適切に調製し得る。
【００５４】 ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、5 ×SSC におけるプ
レソーキング、及び20％ホルムアミド、5 ×Denhardt's溶液、50mMのリン酸ナト
リウム、pH6.8 、及び50mgの音波処理された変性ウシ胸腺DNA の溶液における約
40℃で１時間のプレハイブリダイゼーション、続いて、100mM のATP により補充
された同じ溶液における約40℃で18時間のハイブリダイゼーション、続いて、2
×SSC 、0.2 ％のSDS の溶液において40℃（低ストリンジェンシー）、好ましく
は50℃（中位のストリンジェンシー）、より好ましくは65℃（高ストリンジェン
シー）、さらにより好ましくは約75℃（超高ストリンジェンシー）での30分のフ
ィルターの3 度の洗浄を包含する。ハイブリダイゼーション方法についての一層
の詳細は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., C
old Spring Harbor, 1989に見出され得る。
【００５５】 本発明において、“〜に由来する”（又は〜由来の）とは、注目の生物の株に
より生成されるか又は生成できるα−アミラーゼのみならず、またそのような株
から単離されたDNA によりコードされ、そして前記DNA 配列により形質転換され
た宿主生物において生成されるα−アミラーゼもまた示すことを意図される。最
後に前記用語は、合成及び／又はcDNA起原のDNA 配列によりコードされ、そして
注目のα−アミラーゼの同一特徴を有するα−アミラーゼを示すことを意図され
る。前記用語はまた、親α−アミラーゼが天然に存在するα−アミラーゼの変異
体、すなわち天然に存在するα−アミラーゼの1 又は複数のアミノ酸残基の修飾
（挿入、置換、欠失）の結果である変異体であり得ることを示す。
【００５６】 フンガミル様アルファーアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング α−アミラーゼをコードするDNA 配列のクローニング 親フンガミル様アルファーアミラーゼをコードするDNA 配列は、当業界におい
てよく知られている種々の方法を用いて、注目のα−アミラーゼを生成するいず
れかの細胞又は微生物から単離され得る。最初に、ゲノムDNA 及び/ 又はcDNAラ
イブラリーが、研究されるべきアルファ−アミラーゼを生成する生物からの染色
体DNA 又はメッセンジャーRNA を用いて構築されるべきである。次に、アルファ
−アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、ラベルされたオリゴヌクレオ
チドプローブが合成され、そして注目の生物から調製されるゲノムライブラリー
からアルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定するために使用され得る
。他方では、既知のアルファ−アミラーゼ遺伝子に対して相同の配列を含むラベ
ルされたオリゴヌクレオチドプローブが、低ストリンジェンシーのハイブリダイ
ゼーション及び洗浄条件を用いて、アルファ−アミラーゼをコードするクローン
を同定するためのプローブとして使用され得る。
【００５７】 アルファーアミラーゼをコードするクローンを同定するためのされにもう1つ
の方法は、発現ベクター、例えばプラスミド中にゲノムDNA のフラグメントを挿
入し、その得られるゲノムDNA ライブラリーによりアルファ−アミラーゼ陰性細
菌を形質転換し、そして次に、その形質転換された細菌を、アルファ−アミラー
ゼのための基質を含む寒天上にプレートし、それにより、アルファ−アミラーゼ
を発現するクローンの同定を可能にすることを包含する。
【００５８】 他方では、酸素をコードするDNA 配列は、確立された標準的方法、例えばS.L.
Beaucage and M.H. Caruthers (1981)、Tetrahedron Letters 22, p.1859-1869
又はMatthes ら、(1984) EMBO J. 3, p.801-805により発表されたホスホロアミ
ジット方法により合成的に調製され得る。ホスホロアミジット方法においては、
オリゴヌクレオチドが、例えば自動DNA 合成機において合成され、精製され、ア
ニーリングされ、ライゲーションされ、そして適切のベクターにおいてクローン
化される。
【００５９】 最終的に、DNA 配列は、標準的技法に従って、合成ゲノム又はcDNA起源のフラ
グメント（適切な場合、完全なDNA 配列の種々の部分に対応するフラグメント）
を連結することによって調製される、混合されたゲノム及び合成起源のもの、混
合された合成及びcDNA起源のもの又は混合されたゲノム及びcDNA起源のものであ
り得る。DNA 配列はまた、例えば米国特許第4,683,202 号又はR.K. Saikiら、(1
988) Science239, pp.487-491に記載されるように、特定のプライマーを用いて
のポリメラーゼ鎖反応（PCR ）により調製され得る。
【００６０】 部位特定の突然変異誘発 フンガミル様アルファ−アミラーゼをコードするDNA 配列が単離され、そして
突然変異のための所望する部位が同定されると、合成オリゴヌクレオチドを用い
て突然変異を導入することができ得る。それらのオリゴヌクレオチドは、所望す
る突然変異部位が隣接するヌクレオチド配列を含む。特定の方法では、アルファ
−アミラーゼをコードする配列たるDNAの一本鎖ギャップを、アルファ−アミラ
ーゼ遺伝子を担持するベクターにおいて構築する。次に、所望する突然変異を担
持する合成ヌクレオチドを、一本鎖DNA の相同部分にアニーリングさせる。次に
、残りのキャップをDNA ポリメラーゼI(クレノウ フラグメント) により埋め、
そしてその構築体をT4リガーゼを用いてライゲーションする。この方法の特定の
例は、Morinagaら(1984) Biotechnology 2, p.646-639に記載されている。米国
特許第4,760,025 号は、カセットの少々の変更を実施することによって、複数の
突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、種
々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るので、さらに多くの種類の
突然変異がMorinagaの方法によりいずれかの時点で一度に導入され得る。
【００６１】 アルファ−アミラーゼをコードするDNA 配列中に突然変異を導入するためのも
う1つの方法が、Nelson and Long (1989) Analytical Biochemistry 180, p.147
-151に記載されている。それは、PCR 反応におけるプライマーの1つとして化学
的に合成されたDNA 鎖を用いることによって導入される所望する突然変異を含む
PCR フラグメントの3段階生成を包含する。PCR生成されたフラグメントから、突
然変異を担持するDNA フラグメントが、制限エンドヌクレアーゼによる分解によ
り単離され、そして発現プラスミド中に再挿入され得る。
【００６２】 ランダム突然変異誘発 ランダム突然変異は、注目の示される、又は完全な遺伝子内に示されるアミノ
酸配列へと翻訳される遺伝子の少なくとも3つの部分における局在化された又は
領域−特異的ランダム突然変異誘発として適切に実施される。 親グルコアミラーゼをコードするDNA 配列のランダム突然変異誘発は、好都合
には、当業界において知られているいずれかの方法の使用により実施され得る。
【００６３】 上記に関して、本発明のさらなる観点は、親と比較して、特に酸ｐＨにおいて
向上した熱安定性を示す親フンガミルアルファ−アミラーゼの変異体を作製する
ための方法に関し、ここで前記方法は、 （ａ）前記親親フンガミルアルファ−アミラーゼをコードするDNA 配列をランダ
ム突然変異誘発にゆだね、 （ｂ）段階（ａ）で得られた突然変異誘発されたDNA 配列を宿主細胞において発
