JP6417061B1 - α−1,6−グルコシル転移活性を有する酵素 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の(a)から(c)のいずれかのタンパク質である、α-1,6-グルコシル転移活性を有する酵素を提供する。
(a) 配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b) 配列番号3に記載のアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c) 配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【選択図】図8B
Description
[1]以下の(a)から(c)のいずれかのタンパク質である、α-1,6-グルコシル転移活性を有する酵素。
(a) 配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b) 配列番号3に記載のアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c) 配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
[2]更に、α-1,4-グルコシル転移活性を有する、[1]に記載の酵素。
(1) α-1,6-グルコシル転移活性を有する;
(2) α-1,4-グルコシル転移活性を有する;
(3) SDS-PAGEにより測定された分子量が80〜90kDaである;
(4) 至適pHが4.0〜5.0である;
(5) 安定pH範囲が3.5〜8.5である;
(6) 至適温度が55℃〜60℃である;
(7) 温度安定性は60℃以下である。
[4](8) 基質として、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびデキストリンに作用する、[3]に記載の酵素。
[6]α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類が澱粉部分分解物である、[5]に記載の酵素剤。
[8]α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類に、[1]から[4]いずれか一に記載の酵素または[5]から[7]のいずれか一に記載の酵素剤を作用させて、α-1,6-グルカンを得る反応工程を含む、α-1,6-グルカンの製造方法。
[9]上記反応工程の前に、以下の工程を含む、[8]に記載の製造方法。
澱粉を加水分解して、α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類を得る工程。
[10][8]または[9]に記載の方法を実施してα-1,6-グルカンを得る工程、および上記工程で得られたα-1,6-グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
[12]糖供与体がマルトオリゴ糖である、[11]に記載の配糖体の製造方法。
[13]糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物またはフェノール性水酸基を有する化合物である、[11]または[12]に記載の配糖体の製造方法。
[14][11]から[13]のいずれか一に記載の方法を実施して配糖体を得る工程、および上記工程で得られた配糖体を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
本発明のα-1,6-グルコシル転移活性を有する酵素は、以下の(a)から(c)のいずれかのタンパク質である。
(a) 配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b) 配列番号3に記載のアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c) 配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
本発明の酵素の製造方法については、後述の<酵素の製造>を参照されたい。
(1) α-1,6-グルコシル転移活性を有する;
(2) α-1,4-グルコシル転移活性を有する;
(3) SDS-PAGEにより測定された分子量が80〜90kDaである;
(4) 至適pHが4.0〜5.0である;
(5) 安定pH範囲が3.5〜8.5である;
(6) 至適温度が55℃〜60℃である;
(7) 温度安定性は60℃以下ある。
(8)基質として、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびデキストリンに作用する。
本発明のα-1,6-グルカンの製造方法は、α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類に、本発明の酵素または酵素剤を作用させて、α-1,6-グルカンを得る反応工程を含む。すなわち、本発明の酵素または酵素剤を、酵素のα-1,6-グルコシル転移活性の発現に好適な条件下、反応液中で、α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類と接触させることにより、酵素のα-1,6-グルコシル転移作用により、α-1,6結合でグルコースが転移伸長され、α-1,6-グルカンを製造することができる。
