JPH06125774A - レバンサッカラーゼ酵素、その製造方法、それを産生する微生物およびそれを含む組成物 - Google Patents
レバンサッカラーゼ酵素、その製造方法、それを産生する微生物およびそれを含む組成物Info
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- JPH06125774A JPH06125774A JP5116027A JP11602793A JPH06125774A JP H06125774 A JPH06125774 A JP H06125774A JP 5116027 A JP5116027 A JP 5116027A JP 11602793 A JP11602793 A JP 11602793A JP H06125774 A JPH06125774 A JP H06125774A
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- C12N9/10—Transferases (2.)
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/836—Bacillus licheniformis
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、既知の酵素よりも広いｐＨ領域で
酵素活性を示し、特に酸性ｐＨでの安定性を有するレバ
ンサッカラーゼ酵素を提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、バチルス種に属する微生物に由来
する酸耐性レバンサッカラーゼ酵素であって、温度約５
５℃、かつｐＨ４．０で、５５℃で測定された最大活性
の少なくとも５０％の酵素活性を発揮することを特徴と
するレバンサッカラーゼ酵素である。
酵素活性を示し、特に酸性ｐＨでの安定性を有するレバ
ンサッカラーゼ酵素を提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、バチルス種に属する微生物に由来
する酸耐性レバンサッカラーゼ酵素であって、温度約５
５℃、かつｐＨ４．０で、５５℃で測定された最大活性
の少なくとも５０％の酵素活性を発揮することを特徴と
するレバンサッカラーゼ酵素である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酸耐性レバンサッカラ
ーゼ酵素、その産生菌、その酸耐性レバンサッカラーゼ
酵素の製造方法およびそれを含む組成物に関する。
ーゼ酵素、その産生菌、その酸耐性レバンサッカラーゼ
酵素の製造方法およびそれを含む組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】レバンサッカラーゼ酵素はフルクトース
の転移を触媒する。より正確にはレバンサッカラーゼ酵
素（E.C.2.4.1.10）は、蔗糖、ラフィノースまたはスタ
キオースのフルクトシル残基の適切な共存物質への転移
を触媒して、一般にはレバンと呼ばれる、β２→６結合
から成る異なる数のフラクトシル残基を含むポリマーを
生成する。レバンは、医薬や研究分野のほかに化学およ
び食品工業に広範囲に利用される。レバンサッカラーゼ
酵素は、種々の微生物、細菌（例えば, Acetobacter su
boxydans, Actinomyces viscosus, Aerobacter levanic
um, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lichenifo
rmis, Bacillus mesentericus, 枯草菌(Bacillussubti
lis),Glucobacter oxydans, Streptococcus mutans, St
reptococcus salivarius, Streptomyces griseus, Zymo
monas mobilis) から分離されてきた。殆どの場合、こ
の酵素は、細胞外性で易熱性である。レバンサッカラー
ゼ酵素製造における最も重要な特徴の一つは、既知のレ
バンサッカラーゼ酵素産生菌を用いてこの酵素を合成す
るためには、増殖培地に少なくとも５％の蔗糖を添加し
なければならないというこである。レバンが産生される
につれ、培養液の粘性が醗酵中に増加するので、結果と
して、培養液からレバンサッカラーゼ酵素を分離するこ
とが困難となる。従って、レバンサッカラーゼの産生に
全く蔗糖を要求しないか、または少量しか要求しない微
生物を求める研究が常に行われてきた。
の転移を触媒する。より正確にはレバンサッカラーゼ酵
素（E.C.2.4.1.10）は、蔗糖、ラフィノースまたはスタ
キオースのフルクトシル残基の適切な共存物質への転移
を触媒して、一般にはレバンと呼ばれる、β２→６結合
から成る異なる数のフラクトシル残基を含むポリマーを
生成する。レバンは、医薬や研究分野のほかに化学およ
び食品工業に広範囲に利用される。レバンサッカラーゼ
酵素は、種々の微生物、細菌（例えば, Acetobacter su
boxydans, Actinomyces viscosus, Aerobacter levanic
um, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lichenifo
rmis, Bacillus mesentericus, 枯草菌(Bacillussubti
lis),Glucobacter oxydans, Streptococcus mutans, St
reptococcus salivarius, Streptomyces griseus, Zymo
monas mobilis) から分離されてきた。殆どの場合、こ
の酵素は、細胞外性で易熱性である。レバンサッカラー
ゼ酵素製造における最も重要な特徴の一つは、既知のレ
バンサッカラーゼ酵素産生菌を用いてこの酵素を合成す
るためには、増殖培地に少なくとも５％の蔗糖を添加し
なければならないというこである。レバンが産生される
につれ、培養液の粘性が醗酵中に増加するので、結果と
して、培養液からレバンサッカラーゼ酵素を分離するこ
とが困難となる。従って、レバンサッカラーゼの産生に
全く蔗糖を要求しないか、または少量しか要求しない微
生物を求める研究が常に行われてきた。
【０００３】日本国特許出願公開５２−８２７８１号
は、低濃度の蔗糖（０. ３（重／容量）％）の存在下
で、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniform
is）３９８２株（Institute of Microbial Engineerin
