JP2933842B2 - デキストランの製造方法 - Google Patents
デキストランの製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、デキストランの製造
に使用されているロイコノストック メセンテロイデス
のデキストランスクラーゼ構成的変異株を用いてデキス
トランを製造する方法に関する。
に使用されているロイコノストック メセンテロイデス
のデキストランスクラーゼ構成的変異株を用いてデキス
トランを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】デキストランは、ロイコノストック メ
センテロイデスにより工業的に生産され、血しょう代替
物を始めとして様々な分野で用途開発されてきた多糖で
ある。かかるデキストランの製造方法としては、スクロ
ースを含む培地でロイコノストック メセンテロイデス
を培養してデキストランを生成させる発酵法と、この菌
が産生する酵素であるデキストランスクラーゼとスクロ
ースを反応させてデキストランを生成させる酵素法があ
る。現在、工業的製造には、発酵法が使用されている。
センテロイデスにより工業的に生産され、血しょう代替
物を始めとして様々な分野で用途開発されてきた多糖で
ある。かかるデキストランの製造方法としては、スクロ
ースを含む培地でロイコノストック メセンテロイデス
を培養してデキストランを生成させる発酵法と、この菌
が産生する酵素であるデキストランスクラーゼとスクロ
ースを反応させてデキストランを生成させる酵素法があ
る。現在、工業的製造には、発酵法が使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】デキストラン製造にお
ける発酵法は、デキストラン生産菌であるロイコノスト
ック メセンテロイデスをスクロースを含む培地で培養
する方法である。この菌は、スクロースによって合成誘
導された酵素デキストランスクラーゼを菌体から培養液
中へ分泌し、この酵素が培地中のスクロースと反応する
ことによりデキストランを培養液中において合成する。
ここに、通常、菌の増殖に伴いデキストランスクラーゼ
が生成されるため、発酵法では、菌の増殖と培養液中の
デキストランスクラーゼの活性との双方を確保維持する
必要がある。すなわち、菌の増殖のための栄養源や生育
因子、最適温度、ｐＨ、デキストラン生成の酵素反応を
行うための最適温度，ｐＨ等の様々な条件が整う必要が
ある。
ける発酵法は、デキストラン生産菌であるロイコノスト
ック メセンテロイデスをスクロースを含む培地で培養
する方法である。この菌は、スクロースによって合成誘
導された酵素デキストランスクラーゼを菌体から培養液
中へ分泌し、この酵素が培地中のスクロースと反応する
ことによりデキストランを培養液中において合成する。
ここに、通常、菌の増殖に伴いデキストランスクラーゼ
が生成されるため、発酵法では、菌の増殖と培養液中の
デキストランスクラーゼの活性との双方を確保維持する
必要がある。すなわち、菌の増殖のための栄養源や生育
因子、最適温度、ｐＨ、デキストラン生成の酵素反応を
行うための最適温度，ｐＨ等の様々な条件が整う必要が
ある。
【０００４】しかしながら、菌の増殖に伴い産生される
有機酸により培養液のｐＨが低下する。一方、培養液の
ｐＨが５．０よりも低下することにより、デキストラン
スクラーゼの活性が低下し、デキストランの生産量が低
下するという問題があった。したがって、通常のデキス
トラン製造用の培地に、ロイコノストック メセンテロ
イデスを植菌して培養しても、そのままでは必ずしも高
収率でデキストランが得られるわけでなく、培養液のｐ
Ｈをチェックし、必要に応じてアルカリ液を添加するｐ
Ｈ調整等により、デキストランスクラーゼの活性を維持
する必要があった。しかし生成されたデキストランによ
り、培養液の粘度が高くなるため、培養液のｐＨ低下抑
制による酵素活性の維持には限界があるとともに、一方
では、ｐＨのモニタリングはコストアップの一因であっ
た。
有機酸により培養液のｐＨが低下する。一方、培養液の
ｐＨが５．０よりも低下することにより、デキストラン
スクラーゼの活性が低下し、デキストランの生産量が低
下するという問題があった。したがって、通常のデキス
トラン製造用の培地に、ロイコノストック メセンテロ
イデスを植菌して培養しても、そのままでは必ずしも高
収率でデキストランが得られるわけでなく、培養液のｐ
Ｈをチェックし、必要に応じてアルカリ液を添加するｐ
Ｈ調整等により、デキストランスクラーゼの活性を維持
する必要があった。しかし生成されたデキストランによ
り、培養液の粘度が高くなるため、培養液のｐＨ低下抑
制による酵素活性の維持には限界があるとともに、一方
では、ｐＨのモニタリングはコストアップの一因であっ
た。
【０００５】また、リン酸塩等の緩衝剤をあらかじめ培
地に加えておくことにより、培養液のｐＨ低下抑制の効
果が得られるが、これも効果に限界があり、コストアッ
プにもなる。
地に加えておくことにより、培養液のｐＨ低下抑制の効
果が得られるが、これも効果に限界があり、コストアッ
プにもなる。
【０００６】そこで、本発明では、安定かつ高収率にデ
キストランの製造が可能なデキストランの製造方法を提
供することを目的とする。
キストランの製造が可能なデキストランの製造方法を提
