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Enzyme de lévane saccharase. procédé pour sa préparation, micro-organismes qui le produisent et compositions le contenant
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La présente invention concerne un enzyme de lévane saccharase stable aux acides, des micro-organismes qui le produisent, un procédé de préparation de cet enzyme de lévane saccharase stable aux acides et des compositions le contenant.
Les enzymes de lévane sacharase catalysent le transfert du fructose. Plus précisément, les enzymes de lévane saccharase (E. C. 2. 4. 1. 10) catalysent le transfert de résidus de fructosyle du saccharose, du raffinose ou du stachyose à un co-substrat approprié, produisant des polymères, généralement appelés lévanes, contenant diverses quantités de résidus de fructosyle constitués de liaisons bêta2- > 6. Les lévanes ont de larges applications dans l'industrie chimique et dans l'industrie alimentaire ainsi qu'en médecine et dans la recherche.
Des enzymes de lévane saccharase ont été isolés d'une variété de sources microbiennes, de micro-organismes tels que l'Acetobacter suboxydans, l'Actinomyces viscosus, l'Aerobacter levanicum, le Bacillus amyloliquefaciens, le Bacillus licheniformis, le Bacillus mesentericus, le Bacillus subtilis, le Glucobacter oxydans. le Streptococcus mutans, le Streptococcus salivarius, le Streptomyces olcs, le SLre griseus et le Zymomonas mobilis. Dans la plupart des cas, l'enzyme est extracellulaire et instable à la chaleur. L'une des caractéristiques les plus importantes dans la production d'enzymes de lévane saccharase est qu'au moins 5 % de saccharose doivent être ajoutés au milieu de croissance pour induire la synthèse de l'enzyme en utilisant des micro-organismes connus produisant des enzymes de lévane saccharase.
Par suite, il devient difficile de séparer l'enzyme de lévane saccharase du bouillon de culture du fait que la viscosité du bouillon de culture augmente au fur
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et à mesure que le lévane se forme au cours de la fermentation. C'est pourquoi on procède toujours à des recherches de micro-organismes nécessitant des niveaux faibles ou nuls de saccharose pour la production de lévane saccharase.
La demande de brevet japonaise JP-A-52-82781 décrit un procédé de production d'un enzyme de lévane saccharase extracellulaire en présence de faibles concentrations de saccharose (0,3 % en poids/volume) en utilisant la souche de Bacillus licheniformis AJ 3982 (dépôt n 3373 à l'Institute of Microbial Engineering). Cependant, cet enzyme a toujours besoin de saccharose pour être induit et produit. En outre, cet enzyme de lévane saccharase ne développe pas d'activité enzymatique à un pH de 4,0 lorsqu'il est maintenu à une température de 55OC. A cette température, il ne développe que 50 % de son activité maximum pour un pH d'environ 5,2 et environ 80 % de son activité maximum à un pH d'environ 6 à environ 7,8. Cette plage de pH étroite restreint le champ d'application de cet enzyme de lévane saccharase.
En outre, la stabilité aux acides de l'enzyme de lévane saccharase est très importante pour de larges applications commerciales de l'enzyme.
La présente invention vise à fournir un enzyme de lévane saccharase qui développe une activité enzymatique dans une gamme de pH plus large que les enzymes connus et qui est stable aux pH acides auxquels les enzymes connus ne le sont pas.
A cet effet, la présente invention vise un enzyme de lévane saccharase stable aux acides dérivé d'un micro-organisme appartenant à l'espèce Bacillus et
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développant, à une température d'environ 550C et à un pH de 4, 0, une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à 55 C.
L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention développe par ailleurs une activité enzymatique appréciable dans une large gamme de pH en présence d'un substrat tel que la saccharose. H développe par ailleurs, à un pH compris entre environ 5,5 et environ 6,3, une activité enzymatique maximum mesurée à environ 55 C.