現し、そして （ｃ）親フンガミルアルファ−アミラーゼと比較して、変更された性質（すなわ
ち、熱安定性）を有するアルファ−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞をスク
リーンする； ことを含んで成る。
【００６４】 本発明の上記の方法の段階（ａ）は好ましくは、ドープされたプライマーを用
いて実施される。 例えば、ランダム突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の
使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA 配列をPCR 生成
された突然変異誘発にゆだねることにより実施され得る。さらに、ランダム突然
変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により実施
され得る。突然変異誘発剤は、例えばトランジション、トランスバージョン、イ
ンバージョン、スクランブリング、欠失、及び/ 又は挿入を誘発するものであり
得る。
【００６５】 当該目的のための適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV
）照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N'−ニトロ−N −ニトロソグアニジ
ン（MNNG）、O −メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネー
ト（EMS ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸、及びヌクレオチド類似体を包含する
。そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異誘発す
べきる親酵素をコードするDNA 配列を、生ぜしめる突然変異誘発のための適切の
条件下で、選択の突然変異誘発剤の存在下でインキュベートし、そして所望する
性質を有する突然変異誘発されたDNA を選択することによって実施される。
【００６６】 突然変異誘発がオリゴヌクレオチドの使用により実施される場合、オリゴヌク
レオチドは、変更される予定である位置でのオリゴヌクレオチドの合成の間、3
種の非−親ヌクレオチドにより刺激され又はスパイクされ得る。刺激又はスパイ
キングは、所望しないアミノ酸のためのコドンが回避されるように行われ得る。
刺激された又はスパイクされたオリゴヌクレオチドは、適切であると思われるよ
うなPCR、LCR又はいずれかのDNA ポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、いずれか
の公開された技法により、α−アミラーゼ酵素をコードするDNA 中に組み込まれ
得る。
【００６７】 好ましくは、ドーピングは、個々の位置における野生型及び突然変異の百分率
が予備定義されている“一定のランダムドーピング”を用いて実施される。さら
に、ドーピングは、一定のヌクレオチドの導入のための選択、及びそれにより、
１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入のための選択に対して向けられ得る。ド
ーピングは、例えば個々の位置における90％の野生型及び10％の突然変異の導入
を可能にするために行われ得る。ドーピングスキームの選択における追加の考え
は、遺伝子の及びタンパク質構造の制約に基づかれている。ドーピングスキーム
は、中でも、停止コドンの導入が回避されることを確保するDOPEプログラムを用
いることによって行われ得る。
【００６８】 PCR生成された突然変異誘発が使用される場合、親アルファ−アミラーゼをコ
ードする、化学的に処理された又は処理されていない遺伝子のいずれかが、ヌク
レオチドの誤った導入を高める条件下でPCR にゆだねられる（Deshler 1992; Le
ung ら、Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15 ）。
【００６９】 E.コリ（E.coli)のミューテーター株（Fowlerら、Molec. Gen. Genet., 133,
1974, pp. 179-191 ）、S.セレビシアエ(S.cerevisiae)又はいずれかの他の微生
物が、例えば親グリコシラーゼを含むプラスミドを用いてミューテーター株を形
質転換し、前記プラスミドと共にミューテーター株を増殖せしめ、そしてミュー
テーター株から突然変異誘発されたプラスミドを単離することによって、アルフ
ァ−アミラーゼをコードするDNA のランダム突然変異誘発のために使用さえ得る
。続いて、突然変異誘発されたプラスミドを用いて、発現生物を形質転換するこ
とができる。
【００７０】 突然変異誘発されるべきDNA 配列は便利には、親アルファ−アミラーゼを発現
する生物から調製されるゲノム又はcDNAライブラリーに存在することができる。
他方では、DNA 配列は、突然変異誘発剤と共にそれ自体インキュベートされるが
、又は他方では、その剤に暴露され得る適切なベクター、例えばプラスミド又は
バクテリオファージ上に存在することができる。突然変異誘発されるべきDNA は
また、宿主細胞のゲノムに組み込まれることによって、又は宿主細胞に含まれる
ベクター上に存在することによって、その宿主細胞にも存在することができる。
最終的に、突然変異誘発されるべきDNA は、単離された形で存在することができ
る。ランダム突然変異誘発にゆだねられるべきDNA 配列は好ましくは、cDNA又は
ゲノムDNA 配列であることが理解されるであろう。
【００７１】 多くの場合、発現段階ｂ）又はスクリーニング段階ｃ）を実施する前、突然変
異誘発されたDNA 配列を増幅することは便利である。そのような増幅は、当業界
において知られている方法に従って実施され得、ここで現在好ましい方法は親酵
素のDNA 又はアミノ酸配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプライマー
を用いてのPCR生成される増幅法である。
【００７２】 突然変異誘発剤とのインキュベーション又はその剤への暴露に続いて、突然変
異誘発されたDNAは、DNA配列を担持する適切な宿主細胞を、発現を生ぜしめる条
件下で培養することによって発現される。この目的のために使用される宿主細胞
は、任意にベクター上に存在する突然変異誘発されたDNA 配列により形質転換さ
れている細胞、又は突然変異誘発処理の間、親酵素をコードするDNA 配列を担持
する細胞であり得る。適切な宿主細胞の例は、次のものである：グラム陽性細菌
、例えばバチルス・スブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタ
ス、バチルス・プレビス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アル
カロフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・コアグランス
、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラウタス、バチルス・メガテリウム、
バチルス・スリンギエンシス、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces l
ividans ）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）; 及びグ
ラム陰性細胞、例えばE.コリ。
【００７３】 突然変異誘発されたDNA 配列はさらに、突然変異誘発されたDNA 配列の発現を
可能にする機能をコードするDNA 配列を含んで成る。
【００７４】 局在化されたランダム突然変異誘発 ランダム突然変異誘発は、好都合には、注目の親アルファ−アミラーゼの一部
に局在化され得る。これは、例えば酵素の一定の領域が酵素の所定の性質のため