供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
課題を解決するため、デキストランスクラーゼを培地中
のスクロースの誘導によらなくても産生するロイコノス
トック メセンテロイデスのデキストランスクラーゼ構
成的変異株を利用してデキストランを製造することを試
み、以下の発明を完成した。
課題を解決するため、デキストランスクラーゼを培地中
のスクロースの誘導によらなくても産生するロイコノス
トック メセンテロイデスのデキストランスクラーゼ構
成的変異株を利用してデキストランを製造することを試
み、以下の発明を完成した。
【０００８】すなわち、請求項１に記載の発明は、スク
ロースからデキストランを製造する方法であって、デキ
ストラン製造用培地でロイコノストック メセンテロイ
デスのデキストランスクラーゼ構成的変異株を培養する
工程を包含し、該変異株を培養する際にその培養液のｐ
Ｈの調整をすることなくデキストランの合成を確保する
ことを特徴とするデキストランの製造方法である。ま
た、請求項２に記載の発明は、前記デキストランスクラ
ーゼ構成的変異株は、ロイコノストック メセンテロイ
デスＭ２０９（生命工学工業技術研究所 受託番号 FE
RM 第BP-4903 号）であることを特徴とする請求項１に
記載のデキストランの製造方法である。また、請求項３
に記載の発明は、前記デキストランスクラーゼ構成的変
異株は、ロイコノストック メセンテロイデスＭ８９８
（生命工学工業技術研究所 受託番号 FERM 第BP-490
4 号）であることを特徴とする請求項１に記載のデキス
トランの製造方法である。
ロースからデキストランを製造する方法であって、デキ
ストラン製造用培地でロイコノストック メセンテロイ
デスのデキストランスクラーゼ構成的変異株を培養する
工程を包含し、該変異株を培養する際にその培養液のｐ
Ｈの調整をすることなくデキストランの合成を確保する
ことを特徴とするデキストランの製造方法である。ま
た、請求項２に記載の発明は、前記デキストランスクラ
ーゼ構成的変異株は、ロイコノストック メセンテロイ
デスＭ２０９（生命工学工業技術研究所 受託番号 FE
RM 第BP-4903 号）であることを特徴とする請求項１に
記載のデキストランの製造方法である。また、請求項３
に記載の発明は、前記デキストランスクラーゼ構成的変
異株は、ロイコノストック メセンテロイデスＭ８９８
（生命工学工業技術研究所 受託番号 FERM 第BP-490
4 号）であることを特徴とする請求項１に記載のデキス
トランの製造方法である。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。ロイコノ
ストック メセンテロイデスは、ロイコノストック属に
属する菌であって、デキストラン及びデキストランスク
ラーゼを産生する菌である。また、デキストランスクラ
ーゼ構成的変異株とは、スクロース以外の糖類からデキ
ストランスクラーゼを生産できる、すなわち、デキスト
ランスクラーゼによるデキストラン合成の基質であるス
クロースの誘導なくしてデキストランスクラーゼを常に
生産する菌株をいう。
ストック メセンテロイデスは、ロイコノストック属に
属する菌であって、デキストラン及びデキストランスク
ラーゼを産生する菌である。また、デキストランスクラ
ーゼ構成的変異株とは、スクロース以外の糖類からデキ
ストランスクラーゼを生産できる、すなわち、デキスト
ランスクラーゼによるデキストラン合成の基質であるス
クロースの誘導なくしてデキストランスクラーゼを常に
生産する菌株をいう。
【００１０】このロイコノストック メセンテロイデス
のデキストランスクラーゼ構成的変異株によれば、デキ
ストランスクラーゼが構成的に生産され、スクロースを
炭素源とした場合に、親株よりも酵素生成量が多くな
る。したがって、培地にスクロースを添加してデキスト
ランを製造する場合、スクロースから誘導的にデキスト
ランスクラーゼが生産される通常の菌株（親株）よりも
多量に、あるいは速やかにデキストランが生成され、培
養状況に大きく影響を受けることなく目的物たるデキス
トランを得ることができる。
のデキストランスクラーゼ構成的変異株によれば、デキ
ストランスクラーゼが構成的に生産され、スクロースを
炭素源とした場合に、親株よりも酵素生成量が多くな
る。したがって、培地にスクロースを添加してデキスト
ランを製造する場合、スクロースから誘導的にデキスト
ランスクラーゼが生産される通常の菌株（親株）よりも
多量に、あるいは速やかにデキストランが生成され、培
養状況に大きく影響を受けることなく目的物たるデキス
トランを得ることができる。
【００１１】かかるデキストランスクラーゼ構成的変異
株としては、ロイコノストック メセンテロイデス Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ（ＡＴＣＣ １０８３０ａ）（Ｌ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆＡｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｂ−５１２Ｆ（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