また、澱粉加水分解物としては、短鎖長アミロースを使用することができる。
本発明の方法で製造された配糖体は、その糖部分と糖以外の化合物の結合部位にグリコシド結合を有することができる。
本発明の酵素は、特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質であってもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質であってもよい。以下に、組み換えタンパク質を作製する場合について、説明する。
1.発現プラスミドの構築
種々の微生物について新規酵素探索を行い、サーモアナエロバクター・シデロフィラス(Thermoanaerobacter siderophilus)由来の仮想タンパク質(Accession number: WP_006569624.1)を選出し、機能解析を行った。この仮想タンパク質のアミノ酸配列(配列番号1)および塩基配列(配列番号2)を、それぞれ図1A、およびB〜Cに示す。配列番号2に記載の塩基配列は、大腸菌での発現に最適化するために、コドン補正が行われている。
5×PS buffer(タカラバイオ) 10μL
2mM dNTP mix(タカラバイオ) 2μL
20μM プライマー(Ts_p20283242_R) 1μL
20μM プライマー(T_p32_d1-752S) 1μL
100ng/μL テンプレート 1μL
Primestar HS DNA Polymerase(タカラバイオ) 0.2μL
H2O 34.8μL
変異酵素△(1〜752)−大腸菌発現用プラスミドを大腸菌BL21(DE3)に導入し、100μg/mLアンピシリンを含む30mLのLB培地に植菌し、37℃にて一晩振盪培養した。この培養液30mLを1Lの同培地に植え継ぎ、濁度(600nm)が0.5に達するまで同条件で培養した。0.1Mイソプロピルβ−D−1−チオガラクトシド(IPTG)を終濃度0.1mMになるように添加し、誘導培養を開始した。誘導後、培養温度を18℃とし、22時間振盪培養した。遠心分離(6、000×g、4℃、10分間)を行い、菌体を回収した。これを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)に懸濁し、超音波により破砕した。超音波処理をSonifier 250(Branson、 Danbury、 CT)を用い、duty cycleを50%、output control3の条件で1分間ずつ3回行った。超音波処理1回ごとに1分間氷冷した。遠心分離(12000×g、10分間、4℃)を2回行い、得られた抽出液を粗酵素液とした。粗酵素液34mLを得た。予め0.5MのNiSO4を用いてNi2+をキレートし、0.5MのNaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)で平衡化したNi-Chelating Sepharose Fast Flowカラム(1.0 i.d. × 7 cm、5.5 mL;GE Healthcare Bioscience、 Uppsala、 Sweden)に粗酵素液を供した。非吸着タンパク質を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)により溶出し、15mLずつ60画分に分画した。イミダゾール直線濃度勾配(30〜500mM、400mL)により吸着タンパク質を溶出し、5mLずつ80画分に分画した。活性画分88〜101を回収した。回収画分を1Lの10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に対して、4回透析した。透析膜には、UC16−32−100(三光純薬、東京)を使用した。透析後の試料をVivaspin20、MWCO30、000(Sartorius、 Goettingen、 Germany)を用いて濃縮した。これを変異酵素△(1〜752)の精製酵素とし、4℃で保存した。
1.発現プラスミドの構築
変異酵素△(1〜752)を枯草菌(Bacillus subtilis)で生産するための発現プラスミドを構築した。まず、実施例1で構築した△(1〜752)−大腸菌発現用プラスミドをテンプレートとして、センス鎖増幅についてはベクターの末端と相同な塩基配列を付加したプライマーを用いて、アンチセンス鎖増幅についてはHis-Tagの配列の一部を付加したプライマーを用いて、目的遺伝子をPCR増幅した。PCR条件を以下に示す。PCR増幅の反応液の総量は50μLであった。
2.5mM dNTPs mix(タカラバイオ) 4μL
10μM プライマー(TSDD−F) 1μL
10μM プライマー(TSDD−R) 1μL
1ng/μL テンプレート 1μL
Primestar GXL DNA Polymerase(タカラバイオ) 1μL
H2O 32μL