Plus précisément, il développe encore, à une température d'environ 55 C et à un pH compris entre environ 4,0 et environ 8,4 une activité enzymatique d'au
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moins 50 % de l'activité maximum mesurée à 55 C. H développe, à cette température d'environ 55 C et à un pH compris entre environ 4, 2 et environ 8, 0, une activité enzymatique d'au moins 70 % de l'activité maximum mesurée à 55 C.
Il développe, à cette température et à un pH compris entre environ 4,5 et environ 7,8, une activité enzymatique d'au moins 80 % de l'activité maximum mesurée à 55 C. Il développe, à environ 55 C et à un pH compris entre environ 4,7 à environ 7,2, une activité enzymatique d'au moins 90 % de l'activité maximum mesurée à 55 C.
L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention a une stabilité thermique appréciable en présence d'un substrat tel que la saccharose. H développe par ailleurs, dans une gamme de température d'environ 55 C à environ 64OC, une activité enzymatique maximum mesurée à un pH de 5,5.
Plus précisément, il développe encore, à un pH d'environ 5,5 et dans une
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gamme de température d'environ 350C à environ 75OC, une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à un pH de 5, 5. Il développe, pour ce pH d'environ 5, 5 et dans une gamme de température d'environ 450C à environ 68OC, une activité enzymatique d'au moins 80 % de l'activité maximum mesurée à un pH de 5, 5. Il développe, à ce pH d'environ 5, 5 et dans une gamme de température d'environ 50 C à environ 67 C, une activité enzymatique d'au moins 90 % de l'activité maximum mesurée à un pH de 5,5.
L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention est un enzyme lié à la cellule. H a une activité de fructosyle transférase et est ainsi à même de produire des polymères de fructosyle à partir de saccharose constitués de fructose à liaison bêta-D (2- > 6) qui appartiennent à la famille des"lévanes".
L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention n'est pas un enzyme inductible par la saccharose, c'est-à-dire qu'il n'a pas besoin de saccharose pour être induit et produit.
La présente invention vise également un procédé de production d'un enzyme de lévane saccharase stable aux acides utilisant un micro-organisme en l'absence de saccharose ajouté au milieu nutritif.
Le procédé selon la présente invention pour la production d'un enzyme de
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lévane saccharase stable aux acides comprend les étapes suivantes : (i) on cultive un micro-organisme appartenant au genre Bacillus dans un milieu nutritif approprié en formant un bouillon de fermentation comprenant une biomasse et (ii) on récupère l'enzyme de lévane saccharase dudit bouillon de fermentation, le micro-organisme étant cultivé en l'absence de saccharose.
La présente invention vise également un nouveau micro-organisme appartenant au genre Bacillus produisant un enzyme de lévane saccharase stable aux acides en l'absence de saccharose dans le milieu nutritif.
A cet effet, la présente invention vise un nouveau micro-organisme de l'espèce Bacillus licheniformis produisant un enzyme de lévane saccharase stable aux acides en l'absence de saccharose dans le milieu nutritif. Le micro-organisme préféré de l'espèce Bacillus licheniformis APMC 84 a été déposé à l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Peoria, Illinois, dans le cadre du Traité de Budapest.
Le numéro de dépôt est NRRL B-18962.
Des mutants naturels et artificiels et les dérivés obtenus par des modifications naturelles ou par des modifications génétiques du micro-organisme de l'espèce Bacillus licheniformis APMC 84 sont également englobés dans la présente invention.
L'enzyme de lévane saccharase de la présente invention peut être produit non seulement par la souche de Bacillus licheniformis NRRL B-18962, mais également par des mutants naturels ou artificiels et d'autres dérivés de ce micro-organisme.
Ces mutants peuvent être obtenus par des techniques bien connues, telles que rayonnement aux rayons X et aux ultraviolets, mutagènes chimiques et génie génétique.