１０８３０ａ））を親株とする変異株であるロイコノス
トック メセテンロイデスＭ２０９株（以下、単にＭ２
０９株という。）やロイコノストック メセンテロイデ
ス Ｍ８９８株（以下、単にＭ８９８株という。）が挙
げられる。なお、Ｍ８９８株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ第ＢＰ−４９０４号として、平
成６年１２月１日付けで寄託され、Ｍ２０９株は、同Ｆ
ＥＲＭ第ＢＰ−４９０３号として平成６年１２月１日付
けで寄託されている。
株としては、ロイコノストック メセンテロイデス Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ（ＡＴＣＣ １０８３０ａ）（Ｌ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆＡｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｂ−５１２Ｆ（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
１０８３０ａ））を親株とする変異株であるロイコノス
トック メセテンロイデスＭ２０９株（以下、単にＭ２
０９株という。）やロイコノストック メセンテロイデ
ス Ｍ８９８株（以下、単にＭ８９８株という。）が挙
げられる。なお、Ｍ８９８株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ第ＢＰ−４９０４号として、平
成６年１２月１日付けで寄託され、Ｍ２０９株は、同Ｆ
ＥＲＭ第ＢＰ−４９０３号として平成６年１２月１日付
けで寄託されている。
【００１２】デキストランスクラーゼ構成的変異株は、
デキストランスクラーゼ（以下、単にＤＳａｓｅとい
う。）を生産するロイコノストック属菌を親株としてこ
れを変異誘導処理して得られた変異株からスクロース以
外の糖類から恒常的にＤＳａｓｅを生産するものを選択
し、これを用いる。
デキストランスクラーゼ（以下、単にＤＳａｓｅとい
う。）を生産するロイコノストック属菌を親株としてこ
れを変異誘導処理して得られた変異株からスクロース以
外の糖類から恒常的にＤＳａｓｅを生産するものを選択
し、これを用いる。
【００１３】変異誘導の方法としては、通常用いられる
公知の変異手段である、ニトロソグアニジン処理、ＵＶ
処理、エチルメタンスルホネート処理などの一般的な変
異手段や、自然変異によっても安定な変異株を得ること
ができる。このように変異誘導された変異株の中から、
ＤＳａｓｅの構成的変異株を選択するには、変異処理し
た株をスクロース以外の糖類を炭素源とした培地におい
て、培養した後、新たなタンパク質合成を抑制した状態
で、スクロースを炭素源として与えることにより、デキ
ストランの合成を確認できる菌株を選択する。
公知の変異手段である、ニトロソグアニジン処理、ＵＶ
処理、エチルメタンスルホネート処理などの一般的な変
異手段や、自然変異によっても安定な変異株を得ること
ができる。このように変異誘導された変異株の中から、
ＤＳａｓｅの構成的変異株を選択するには、変異処理し
た株をスクロース以外の糖類を炭素源とした培地におい
て、培養した後、新たなタンパク質合成を抑制した状態
で、スクロースを炭素源として与えることにより、デキ
ストランの合成を確認できる菌株を選択する。
【００１４】以下に、Ｍ８９８株及びＭ２０９株につい
ての取得例を示す。まず、前記親株（Ｂ−５１２Ｆ株）
をＭＲＳ液体培地（米国ＤＩＦＣＯ社製Ｌａｃｔｏｂａ
ｓｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ，炭素源はグルコース
であり、スクロースを含まない）で３０℃、２４時間培
養し、菌体を洗浄後、ＮＴＧで処理（０．５ｍｇ／ｍ
ｌ、６０分）した。さらに、菌体を洗浄した後、適宜希
釈してＭＲＳ寒天平板培地に塗布し、３０℃で２日間培
養した。この後、４０００ｐｐｍのテトラサイクリンを
含む１０％スクロース寒天を重層し、２５℃で２〜６時
間放置した。ここに重層寒天中のテトラサイクリンは、
ＭＲＳ寒天培地中の変異株の新規なタンパク質の合成を
阻害する。このため、寒天の重層前のＭＲＳ寒天培地中
での培養により既に生産されたＤＳａｓｅのみが、重層
された寒天中のスクロースを基質としてデキストランを
合成することができる。
ての取得例を示す。まず、前記親株（Ｂ−５１２Ｆ株）
をＭＲＳ液体培地（米国ＤＩＦＣＯ社製Ｌａｃｔｏｂａ
ｓｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ，炭素源はグルコース
であり、スクロースを含まない）で３０℃、２４時間培
養し、菌体を洗浄後、ＮＴＧで処理（０．５ｍｇ／ｍ
ｌ、６０分）した。さらに、菌体を洗浄した後、適宜希
釈してＭＲＳ寒天平板培地に塗布し、３０℃で２日間培
養した。この後、４０００ｐｐｍのテトラサイクリンを
含む１０％スクロース寒天を重層し、２５℃で２〜６時
間放置した。ここに重層寒天中のテトラサイクリンは、
ＭＲＳ寒天培地中の変異株の新規なタンパク質の合成を
阻害する。このため、寒天の重層前のＭＲＳ寒天培地中
での培養により既に生産されたＤＳａｓｅのみが、重層
された寒天中のスクロースを基質としてデキストランを
合成することができる。
【００１５】平板を観察して、コロニーの回りに粘性の