に特に重要であることが同定されている場合、及び修飾が改良された性質を有す
る変異体をもたらすことが予測される場合、好都合であり得る。そのような領域
は、親酵素の三次構造が誘発され、そして酵素の機能に関連している場合に通常
同定され得る。
【００７５】 局在化された又は領域−特異的ランダム突然変異誘発は、上記のようなPCR生
成される突然変異誘発技法、又は当業界において知られているいずれか他の適切
な技法の使用により便利には実施される。他方では、修飾されるべきDNA 配列の
部分をコードするDNA 配列は、例えば適切なベクター中への挿入により単離され
得、そして続いて、前記部分が上記で論じられた突然変異誘発方法のいずれかの
使用により突然変異誘発にゆだねられる。
【００７６】 本発明の変異体を提供するための他の方法は、例えばWO95/22625（Affymax Te
chnologies N.V. からの）及びWO96/00343（Novo Nordisk A/Sからの）に記載さ
れる方法を包含する、当業界において知られている遺伝子シャフリング方法（ge
ne shuffling method ）を包含する。
【００７７】 α−アミラーゼ変異体の発現 本発明によれば、上記方法、又は当業界において知られているいずれか他の方
法により生成される変異体をコードするDNA 配列は、典型的には、プロモーター
、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意には、リプ
レッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を含む。
【００７８】 発現ベクター 本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列を担持する組換え
発現ベクターは、便利には、組換えDNA方法にゆだねられ得るいずれかのベクタ
ーであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿
主細胞に依存するであろう。ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細
胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製さ
れるベクターであり得る。適当なベクターの例はｐＭＴ８３８である。
【００７９】 プロモーター ベクターにおいて、DNA 配列は適切なプロモーター配列に作用可能式に結合さ
れるべきである。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいず
れかのDNA 配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は非相同であ
るタンパク質コードの遺伝子に由来することができる。
【００８０】 本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするDNA 配列の転写を、特に細
菌宿主において指令するための適切なプロモーターの例は、E.コリのlac オペロ
ンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolo
r ）アガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リケニホルミスα−アミラ
ーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラス マル
トジェン性アミラーゼ遺伝子のプロモーター（amyM）、バチルス・アミロリクエ
ファシエンスα−アミラーゼのプロモーター（amyQ）、バチルス・スブチリスxy
lA及びxylB遺伝子のプロモータ、等である。真菌宿主における転写に関して、有
用なプロモーターの例は、A.オリザTAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（R
hizomucor miehei ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニガー中性α−アミラ
ーゼ、A.ニガー酸性安定性α−アミラーゼ、A.ニガーグルコアミラーゼ、リゾム
コル・ミエヘイリパーゼ、A.オリザアルカリプロテアーゼ、A.オリザトリオース
リン酸イソメラーゼ、又はA.ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子
に由来するものである。
【００８１】 発現ベクター 本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、及び真核生物にお
いては、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするDNA 配列に作用可能
式に連結されるポリアデニル化配列を含んで成ることができる。終止及びポリア
デニル化配列は、プロモーターと同じ源に適切には由来することができる。
【００８２】 ベクターはさらに、注目の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA
配列を含んで成ることができる。そのような配列の例は、プラスミドpUC19, pAC
YC177, pUB110, pE194, pAMB1,及びpIJ702の複製の起点である。
【００８３】 ベクター又は、選択マーカー、例えば1 つの遺伝子（ここでその生物が宿主細
胞における欠陥を補充する）、例えばB.スブチリス又はB.リケニホルミスからの
dal 遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラム
フェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含んで成ることがで
きる。さらに、ベクターは、アスペルギルス選択マーカー、例えばamdS, argB,
niaD及びsC、ヒグロマイシン耐性を生ぜしめるマーカーを含んで成ることができ
、又はその選択は例えばWO91/17243に記載のようにして同時−形質転換により達
成され得る。
【００８４】 それぞれ、グルコアミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の
要素をコードする本発明のDNA構築体をライゲーションし、そしてそれらを、複
製のために必要な情報を含む適切なベクター中に挿入するため使用される方法は
、当業者に良く知られている（例えば、Sambrookなど., Molecular Cloning: A
laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989を参照のこと）。
【００８５】 宿主細胞 上記で定義されたような本発明のDNA構築体又は発現ベクターのいずれかを含
んで成る本発明の細胞は、好都合には、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体の
組換え生成において宿主細胞として使用される。細胞は、便利には、宿主染色体
にDNA構築体（１または複数のコピーにおける）を組み込むことによって、変異
体をコードする本発明のDNA構築体により形質置換され得る。この組み込みは一
般的には、DNA 配列が細胞において安定して維持されるので、好都合であると思
われる。宿主染色体中へのDNA構築体の組み込みは、従来の方法、例えば相同又
は非相同組換えにより行われ得る。他方では、細胞は、異なった型の宿主細胞に
関して上記に記載されるようにして、発現ベクターにより形質転換され得る。
【００８６】 本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳類又は昆虫の細胞であり得るが、しか
し好ましくは、微生物細胞、例えば細菌又は菌類（酵母を包含する）細胞である
。
【００８７】 適切な細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバチルス・スブチリス、バチルス
