DE3702626A1 - Thermostabile amylasen und pullulanasen aus 2 anaeroben mikroorganismen - Google Patents

Thermostabile amylasen und pullulanasen aus 2 anaeroben mikroorganismen

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DE3702626A1
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Gerhard Prof Dr Gottschalk
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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Description

Clostridium thermosaccharolyticum DSM 572 und Thermoanaerobacter ethanolicus DSM 2246 produzieren thermostabile Amylase und Pullulanase. Bei Stärke als Substrat werden in kontinuierlicher Kultur über 90% beider Enzyme ins Medium ausgeschieden. Zur Gewinnung kann auf das Verfahren gemäß Patent . . . (Patentanmeldung P 36 39 267.7) verwiesen werden.
Als Pullulanase wurde ein Enzym definiert, das in der Lage ist, Pullulan zu hydrolysieren. Als Amylase wurde ein Enzym definiert, das in der Lage ist, Stärke zu hydrolysieren.
Die in kontinuierlicher Kultur erreichten maximalen Aktivitäten beider Enzyme waren folgende:
  • 1) Thermoanaerobacter ethanolicus Pullulanase:12 300 U/l extrazellulär, 97% des Enzyms im Überstand
    300 U/l zellgebunden, 3% des Enzyms zellgebunden Amylase:4 670 U/l extrazellulär, 92% des Enzyms im Überstand
    390 U/l zellgebunden, 8% des Enzyms zellgebunden
  • Die Bedingungen der optimalen Enzymproduktion im Fermenter waren:
    • - ph 5,6
    • -1% Stärke im Medium
    • - Durchflußrate 0,039/h
    • - Temperatur: 65°C
  • 2) Clostridium thermosaccharolyticum Pullulanase:3400 U/l extrazellulär, 92% des Enzyms im Überstand
    300 U/l zellgebunden, 8% des Enzyms zellgebunden Amylase:1960 U/l extrazellulär, 96% des Enzyms im Überstand
    80 U/l zellgebunden, 4% des Enzyms zellgebunden
  • Die Bedingungen der optimalen Enzymproduktion im Fermenter waren:
    • - pH 6,0
    • - 1% Stärke im Medium
    • - Durchflußrate 0,063/h
    • - Temperatur: 60°C
Nachstehend wird die Erfindung mit Abbildungen näher erläutert. Es zeigt:
Abb. 1 die Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Temperatur für T. ethanolicus DSM 2246;
Abb. 2 die Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH für T. ethanolicus DSM 2246;
Abb. 3 die Abhängigkeit der Amylaseaktivität von der Zeit für T. ethanolicus DSM 2246;
Abb. 4 die Abhängigkeit der Pullulanaseaktivität von der Zeit für T. ethanolicus DSM 2246;
Abb. 5 die Abhängigkeit der Pullulanaseaktivitäten von der Zeit für C. thermosaccharolyticum DSM 572 und T. ethanolicus DSM 2246;
Abb. 6 die Abhängigkeit der Enzymaktivitäten der Temperatur für C. thermosaccharolyticum DSM 572;
Abb. 7 die Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH-Wert für C. thermosaccharolyticum DSM 572;
Abb. 8 die Abhängigkeit der Amylaseaktivität von der Zeit für C. thermosaccharolyticum DSM 572; und
Abb. 9 die Abhängigkeit der Pullulanaseaktivität von der Zeit für C. thermosaccharolyticum DSM 572.
Charakterisierung der Enzyme 1) Thermoanaerobacter ethanolicus Temperaturoptimum von Amylase und Pullulanase
Beide Enzyme sind aktiv bei Temperaturen zwischen 50°C und 100°C, insbesonders zwischen 70°C und 95°C, vorzugsweise zwischen 75°C und 90°C und besonders bevorzugt zwischen 85°C und 90°C. Siehe dazu Abb. 1.
pH-Optimum von Amylase und Pullulanase
Beide Enzyme sind aktiv bei pH-Werten zwischen 4 und 7, insbesonders zwischen pH 4,5 und 6,5, vorzugsweise zwischen pH 5,0 und 6,2 und besonders bevorzugt zwischen pH 5,5 und 6,0. Siehe dazu Abb. 2.
Beide Enzyme sind unter den gleichen Bedingungen (pH-Wert und Temperatur) katalytisch aktiv, so daß sie in einem Schritt zur Stärkehydrolyse eingesetzt werden können. Hierfür werden keine Metallionen benötigt. Die Experimente wurden unter aeroben Bedingungen und ohne Substratzugabe durchgeführt.
Enzymaktivität in Gegenwart von Metallen
In Gegenwart von Zink und Kupfer fällt die Aktivität von Amylase und Pullulanase ab. Die übrigen Metalle hatten keinen großen Einfluß auf die Enzymaktivität (Tabelle 1).
Enzymaktivität in Gegenwart von Cyclodextrinen
Amylase und Pullulanase werden durch a-Cyclodextrin nicht gehemmt. In Gegenwart von β-Cyclodextrin war die Hemmung der Pullulanase deutlicher als die der Amylase. Siehe dazu Tabelle 2.
Stabilität der Enzyme
Bei pH 5,5 wurde in Abwesenheit von Substrat und ohne Zusatz von Metallionen unter aeroben Bedingungen bei 60°C und bei 70°C nach 80 Stunden kein Aktivitätsverlust festgestellt. Dies gilt für Amylase und Pullulanase. Die unter den gleichen Bedingungen gemessenen Stabilitäten bei 80°C, 90°C und 100°C sind den Abb. 3 und 4 zu entnehmen.
Vergleich der Stabilität der Pullulanase mit der käuflicher Enzyme
Bei 60°C wurde die Stabilität von Promozym, Dextrozym und Pulluzym mit der der Pullulanase von Thermoanaerobacter ethanolicus verglichen. Gleiche Aktivitäten wurden eingesetzt. Siehe dazu Abb. 5.
Clostridium thermosaccharolyticum Temperaturoptimum von Amylase und Pullulanase
Beide Enzyme sind aktiv bei Temperaturen zwischen 50°C und 80°C, insbesonders zwischen 55°C und 78°C, vorzugsweise zwischen 60°C und 75°C und besonders bevorzugt zwischen 65°C und 75°C. Siehe dazu Abb. 6.
pH-Optimum von Amylase und Pullulanase
Beide Enzyme sind aktiv bei pH-Werten zwischen 4,0 und 7,0, insbesonders zwischen pH 4,5 und 6,5 und besonders bevorzugt zwischen pH 5,0 und 6,0. Siehe dazu Abb. 7. Beide Enzyme sind unter den gleichen Bedingungen katalytisch aktiv, so daß sie in einem Schritt zur Stärkehydrolyse eingesetzt werden können. Hierfür werden keine Metallionen benötigt. Die Experimente wurden unter aeroben Bedingungen und ohne Substratzugabe durchgeführt.
Enzymaktivität in Gegenwart von Metallen
In Gegenwart von Zink und Kupfer fällt die Aktivität von Amylase und Pullulanase deutlich ab. Calciumionen haben sowohl auf die Aktivität der Amylase als auch auf die der Pullulanase einen stimulierenden Effekt. Siehe dazu Tabelle 1.
Enzymaktivität in Gegenwart von Cyclodextrinen
Amylase und Pullulanase werden durch α-Cyclodextrin nicht gehemmt. β-Cyclodextrin hemmt die Aktivität der Amylase und Pullulanase leicht. Siehe dazu Tabelle 2.
Stabilität der Enzyme
Bei pH 5,3 wurde in Abwesenheit von Substrat und ohne Zusatz von Metallionen unter aeroben Bedingungen bei 60°C nach 92 Stunden kein Aktivitätsverlust festgestellt. Dies gilt für Amylase und Pullulanase. Die unter den gleichen Bedingungen gemessenen Stabilitäten bei 70°C und 80°C sind den Abb. 8 und 9 zu entnehmen.
Vergleich der Stabilität der Pullulanase mit der käuflicher Enzyme
Bei 60°C wurde die Stabilität von Promozym, Dextrozym und Pullucym mit der der Pullulanase von Clostridium thermosaccharolyticum verglichen. Es wurden jeweils gleiche Aktivitäten eingesetzt. Siehe dazu Abb. 5.
Einfluß von Metallen und Cyclodextrinen
Der Einfluß von Metallen und Cyclodextrinen wurde mit konzentriertem Enzym gemessen, das zuvor gegen 20 mM Acetat- Puffer pH 5,3 (Clostridium thermosaccharolyticum) bzw. pH 5,5 (Thermoanaerobacter ethanolicus) dialysiert wurde. Es wurden Konzentrationen von 0-4 mM des entsprechenden Metalls und 0-10 mM des entsprechenden Cyclodextrins eingesetzt.
Tabelle 1
Abhängigkeit der Enzymaktivität von Metallionen
Tabelle 2
Enzymaktivität in Gegenwart von Cyclodextrinen