デキストランを生成した株をＤＳａｓｅ構成的変異株と
して分離した。これらの変異株について、菌の安定性と
各種の炭素源を含む液体培地におけるＤＳａｓｅ生産性
を検討し、Ｍ８９８株及びＭ２０９株を選択した。な
お、液体培地の組成は、炭素源０．２％、Ｋ2 ＨＰＯ4
１．４％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．６％、酵母エキス２．０
％、ペプトン１．０％、金属塩溶液１．０％、ＣａＣＯ
3 ０．５％であり、ｐＨは７．０であった。ここに金属
塩溶液の組成は、ＮａＣｌ ２．０％、ＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ２．０％、ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2Ｏ ０．１％、
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１％であった。
デキストランを生成した株をＤＳａｓｅ構成的変異株と
して分離した。これらの変異株について、菌の安定性と
各種の炭素源を含む液体培地におけるＤＳａｓｅ生産性
を検討し、Ｍ８９８株及びＭ２０９株を選択した。な
お、液体培地の組成は、炭素源０．２％、Ｋ2 ＨＰＯ4
１．４％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．６％、酵母エキス２．０
％、ペプトン１．０％、金属塩溶液１．０％、ＣａＣＯ
3 ０．５％であり、ｐＨは７．０であった。ここに金属
塩溶液の組成は、ＮａＣｌ ２．０％、ＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ２．０％、ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2Ｏ ０．１％、
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１％であった。
【００１６】このようなＤＳａｓｅ構成的変異株によ
る、デキストラン合成のための培地は、通常のデキスト
ラン製造と同様、スクロースを含むデキストラン製造培
地を用いる。すなわち、炭素源として、スクロースを含
み、窒素源、有機天然栄養源、リン酸塩、金属イオン、
ビタミン等がバランスよく含まれていればよい。
る、デキストラン合成のための培地は、通常のデキスト
ラン製造と同様、スクロースを含むデキストラン製造培
地を用いる。すなわち、炭素源として、スクロースを含
み、窒素源、有機天然栄養源、リン酸塩、金属イオン、
ビタミン等がバランスよく含まれていればよい。
【００１７】また、天然物を用いてデキストラン製造を
行うこともできる。例えば、甜菜や甘しょの搾汁液、廃
糖密等を有効利用の目的でデキストラン製造用培地とし
て用いることができる。この場合、これらをそのままあ
るいは適当に希釈した後、オートクレーブするだけで直
接培地として使用することができる。したがって、コス
ト的にも安価にデキストランを製造することができる。
行うこともできる。例えば、甜菜や甘しょの搾汁液、廃
糖密等を有効利用の目的でデキストラン製造用培地とし
て用いることができる。この場合、これらをそのままあ
るいは適当に希釈した後、オートクレーブするだけで直
接培地として使用することができる。したがって、コス
ト的にも安価にデキストランを製造することができる。
【００１８】培養条件は、通常のデキストラン製造に用
いられている条件を用いることができる。すなわち、静
置培養若しくはゆっくりとした撹拌培養で、８〜４８時
間培養する。培養温度は、１５〜３５℃、好ましくは２
５〜３０℃である。初発の培地ｐＨは、５．０〜８．
０、好ましくは、６．０〜７．５がよい。
いられている条件を用いることができる。すなわち、静
置培養若しくはゆっくりとした撹拌培養で、８〜４８時
間培養する。培養温度は、１５〜３５℃、好ましくは２
５〜３０℃である。初発の培地ｐＨは、５．０〜８．
０、好ましくは、６．０〜７．５がよい。
【００１９】培養液からのデキストランの分離には、遠
心分離法やろ過法によって菌体を除去した後、上清液に
アルコールを加えて沈殿させることにより行うことがで
きる。分離されたデキストランの、水への溶解とアルコ
ール沈殿を繰り返すことにより洗浄を行い、デキストラ
ンを精製することができる。
心分離法やろ過法によって菌体を除去した後、上清液に
アルコールを加えて沈殿させることにより行うことがで
きる。分離されたデキストランの、水への溶解とアルコ
ール沈殿を繰り返すことにより洗浄を行い、デキストラ
ンを精製することができる。
【００２０】ここに、上記のデキストラン製造方法を用
いて、デキストラン生産を行った場合、ｐＨ低下抑制が
十分でない培地で、親株であるロイコノストック メセ
ンテロイデス Ｂ−５１２Ｆを培養すると、著しくデキ
ストラン生成量が少ないことがある。
いて、デキストラン生産を行った場合、ｐＨ低下抑制が
十分でない培地で、親株であるロイコノストック メセ
ンテロイデス Ｂ−５１２Ｆを培養すると、著しくデキ
ストラン生成量が少ないことがある。
【００２１】しかし、上記変異株Ｍ２０９株において
は、特にデキストラン生成が非常に速く、短時間に高収
率でデキストランを得ることができる。この株において