・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・プレビス、バチルス・ステ
アロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエフ
ァシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・
ラクタス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンギエンシス、ストレプト
ミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナス; 及びグラム陰性細胞、例
えばE.コリである。細菌の形質転換は、原形質形質転換により、又はそれ自体知
られている態様でコンピテント細胞を用いることによってもたらされ得る。
【００８８】 酵母生物は、好ましくは、サッカロミセス（Saccharomyces ）又はシゾサッカ
ロミセス（Schizosaccharomyces ）の種、例えばサッカロミセス・セレビシアエ
から選択される。
【００８９】 宿主細胞は糸状菌、例えばアスペルギルス属の種に属する株、最も好ましくは
アスペルギルス・オリザもしくはアスペルギルス・ニガーの株、又はフサリウム
（Fusarium)の株、例えばフサリウム・オキシスポリウム、フサリウム・グラミ
ネアルム（完璧な状態では、グリベレラ・ジー（Gribberella zeae)と称され、
旧名はスフェリア・ジー(Sphaeria zeae)であり、ジッベレラ・ロゼウム(Gibber
ella roseum)及びジッベレラ・ロゼウムf. sp.セレアリスと同義である）又はフ
サリウム・スルフレウム（完璧な状態では、ジッベレラ・プリカリス（Gibberel
la puricaris)と称され、フサリウム・トリコセシオイデス、フサリウム・バク
トリジオイデス、フサリウム・サムブシウム、フサリウム・ロゼウム及びフサリ
ウム・ロゼウムvar. グラミネアルムと同義である）、フサリウム・セレアリス
（フサリウム・クロックウェルンス）又はフサリウム・ベネナトゥムと同義であ
る）であってもよい。
【００９０】 本発明の好適な態様において、宿主細胞はプロテアーゼ欠損株又はプロテアー
ゼマイナス株である。これは例えばアスペルギルス属のプロテアーゼ欠損株、特
にＡ．オリザの株、例えば「alp」という名のアルカリプロテアーゼ遺伝子の欠
失したＡ．オリザＪａｌ１２５であってよい。この株はＷＯ97/35956号（Novo N
ordisk)に記載されている。
【００９１】 糸状菌は、プロトプラスト形成、及びプロトプラストの形質転換、続いて、そ
れ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する方法により形質転換され得
る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許
第238,023 号に記載されている。
【００９２】 本発明のアルファ−アミラーゼ変異体を生成するための方法 さらにもう1つの観点においては、本発明は本発明のアルファ−アミラーゼ変
異体を生成するための方法に関し、ここで前記方法は、上記のような宿主細胞を
、変異体の生成の助けとなる条件下で培養し、そして細胞及び/ 又は培養培地か
ら変異体を回収することを含んでなる。
【００９３】 細胞を培養するために使用される培地は、注目の宿主細胞を増殖し、そして本
発明のアルファ−アミラーゼ変異体の発現を得るために適切ないずれかの従来の
培地であり得る。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開されたレ
シピーに従って調製され得る（例えば、American Type Culture Collectionのカ
タログに記載のようにして）。
【００９４】 宿主細胞から分泌されるアルファ−アミラーゼ変異体は便利には、良く知られ
ている方法、例えば遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、そして培地
中のタンパク質成分を、塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、続いて
クロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマ
トグラフィー又は同様のものを使用することによる方法により、培養物培地から
回収され得る。
【００９５】 デンプンの転化 本発明はデンプンからグルコース又はマルトース等を生成するための本発明の
アルファ−アミラーゼ変異体の利用方法を提供する。
【００９６】 一般に、この方法はアルファ−アミラーゼの存在下での前駆体デンプンの部分
加水分解、しかる後の更なる加水分解、グルコアミラーゼの存在下でアルファ−
（１→４）及びアルファ−（１→６）グルコシド結合を切断する、デンプン又は
関連のオリゴ及び多糖分子の非還元末端からのＤ−グルコースの遊離の段階を含
む。
【００９７】 アルファ−アミラーゼを利用する前駆体デンプンの部分加水分解は内部アルフ
ァ−（１→４）結合の加水分解によりデンプン分子の一次分解を供する。商業的
用途では、アルファ−アミラーゼを利用する一次加水分解は約１０５℃の温度で
実施する。非常に高いデンプン濃度、通常は３０〜４０％の固形分が処理される
。一次加水分解は通常この高温で５分実施される。この部分加水分解デンプンを
次に第二タンクに移し、そして８５〜９０℃の温度で約１時間インキュベーショ
ンし、１０〜１５のデキストロース当量（Ｄ．Ｅ．）を誘導する。
【００９８】 グルコアミラーゼの存在下で更なる加水分解を行い、デンプン又は関連のオリ
ゴ及び多糖分子の非還元末端からＤ−グルコースを遊離する工程は別のタンクの
中で３０〜６０℃の低められた温度で通常実施される。この溶液のpHは６〜６．
５から、３〜５．５の範囲へと下がる。好ましくは、この溶液のpHは４〜４．５
である。グルコアミラーゼをこの溶液に加え、そして反応を２４〜７２時間、好
ましくは３６〜４８時間実施する。
【００９９】 本発明に従ってフンガミル様アルファ−アミラーゼの熱安定性を向上させるこ
とにより、かかるアルファ−アミラーゼはデンプンの液化に利用されうる。
【０１００】 一の観点において、本発明はデンプン転化工程における本発明のアルファ−ア
ミラーゼ変異体の利用に関する。
【０１０１】 醸造 本発明のアルファ−アミラーゼは醸造工程においても使用してよい。
【０１０２】 高マルトースシロップ生産（５５％マルトース） 本発明の変異体はマルトースの生産にも利用されうる。高マルトースシロップ
は典型的には以下のようにして生産される。
【０１０３】高マルトースシロップの生産 （５０〜５５％のマルトース含有） 「高マルトースシロップ」を作るため、デンプンをＤＥ １０〜２０へと液化
する。液化デンプンのpH及び温度は６５℃及び５．０付近のpHそれぞれに調整し
、そしてマルトジェニックアルファ−アミラーゼ活性（例えば、バチルス・ステ
アロサーモフィルス・アミラーゼ、例えばＭａｌｔｏｇｅｎａｓｅ（商標）４０
００Ｌ、０．４ｌ／ｔ ＤＳ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ））、プルラナーゼ活
性（例えば、バチルス・プルラナーゼ、例えばＰｒｏｍｏｚｙｍｅ（商標）６０
０Ｌ、０．３ｌ／ｔ ＤＳ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ））及びアルファ−アミ
ラーゼ活性（例えば、ＢＡＮ ２４０Ｌ又はＴｅｒｍａｍｙｌ（商標）１２０Ｌ
、タイプＬＳ、０．４kg／ｔ ＤＳ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ））に２４〜４
１時間委ねる。特定の処理時間は達成すべき所望の糖スペクトルに依存する。マ
ルトジェニックアルファ−アミラーゼ及びプルラナーゼの投与量を増やすことに
より、マルトース含量は増大しうる。