g, 寄託番号３３７３号）を用いて、細胞外レバンサッ
カラーゼ酵素を製造する方法を開示する。しかしこの酵
素の誘発および産生にはなお蔗糖が必要である。しかも
このレバンサッカラーゼ酵素は、温度が５５℃のときｐ
Ｈ４．０では一切酵素活性を発揮しない。この温度で
は、ｐＨ約５．２でその最大活性の５０％が、さらにｐ
Ｈが約６から約７．８ではその最大活性の約８０％が発
揮されるだけである。この狭いｐＨ範囲が、このレバン
サッカラーゼ酵素の応用範囲を制限している。しかも、
レバンサッカラーゼ酵素の酸耐性は、該酵素の広範囲の
工業利用のために非常に重要である。
は、低濃度の蔗糖（０. ３（重／容量）％）の存在下
で、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniform
is）３９８２株（Institute of Microbial Engineerin
g, 寄託番号３３７３号）を用いて、細胞外レバンサッ
カラーゼ酵素を製造する方法を開示する。しかしこの酵
素の誘発および産生にはなお蔗糖が必要である。しかも
このレバンサッカラーゼ酵素は、温度が５５℃のときｐ
Ｈ４．０では一切酵素活性を発揮しない。この温度で
は、ｐＨ約５．２でその最大活性の５０％が、さらにｐ
Ｈが約６から約７．８ではその最大活性の約８０％が発
揮されるだけである。この狭いｐＨ範囲が、このレバン
サッカラーゼ酵素の応用範囲を制限している。しかも、
レバンサッカラーゼ酵素の酸耐性は、該酵素の広範囲の
工業利用のために非常に重要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題および課題解決の手段】
本発明は、既知の酵素よりも広いｐＨ領域で酵素活性を
示し、さらに既知の酵素にはない、酸性ｐＨでの安定性
を有するレバンサッカラーゼ酵素を提供することを目的
とする。この目的のために、本発明は、バチルス種に属
する細菌に由来し、５５℃で測定したときの最大活性の
少なくとも５０％の酵素活性を、約５５℃、ｐＨ４．０
で発揮する酸耐性レバンサッカラーゼ酵素を提供する。
のみならず、本発明のレバンサッカラーゼ酵素は、蔗糖
のような基質の存在下で広いｐＨ領域で明らかな酵素活
性を発揮する。さらに、この酵素は約５．５から６．３
の範囲のｐＨで、約５５℃で測定したときの最大酵素活
性を発揮する。より正確には、この酵素はまた、約５５
℃の温度で約４．０から約８．４のｐＨ領域で、５５℃
の最大活性の少なくとも５０％の酵素活性を発揮する。
当該約５５℃の温度および約４．２から約８．０のｐＨ
領域で、この酵素は、５５℃の最大活性の少なくとも７
０％の酵素活性を発揮する。当該温度および約４．５か
ら約７．８のｐＨ領域で、該酵素は５５℃の最大活性の
少なくとも８０％の酵素活性を発揮する。約５５℃およ
び約４．７から約７．２のｐＨ領域で、該酵素は、５５
℃の最大活性の少なくとも９０％の酵素活性を発揮す
る。
本発明は、既知の酵素よりも広いｐＨ領域で酵素活性を
示し、さらに既知の酵素にはない、酸性ｐＨでの安定性
を有するレバンサッカラーゼ酵素を提供することを目的
とする。この目的のために、本発明は、バチルス種に属
する細菌に由来し、５５℃で測定したときの最大活性の
少なくとも５０％の酵素活性を、約５５℃、ｐＨ４．０
で発揮する酸耐性レバンサッカラーゼ酵素を提供する。
のみならず、本発明のレバンサッカラーゼ酵素は、蔗糖
のような基質の存在下で広いｐＨ領域で明らかな酵素活
性を発揮する。さらに、この酵素は約５．５から６．３
の範囲のｐＨで、約５５℃で測定したときの最大酵素活
性を発揮する。より正確には、この酵素はまた、約５５
℃の温度で約４．０から約８．４のｐＨ領域で、５５℃
の最大活性の少なくとも５０％の酵素活性を発揮する。
当該約５５℃の温度および約４．２から約８．０のｐＨ
領域で、この酵素は、５５℃の最大活性の少なくとも７
０％の酵素活性を発揮する。当該温度および約４．５か
ら約７．８のｐＨ領域で、該酵素は５５℃の最大活性の
少なくとも８０％の酵素活性を発揮する。約５５℃およ
び約４．７から約７．２のｐＨ領域で、該酵素は、５５
℃の最大活性の少なくとも９０％の酵素活性を発揮す
る。
【０００５】本発明のレバンサッカラーゼ酵素は、蔗糖
のような基質の存在下で明らかな耐熱性をもつ。また、
該酵素は、約５５℃から約６４℃の範囲の温度でｐＨ
５．５の最大酵素活性を発揮する。より正確には、約
５．５のｐＨで、約３５℃から約７５℃の範囲の温度
で、該酵素は、ｐＨ５．５の最大活性の少なくとも５０
％の酵素活性を発揮する。約５．５のｐＨで、約４５℃
から約６８℃の範囲の温度で、該酵素はｐＨ５．５の最
大活性の少なくとも８０％の酵素活性を発揮する。約
５．５のｐＨで、約５０℃から約６７℃の範囲の温度
で、該酵素はｐＨ５．５の最大活性の少なくとも９０％
の酵素活性を発揮する。本発明のレバンサッカラーゼ酵
素は細胞結合酵素である。それはフラクトシル転移酵素
活性をもち、したがって、レバン系に属するβ−Ｄ（２
→６）結合フルクトースから成る蔗糖からフラクトシル
ポリマーを生成することができる。本発明のレバンサッ
カラーゼ酵素は蔗糖誘発酵素ではない。すなわち、それ
は誘発および産生に蔗糖を必要としない。
のような基質の存在下で明らかな耐熱性をもつ。また、
該酵素は、約５５℃から約６４℃の範囲の温度でｐＨ
５．５の最大酵素活性を発揮する。より正確には、約
５．５のｐＨで、約３５℃から約７５℃の範囲の温度
で、該酵素は、ｐＨ５．５の最大活性の少なくとも５０
％の酵素活性を発揮する。約５．５のｐＨで、約４５℃
から約６８℃の範囲の温度で、該酵素はｐＨ５．５の最
大活性の少なくとも８０％の酵素活性を発揮する。約
５．５のｐＨで、約５０℃から約６７℃の範囲の温度
で、該酵素はｐＨ５．５の最大活性の少なくとも９０％
の酵素活性を発揮する。本発明のレバンサッカラーゼ酵
素は細胞結合酵素である。それはフラクトシル転移酵素
活性をもち、したがって、レバン系に属するβ−Ｄ（２
→６）結合フルクトースから成る蔗糖からフラクトシル
ポリマーを生成することができる。本発明のレバンサッ
カラーゼ酵素は蔗糖誘発酵素ではない。すなわち、それ
は誘発および産生に蔗糖を必要としない。
【０００６】本発明はまた、栄養培地に蔗糖を添加する
こと無く、微生物を用いて酸耐性レバンサッカラーゼ酵
素を製造する方法を提供する。本発明の酸耐性レバンサ
ッカラーゼ酵素の製造方法は次の工程を含む： （ｉ）バイオマスを含む醗酵培養液を生成することによ
って、適切な栄養培地でバチルス属に属する微生物を培
養する； （ｉｉ）該醗酵培養液からレバンサッカラーゼ酵素を回
収する；ここで、微生物は蔗糖の非存在下で培養され
る。
こと無く、微生物を用いて酸耐性レバンサッカラーゼ酵
素を製造する方法を提供する。本発明の酸耐性レバンサ