L'enzyme de lévane saccharase produit selon le procédé de l'invention est préparé en cultivant le micro-organisme appartenant au genre Bacillus dans un milieu nutritif contenant du carbone, de l'azote et des sels minéraux dans des conditions aérobies en l'absence de saccharose, et ensuite en récupérant l'enzyme de lévane saccharase.
Les conditions de culture de ces micro-organismes, notamment les composants du milieu nutritif, les paramètres, la température, le pH, l'agitation, l'aération,
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apparaîtront à l'homme de l'art.
Comme sources de carbone appropriées, on peut citer le glucose, le fructose, les maltodextrines, le glycérol, le sirop de mais, l'amidon, l'amidon hydrolysé et des mélanges de deux ou plusieurs de ces sources de carbone. Les sources de carbone préférées sont le sirop de mais et l'amidon hydrolysé.
Comme sources d'azote que l'on peut utiliser, on peut citer la farine de soja, la liqueur de trempage de mais, la farine de pommes de terre, la farine de graines de coton, la farine de poisson, la levure, les extraits de levure ou des mélanges de deux ou plusieurs de ces sources d'azote. Les sources d'azote préférées sont la farine de soja, la farine de graines de coton, les extraits de levure ou un mélange de farine de soja et d'extrait de levure.
Comme sels appropriés, on peut citer le sulfate de potassium, le sulfate de manganèse, le sulfate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le phosphate de potassium, le phosphate de sodium mono-acide, le phosphate de sodium di-acide, le chlorure de calcium, le citrate de sodium ou des mélanges de deux ou plusieurs de ces sels. Comme sels préférés, on peut citer un mélange de phosphate de sodium mono-acide, de phosphate de sodium di-acide, de chlorure de calcium et de citrate de sodium.
Le milieu contenant les composés précités est stérilisé de manière classique et inoculé par la souche appropriée de micro-organisme, de préférence par la souche de B. licheniformis et, mieux encore, par la souche de B. licheniformis APMC 84.
La culture est réalisée dans des conditions aérobies sous agitation ou sous agitation aérée, typiquement à une température comprise entre environ 25 C et 46 C pendant environ 6 à 40 heures et à un pH compris entre environ 5,0 et environ 8,5.
De préférence, la culture sera réalisée à une température comprise entre environ 30 C et 42 C pendant environ 12 à 30 heures et à un pH d'environ 6,0 à 8,0. De bons résultats sont obtenus lorsque la culture est réalisée à une température comprise entre environ 36 C et 40 C à un pH compris entre environ 6,5 et 8,5.
Après la culture, un bouillon de fermentation comprenant une biomasse est obtenu. Cette biomasse, comprenant les cellules des micro-organismes et l'enzyme de lévane saccharase à liaison cellulaire, est séparée et récupérée du filtrat de culture
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en utilisant des procédés classiques tels que centrifugation, désalinisation, précipitation, filtration, ultrafiltration, microfiltration, centrifugation suivie d'une ultrafiltration ou filtration suivie d'une microfiltration.
La biomasse séparée et récupérée est ensuite lavée de préférence à plusieurs reprises à l'aide d'eau et, mieux encore, à l'aide d'eau distillée désionisée, et homogénéisée. Le lavage répété de la biomasse n'a aucun effet sur l'activité de l'enzyme de lévane saccharase à liaison cellulaire, ce qui mène à la conclusion que l'enzyme est étroitement lié à la cellule.
L'enzyme de lévane saccharase peut encore être purifié si nécessaire et selon les emplois planifiés. La solubilisation de l'enzyme à liaison cellulaire peut être obtenue en présence de détergents ioniques tels que le cholate de sodium ou le dodécylsulfate de sodium (0,25 % à 2,5 %) ou des solutions de sels telles qu'une solution de Mg++.
L'enzyme peut également être précipité par du sulfate d'ammonium dans la plage de 65 à 95 % de saturation à une température d'environ 0 C. Une technique de sonication peut également être utilisée pour séparer l'enzyme de lévane saccharase et les cellules, si nécessaire.