【０１０４】 他方、「高マルトースシロップ」はまずデンプンをＤＥ １０〜２０へと液化
し、次いでpH及び温度をそれぞれ５５℃及び５．５付近のpHへと調整し、そして
その液化デンプンを真菌アルファ−アミラーゼ活性（例えばバチルス・ステアロ
サーモフィルス・アミラーゼ、例えばＦｕｎｇａｍｙｌ（商標）８００Ｌ（Ｎｏ
ｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ））に２２〜４４時間委ねることにより生産されうる。真
菌アルファ−アミラーゼの投与量は予想の糖化時間に依存し、例えば４４時間の
場合２００ｇ／ｔ ＤＳ、そして２２時間の場合４００ｇ／ｔ ＤＳである。
【０１０５】 ５５〜６５％のマルトース含量の「高マルトースシロップ」デンプンを作るに
は、デンプンをＤＥ １０〜２０へと液化する。液化デンプンのpH及び温度はそ
れぞれ６０℃及び６付近のpHに調整し、そしてマルトジェニックアルファ−アミ
ラーゼ活性（例えば、Ｍａｌｔｏｇｅｎａｓｅ（商標）４０００Ｌ、０．２５−
１．０ｌ／ｔ ＤＳ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ））及び真菌アルファ−アミラ
ーゼ活性（例えば、アスペルギルスアミラーゼ、例えばＦｕｎｇａｍｙｌ（商標
）８００Ｌ、０．４−１．０kg／ｔ ＤＳ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に２４
〜４８時間委ねる。
【０１０６】 他方、液化デンプンは６５℃の温度及び５．０付近のpHに調整し、それからマ
ルトジェニックアルファ−アミラーゼ活性（例えばバチルス・ステアロサーモフ
ィルス・アミラーゼ、例えばＭａｌｔｏｇｅｎａｓｅ（商標）４０００Ｌ、０．
５〜１．０ｌ／ｔ ＤＳ）及びプルラナーゼ活性（例えば、バチルス・プルラナ
ーゼ、例えばＰｒｏｍｏｚｙｍｅ（商標）６００Ｌ、０．５〜１．０ｌ／ｔ Ｄ
Ｓ）に１８〜４２時間委ねてよい。
【０１０７】 本発明に従うと、本発明の１又は複数のフンガミル様変異体を上記の真菌アル
ファ−アミラーゼ活性体の代わりに、又はそれと一緒に使用してよい。
【０１０８】 ベーキング 本発明のアルファ−アミラーゼ変異体はベーキング工程に使用することもでき
うる。
【０１０９】 用途 一の観点において、本発明はデンプン転化、アルコール生産、醸造、ベーキン
グのための本発明の変異体の利用に関する。
【０１１０】 本発明の方法 本発明は更にマルトースシロップを生産するための方法にも関連する。この方
法は： １）アルファ−アミラーゼの存在下でデンプンを液化し； ２）本発明の真菌アルファ−アミラーゼ変異体の存在下でデキストリン化し；
そして ３）シロップを回収し、そして任意的にシロップを精製する； 工程を含んで成る。
【０１１１】 工程１）における液化のために使用するアルファ−アミラーゼは任意のアルフ
ァ−アミラーゼであってよい。好適なアルファ−アミラーゼはバチルスアルファ
−アミラーゼ、例えばターマミル様アルファ−アミラーゼ、例えばＢ．リシェニ
ホルミス・アルファ−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏ
ｒｄｉｓｋ）として商業的に入手可能）、Ｂ．アミロリケファシエンス・アルフ
ァ−アミラーゼ（ＢＡＮとして市販（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ））、Ｂ．ステ
アロサーモフィルス・アルファ−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）１２０
ＬタイプＳとして市販）、バチルス種の株ＮＣＩＢ １２２８９，ＮＣＩＢ １
２５１２，ＮＣＩＢ １２５１３又はＤＳＭ ９３７５由来のアルファ−アミラ
ーゼ（これらは全てＷＯ９５／２６３９７号に詳細に説明されている）及びＴｓ
ｕｋａｍｏｔｏら、Biochemical and Biophysical Research Communications, 1
51 (1988), pp. 25-31に記載されているアルファ−アミラーゼであってよい。「
ターマミル様アルファ−アミラーゼ」の定義に入るアルファ−アミラーゼは例え
ばＷＯ９６／２３８７４（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に規定されている。
【０１１２】 別の観点において、本発明は以下の工程を含んで成る、マルトースの生産方法
に関する： １）デンプンを１４０〜１６０℃の温度、４〜６のpHで液化し、 ２）６０〜９５℃の範囲の温度、特に６５〜８５℃の温度、例えば７０〜８０
℃で、pH４〜６で、本発明の真菌アルファ−アミラーゼ変異体の存在下でデキス
トリン化し；そして ３）シロップを回収し；そして任意的にシロップを精製する。
【０１１３】 本発明の態様において、有効量のグルコアミラーゼを工程２）に加える。シロ
ップはこの態様（グルコアミラーゼによる処理を含む）ではマルトースシロップ
ではなく、別の糖プロファイルを有するシロップとなる。グルコアミラーゼはア
スペルギルス・グルコアミラーゼ、特にアスペルギルス・ニガー・グルコアミラ
ーゼであってよい。
【０１１４】 他方、この方法は以下の工程を含んで成る： １）９５〜１１０℃の温度、４〜６のpHでの、バチルス・アルファ−アミラー
ゼの存在下でのデンプンの液化、しかる後の ２）７０〜９５℃の範囲の温度、pH４〜６での、本発明の真菌アルファ−アミ
ラーゼ変異体の存在下での液化、それに続く得られる製品の回収及び／又は任意
的な精製。
【０１１５】固定化された本発明の真菌アルファ−アミラーゼ変異体 一の観点において、本発明は固定化された本発明のアルファ−アミラーゼ変異
体に関する。このアルファ−アミラーゼ変異体は当業界公知の任意の適当な方法
、例えば米国特許第４，６８７，７４２号におけるグルコースイソメラーゼのた
めに用いた方法を利用して固定化してよい。
【０１１６】 材料と方法 材料：酵素 ： ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）：アスペルギルス・オリザに由来し、且つＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２に示す真菌アルファ−アミラーゼ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓ
ｋより入手可能）
【０１１７】宿主細胞 ： Ａ．オリザＪａＬ１２５：発酵研究所、大阪府淀川区十三反町２−１７−２５
より入手可能であり、一段階遺伝子置換方法（G. May「Applied Molecular Gene
tics of Filamentous Fungi」(1992), p. 1-25, Eds. J.R. Kinghorn and G. Tu
rner; Blackie Academic and Proffesional)によりＡ．オリザｐｙｒＧ遺伝子を
マーカーとして用いて「ａｌｐ」という名のアルカリプロテアーゼ遺伝子（Mura
kami Kら（1991), Agric. Biol. Chem. 55, p. 2807-2811）が欠失したアスペル
ギルス・オリザＩＦＯ ４１７７。ＪａＬ １２５株はＷＯ９７／３５９５６（
Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に更に詳しく開示されている。
【０１１８】微生物 ： 株：サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＹＮＧ３１８：ＭＡＴαｌｅｕ２−Δ２ ｕｒａ３−５２ ｈｉ
ｓ４−５３９ ｐｅｐ４−Δ１〔ｃｉｒ ＋〕。
【０１１９】 方法：アスペルギルス・オリザの形質転換（一般手順） １００mlのＹＰＤ（Shermanら（1981) Methods in Yeast Genetics, Cold Spr
ing Harbor Laboratory)にＡ．オリザの胞子を接種し、そして約２４時間振盪し
ながらインキュベーションする。菌糸体をミラクロスを介する濾過により回収し