ッカラーゼ酵素の製造方法は次の工程を含む： （ｉ）バイオマスを含む醗酵培養液を生成することによ
って、適切な栄養培地でバチルス属に属する微生物を培
養する； （ｉｉ）該醗酵培養液からレバンサッカラーゼ酵素を回
収する；ここで、微生物は蔗糖の非存在下で培養され
る。
【０００７】本発明はまた、バチルス属に属し、蔗糖の
非存在下で栄養培地中で酸耐性レバンサッカラーゼ酵素
を産生する新規な微生物を提供する。この目的のため
に、本発明は、蔗糖の非存在下で栄養培地中で酸耐性レ
バンサッカラーゼ酵素を産生する、バチルス・リケニホ
ルミス種の新規な微生物を提供る。好ましい微生物のバ
チルス・リケニホルミス種ＡＭＰＣ８４は、ブダペスト
条約に基づきAgricultural Research Culture Collecti
on(NRRL)( ペーリア、イリノイ）に寄託された。寄託番
号はＮＲＲＬＢ−１８９６２号である。バチルス・リケ
ニホルミス種ＡＰＭＣ８４の非人工的修飾または遺伝子
工学的修飾によって得られる、天然および人工変異株並
びに由来株もまた本発明の範囲に入る。本発明のレバン
サッカラーゼ酵素は、バチルス・リケニホルミスＮＲＲ
ＬＢ−１８９６２株だけでなく、この微生物の天然また
は人工変異株および他の由来株によっても製造できる。
そのような変異株は、既知の方法（例えばＸ線、紫外線
照射、突然変異誘導化学物質および遺伝子工学）によっ
て得ることができる。
非存在下で栄養培地中で酸耐性レバンサッカラーゼ酵素
を産生する新規な微生物を提供する。この目的のため
に、本発明は、蔗糖の非存在下で栄養培地中で酸耐性レ
バンサッカラーゼ酵素を産生する、バチルス・リケニホ
ルミス種の新規な微生物を提供る。好ましい微生物のバ
チルス・リケニホルミス種ＡＭＰＣ８４は、ブダペスト
条約に基づきAgricultural Research Culture Collecti
on(NRRL)( ペーリア、イリノイ）に寄託された。寄託番
号はＮＲＲＬＢ−１８９６２号である。バチルス・リケ
ニホルミス種ＡＰＭＣ８４の非人工的修飾または遺伝子
工学的修飾によって得られる、天然および人工変異株並
びに由来株もまた本発明の範囲に入る。本発明のレバン
サッカラーゼ酵素は、バチルス・リケニホルミスＮＲＲ
ＬＢ−１８９６２株だけでなく、この微生物の天然また
は人工変異株および他の由来株によっても製造できる。
そのような変異株は、既知の方法（例えばＸ線、紫外線
照射、突然変異誘導化学物質および遺伝子工学）によっ
て得ることができる。
【０００８】本発明の方法により製造されるレバンサッ
カラーゼ酵素は、バチルス属に属す該微生物を、炭素、
窒素および無機塩を含む栄養培地中で好気的条件下で蔗
糖の非存在下で培養し、続いてそこからレバンサッカラ
ーゼ酵素を回収することによって製造できる。これら微
生物の培養条件（例えば栄養培地成分、パラメーター、
温度、ｐＨ、攪拌、通気）は、当業者にとり明白であ
る。適切な炭素源は、グルコース、フルクトース、水解
澱粉またはこれら炭素源の２つまたはそれ以上を混合し
たものを含む。好ましい炭素源はコーンシロップおよび
水解澱粉である。利用できる窒素源には、大豆粉、コー
ンスティープリカー、馬鈴薯粉、挽き割り綿実、魚粉、
酵母、酵母エキス、またはこれら窒素源の２つまたはそ
れ以上の混合物が含まれる。好ましい窒素源は、大豆粉
挽き割り綿実、酵母エキス、並びに大豆粉および酵母エ
キスの混合物である。適切な塩は、硫酸カリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウ
ム、リン酸カリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸
二水素ナトリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウ
ム、またはこれらの塩の２つもしくはそれ以上の混成物
を含む。好ましい塩には、リン酸一水素ナトリウム、リ
ン酸二水素ナトリウム、塩化カルシウムおよびクエン酸
ナトリウムの混成物が含まれる。
カラーゼ酵素は、バチルス属に属す該微生物を、炭素、
窒素および無機塩を含む栄養培地中で好気的条件下で蔗
糖の非存在下で培養し、続いてそこからレバンサッカラ
ーゼ酵素を回収することによって製造できる。これら微
生物の培養条件（例えば栄養培地成分、パラメーター、
温度、ｐＨ、攪拌、通気）は、当業者にとり明白であ
る。適切な炭素源は、グルコース、フルクトース、水解
澱粉またはこれら炭素源の２つまたはそれ以上を混合し
たものを含む。好ましい炭素源はコーンシロップおよび
水解澱粉である。利用できる窒素源には、大豆粉、コー
ンスティープリカー、馬鈴薯粉、挽き割り綿実、魚粉、
酵母、酵母エキス、またはこれら窒素源の２つまたはそ
れ以上の混合物が含まれる。好ましい窒素源は、大豆粉
挽き割り綿実、酵母エキス、並びに大豆粉および酵母エ
キスの混合物である。適切な塩は、硫酸カリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウ
ム、リン酸カリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸
二水素ナトリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウ
ム、またはこれらの塩の２つもしくはそれ以上の混成物
を含む。好ましい塩には、リン酸一水素ナトリウム、リ
ン酸二水素ナトリウム、塩化カルシウムおよびクエン酸
ナトリウムの混成物が含まれる。
【０００９】上記の成分を含む培地は慣用的な方法で滅
菌し、適切な微生物株、好ましくはバチルス・リケニホ
ルミス株さらに好ましくは、バチルス・リケニホルミス
ＡＰＭＣ８４株を接種する。培養は、振盪または通気攪
拌下で好気的に、さらに典型的には約２５から４６℃の
間の温度で約６から４０時間、約５．０から約８．５の
間のｐＨで行われる。好ましくは、培養は、約３０から
４２℃の間の温度で約１２から３０時間、約６．０から
約８．０の間のｐＨで行われる。良好な結果は、培養が
約３６と４０℃の間の温度で約６．５から約８．５の間
のｐＨで行われたときに得られる。培養後、バイオマス
を含む醗酵培養液が得られる。菌体に結合したレバンサ
ッカラーゼ酵素とともに微生物菌体を含むバイオマスを
分離し、培養濾液から慣用的な方法（例えば遠心、塩
析、沈澱、濾過、限外濾過、微粒子濾過、限外濾過を伴
う遠心、または微粒子濾過を伴う濾過）を用いて回収す
る。分離回収したバイオマスをその後洗浄し、好ましく
は数回水で、より好ましくは脱イオン蒸留水で洗浄し、
さらに均質化する。バイオマスの反復洗浄は菌体結合レ
バンサッカラーゼ酵素活性に全く影響を与えず、この酵