は、菌の増殖スピードは親株と同様であるが、単位菌体
あたりのＤＳａｓｅ合成能が親株の数倍もあるため、培
養開始から短時間で、すなわち、培養液のｐＨがＤＳａ
ｓｅの不活性化域まで低下する前に、高活性のＤＳａｓ
ｅによりデキストランを効率よく産生することができる
からである。
は、特にデキストラン生成が非常に速く、短時間に高収
率でデキストランを得ることができる。この株において
は、菌の増殖スピードは親株と同様であるが、単位菌体
あたりのＤＳａｓｅ合成能が親株の数倍もあるため、培
養開始から短時間で、すなわち、培養液のｐＨがＤＳａ
ｓｅの不活性化域まで低下する前に、高活性のＤＳａｓ
ｅによりデキストランを効率よく産生することができる
からである。
【００２２】また、Ｍ８９８株においては、特に、菌の
増殖が遅いため培養液のｐＨの低下が遅く、かつ単位菌
体あたりのＤＳａｓｅ合成能が高いため、ｐＨが低下し
ない状態の培養液中で活性状態のＤＳａｓｅを存在させ
ることができ、効率的にデキストランの製造を安定して
行うことができる。よって、Ｍ８９８株では、親株の約
１００分の１程度の菌数でもデキストランを十分に製造
できる。
増殖が遅いため培養液のｐＨの低下が遅く、かつ単位菌
体あたりのＤＳａｓｅ合成能が高いため、ｐＨが低下し
ない状態の培養液中で活性状態のＤＳａｓｅを存在させ
ることができ、効率的にデキストランの製造を安定して
行うことができる。よって、Ｍ８９８株では、親株の約
１００分の１程度の菌数でもデキストランを十分に製造
できる。
【００２３】したがって、Ｍ２０９株では、短時間に高
収率でデキストランを得ることができ、Ｍ８９８株で
は、少ない菌数で安定的にデキストランを得ることがで
き、これらの菌株の性質に適合したデキストラン製造法
を選択することができる。
収率でデキストランを得ることができ、Ｍ８９８株で
は、少ない菌数で安定的にデキストランを得ることがで
き、これらの菌株の性質に適合したデキストラン製造法
を選択することができる。
【００２４】このようにＭ２０９株及びＭ８９８株にお
いては、ＤＳａｓｅを構成的に産生するという性質と、
菌株のＤＳａｓｅ合成能と培養液のｐＨ低下の原因であ
る菌の増殖スピードとの関係から、特にｐＨ調整をする
ことなく培養液中でのデキストラン合成を確保すること
ができる。
いては、ＤＳａｓｅを構成的に産生するという性質と、
菌株のＤＳａｓｅ合成能と培養液のｐＨ低下の原因であ
る菌の増殖スピードとの関係から、特にｐＨ調整をする
ことなく培養液中でのデキストラン合成を確保すること
ができる。
【００２５】また、親株の培養液のｐＨの低下を抑制し
てデキストランを高生成させた場合でも、Ｍ２０９株の
ような酵素生成が高い変異株の方がデキストラン生成を
より短時間に行うことができる。以上のように、ＤＳａ
ｓｅ構成的変異株を取得して、これらデキストランを高
収率で安定して生産できる実用的な株を選ぶことができ
るのである。
てデキストランを高生成させた場合でも、Ｍ２０９株の
ような酵素生成が高い変異株の方がデキストラン生成を
より短時間に行うことができる。以上のように、ＤＳａ
ｓｅ構成的変異株を取得して、これらデキストランを高
収率で安定して生産できる実用的な株を選ぶことができ
るのである。
【００２６】なお、かかるＤＳａｓｅ構成的変異株は、
バッチ法のみならず、流加培養法、菌を担体に固定する
方法等、菌体を用いたデキストラン製造方法であれば、
使用することができる。
バッチ法のみならず、流加培養法、菌を担体に固定する
方法等、菌体を用いたデキストラン製造方法であれば、
使用することができる。
【００２７】
【発明の効果】請求項１に記載の発明によれば、ＤＳａ
ｓｅ構成的変異株によりスクロースからデキストランを
製造するため、培養液中にＤＳａｓｅを速やかに供給し
たり、あるいは、ＤＳａｓｅ濃度を高濃度とすることが
できる。したがって、菌株の増殖による培養環境の影響
を受けにくく、安定かつ高収率にデキストランを製造す
ることができる。請求項２に記載のＤＳａｓｅ構成的変
異株であるＭ２０９株によれば、菌株のＤＳａｓｅ合成
能が高いため、菌の増殖により培養液のｐＨがＤＳａｓ
ｅの不活性化域まで低下する前に、短期間に安定にかつ
高収率にデキストランを製造することができる。請求項
３に記載のＤＳａｓｅ構成的変異株のＭ８９８株は、菌
の増殖速度が遅くかつＤＳａｓｅ合成能が高いため、培
養液のｐＨが菌の増殖により低下しにくく、良好な培養
環境下でのＤＳａｓｅの活性が長時間確保される。した
がって、安定して、高収率でデキストランを得ることが
できる。
ｓｅ構成的変異株によりスクロースからデキストランを
製造するため、培養液中にＤＳａｓｅを速やかに供給し
たり、あるいは、ＤＳａｓｅ濃度を高濃度とすることが
できる。したがって、菌株の増殖による培養環境の影響
を受けにくく、安定かつ高収率にデキストランを製造す
ることができる。請求項２に記載のＤＳａｓｅ構成的変
異株であるＭ２０９株によれば、菌株のＤＳａｓｅ合成
能が高いため、菌の増殖により培養液のｐＨがＤＳａｓ
ｅの不活性化域まで低下する前に、短期間に安定にかつ
高収率にデキストランを製造することができる。請求項
３に記載のＤＳａｓｅ構成的変異株のＭ８９８株は、菌
の増殖速度が遅くかつＤＳａｓｅ合成能が高いため、培
養液のｐＨが菌の増殖により低下しにくく、良好な培養