L'enzyme de lévane saccharase peut être formulé en compositions contenant l'enzyme de lévane saccharase utilisables dans diverses industries, notamment et tout particulièrement dans les industries alimentaire, pharmaceutique et chimique.
L'enzyme de lévane saccharase est formulé selon les applications que l'on envisage. Habituellement, des stabilisants et des conservateurs sont également ajoutés aux compositions enzymatiques. Par exemple, l'enzyme peut être stabilisé en ajoutant du glycérol (50 % en volume), du sulfate d'ammonium (3,2 moles/l) ou du chlorure de sodium (3 moles/l) à la solution aqueuse de l'enzyme.
Pour les applications médicales, l'enzyme peut être utilisé de préférence sous forme lyophilisée.
Pour les applications alimentaires, l'enzyme peut être utilisé immobilisé par couplage physique ou chimique de l'enzyme avec des supports inertes sensiblement insolubles qui facilitent leur emploi dans des réacteurs à écoulement.
Habituellement, l'enzyme est attaché au support. Les matières utilisées pour le
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support comprennent des matières organiques et minérales telles de la terre de diatomées granulaire poreuse traitée par une solution de polyamine et de glutaraldéhyde, du charbon granulaire activé, une matière tensio-active telle que l'alumine, le charbon, l'argile, la zircone, le bioxyde de titane, des résines échangeuses d'ions, de la cellulose ou du verre, des supports chimiquement activés tels que la cellulose, l'agarose, des polymères synthétiques, des gels par exemple de polyacrylamides, la silice et l'amidon, l'enzyme étant inclus dans le réseau polymérique.
De préférence, l'enzyme de lévane saccharase comprenant des cellules entières de Bacillus peut être directement utilisé dans le procédé d'immobilisation sans isolement ni purification de l'enzyme.
Les compositions contenant l'enzyme de lévane saccharase de la présente invention peuvent être utilisées sous forme solide ou liquide. Ces compositions peuvent être transformées en un produit final qui peut être une solution liquide, un solide, des granulés, une poudre ou une suspension.
Les compositions selon la présente invention peuvent être utilisées pour la production de lévanes à partir de sucres contenant des résidus de fructosyle tels que le saccharose, le raffinose ou le stachyose. Ces sucres peuvent être dérivés de matières brutes, telles que les betteraves sucrières brutes, le jus purifié provenant de betteraves sucrières broyées ou déchiquetées, les mélasses, les sucres de canne, les sucres de betterave, les sucres de plantes.
Les lévanes obtenus peuvent être des lévanes de haut poids moléculaire, des lévanes de bas poids moléculaire (fructooligosaccharides) et des polymères de fructosyle.
La présente invention sera illustrée par ailleurs par les exemples suivants.
Exemple 1
Un milieu d'ensemencement utilisé pour le développement de l'inoculum est préparé avec les composants suivants : chlorure de calcium 0,02 % en poids/volume, citrate de sodium 0,3 %, amidon hydrolysé 2,6 % vendu sous la marque déposée
MALTRIN 100 (GPC), farine de coton 4,6 % vendue sous la marque déposée
PHARMAMEDIA (TRADERS PROTEIN), phosphate de sodium mono-acide
0,21 % et phosphate de sodium di-acide 0,54 %. Ce milieu d'ensemencement est
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stérilisé à 125 C pendant 30 minutes dans des flacons d'ensemencement qui sont des flacons d'Erlenmeyer à triple chicane de 250 ml contenant 50 ml de milieu d'ensemencement. Ensuite, ces flacons sont inoculés à partir d'une culture de la souche de B. licheniformis APMC 84.
Cette souche est mise en culture sur un agitateur giratoire à 37 C pendant 24 heures avant son emploi comme source d'inoculum pour les flacons de production.