素は菌体に強固に結合していると結論できる。
菌し、適切な微生物株、好ましくはバチルス・リケニホ
ルミス株さらに好ましくは、バチルス・リケニホルミス
ＡＰＭＣ８４株を接種する。培養は、振盪または通気攪
拌下で好気的に、さらに典型的には約２５から４６℃の
間の温度で約６から４０時間、約５．０から約８．５の
間のｐＨで行われる。好ましくは、培養は、約３０から
４２℃の間の温度で約１２から３０時間、約６．０から
約８．０の間のｐＨで行われる。良好な結果は、培養が
約３６と４０℃の間の温度で約６．５から約８．５の間
のｐＨで行われたときに得られる。培養後、バイオマス
を含む醗酵培養液が得られる。菌体に結合したレバンサ
ッカラーゼ酵素とともに微生物菌体を含むバイオマスを
分離し、培養濾液から慣用的な方法（例えば遠心、塩
析、沈澱、濾過、限外濾過、微粒子濾過、限外濾過を伴
う遠心、または微粒子濾過を伴う濾過）を用いて回収す
る。分離回収したバイオマスをその後洗浄し、好ましく
は数回水で、より好ましくは脱イオン蒸留水で洗浄し、
さらに均質化する。バイオマスの反復洗浄は菌体結合レ
バンサッカラーゼ酵素活性に全く影響を与えず、この酵
素は菌体に強固に結合していると結論できる。
【００１０】レバンサッカラーゼ酵素は、必要な場合ま
たは利用予定に応じて、さらに精製することができる。
菌体結合酵素の可溶化は、イオン性洗浄剤（例えば、コ
ール酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウム（０．
２５％から２．５％））または塩類溶液（例えばＭｇ++
溶液）の存在下で行うことができる。この酵素はまた、
約０℃の温度で６５−９５％飽和の範囲で硫酸アンモニ
ウムよっても沈澱させるとができる。必要ならば超音波
処理も、菌体とレバンサッカラーゼ酵素の分離に用るこ
とができる。レバンサッカラーゼ酵素は、種々の工業
（例えば特に食品工業、製薬工業および化学工業）に利
用可能なレバンサッカラーゼ酵素を含む組成物に製剤化
できる。レバンサッカラーゼ酵素は、その利用予定にし
たがって製剤化される。通常は、安定剤および保存料
も、該酵素組成物に添加される。例えば、酵素は、グリ
セロール（５０容量％）、硫酸アンモニウム（３．３mo
1/1 ）または塩化ナトリウム（３mo1/1 ）を、酵素の水
溶液に添加することによって安定化される。
たは利用予定に応じて、さらに精製することができる。
菌体結合酵素の可溶化は、イオン性洗浄剤（例えば、コ
ール酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウム（０．
２５％から２．５％））または塩類溶液（例えばＭｇ++
溶液）の存在下で行うことができる。この酵素はまた、
約０℃の温度で６５−９５％飽和の範囲で硫酸アンモニ
ウムよっても沈澱させるとができる。必要ならば超音波
処理も、菌体とレバンサッカラーゼ酵素の分離に用るこ
とができる。レバンサッカラーゼ酵素は、種々の工業
（例えば特に食品工業、製薬工業および化学工業）に利
用可能なレバンサッカラーゼ酵素を含む組成物に製剤化
できる。レバンサッカラーゼ酵素は、その利用予定にし
たがって製剤化される。通常は、安定剤および保存料
も、該酵素組成物に添加される。例えば、酵素は、グリ
セロール（５０容量％）、硫酸アンモニウム（３．３mo
1/1 ）または塩化ナトリウム（３mo1/1 ）を、酵素の水
溶液に添加することによって安定化される。
【００１１】医薬への利用には、該酵素は好ましくは凍
結乾燥形で用いることができる。食品への応用では、フ
ロースルーリアクターでそれらを使用し易くする、本質
的に不溶性の不活性担体に、該酵素を生理的または化学
的共有結合によって固定して利用することができる。通
常、酵素は担体に結合させる。担体に用いられる物質に
は、有機および無機物質、例えばポリアミンおよびグル
タールアルデヒド溶液で処理した多孔性顆粒性珪藻土、
顆粒性活性炭素、界面活性物質（例えば酸化アルミニウ
ム、炭素、粘土、酸化ジルコニウム、酸化チタン、イオ
ン交換樹脂、セルロースまたはガラス）、化学的に活性
化された支持体（例えばセルロース、アガロース、合成
ポリマー、ゲル（例えばポリアクリルアミドゲル、シリ
カゲルおよび澱粉ゲル）、ポリマーマトリクス内に補足
される酵素が含まれる。
結乾燥形で用いることができる。食品への応用では、フ
ロースルーリアクターでそれらを使用し易くする、本質
的に不溶性の不活性担体に、該酵素を生理的または化学
的共有結合によって固定して利用することができる。通
常、酵素は担体に結合させる。担体に用いられる物質に
は、有機および無機物質、例えばポリアミンおよびグル
タールアルデヒド溶液で処理した多孔性顆粒性珪藻土、
顆粒性活性炭素、界面活性物質（例えば酸化アルミニウ
ム、炭素、粘土、酸化ジルコニウム、酸化チタン、イオ
ン交換樹脂、セルロースまたはガラス）、化学的に活性
化された支持体（例えばセルロース、アガロース、合成
ポリマー、ゲル（例えばポリアクリルアミドゲル、シリ
カゲルおよび澱粉ゲル）、ポリマーマトリクス内に補足
される酵素が含まれる。
【００１２】酵素を分離精製すること無く、バチルスの
全菌体を含むレバンサッカラーゼ酵素を、好ましくは固
定化工程に直接用いることができる。本発明のレバンサ
ッカラーゼ酵素を含む組成物は、固体または液体のいず
れの形態でも用いることができる。これらの組成物は、
液体溶液、固形物、顆粒、粉末またはスラリーのいずれ
かの最終生成物とすることができる。本発明の組成物
は、フラクトシル残基を含む糖類（例えば蔗糖、ラフィ
ノース、またはスタキオース）からレバンを製造するた
めに用いることができる。これらの糖類は原料物質、例
えば原料テンサイ、破砕または細断したテンサイの絞り
汁、糖蜜、砂糖黍、テンサイ糖、植物糖から求めること
ができる。得られるレバンは、高分子量レバン、低分子
量レバン（フルクトオリゴサッカライド）またはフルク
トシルポリマーであろう。本発明をさらに下記の実施例
によって詳述する。
全菌体を含むレバンサッカラーゼ酵素を、好ましくは固
定化工程に直接用いることができる。本発明のレバンサ
ッカラーゼ酵素を含む組成物は、固体または液体のいず
れの形態でも用いることができる。これらの組成物は、
液体溶液、固形物、顆粒、粉末またはスラリーのいずれ
かの最終生成物とすることができる。本発明の組成物
は、フラクトシル残基を含む糖類（例えば蔗糖、ラフィ
ノース、またはスタキオース）からレバンを製造するた
めに用いることができる。これらの糖類は原料物質、例
えば原料テンサイ、破砕または細断したテンサイの絞り
汁、糖蜜、砂糖黍、テンサイ糖、植物糖から求めること
ができる。得られるレバンは、高分子量レバン、低分子
量レバン（フルクトオリゴサッカライド）またはフルク