環境下でのＤＳａｓｅの活性が長時間確保される。した
がって、安定して、高収率でデキストランを得ることが
できる。
【００２８】
【実施例】以下に本発明を具現化した実施例について説
明する。なお、本発明は、本実施例に限定されるもので
はない。 （実施例１）本実施例では、ＤＳａｓｅ構成的変異株と
してＭ２０９株及びＭ８９８株を用いて、以下の条件下
でデキストランを製造した。また、比較対照のため、親
株であるロイコノストック メセンテロイデス ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−５１２Ｆ（以下、単に親株という。）を使用し
て同様にデキストランを製造した。
明する。なお、本発明は、本実施例に限定されるもので
はない。 （実施例１）本実施例では、ＤＳａｓｅ構成的変異株と
してＭ２０９株及びＭ８９８株を用いて、以下の条件下
でデキストランを製造した。また、比較対照のため、親
株であるロイコノストック メセンテロイデス ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−５１２Ｆ（以下、単に親株という。）を使用し
て同様にデキストランを製造した。
【００２９】１．培地の組成 ｉデキストラン製造用基本培地の組成 ペプトン ０．３％ 酵母エキス ０．１５％ リン酸二カリウム ０．５％ ＮａＣｌ ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００１％ ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ ０．００１％ となるように、水を加えて溶かし、ｐＨ６．８に調整
し、デキストラン製造用基本培地とした。 ii 種培養用培地の組成 本培地として、前記したデキストラン製造用基本培地に
炭素源としてスクロース濃度を５％としたものを用い
た。 iii デキストラン製造培地の組成 前記したデキストラン製造用基本培地に炭素源としてス
クロース濃度を１８．４％とした培地を用いた。
し、デキストラン製造用基本培地とした。 ii 種培養用培地の組成 本培地として、前記したデキストラン製造用基本培地に
炭素源としてスクロース濃度を５％としたものを用い
た。 iii デキストラン製造培地の組成 前記したデキストラン製造用基本培地に炭素源としてス
クロース濃度を１８．４％とした培地を用いた。
【００３０】２．種培養 前記種培養用培地でＭ２０９株、Ｍ８９８株及び親株を
２４時間フラスコ培養した培養液を種培養とした。
２４時間フラスコ培養した培養液を種培養とした。
【００３１】３．デキストラン製造培養 前記種培養を前記したデキストラン製造培地１Ｌに植菌
し、２Ｌジャー中で１００ｒｐｍで撹拌しながら２５℃
で培養した。なお、初発の菌数は約１．０×１０7 個／
ｍｌとなるように植菌した。この培養液から、１２時
間、２４時間、３６時間後に試料として培養液を採取し
た。
し、２Ｌジャー中で１００ｒｐｍで撹拌しながら２５℃
で培養した。なお、初発の菌数は約１．０×１０7 個／
ｍｌとなるように植菌した。この培養液から、１２時
間、２４時間、３６時間後に試料として培養液を採取し
た。
【００３２】４．試験項目 採取した培養液につき、ｐＨ、ＤＳａｓｅ活性、デキス
トラン生産量を測定した。ＤＳａｓｅ活性は、ｐＨ５．
２の酢酸緩衝液中で３０℃で１分間にスクロースから１
μｍｏｌのフラクトースを遊離させる酵素量を１ユニッ
トとして測定した。また、デキストラン生産量は、培養
液を適度に水で希釈して、遠心分離により菌体を除去
し、エタノールを上清の２倍量加えてデキストランを沈
殿させ２回洗浄を行い、最終的にエタノール濃度５０％
で沈殿したデキストランを水に溶解してフェノール・硫
酸法でグルコース量として測定した。
トラン生産量を測定した。ＤＳａｓｅ活性は、ｐＨ５．
２の酢酸緩衝液中で３０℃で１分間にスクロースから１
μｍｏｌのフラクトースを遊離させる酵素量を１ユニッ
トとして測定した。また、デキストラン生産量は、培養
液を適度に水で希釈して、遠心分離により菌体を除去
し、エタノールを上清の２倍量加えてデキストランを沈
殿させ２回洗浄を行い、最終的にエタノール濃度５０％
で沈殿したデキストランを水に溶解してフェノール・硫
酸法でグルコース量として測定した。
【００３３】ＤＳａｓｅ構成的変異株であるＭ２０９
株、Ｍ８９８株及び親株について試験した結果を表１に
示す。
株、Ｍ８９８株及び親株について試験した結果を表１に
示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】表１に示す結果から明らかなように、親株
では、１２時間後には、培養液のｐＨが４．３０にまで
低下し、これに対応して、ＤＳａｓｅ活性は低下し、デ
キストラン生産量も増加せず、ほぼ１２時間経過後と同
様の低いデキストラン量が維持されるのみであった。こ
れに対し、Ｍ２０９株では、ほぼ親株と同様に菌数が増
加し、培養液のｐＨが低下するが、１２時間経過時点
で、ＤＳａｓｅ活性が親株に比べて約５倍近い高い数値
を示しており、デキストラン量も約３倍となっていた。
すなわち、Ｍ２０９株では、特に、培養液のｐＨの調整
をしなくても、培養後１２時間で、同一のバッチサイズ
において従来の親株の発酵法によるデキストラン生産量
の約３倍収量が得られることが明らかである。また、短