、そして２００mlの０．６ＭのＭｇＳＯ4 で洗浄する。その菌糸体を１５mlの１
．２ＭのＭｇＳＯ4 、１０mMのＮａＨ2 ＰＯ4 、pH５．８に懸濁する。その懸濁
物を氷の上で冷却し、そして１２０mgのＮｏｖｏｚｙｍ（商標）２３４を含むバ
ッファー１mlを加える。５分後、１mlの１２mg／mlのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ｔｙ
ｐｅ Ｈ２５）を加え、そしてサンプル中で大量のプロトプラストが顕微鏡下で
見えるようになるまで、３７℃で１．５〜２．５時間静かに撹拌しながらインキ
ュベーションする。
【０１２０】 その懸濁物をミラクロスを介し濾過し、その濾液を無菌チューブに移し、そし
て５mlの０．６Ｍのソルビトール、１００mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０をそ
の上に載せる。遠心分離を１５min 、１０００ｇで実施し、そしてそのプロトプ
ラストをＭｇＳＯ4 クッションの頂部から集める。２容量のＳＴＣ（１．２Ｍの
ソルビトール、１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５、１０mMのＣａＣｌ2 ）を
このプロトプラスト懸濁物に加え、そしてこの混合物を５分、１０００ｇで遠心
分離する。このプロトプラストペレットを３mlのＳＴＣに再懸濁し、そして再ペ
レット化する。これを繰り返す。最後に、このプロトプラストを０．２〜１mlの
ＳＴＣに再懸濁する。
【０１２１】 １００μｌのプロトプラスト懸濁物を１０μｌのＳＴＣ中の５〜２５μｇのｐ
３ＳＲ２（Ａ．ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子担持プラスミド：Ｈｙｎｅｓら、Mo
l. and Cel. Biol., Vol. 3, No.8, 1430-1439, 1983年８月に記載）と混合する
。この混合物を室温で２５分放置し、０．２mlの６０％のＰＥＧ４０００（ＢＤ
Ｈ ２９５７６）、１０mMのＣａＣｌ2 及び１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．
５を加え、そして慎重に混合し（２回）、そして最後に０．８５mlの同溶液を加
え、そして慎重に混合する。この混合物を室温で２５分放置し、２，５００ｇで
１５分遠心分離し、そしてそのペレットを２mlの１．２Ｍのソルビトールに再懸
濁する。もう一回の沈降の後、そのプロトプラストを１．０Ｍのスクロース、pH
７．０、窒素源としての１０mMのアセトアミド及びバックグランド増殖を阻害す
るための２０mMのＣｓＣｌを含む最少プレート（Cove (1966), Biochem. Biophy
s. Acta 113, 51-56）上にまく。３７℃で４〜７日間インキュベーション後、胞
子を拾い、無菌水に懸濁し、そして孤立コロニーのために拡布する。この手順を
繰り返し、そして２回目の再単離後の孤立コロニーの胞子を規定の形質転換体と
して保存する。
【０１２２】供給バッチ発酵 供給バッチ発酵は炭素源としてのマルトデキストリン、窒素源としての尿素及
び酵母エキスを含んで成る培地の中で実施する。供給バッチ発酵は注目のＡ．オ
リザ宿主細胞の振盪フラスコ培養物を３．５％の炭素源及び０．５％の窒素源を
含んで成る培地に接種することにより実施する。pH５．０及び３４℃で２４時間
の培養後、追加の炭素及び窒素源の連続供給を開始する。炭素源は律速因子とし
て保ち、そして酸素は過剰で存在することを確実にする。供給バッチ培養は４日
続け、その後酵素を遠心分離、限外濾過、浄化濾過及び菌体（ｇｅｒｍ）濾過に
より回収する。更なる精製を当業界公知のアニオン交換クロマトグラフィー方法
により実施してよい。
【０１２３】精製 培養ブロスを濾過し、そして硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）を１．７ＭのＡＭＳ
の濃度となるまで加え、そしてpHを５に調整する。沈殿した材料を遠心分離によ
り除去する。アルファ−アミラーゼ活性を含む溶液を１．７ＭのＡＭＳ、２０mM
の酢酸ナトリウム、pH５で予め平衡にしておいたＴｏｙｏ Ｐｅａｒｌブチルカ
ラムに載せる。末結合の材料を平衡バッファーで洗い流す。結合したタンパク質
を１０mMの酢酸ナトリウム、pH４．５により、１０カラム容量にわたる１．７か
ら０Ｍに至るＡＭＳの線形勾配を利用して溶出させる。グルコアミラーゼ含有画
分を集め、そして２０mMの酢酸ナトリウム、pH４．５に対して透析する。
【０１２４】熱安定性アルファ−アミラーゼ変異体のスクリーニング これらのライブラリーを下記の熱安定性フィルターアッセイでスクリーニング
する。
【０１２５】熱安定性のためのフィルターアッセイ 酵母ライブラリーを１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＳＣ ｕｒａ- アガ
ープレート上のセルロースアセテート（OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel,
Germany）とニトロセルロースフィルター（Protran-Ba 85, Schleicher & Schu
ell, Dassel, Germany）のサンドイッチの上に３０℃で少なくとも７２時間プレ
ートする。これらのコロニーを１分かけてメタノールで活性化しておいたＰＶＤ
Ｆフィルター（Immobilon-P, Millipore, Bedford)にレプリカプレーティングし
、次いで０．１ＭのＮａＡｃで洗浄し、その後室温で２時間インキュベーション
する。コロニーを水道水でＰＶＤＦフィルターから洗い流す。フィルターサンド
イッチ及びＰＶＤＦフィルター各々をインキュベーションの前に針で特定の印を
付け、スクリーニング後のフィルター上の陽性変異体の位置決めができるように
する。変異体の結合したＰＶＤＦフィルターを０．１ＭのＮａＡｃ、pH４．５の
入った容器に移し、そして４７℃で１５分インキュベーションする。ＳＣ ｕｒ
ａ−アガープレート上のセルロースアセテート及びニトロセルロースフィルター
のサンドイッチを使用時まで室温で保存する。インキュベーション後、残留活性
を５％のマルトース、１％のアガロース、５０mMのＮａＡｃ、pH４．５を含むプ
レート上で検出する。ＰＶＤＦフィルターの付いたアッセイプレートをフィルタ
ーサンドイッチと同じようにして印を付け、そして５０℃で２時間インキュベー
ションする。ＰＶＤＦフィルターを除去してから、アッセイプレートをGlucose
GOD perid (Boehringer Mannheim GmbH, Germany）で染色する。残留活性を有す
る変異体はアッセイプレート上で白色背景の上の暗緑色斑点として検出される。
改良変異体を保管プレートに載せる。改良変異体を第一スクリーニングと同じ条
件下で２回再スクリーニングする。
【０１２６】ＦＡＵ活性の決定 １真菌アルファ−アミラーゼ単位（ＦＡＵ）は、以下の標準条件に基づきアル
ファ−アミラーゼを決定するためのＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ標準方法にて１時
間当り５．２６ｇのデンプン（Ｍｅｒｃｋ Ａｍｙｌｕｍ可溶性Ｅｒｇ．Ｂ６，
Ｂａｔｃｈ ９９４７２７５）を分解する酵素の量として規定される： 基質 … 可溶性デンプン 温度 … ３７℃ pH … ４．７ 反応時間 … ７〜２０分 Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋの方法の詳細な説明は注文に応じて入手できる。
【０１２７】酸アルファ−アミラーゼ活性の決定（ＡＦＡＵ） 酸アルファ−アミラーゼ活性を、酵素標準品と対比して決定されるＡＦＡＵ（
酸真菌アルファ−アミラーゼ単位：Acid Fungal Alpha-amylase Units)で測定す
る。
【０１２８】 使用する標準品はＡＭＧ ３００Ｌ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋｓ）とする。