トシルポリマーであろう。本発明をさらに下記の実施例
によって詳述する。
【００１３】
【実施例】実施例１ 接種用に用いる種培地は次の成分で調製した：塩化カル
シウム０．０２％（重量／容量）、クエン酸ナトリウム
０．３％、水解澱粉２．６％（商標名MALTRIN100(GP
C)）、綿実粉４．６％（商標名PHARMAMEDIA(TRADERS PR
OTEIN)）、リン酸一水素ナトリウム０．２１％およびリ
ン酸二水素ナトリウム０．５４％。この種培地は、種用
フラスコで３０分１２５℃で滅菌した。種用フラスコ
は、２５０ｍｌ容量の３枚の邪魔板付エーレンマイヤー
フラスコで、種培地を５０ｍｌ含むものである。続いて
それに、凍結グリセロール培地のバチルス・リケニホル
ミスＡＰＭＣ８４株を接種した。製造用フラスコに接種
するために使用する前に、この種株を螺旋回転シェーカ
ーで３７℃、２４時間増殖させた。レバンサッカラーゼ
酵素の製造に用いる培地は以下の成分で調製した：１
０．３％（重量／容量）コーンシロップ（商標名STALEY
200コーンシロップ（A.E.STALEY）、５．５％大豆粉(
商標名PROMOSOY 100(CENTRAL SOYA)) 、０．３２％酵母
エキス( UNINVERSAL FOODS社市販))、０．７％リン酸一
水素ナトリウムおよび０．７％リン酸二水素ナトリウ
ム。この製造用培地は、製造用フラスコで１２５℃３０
分滅菌した。製造用フラスコは、２５０ｍｌ容量の３枚
の邪魔板付エーレンマイヤーフラスコで５０ｍｌの製造
培地を含むものである。接種量は２％（容量／容量）で
あった。接種済製造用フラスコは、螺旋回転シェーカー
で３７℃で１６から２０時間培養した。レバンが醗酵培
養液中に生成されているとき、粘性増加は認められなか
った。生成酵素は、殆ど粘つくこと無く容易に分離でき
た。フラスコのバイオマスを醗酵培養液から遠心により
分離し、菌体を脱イオン蒸留水で２度洗浄して均質化し
た。本発明のレバンサッカラーゼ酵素を回収した。
シウム０．０２％（重量／容量）、クエン酸ナトリウム
０．３％、水解澱粉２．６％（商標名MALTRIN100(GP
C)）、綿実粉４．６％（商標名PHARMAMEDIA(TRADERS PR
OTEIN)）、リン酸一水素ナトリウム０．２１％およびリ
ン酸二水素ナトリウム０．５４％。この種培地は、種用
フラスコで３０分１２５℃で滅菌した。種用フラスコ
は、２５０ｍｌ容量の３枚の邪魔板付エーレンマイヤー
フラスコで、種培地を５０ｍｌ含むものである。続いて
それに、凍結グリセロール培地のバチルス・リケニホル
ミスＡＰＭＣ８４株を接種した。製造用フラスコに接種
するために使用する前に、この種株を螺旋回転シェーカ
ーで３７℃、２４時間増殖させた。レバンサッカラーゼ
酵素の製造に用いる培地は以下の成分で調製した：１
０．３％（重量／容量）コーンシロップ（商標名STALEY
200コーンシロップ（A.E.STALEY）、５．５％大豆粉(
商標名PROMOSOY 100(CENTRAL SOYA)) 、０．３２％酵母
エキス( UNINVERSAL FOODS社市販))、０．７％リン酸一
水素ナトリウムおよび０．７％リン酸二水素ナトリウ
ム。この製造用培地は、製造用フラスコで１２５℃３０
分滅菌した。製造用フラスコは、２５０ｍｌ容量の３枚
の邪魔板付エーレンマイヤーフラスコで５０ｍｌの製造
培地を含むものである。接種量は２％（容量／容量）で
あった。接種済製造用フラスコは、螺旋回転シェーカー
で３７℃で１６から２０時間培養した。レバンが醗酵培
養液中に生成されているとき、粘性増加は認められなか
った。生成酵素は、殆ど粘つくこと無く容易に分離でき
た。フラスコのバイオマスを醗酵培養液から遠心により
分離し、菌体を脱イオン蒸留水で２度洗浄して均質化し
た。本発明のレバンサッカラーゼ酵素を回収した。
【００１４】レバンサッカラーゼ酵素単位（ＬＳＵ）
は、アッセー条件下で１分につき１マイクロモルのグル
コースを生じるために必要な酵素活性量と定義される。
該酵素活性は、基質として蔗糖を用いて測定された。酵
素液量１ミリリットルに、７．５ｍｌの０．０１Ｍクエ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．５、蔗糖６０％（重量／重量）含
有）を加えた。その後、反応混合物の容量を蒸留水で１
０ｍｌに調整し、５５℃で１時間インキュベートした。
特定の時間後、９５℃で１０分加熱して酵素反応を停止
させた。反応生成物のグルコース濃度を高速液体クロマ
トグラフィー分析（ＨＰＬＣ）で求めた（K.M. Brost &
H.D. Schobell, 1982. Starch/Starke, 34, 117-121)
。レバンサッカラーゼ酵素活性に対するｐＨの影響
は、異なるｐＨ値（すなわち４．０、４．５、５．０、
５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．
０）で１時間５５℃で適切なリン酸緩衝液（０．０１
Ｍ）を用いてインキュベートしてから酵素的フルクトシ
ル転移反応を実施して求めた。生成したグルコースは、
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー分析）を用いて
求めた。活性は計算で求めた。
は、アッセー条件下で１分につき１マイクロモルのグル
コースを生じるために必要な酵素活性量と定義される。
該酵素活性は、基質として蔗糖を用いて測定された。酵
素液量１ミリリットルに、７．５ｍｌの０．０１Ｍクエ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．５、蔗糖６０％（重量／重量）含
有）を加えた。その後、反応混合物の容量を蒸留水で１
０ｍｌに調整し、５５℃で１時間インキュベートした。
特定の時間後、９５℃で１０分加熱して酵素反応を停止
させた。反応生成物のグルコース濃度を高速液体クロマ
トグラフィー分析（ＨＰＬＣ）で求めた（K.M. Brost &
H.D. Schobell, 1982. Starch/Starke, 34, 117-121)
。レバンサッカラーゼ酵素活性に対するｐＨの影響
は、異なるｐＨ値（すなわち４．０、４．５、５．０、
５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．
０）で１時間５５℃で適切なリン酸緩衝液（０．０１
Ｍ）を用いてインキュベートしてから酵素的フルクトシ
ル転移反応を実施して求めた。生成したグルコースは、
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー分析）を用いて
求めた。活性は計算で求めた。
【００１５】５５℃で最大活性は、ｐＨ５．５−６．０
辺りで発揮された。図１は５５℃における酵素活性に対