変異酵素△(1〜752)−枯草菌発現用プラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ISW1214(タカラバイオ)に導入し、7.5μg/mLテトラサイクリンを含む再生寒天培地(組成:8.1%コハク酸ナトリウム、1%寒天、0.5%カザミノ酸、0.5%酵母エキス、0.15%リン酸2水素カリウム、0.35%リン酸水素2カリウム、0.5%グルコース、0.4%塩化マグネシウム、0.01%ウシ血清アルブミン、0.001%メチオニン、および0.001%ロイシン)にて30℃で2日間培養した。得られたコロニーを前培養培地、続いて本培養培地で培養した(特開2009−17841号および特開2009−17842号に記載のとおり培養したが、培地の組成は改変したものを使用した)。遠心分離(15、000×g、4℃、5分間)を行い、上清を0.45μmフィルター(メルク)で濾過したものを変異酵素△(1〜752)の酵素溶液とした。該酵素液についてSDS−PAGEを行い、組み換え酵素の生産を確認した。変異酵素△(1〜752)の理論的な分子量サイズ(約91.5kDa)付近の80〜90kDaに濃いバンドが見られ、培養上清中に変異酵素△(1〜752)が分泌されたことを確認した(図3)。
実施例1で得られた精製酵素△(1〜752)(本酵素1)の活性を測定するため、マルトース分解活性を測定した。
100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5) 20μL
50mMマルトース 20μL
精製酵素△(1〜752)溶液 10μL
本酵素の理化学的性質については、マルトース分解活性を測定して確認した。酵素は、実施例1で得られた精製酵素△(1〜752)(本酵素1)を使用した。
1.至適pH
本酵素のマルトース分解活性を、pH3.0〜11.0の緩衝液中で測定した。マルトース分解活性は、実施例3の活性測定に記載の方法に従って測定した。ただし、40mM Britton−Robinson(BR)緩衝液(pH3.0〜11.0)を反応緩衝液として使用した。本酵素は、pH4.5で最大活性を示し、pH3.5、4.0および5.0で最大活性に対し90%以上の活性を示し、pH4.0〜5.0において最大活性の98%以上の活性を示した(図4a、黒丸)。
各pH(pH3.0〜11.0)の0.1MのBR緩衝液75μLと、4.08μg/mLの本酵素75μLを混合して酵素希釈液を得て、4℃で24時間保持した。24時間保持後の酵素希釈液を用いて、実施例3の活性測定に記載の方法に従って活性を測定した。各pHの0.1MのBR緩衝液に保持する前の活性に対して、保持後の活性(残存活性)の割合(%)を算出した。残存活性85%以上を示すpHの範囲をpH安定域とした場合、本酵素のpH安定域は3.5〜8.5であった(図4a、白丸)。
酵素反応温度を30、37、45、50、55、60、65、70、75または80℃とし、実施例3の活性測定に記載の方法に従って、酵素反応温度ごとにマルトース分解活性を測定した。本酵素は、温度60℃で最大活性を示し、温度55〜60℃の範囲で最大活性の80%以上の活性を示した(図4b、黒丸)。
0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)20μLと、10.2μg/mLの本酵素10μLを混合し、30、37、45、50、55、60、65、70、75または80℃で15分間保持した。各温度で保持後の活性を、実施例3の活性測定に記載の方法に従って測定した。各温度に保持する前の活性に対して、保持後の活性(残存活性)の割合(%)を算出した。残存活性90%以上を示す場合、その温度で安定性を有すると判断した。本酵素は、温度60℃以下で安定であった(図4b、白丸)。
HPAEC−PAD(High performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection;パルスドアンペロメトリ検出器を用いた陰イオンクロマトグラフィ)により、変異酵素△(1〜752)による基質の反応生成物を分析した。基質は、マルトース(G2)、マルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)、マルトペンタオース(G5)、イソマルトース(IG2)及びイソマルトトリオース(IG3)を使用した。
TLC(薄層クロマトグラフィー)により、酵素△(1〜752)による基質の反応生成物を経時的に分析した。
まず、実施例1で得られた酵素△(1〜752)(本酵素1)を、基質マルトペンタオース(G5)に作用させた。具体的には、以下の組成からなる1mLの反応液を37℃に保持して反応させた。酵素の希釈には、1mg/mLのBSAを含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)を用いた。
30mMマルトペンタオース 500μL(終濃度15mM)
本酵素溶液 400μL(終濃度36.7μg/mL)
100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5) 100μL(終濃度10mM)
反応開始後1、6、24、48、96時間に、反応液から100μLを採取し、100℃で3分間の熱処理を行い反応停止した。
1.方法