このＡＭＧ中の中性アルファ−アミラーゼは室温で３週間貯蔵すると約１ FAU／
mlから０．０５ FAU／ml以下へと低下する。
【０１２９】 このＡＭＧ標準品内の酸アルファ−アミラーゼ活性はＡＦ ９ ｉ／３に従っ
て決定される（真菌アルファ−アミラーゼの決定のためのＮｏｖｏの方法）。こ
の方法では、１ FAUは、標準の条件下で１時間当り５．２６０mgのデンプン乾燥
質を分解する酵素の量として規定される。
【０１３０】 ヨウ素はデンプンの分解産物ではなく、デンプンと青色の錯体を形成する。色
の強さは従ってデンプンの濃度に正比例する。アミラーゼ活性は特定の分析条件
下でのデンプンの濃度の低下として逆比色を利用して決定される。
【数１】
【０１３１】標準条件／反応条件： （１分当り） 基質： デンプン、約０．１７ｇ／Ｌ バッファー： クエン酸塩、約０．０３Ｍ ヨウ素（Ｉ2 ）： ０．０３ｇ／Ｌ ＣａＣｌ2 ： １．８５mM pH： ２．５０±０．０５ インキュベーション温度：４０℃ 反応時間： ２３秒 波長： ラムダ：５９０nm 酵素濃度： ０．０２５AFAU／ml 酵素有効範囲： ０．０１−０．０４AFAU／ml 更なる詳細は引用することで本明細書と組入れる、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ
から注文に応じて入手できるＥＢ−ＳＭ−０２５９．０２／０１に見い出せうる
。
【０１３２】本発明の変異体の熱／pH安定性 本発明の変異体の熱安定性は下記の方法を利用して試験する：９５０μｌの０
．１Ｍのクエン酸＋４．３mMのＣａ2+バッファーを６０℃で１時間インキュベー
ションする。バッファー中の５０μｌの酵素（４AFAU／ml）を加える。２×４０
μｌのサンプルを０及び６０分目に採取し、そして氷上で冷却する。インキュベ
ーション前（０分）に測定した活性（AFAU／ml）を対照（１００％）として用い
る。パーセント表示での傾きをインキュベーション時間の関数として算出する。
【０１３３】 熱安定性を決定するため、試験を様々な温度、例えば５０，６０，７０，８０
及び９０℃で繰り返す。
【０１３４】 pH安定性を決定するため、試験を様々なpH、例えばpH２．５，３，３．５，４
，４．５，５を利用して繰り返す。
【０１３５】ＤＯＰＥプログラムを利用するランダム突然変異誘発のための一般方法 ランダム突然変異誘発は以下の通りにして実施できうる： １．親酵素において修飾のために注目される領域を選定し、 ２．選定した領域における突然変異部位及び非突然変異部位を決定し、 ３．例えば構築すべき変異体の所望の安定性及び／又は性能に関し、どのよう
な種類の突然変異を実施すべきか決定し、 ４．構造的に妥当な突然変異を選定し、 ５．工程３により選定された残基を工程４に関して調整し、 ６．適当なドープアルゴリズムを利用してヌクレオチド分布を分析し、 ７．必要なら、例えば停止コドンの導入を回避するため、例えば遺伝子コード
に由来する拘束を考慮しながら、求める残基を遺伝子コードリアリズムに適合さ
せ（当案者はある種のコドンの組合せは実際には利用できず、それ故適合が必要
であることを理解している）、 ８．プライマーを作製し、 ９．プライマーを利用してランダム突然変異誘発を実施し、 １０．得られるグルコアミラーゼ変異体を所望の向上した特性についてスクリ
ーニングすることにより選定する。
【０１３６】ドープアルゴリズム 工程６において利用するために適当なドープアルゴリズムは当業界において周
知である。かかるアルゴリズムの一つはTomandl, D.ら、1997, Journal of Comp
uter-Aided Molecular Design 11 : 29-38. Another algorithm is DOPE (Jense
, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids
Research 26 : 697-702）に記載されている。
【０１３７】 実施例 実施例１変異体Ｑ１５３Ｓの構築 ＴＡＫＡ−アミラーゼ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２に示すＦｕｎｇａ
ｍｙｌ（商標））の変異体の構築のため、市販のキット、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ二
本鎖部位特異的突然変異誘発キットを製造者の指示に従って使用する。
【０１３８】 注目のアミラーゼ酵素をコードする遺伝子はプラスミドｐＴＡＫＡ１７（ＥＰ
２３８，０２３、ｆｉｇｕｒｅ ２及びＥｘａｍｐｌｅ ２）に示されている
。製造者の指示に従うと、ｐＴＡＫＡ１７のアンピシリン遺伝子のＳｃａＩ部位
は下記のプライマーを利用することによりＭＩｕＩ部位へと変えられる： プライマー７２５８： ５′ｐ ｇａａ ｔｇａ ｃｔｔ ｇｇｔ ｔｇａ ｃｇｃ ｇｔｃ ａｃｃ
ａｇｔ ｃａｃ ３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
【０１３９】 アミラーゼ遺伝子中のイントロンにおけるＳｃａＩ部位は次のプライマーを用
いて除去される： プライマー１： ５′ｐ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＡＴ ＴＴＣ ＡＧＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＡＴＴ
ＧＡＧ ＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
【０１４０】 所望の突然変異は、所望の突然変異を含んで成る適当なオリゴの追加により注
目のアミラーゼ遺伝子に導入される。
【０１４１】 例えばＱ１５３Ｓの如き突然変異を導入するには、オリゴを次のようにデザイ
ンする： プライマー２： ５′Ｐ ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＴＣ ＡＴＴ ＴＣＧ ＡＡＣ ＴＡＴ ＧＡＡ
ＧＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
【０１４２】 注目のアミラーゼ遺伝子を含んで成るｐＴＡＫＡ１７ベクターを次にＤＮＡポ
リメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ（オリゴ上の５′リン酸（５′Ｐ）に対するライゲ
ーションのため）、オリゴ７２５８、プライマー１及びプライマー２として利用
する。
【０１４３】 ＤＮＡ−ｐｒｅｐを作り、そして突然変異の導入を配列決定により確認する。
【０１４４】 このＤＮＡ−ｐｒｅｐを「材料と方法」の章に記載の通りにしてアスペルギル
ス・オリザ宿主細胞に形質転換し、そしてアミラーゼ活性についてスクリーニン
グする。
【０１４５】 実施例２向上した熱安定性 実施例１で構築した変異体を「材料と方法」に開示の熱安定性決定アッセイに
従い、向上した熱安定性について試験した。
【０１４６】 実施例３向上した酸安定性 実施例１で構築した変異体を「材料と方法」に開示のpH安定性決定アッセイに
従い、酸pHでの向上した安定性について試験した。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 11/00 Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｚ ４Ｂ０６４ Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｃ１２Ｒ 1:69 ４Ｂ０６５ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B015 AG02 AG17 CG02 CG17 GG02 GG14 NB01 NB02 NG02 NG14 NP01 4B024 AA03 AA05 BA13 CA02 CA20 DA11 EA04 GA11 GA21 GA25 GA27 HA03 4B032 DK51 4B033 NA01 NA28 4B050 CC01 CC04 DD03 FF03E FF04E FF05E FF11E GG01 HH02 LL02 LL05 4B064 AF03 AF04 AF12 CA21 CB01 CC24 CD19 DA10 4B065 AA63X AA63Y AB01 AC14 BA02 BA10 BA16 BA24 BB07 BB18 BB29 BC02 BC03 BC05 BD14 BD15 BD18 CA32 CA42