するｐＨの影響を詳述している。この図では、横座標
は、ｐＨを示し、縦座標はｐＨ５．５、５５℃の最大活
性の百分率で表した酵素活性を示している。白丸は本発
明の酵素のデータを表し、さらに比較のために、日本国
特許出願公開第５２−８２７８１号のデータを記号＃で
表した。本発明の酵素は、当該先行する公開公報に開示
されている酵素より、酸性ｐＨ領域でより安定であっ
た。本発明の酵素は、５５℃ｐＨ４．０で、５５℃で測
定された最大活性の５０％以上を発揮したが、一方先行
技術の酵素はｐＨ４．０でこの温度では一切活性を示さ
なかった。図１は、本発明のレバンサッカラーゼ酵素
は、蔗糖の存在下で広いｐＨ領域にわたって、明らかな
酵素活性を発揮することを示している。それは、約５．
５から約６．３の範囲のｐＨで、５５℃の最大酵素活性
を発揮する。より正確には、約５５℃の温度でｐＨが約
４．０から約８．４の範囲で、この酵素は５５℃の最大
活性の少なくとも５０％の酵素活性を発揮する。それ
は、約５５℃の温度でｐＨが約４．２から約８．０の範
囲で５５℃の最大活性の少なくとも７０％の酵素活性を
発揮する。この酵素は、この温度でｐＨが約４．５から
約７．８の範囲で５５℃の最大活性の少なくとも８０％
の酵素活性を発揮する。それは、約５５℃ｐＨが約４．
７から約７．２の範囲で５５℃の最大活性の少なくとも
９０％の酵活性を発揮する。
辺りで発揮された。図１は５５℃における酵素活性に対
するｐＨの影響を詳述している。この図では、横座標
は、ｐＨを示し、縦座標はｐＨ５．５、５５℃の最大活
性の百分率で表した酵素活性を示している。白丸は本発
明の酵素のデータを表し、さらに比較のために、日本国
特許出願公開第５２−８２７８１号のデータを記号＃で
表した。本発明の酵素は、当該先行する公開公報に開示
されている酵素より、酸性ｐＨ領域でより安定であっ
た。本発明の酵素は、５５℃ｐＨ４．０で、５５℃で測
定された最大活性の５０％以上を発揮したが、一方先行
技術の酵素はｐＨ４．０でこの温度では一切活性を示さ
なかった。図１は、本発明のレバンサッカラーゼ酵素
は、蔗糖の存在下で広いｐＨ領域にわたって、明らかな
酵素活性を発揮することを示している。それは、約５．
５から約６．３の範囲のｐＨで、５５℃の最大酵素活性
を発揮する。より正確には、約５５℃の温度でｐＨが約
４．０から約８．４の範囲で、この酵素は５５℃の最大
活性の少なくとも５０％の酵素活性を発揮する。それ
は、約５５℃の温度でｐＨが約４．２から約８．０の範
囲で５５℃の最大活性の少なくとも７０％の酵素活性を
発揮する。この酵素は、この温度でｐＨが約４．５から
約７．８の範囲で５５℃の最大活性の少なくとも８０％
の酵素活性を発揮する。それは、約５５℃ｐＨが約４．
７から約７．２の範囲で５５℃の最大活性の少なくとも
９０％の酵活性を発揮する。
【００１６】レバンサッカラーゼ酵素に対する温度の影
響は、異なる温度（すなわち４０℃、５０℃、５５℃、
６０℃、７０℃、および８０℃）で１時間インキュベー
トしてからｐＨ５．５で酵素反応を実施して求めた。反
応混合物は、０．０１Ｍのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．５）中の６０％（重量／容量）蔗糖溶液７．５ｍ
ｌおよび３０ＬＳＵ／ｍｌの酵素活性を含むバイオマス
１．０ｍｌから成る。ｐＨ５．５では最大活性は約６０
℃の温度で発揮される。レバンサッカラーゼ酵素に対す
る温度の影響は図２に示されている。この図では、横座
標は℃で表した反応温度を示し、縦座標は、ｐＨ５．５
で６０℃で発揮される最大活性の百分率で表した活性が
示されている。白丸は本発明の酵素を表し、さらに比較
のため、日本国特許出願公開第５２−８２７８１号のデ
ータを記号＃で表した。図２は、本発明のレバンサッカ
ラーゼ酵素は、蔗糖の存在下で明らかな耐熱性をもつこ
とを示している。この酵素は、約５５℃から約６４℃の
範囲の温度で、ｐＨ約５．５で測定された最大酵素活性
を発揮した。より正確には、それは、ｐＨ約５．５で約
３５℃から約７５℃の範囲の温度で、ｐＨ５．５で測定
した最大活性の少なくとも５０％の酵素活性を発揮し
た。それは、ｐＨ約５．５で約４５℃から約６８℃の範
囲の温度で、ｐＨ５．５で測定した最大活性の少なくと
も８０％の酵素活性を発揮した。それは、ｐＨ約５．５
で約５０℃から約６７℃の範囲の温度で、ｐＨ５．５で
測定した最大活性の少なくとも９０％の酵素活性を発揮
した。
響は、異なる温度（すなわち４０℃、５０℃、５５℃、
６０℃、７０℃、および８０℃）で１時間インキュベー
トしてからｐＨ５．５で酵素反応を実施して求めた。反
応混合物は、０．０１Ｍのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．５）中の６０％（重量／容量）蔗糖溶液７．５ｍ
ｌおよび３０ＬＳＵ／ｍｌの酵素活性を含むバイオマス
１．０ｍｌから成る。ｐＨ５．５では最大活性は約６０
℃の温度で発揮される。レバンサッカラーゼ酵素に対す
る温度の影響は図２に示されている。この図では、横座
標は℃で表した反応温度を示し、縦座標は、ｐＨ５．５
で６０℃で発揮される最大活性の百分率で表した活性が
示されている。白丸は本発明の酵素を表し、さらに比較
のため、日本国特許出願公開第５２−８２７８１号のデ
ータを記号＃で表した。図２は、本発明のレバンサッカ
ラーゼ酵素は、蔗糖の存在下で明らかな耐熱性をもつこ
とを示している。この酵素は、約５５℃から約６４℃の
範囲の温度で、ｐＨ約５．５で測定された最大酵素活性
を発揮した。より正確には、それは、ｐＨ約５．５で約
３５℃から約７５℃の範囲の温度で、ｐＨ５．５で測定
した最大活性の少なくとも５０％の酵素活性を発揮し
た。それは、ｐＨ約５．５で約４５℃から約６８℃の範
囲の温度で、ｐＨ５．５で測定した最大活性の少なくと
も８０％の酵素活性を発揮した。それは、ｐＨ約５．５
で約５０℃から約６７℃の範囲の温度で、ｐＨ５．５で
測定した最大活性の少なくとも９０％の酵素活性を発揮
した。
【００１７】実施例２ 種々の時間間隔における反応生成物の組成に対するレバ
ンサッカラーゼ酵素の濃度（ＬＳＵ／ｇ蔗糖）の影響
を、ｐＨ５．５で５５℃で調べた。典型的な実験では、
９．５ｍｌの水に溶かした４．５ｇの蔗糖を、種々の量
のレバンサッカラーゼ酵素（すなわち４．５、９．０お
よび２２．５ＬＳＵ）を含むバイオマスの０．５ｍｌと
ともに５０℃でインキュベートした。種々の時間間隔で
サンプルを取り出し、９０℃１０分加熱して反応を停止
させた。生成物の組成を高速液体クロマトグラフィーで
求めた（表１）。
ンサッカラーゼ酵素の濃度（ＬＳＵ／ｇ蔗糖）の影響
を、ｐＨ５．５で５５℃で調べた。典型的な実験では、
９．５ｍｌの水に溶かした４．５ｇの蔗糖を、種々の量