期間の培養で多くの収量が得られることも明らかであ
る。
では、１２時間後には、培養液のｐＨが４．３０にまで
低下し、これに対応して、ＤＳａｓｅ活性は低下し、デ
キストラン生産量も増加せず、ほぼ１２時間経過後と同
様の低いデキストラン量が維持されるのみであった。こ
れに対し、Ｍ２０９株では、ほぼ親株と同様に菌数が増
加し、培養液のｐＨが低下するが、１２時間経過時点
で、ＤＳａｓｅ活性が親株に比べて約５倍近い高い数値
を示しており、デキストラン量も約３倍となっていた。
すなわち、Ｍ２０９株では、特に、培養液のｐＨの調整
をしなくても、培養後１２時間で、同一のバッチサイズ
において従来の親株の発酵法によるデキストラン生産量
の約３倍収量が得られることが明らかである。また、短
期間の培養で多くの収量が得られることも明らかであ
る。
【００３６】また、Ｍ８９８株では、菌の増殖が弱く、
３６時間経過後においても、依然として初発植菌数であ
る１０7 オーダーのままである。この結果、ｐＨはＤＳ
ａｓｅ活性が失活する５以下になることがない。一方、
ＤＳａｓｅ合成が活発に行われ、ＤＳａｓｅ活性は時間
の経過とともに増加され、この結果、２４時間経過後に
は、親株の約３倍量のデキストランが生産された。すな
わち、Ｍ８９８株では、特に、培養液のｐＨ調整をしな
くても、安定的にデキストランを製造でき、高収率を得
られることが明らかである。
３６時間経過後においても、依然として初発植菌数であ
る１０7 オーダーのままである。この結果、ｐＨはＤＳ
ａｓｅ活性が失活する５以下になることがない。一方、
ＤＳａｓｅ合成が活発に行われ、ＤＳａｓｅ活性は時間
の経過とともに増加され、この結果、２４時間経過後に
は、親株の約３倍量のデキストランが生産された。すな
わち、Ｍ８９８株では、特に、培養液のｐＨ調整をしな
くても、安定的にデキストランを製造でき、高収率を得
られることが明らかである。
【００３７】このように、本発明においては、いずれの
ＤＳａｓｅ構成的変異株において、親株を上回るデキス
トランを生産することができた。これは、Ｍ２０９株及
び８９８株がＤＳａｓｅ構成的変異株であり、スクロー
スの存在下、親株よりも多くのＤＳａｓｅを合成するこ
とと、これらの変異株の生育とＤＳａｓｅ合成能との関
係から、菌株培養中にＤＳａｓｅによるデキストラン合
成の条件が確保できるということによるものである。
ＤＳａｓｅ構成的変異株において、親株を上回るデキス
トランを生産することができた。これは、Ｍ２０９株及
び８９８株がＤＳａｓｅ構成的変異株であり、スクロー
スの存在下、親株よりも多くのＤＳａｓｅを合成するこ
とと、これらの変異株の生育とＤＳａｓｅ合成能との関
係から、菌株培養中にＤＳａｓｅによるデキストラン合
成の条件が確保できるということによるものである。
【００３８】なお、上記試験例において親株の培養液
を、水酸化ナトリウムにてｐＨ５．５に維持した場合、
培養２０時間後に最高デキストラン量４．８１％に達し
た。一方、表１に示した通り、Ｍ２０９株では培養液の
ｐＨ調整をしなくても１２時間後にデキストラン量６．
２１％に達しており、また、同様にＭ８９８株では、２
４時間後には、最高デキストラン量６．４８％に達して
おり、Ｍ２０９株及びＭ８９８株の発酵法によるデキス
トラン生産の有用性を確認できた。
を、水酸化ナトリウムにてｐＨ５．５に維持した場合、
培養２０時間後に最高デキストラン量４．８１％に達し
た。一方、表１に示した通り、Ｍ２０９株では培養液の
ｐＨ調整をしなくても１２時間後にデキストラン量６．
２１％に達しており、また、同様にＭ８９８株では、２
４時間後には、最高デキストラン量６．４８％に達して
おり、Ｍ２０９株及びＭ８９８株の発酵法によるデキス
トラン生産の有用性を確認できた。
【００３９】（実施例２）次に、同様に本実施例では、
実施例１と同様にＭ２０９株、Ｍ８９８株及び親株につ
いて、デキストラン製造用培地として、北海道産甜菜
（品種 モノヒカリ）の根の部分をすりつぶし、ガーゼ
に包んで搾り出した搾汁液をｐＨ６．８に調製してその
ままオートクレーブしたもの（スクロース濃度は１８．
７％）を用いて、その他は実施例１と同様の条件で培養
を行い、同様の試験項目について試験をした。結果を表
２に示す。
実施例１と同様にＭ２０９株、Ｍ８９８株及び親株につ
いて、デキストラン製造用培地として、北海道産甜菜
（品種 モノヒカリ）の根の部分をすりつぶし、ガーゼ
に包んで搾り出した搾汁液をｐＨ６．８に調製してその
ままオートクレーブしたもの（スクロース濃度は１８．
７％）を用いて、その他は実施例１と同様の条件で培養
を行い、同様の試験項目について試験をした。結果を表
２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】この表２に示す結果から明らかなように、
甜菜の搾汁液による培地でも、親株では、デキストラン
量は１％にも満たないのに対し、Ｍ２０９株やＭ８９８
株では、高レベルで生産されることがわかった。なお、
本培地においては、１２時間後には、どの株も菌数は１
０9 オーダーまで増殖して培養液のｐＨは５を下回って
いるが、変異株では、ＤＳａｓｅ合成能が高く、ＤＳａ
ｓｅ活性が高いため、デキストランが高収率に得ること
ができた。特に、Ｍ２０９株では、１２時間後にほぼ最
高デキストラン量に達している。