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の群から選ばれる１又は複数の領域において改変を含ん
    で成る親フンガミル様アルファ−アミラーゼの変異体であって、 領域９８−１１０、 領域１５０−１６０、 領域１６１−１６７、 領域２８０−２８８、 領域４４８−４５５、 領域４６８−４７５ ここで （ａ）当該改変は独立して （ｉ）位置を占拠するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入； （ii）位置を占拠するアミノ酸の欠失；又は （iii)位置を占拠するアミノ酸の別のアミノ酸による置換 であり、 （ｂ）当該変異体はアルファ−アミラーゼ活性を有し、そして（ｃ）各領域又は
    位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する親フンガミル様アルファ
    −アミラーゼのアミノ酸配列の領域又は位置に対応する、変異体。
  2. 【請求項２】 前記変異体が以下の置換である、請求項１記載の変異体： Ｑ１５３Ｓ。
  3. 【請求項３】 前記変異体が向上した熱安定性及び／又は酸pHでの向上した
    安定性を有する、請求項１記載の変異体。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載のアルファ−アミラーゼ変
    異体をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築体。
  5. 【請求項５】 請求項４記載のＤＮＡ構築体を担持する組換発現ベクター。
  6. 【請求項６】 請求項４記載のＤＮＡ構築体又は請求項５記載のベクターで
    形質転換された細胞。
  7. 【請求項７】 前記細胞が微生物、例えば細菌又は真菌である、請求項６記
    載の細胞。
  8. 【請求項８】 アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、特にＡ．オリ
    ザ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のプロテアーゼ欠損株である、請求項７記載の細胞。
  9. 【請求項９】 請求項１〜３のフンガミル様アルファ−アミラーゼ変異体を
    含んで成る高マルトースシロップを製造するための組成物。
  10. 【請求項１０】 ベーターアミラーゼ活性を更に含んで成る、請求項９記載
    の組成物。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれか１項記載のアルファ−アミラーゼ
    変異体を含んで成る、ドウ改良用組成物。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜３のいずれか１項記載のアルファ−アミラーゼ
    変異体を含んで成る、醸造用組成物。
  13. 【請求項１３】 ベーターアミラーゼ及びイソアミラーゼの群から選ばれる
    １又は複数種の酵素を更に含んで成る、請求項１２記載の醸造用組成物。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜３のいずれか１項記載のアルファ−アミラーゼ
    変異体を含んで成る、アルコール生産用組成物。
  15. 【請求項１５】 デンプンの処理のために請求項１〜３のアルファ−アミラ
    ーゼ変異体を使用する、デンプンを液化する方法。
  16. 【請求項１６】 デンプンの液化のために請求項１〜３のアルファ−アミラ
    ーゼ変異体を使用する、高マルトースシロップを生産する方法。
  17. 【請求項１７】 麦汁の発酵の間に請求項１〜３のアルファ−アミラーゼ変
    異体を添加する、醸造方法。
  18. 【請求項１８】 蒸留酒製造用マッシュ中のデンプンの液化のために請求項
    １〜３のアルファ−アミラーゼ変異体を使用する、アルコール生産方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜３のアルファ−アミラーゼ変異体を含んで成る
    ドウ製品をベーキングする方法。
  20. 【請求項２０】 デンプンの液化のための請求項１〜３のいずれか１項記載
    のアルファ−アミラーゼ又は請求項９記載の組成物の使用。
  21. 【請求項２１】 アルコールの生産のための請求項１〜３のいずれか１項記
    載のアルファ−アミラーゼ又は請求項９記載の組成物の使用。
  22. 【請求項２２】 醸造のための請求項１〜３のいずれか１項記載のアルファ
    −アミラーゼ又は請求項９記載の組成物の使用。
  23. 【請求項２３】 ベーキングのための請求項１〜３のいずれか１項記載のア
    ルファ−アミラーゼ又は請求項９記載の組成物の使用。
  24. 【請求項２４】 親酵素と比べ、向上した熱安定性を、特に酸pHにおいて有
    する、親フンガミル様アルファ−アミラーゼのアルファ−アミラーゼ変異体を製
    造するための方法であって、 （ａ）当該親フンガミル様アルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列をラン
    ダム突然変異誘発にかけ、 （ｂ）工程（ａ）で得られる突然変異したＤＮＡ配列を宿主細胞内で発現させ、
    そして （ｃ）前記親フンガミル様アルファ−アミラーゼと比べて酸pHにおいて向上した
    熱安定性を有する突然変異したアルファ−アミラーゼを発現する宿主細胞をスク
    リーニングする； ことを含んで成る方法。
  25. 【請求項２５】 下記の工程： １）アルファ−アミラーゼの存在下でのデンプンの液化、しかる後の ２）請求項１〜３の真菌アルファ−アミラーゼ変異体の存在下でのデキストリ
    ン化； ３）そのシロップの回収；及び任意的な精製； を含んで成る、マルトースシロップの生産方法。
  26. 【請求項２６】 下記の工程： １）１４０〜１６０℃の温度、４〜６のpHでのデンプンの液化、しかる後の ２）６０〜９５℃の範囲の温度、pH４〜６での、請求項１〜３の真菌アルファ
    −アミラーゼ変異体の存在下でのデキストリン化；並びに ３）そのシロップの回収；及び任意的な精製； を含んで成る、シロップ、特にマルトースシロップの生産方法。
  27. 【請求項２７】 前記液化デンプンを６５〜８５℃、特に７０〜８０℃の温
    度で処理する、請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 有効量のグルコアミラーゼを工程２）に添加する、請求項
    ２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 下記の工程： １）９５〜１１０℃の温度、４〜６のpHでの、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
    アルファ−アミラーゼの存在下でのデンプンの液化、しかる後の ２）６０〜９５℃の範囲の温度、pH４〜６での、請求項１〜３の真菌アルファ
    −アミラーゼ変異体の存在下でのデキストリン化；並びに ３）そのシロップの回収；及び任意的な精製； を含んで成る、マルトースシロップの生産方法。
  30. 【請求項３０】 請求項１〜３記載の固定化変異体。
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