のレバンサッカラーゼ酵素（すなわち４．５、９．０お
よび２２．５ＬＳＵ）を含むバイオマスの０．５ｍｌと
ともに５０℃でインキュベートした。種々の時間間隔で
サンプルを取り出し、９０℃１０分加熱して反応を停止
させた。生成物の組成を高速液体クロマトグラフィーで
求めた（表１）。
【００１８】
【表１】 表 １ 反応生成物の組成に対するレバンサッカラーゼ酵素濃度 （ＬＳＵ／ｇ蔗糖）の影響 ─────────────────────────────────── 酵素濃度 反応生成物の組成 ％ ＬＳＵ／ｇ蔗糖（時間）──────────────────────── フルクトース グルコース 蔗糖 レバン ─────────────────────────────────── １ ＬＳＵ／ｇ ２ 2.４８ 4.９３ ８6.８２ 5.７７ ４ 4.１３ 9.６３ ７6.２４ １0.００ ６ 5.５０ ４1.０６ ６6.７４ １3.７０ ８ 6.９４ １8.４１ ５8.５４ １6.５６ １２ 7.４９ ２3.０６ ４7.３０ ２1.６１ １６ 8.６０ ２8.９５ ３7.９０ ２4.５５ ２４ 9.７９ ３6.３５ ２3.１４ ３0.７１ ３６ １0.９０ ４1.５７ １3.４０ ３4.１４ ４４ １1.２４ ４2.９１ １0.５５ ３5.２９ ─────────────────────────────────── ２ ＬＳＵ／ｇ ２ 3.９９ １0.１０ ７6.５５ 9.３６ ４ 6.４１ １8.５９ ５8.２８ １6.７２ ６ 7.８７ ２6.０９ ４3.０９ ２2.９５ ８ 9.０３ ３2.３３ ３1.５９ ２7.０８ １２ １0.２２ ３9.２７ １7.７４ ３2.７７ １６ １0.９３ ４2.９３ １1.１１ ３5.０２ ２４ １1.７６ ４5.２５ 6.９０ ３6.０８ ─────────────────────────────────── ５ ＬＳＵ／ｇ ２ 7.１９ ２3.９４ ４8.０２ ２0.３５ ４ 9.７６ ３8.６１ １9.２３ ３2.３９ ６ １0.９８ ４4.２８ 8.７１ ３6.０２ ８ １1.４１ ４5.６５ 6.４８ ３6.４６ １２ １2.３４ ４5.３２ 6.４３ ３5.９１ １６ １3.０１ ４5.４６ 6.０６ ３5.４７ ───────────────────────────────────
【００１９】レバンサッカラーゼ酵素によって蔗糖から
グルコースが生成される速度は、酵素の濃度が増加する
につれ増加した。すべての実験でレバンは３５％生成さ
れ、グルコースは４５％生成された。基質の存在下にお
ける該酵素の耐熱性は、酵素の広範囲な工業的利用に非
常に重要である。反応生成物の組成に対する温度の影響
を、４０℃、５０℃および６０℃で調べた。反応混合物
は、０．０１Ｍのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）中の６０％（重量／容量）蔗糖溶液０．７５ｍｌお
よび２．５ｍｌの酵素溶液（４０単位ＬＳＵ）から成
る。サンプルを異なる時間間隔で取り出し、反応を９０
℃で１０分加熱して停止させた。生成物の組成は高速液
体クロマトグラフィーで求めた（表２）。
グルコースが生成される速度は、酵素の濃度が増加する
につれ増加した。すべての実験でレバンは３５％生成さ
れ、グルコースは４５％生成された。基質の存在下にお
ける該酵素の耐熱性は、酵素の広範囲な工業的利用に非
常に重要である。反応生成物の組成に対する温度の影響
を、４０℃、５０℃および６０℃で調べた。反応混合物
は、０．０１Ｍのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）中の６０％（重量／容量）蔗糖溶液０．７５ｍｌお
よび２．５ｍｌの酵素溶液（４０単位ＬＳＵ）から成
る。サンプルを異なる時間間隔で取り出し、反応を９０
℃で１０分加熱して停止させた。生成物の組成は高速液
体クロマトグラフィーで求めた（表２）。
【００２０】
【表２】 表 ２ 反応生成物の組成に対する温度の影響 ────────────────────────────────── 反応生成物の組成 ％ 反応温度 （時間）──────────────────────── フルクトース グルコース 蔗糖 レバン ────────────────────────────────── ５０℃ ４ 7.５０ ２3.３１ ４3.３３ ２1.８６ ８ 9.１５ ３5.４５ ２4.１６ ３1.１５ １４ １1.２８ ４7.３０ 7.２７ ３4.１５ ２４ １1.０９ ４3.３２ １0.５８ ３5.０１ ────────────────────────────────── ５５℃ ４ 7.９２ ２4.３２ ４5.２６ ２2.５０ ８ １0.６３ ３5.５８ ２3.３９ ３0.４１ １４ １3.８０ ４6.０７ 9.０７ ３0.９３ ２４ １4.４３ ４6.７７ 6.２０ ３2.６１ ────────────────────────────────── ６０℃ ４ 8.６５ ２3.６６ ４6.３５ ２1.３４ ８ １1.５１ ３2.１４ ２9.９８ ２6.３６ １４ １5.１１ ４2.８７ １8.０９ ２3.９３ ２４ １4.５５ ４0.３６ １4.７４ ３0.３６ ──────────────────────────────────
【００２１】表２のデータは、本発明の酵素はｐＨ５．
５で５０から６０℃の間で、基質の存在下で良好な熱安
定性を有することを示している。実施例４ 反応生成物の濃縮のための高エネルギーコストの故に、
高濃度基質はいずれの工業的変換についても常に望まし
い。反応生成物の組成に対する蔗糖濃度の影響を、ｐＨ
５．５温度５５℃で酵素とともに蔗糖を種々の時間間隔
でインキュベートして調べた。種々の量の蔗糖を含む酢
酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）を調製した。適量の
酵素を最終濃度が１０ＬＳＵ／ｇ蔗糖となるように加
え、５５℃でインキュベートした。サンプルを種々の時
間間隔で取り出し、９０℃１０分加熱して酵素反応を停
止させた。その後、反応生成物の組成を高速液体クロマ
トグラフィーで求めた（表３）。
５で５０から６０℃の間で、基質の存在下で良好な熱安
定性を有することを示している。実施例４ 反応生成物の濃縮のための高エネルギーコストの故に、
高濃度基質はいずれの工業的変換についても常に望まし
い。反応生成物の組成に対する蔗糖濃度の影響を、ｐＨ
５．５温度５５℃で酵素とともに蔗糖を種々の時間間隔
でインキュベートして調べた。種々の量の蔗糖を含む酢
酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）を調製した。適量の
酵素を最終濃度が１０ＬＳＵ／ｇ蔗糖となるように加