今回の試験用に分画調整したG67 richシラップを終濃度30%となるように超純水に溶解し、1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を終濃度50mM、およびCaCl2を終濃度3mMとなるように添加した反応液を、5本用意した。各反応液に、実施例2で調製した変異酵素△(1〜752)を含む枯草菌の培養上清(本酵素2)を、62.5、125、250、500、または1000μL/g−DS添加し、53℃で72時間反応させた。
図7A、BおよびCに、G67 richシラップ、本酵素による反応生成物のHPLC分析のクロマトグラムを示す。表6に、G67 richシラップおよび本酵素の反応生成物の糖組成およびデキストラナーゼ処理後のDP1〜3の増加割合(%)を示す。
また、本酵素の添加量が多いほど、反応生成物中のDP1〜2の含有割合が増加する傾向があった(表6、図7C)。
1.方法
図8A、BおよびCに、パインデックス#1、本酵素による反応生成物のHPLC分析のクロマトグラムを示す。表7に、パインデックス#1および本酵素の反応生成物の糖組成およびデキストラナーゼ処理後のDP1〜3の増加割合(%)を示す。
配列番号2:サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の仮想タンパク質をコードする塩基配列
配列番号3:変異酵素△(1〜752)のアミノ酸配列
配列番号4:変異酵素△(1〜752)をコードする塩基配列
配列番号5および6:表1に記載のプライマー
配列番号7および8:表2に記載のプライマー
配列番号9および10:表3に記載のプライマー
配列番号11および12:表4に記載のプライマー
Claims (13)
- 以下の(a)から(c)のいずれかのタンパク質を含む、α-1,6-グルコシル転移活性を有する酵素剤。
(a) 配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b) 配列番号3に記載のアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、α-1,6-グルコシル転移活性を有するタンパク質;
(c) 配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなり、α-1,6-グルコシル転移活性を有するタンパク質。 - 更に、α-1,4-グルコシル転移活性を有する、請求項1に記載の酵素剤。
- 前記タンパク質が、サーモアナエロバクター・シデロフィラス(Thermoanaerobacter siderophilus)に由来し、下記の性質のいずれかを有する、請求項1又は2に記載の酵素剤。
(1) 至適pHが4.0〜5.0である;
(2) 安定pH範囲が3.5〜8.5である;
(3) 至適温度が55℃〜60℃である;
(4) 温度安定性は60℃以下である;
(5) 基質として、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびデキストリンに作用する。 - α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類からα-1,6-グルカンを製造するために用いられる、請求項1から3の何れか一項に記載の酵素剤。
- α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類が澱粉部分分解物である、請求項4に記載の酵素剤。
- 前記α-1,6-グルカンが、重合度2から30を有するイソマルトオリゴ糖および/またはイソマルトメガロ糖である、請求項4または5に記載の酵素剤。
- α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類に、請求項1から6のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させて、α-1,6-グルカンを得る反応工程を含む、α-1,6-グルカンの製造方法。
- 前記反応工程の前に、以下の工程を含む、請求項7に記載の製造方法。
澱粉を加水分解して、α-1,4-グルコシド結合および/またはα-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖および/または多糖類を得る工程。 - 請求項7または8に記載の方法を実施してα-1,6-グルカンを得る工程、および前記工程で得られたα-1,6-グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
- 糖受容体と糖供与体に、請求項1から6のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。
- 糖供与体がマルトオリゴ糖である、請求項10に記載の配糖体の製造方法。
- 糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物またはフェノール性水酸基を有する化合物である、請求項10または11に記載の配糖体の製造方法。
- 請求項10から12のいずれか一項に記載の方法を実施して配糖体を得る工程、および前記工程で得られた配糖体を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
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