Claims (4)

1. Amylase, gewinnbar aus Clostridium thermosaccharolyticum DSM 572 nach dem Verfahren gemäß Patent . . . (Patentanmeldung P 36 39 267.7), bei dem man unter in bezug auf ein höheres Saccharid als Kohlenstoffquelle limitierenden Bedingungen kultiviert.
2. Pullulanase, gewinnbar aus Clostridium thermosaccharolyticum DM 572 nach dem Verfahren gemäß Patent . . . (Patentanmeldung P 36 39 267.7), bei dem man unter in bezug auf ein höheres Saccharid als Kohlenstoffquelle limitierenden Bedingungen kultiviert.
3. Amylase, gewinnbar aus Thermoanaerobacter ethanolicus DSM 2246 nach dem Verfahren gemäß Patent . . . (Patentanmeldung P 36 39 267.7), bei dem man unter in bezug auf ein höheres Saccharid als Kohlenstoffquelle limitierenden Bedingungen kultiviert.
4. Pullulanase, gewinnbar aus Thermoanaerobacter ethanolicus DSM 2246 nach dem Verfahren gemäß Patent . . . (Patentanmeldung P 36 39 267.7), bei dem man unter in bezug auf ein höheres Saccharid als Kohlenstoffquelle limitierenden Bedingungen kultiviert.
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