え、５５℃でインキュベートした。サンプルを種々の時
間間隔で取り出し、９０℃１０分加熱して酵素反応を停
止させた。その後、反応生成物の組成を高速液体クロマ
トグラフィーで求めた（表３）。
【００２２】
【表３】 表 ３ 反応生成物の組成に対する蔗糖濃度の影響 ─────────────────────────────────── 蔗糖濃度 ％ 組成 遊離フルクト ｇ／100 ｍｌ（時間）───────────────────ースに対する フルク グルコ 蔗糖 レバン レバンの比率 トース ース ─────────────────────────────────── ３０ ５ 9.75 25.69 43.88 21.57 2.21 ８ 12.47 32.78 30.09 24.67 1.98 12 16.14 43.04 17.75 23.08 1.43 24 17.67 45.35 6.66 30.33 1.73 ─────────────────────────────────── ４５ ５ 8.99 29.44 36.84 24.72 2.75 ８ 10.71 36.40 22.75 30.13 2.81 12 13.66 44.31 11.03 31.00 2.27 24 13.56 42.75 10.20 33.46 2.46 ─────────────────────────────────── ６０ ５ 6.93 29.47 34.12 29.49 4.26 ８ 8.46 39.93 20.55 34.05 4.02 12 11.12 44.98 8.78 34.12 3.16 24 14.03 44.98 5.37 35.62 2.54 ─────────────────────────────────── ７５ ５ 6.25 29.15 33.34 31.27 5.00 ８ 7.57 37.30 19.00 36.12 4.77 12 9.45 44.26 8.93 37.34 3.95 24 10.76 43.31 4.96 41.12 3.82 ───────────────────────────────────
【００２３】表３に示された結果は、蔗糖濃度が増加す
るにつれ、フルクトシル転移反応が増加することを表し
ている。いずれの時間間隔でも、高濃度基質における遊
離フルクトースに対する生成レバンの比率は、低濃度基
質におけるその比率に比べて高かった。例えば、３０％
蔗糖濃度では遊離フルクトースに対するレバンの比は
１．４から２．２の間で、一方７５％蔗糖濃度では、そ
の比は４．５−５．０であった。このことは、弱い水の
作用がレバン生成に有利であることを強く提示するもの
である。
るにつれ、フルクトシル転移反応が増加することを表し
ている。いずれの時間間隔でも、高濃度基質における遊
離フルクトースに対する生成レバンの比率は、低濃度基
質におけるその比率に比べて高かった。例えば、３０％
蔗糖濃度では遊離フルクトースに対するレバンの比は
１．４から２．２の間で、一方７５％蔗糖濃度では、そ
の比は４．５−５．０であった。このことは、弱い水の
作用がレバン生成に有利であることを強く提示するもの
である。
【図１】 ５５℃における酵素活性に対するｐＨの影響
を示すグラフである。白丸は本発明の酵素のデータを、
♯は比較例を示す。
を示すグラフである。白丸は本発明の酵素のデータを、
♯は比較例を示す。
【図２】 蔗糖の存在下における耐熱性を示すグラフで
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジャヤラマ ケイ シェッティー アメリカ合衆国 インディアナ州 46514 エルクハート ブルックトゥリー コー ト 2912
Claims (17)
- 【請求項１】 バチルス種に属する微生物に由来する酸
耐性レバンサッカラーゼ酵素であって、温度約５５℃、
ｐＨ４．０で、５５℃で測定された最大活性の少なくと
も５０％の酵素活性を発揮することを特徴とするレバン
サッカラーゼ酵素。 - 【請求項２】 さらにｐＨが約５．５から約６．３の範
囲で、約５５℃で測定された最大酵素活性を発揮する、
請求項１に記載の酸耐性レバンサッカラーゼ酵素。 - 【請求項３】 さらに、約５５℃でｐＨが約４．０から
約８．４の範囲で、５５℃で測定された最大活性の少な
くとも５０％の酵素活性を発揮する、請求項１または２
に記載のレバンサッカラーゼ酵素。 - 【請求項４】 さらに、約５５℃でｐＨが約４．５から
約７．８の範囲で、５５℃で測定された最大活性の少な
くとも８０％の酵素活性を発揮することを特徴とする、
請求項３に記載のレバンサッカラーゼ酵素。 - 【請求項５】 さらに、ｐＨが約５．５で温度が約３５
℃から約７５℃の範囲で、ｐＨ５．５で測定された最大
活性の少なくとも５０％の酵素活性を発揮する、請求項
１または２に記載のレバンサッカラーゼ酵素。 - 【請求項６】 次の工程を含む酸耐性レバンサッカラー
ゼ酵素の製造方法： （ｉ）バイオマスを含む醗酵培養液を生成することによ
って、適切な栄養培地でチルス属に属する微生物を培養
し、さらに（ｉｉ）当該醗酵培養液からレバンサッカラ
ーゼ酵素を回収するが、この場合にあって該微生物は蔗
糖の非存在下で培養される。 - 【請求項７】 該微生物がバチルス・リケニホルミス種
に属する、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 該微生物がバチルス・リケニホルミスＮ
ＲＲＬＢ−１８９６２である、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 工程（ｉｉ）がさらに、（ａ）培養濾液
からレバンサッカラーゼ酵素とともに微生物菌体を分離
し、（ｂ）そこから分離されたバイオマスを洗浄するこ
とを含む請求項６に記載の方法。 - 【請求項１０】 栄養培地中で蔗糖の非存在下で酸耐性
レバンサッカラーゼ酵素を産生する、バチルス属に属す
る微生物。 - 【請求項１１】 該微生物がバチルス・リケニホルミス
種に属する、請求項１０に記載の微生物。 - 【請求項１２】 寄託番号ＮＲＲＬＢ−１８９６２の下
に寄託されたバチルス・リケニホルミスＡＰＭＣ８４。 - 【請求項１３】 請求項１に記載の酸耐性レバンサッカ
ラーゼ酵素を含む組成物。 - 【請求項１４】 液体溶液とした請求項１３に記載の組
成物。 - 【請求項１５】 固形物とした請求項１３に記載の組成
物。 - 【請求項１６】 レバンサッカラーゼ酵素またはレバン
サッカラーゼ酵素含有バチルスの全菌体が固定されてい
る、請求項１３に記載の組成物。 - 【請求項１７】 レバン製造のための、請求項１３に記
載の組成物。
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