DE3909096A1 - Alpha-amylase - Google Patents

Description

1. Bedingungen für die Enzymproduktion

Pyrococcus woesel DSM 3773 wächst in einem Temperaturbereich von 80°C bis 106°C, sowie einem pH-Bereich von 7,5 bis 4,5. Unter einer kontinuierlichen H₂/CO₂-Atmosphäre mit Sacchariden wie z. B. Stärke, Amylose, Amylopektin, Glykogen, verzweigten und linearen Oligosacchariden (z. B. Maltotetraose, Maltotriose, Maltose und Glucose) und Maltodextrin oder deren Gemische als C-Quelle, elementarem Schwefel als Elektronenaktzeptor und 3% NaCl werden 250 U/l α-Amylase ins Medium ausgeschieden. Bei nicht-kontinuierlicher Begasung können unter den gleichen Bedingungen 40 U/l α-Amylase extrazellulär nachgewiesen werden. Die Enzymsynthese des Organismus erfolgt zu allen Zeiten des Wachstums, sie beginnt bereits in der frühen logarithmischen Phase und erreicht in der stationären Phase ihr Maximum.

Als α-Amylase wurde ein Enzym definiert, daß in der Lage ist, Glucosepolymere an den α-1,4-Bindungen zu spalten und daraus Glucoseoligomere freizusetzen. DSM = Deutsche Sammlung von Mikro­ organismen.

2. Gewinnung der α-Amylase

Das Enzym kann auf einfache Weise aus dem zellfreien Kulturüberstand gewonnen werden. Es bindet an native und lösliche Stärke, die dann aus dem Kulturüberstand durch Kälte oder Zugabe von organischen Lösungsmitteln wie z. B. Ethanol ausgefällt werden kann. Dabei verliert das Enzym nicht an Aktivität.

3. Charakterisierung der α-Amylase 3.1. Temperaturoptimum der α-Amylase

Die α-Amylase ist unter aeroben Bedingungen in Abwesenheit von Metallionen in einem Temperaturbereich von 40°C bis 140°C, insbesondere zwischen 60°C und 120°C, vorzugsweise zwischen 80°C und 110°C und besonders bevorzugt zwischen 90°C und 105°C aktiv (siehe Abb. 1).

3.2. pH-Optimum der α-Amylase

Die α-Amylase ist aktiv in einem pH-Bereich von 3,5 bis 8, insbesondere zwischen pH 4,5 und 6,5, vorzugsweise zwischen pH 5 und 6 und besonders bevorzugt bei einem pH-Wert von 5,2 bis 5,8 (siehe Abb. 2).

3.3. Stabilität der α-Amylase

Das Enzym ist bei 70°C bis 100°C in Gegenwart von Polysacchariden wie z. B. Stärke, Glykogen, verzweigte Glucosepolymere, Amylose, Amylopektin, Maltodexrin und deren Gemische für mehr als 12 Stunden unter aeroben Bedingungen in Abwesenheit von Metallionen stabil. Nach 60minütiger Inkubation sind unter den gleichen Bedingungen bei 100°C 100%, bei 110°C und 120°C 70%, 130°C 10% der Anfangsaktivität zu messen (siehe Abb. 3). Der Verlauf der unter den gleichen Bedingungen gemessenen Aktivität über einen Zeitraum von 12 h ist der Abb. 3 zu entnehmen.

3.4. Metallionenabhängigkeit

Die Metallionenabhängigkeit wurde mit metallionenfreiem, vorgereinigtem Enzym untersucht. Die unten aufgeführten Metalle wurden in Konzentrationen bis zu 5 mM dem Enzym zugesetzt.

Molybdän-, Calcium- und Magnesiumionen beeinflussen die Enzymaktivität nicht. Eine leichte Hemmung der Enzymaktivität ist in Gegenwart von Cobalt-, Nickel- und Eisenionen festzustellen, Zink- und Kupferionen hemmen das Enzym vollständig. EDTA und Jodessigsäure haben ebenfalls keinen Einfluß auf die Enzymaktivität.

3.5. Substrate und Produkte der α-Amylase

Native Stärke, lösliche Stärke, verzweigte Oligosaccharide und Amylose werden von der α-Amylase hydrolysiert. Hauptprodukte der Hydrolyse dieser Substrate sind größere Glucoseoligomere mit einem Polymerisationsgrad von 6 und größer. Maltose, Maltotriose, Maltotetraose und Maltopentaose werden nur in geringem Umfang freigesetzt, Glucose entsteht nicht. Pullulan, Dextran und Maltose werden nicht vom Enzym angegriffen. Die Fähigkeit dieses Enzyms native und lösliche Stärke bei Temperaturen selbst über 100°C zu einem glucosefreien Saccharidgemisch abzubauen und seine einfache Gewinnung machen es für einen industriellen Einsatz z. B. in der Stärkeverzuckerung außerordentlich interessant.

4. Zusammenfassung

Eine extrem thermostabile metallionenunabhägige α-Amylase aus einem thermophilen Organismus ist in der Lage in einem Temperaturbereich von 40°C bis 140°C und einem pH-Bereich von 3,5 bis 8,0 Glucosepolymere wie z. B. Stärke zu hydrolysieren. Das Enzym besitzt eine maximale Aktivität bei pH 5,5 und einer Temperatur von 100°C. Die Produkte der Stärkehydrolyse sind längerkettige Glucoseoligomere. Das extrazelluläre Enzym kann auf einfache Weise durch Ausfällung aus dem zellfreien Kulturüberstand gewonnen werden. Die Eigenschaften des Enzyms machen es für eine industrielle Anwendung außerordentlich interessant.

Claims (1)

1. alpha-Amylase, erhältlich aus Kulturmedien von Pyrococcus woesei DSM 3773 und mit den folgenden Merkmalen:

   • - Aktivitätsoptimum bei insbesondere 90 bis 105°C und
   • - insbesondere pH 5,2 bis 5,8.