甜菜の搾汁液による培地でも、親株では、デキストラン
量は１％にも満たないのに対し、Ｍ２０９株やＭ８９８
株では、高レベルで生産されることがわかった。なお、
本培地においては、１２時間後には、どの株も菌数は１
０9 オーダーまで増殖して培養液のｐＨは５を下回って
いるが、変異株では、ＤＳａｓｅ合成能が高く、ＤＳａ
ｓｅ活性が高いため、デキストランが高収率に得ること
ができた。特に、Ｍ２０９株では、１２時間後にほぼ最
高デキストラン量に達している。
【００４２】また、実施例１と同様に、親株の培養液の
ｐＨを５．５に維持した場合、２０時間経過後に、最高
デキストラン量４．６５％に達したものの、Ｍ２０９株
では何らｐＨを調整しなくても１２時間後にデキストラ
ン量５．４２％に達し、また、Ｍ８９８株でも同様に、
２４時間後にデキストラン量４．７０％に達しているた
め、これらの菌株による発酵法の有用性が確認できた。
ｐＨを５．５に維持した場合、２０時間経過後に、最高
デキストラン量４．６５％に達したものの、Ｍ２０９株
では何らｐＨを調整しなくても１２時間後にデキストラ
ン量５．４２％に達し、また、Ｍ８９８株でも同様に、
２４時間後にデキストラン量４．７０％に達しているた
め、これらの菌株による発酵法の有用性が確認できた。
フロントページの続き (72)発明者 高山 健一郎 愛知県名古屋市東区白壁五丁目３番地 敷島製パン株式会社内 (56)参考文献 特開 平６−325360（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 19/08 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 スクロースからデキストランを製造する
方法であって、 デキストラン製造用培地でロイコノスト
ック メセンテロイデスのデキストランスクラーゼ構成
的変異株を培養する工程を包含し、 該変異株を培養する際にその培養液のｐＨの調整をする
ことなくデキストランの合成を確保する ことを特徴とす
るデキストランの製造方法。 - 【請求項２】 前記デキストランスクラーゼ構成的変異
株は、ロイコノストック メセンテロイデスＭ２０９
（生命工学工業技術研究所 受託番号 FERM 第BP-490
3 号）であることを特徴とする請求項１に記載のデキス
トランの製造方法。 - 【請求項３】 前記デキストランスクラーゼ構成的変異
株は、ロイコノストック メセンテロイデスＭ８９８
（生命工学工業技術研究所 受託番号 FERM 第BP-490
4 号）であることを特徴とする請求項１に記載のデキス
トランの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32536094A JP2933842B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | デキストランの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32536094A JP2933842B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | デキストランの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08173178A JPH08173178A (ja) | 1996-07-09 |
| JP2933842B2 true JP2933842B2 (ja) | 1999-08-16 |
Family
ID=18175960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32536094A Expired - Fee Related JP2933842B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | デキストランの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2933842B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0881283A1 (fr) * | 1997-05-31 | 1998-12-02 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Production de dextrane |
| JP6417061B1 (ja) | 2018-02-20 | 2018-10-31 | 国立大学法人北海道大学 | α−１，６−グルコシル転移活性を有する酵素 |
| JP6650546B1 (ja) | 2019-08-01 | 2020-02-19 | 日本食品化工株式会社 | α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質 |
-
1994
- 1994-12-27 JP JP32536094A patent/JP2933842B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08173178A (ja) | 1996-07-09 |
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