Le milieu utilisé pour la production de l'enzyme de lévane saccharase est préparé avec les composants suivants : sirop de maïs 10,3 % en poids/volume vendu sous la marque déposée STALEY 200 (A. E. STALEY), farine de soja 5,5 % vendue sous la marque déposée PROMOSOY 100 (CENTRAL SOJA), extrait de levure (vendue par UNIVERSAL FOODS CORP) 0,32 %, phosphate de sodium
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mono-acide 0, 7 % et phosphate de sodium di-acide 0, 7 %.
Ce milieu de production est stérilisé à 125 C pendant 30 minutes dans des flacons de production qui sont des flacons d'Erlenmeyer à triple chicane de 250 ml contenant 50 ml de milieu de production.
La quantité d'inoculum est de 2 % en volume/volume. Les flacons de production inoculés sont incubés sur un agitateur giratoire à une température de 37 C pendant 16 à 20 heures.
On n'observe pas d'augmentation de la viscosité lorsque le lévane est produit dans un bouillon de fermentation.
L'enzyme produit peut être isolé aisément presque sans poisser.
La biomasse est séparée du bouillon de fermentation par centrifugation, ensuite les cellules sont lavées à l'aide d'eau distillée désionisée à deux reprises et homogénéisées.
L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention est récupéré.
L'unité d'enzyme de lévane saccharase (LSU) est définie comme la quantité d'activité enzymatique requise pour produire une micromole de glucose par minute dans les conditions de l'essai.
L'activité enzymatique a été mesurée en utilisant du saccharose à titre de substrat. A un millilitre d'une quantité aliquote d'enzyme, on a ajouté 7,5 ml de
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tampon de citrate 0,01 M, pH 5,5, contenant 60 % de saccharose (poids/poids). Ensuite, le volume du mélange réactionnel a été ajusté à 10 ml en utilisant de l'eau distillée et le mélange a été incubé à 550C pendant une heure. Après le temps spécifié, la réaction enzymatique a été achevée par application de chaleur à 95 C pendant 10 minutes. La teneur en glucose des produits réactionnels a été déterminée par analyse chromatographique en phase liquide de haute performance (HPLC) (Brobst, K. M., et H. D. Schobell, 1982. Starch/Starke, 34,117-121).
L'évaluation de l'effet du pH sur l'activité de l'enzyme de lévane saccharase a été déterminée en effectuant la réaction de transfructosylation enzymatique après
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incubation à 550C pendant une heure à différents niveaux de pH, c'est-à-dire 4, 0, 4, 5, 5, 0, 5, 5, 6, 0, 6, 5, 7, 0, 7, 5 et 8, 0 en utilisant un tampon de phosphate approprié (0,01 M). La quantité de glucose formée a été déterminée en utilisant le HPLC (analyse chromatographique en phase liquide de haute performance). L'activité a été calculée.
A 55OC, l'activité maximum s'est développée à pH d'environ 5,5-6, 0.
La figure 1 illustre l'effet du pH sur l'activité de l'enzyme à une température
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de 55OC. Sur cette figure, le pH est en abscisses et l'activité exprimée en pourcentage de l'activité maximum développée à pH 5,5 et à une température de 550C en ordonnées. Le symbole 0 représente les données correspondant à l'enzyme selon l'invention et, à titre de comparaison, le symbole # représente les données de la demande de brevet japonaise JP-A-52-82781.
L'enzyme de la présente invention est plus stable dans la gamme de pH acides que l'enzyme décrit dans la demande de brevet japonaise mentionnée ci-dessus.
L'enzyme de la présente invention présente à 55 OC et à un pH de 4,0 plus de 50 % de son activité maximum mesurée à 55OC, tandis que l'enzyme de la technique antérieure ne présentait pas d'activité à pH 4,0 et à cette température.
La figure 1 montre que l'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention développe une activité enzymatique appréciable dans une large gamme de pH en présence de saccharose. H développe dans une gamme de pH d'environ 5,5 à environ 6,3 une activité enzymatique maximum mesurée à 55OC. Plus précisément, il développe, à une température d'environ 550C et dans une gamme de
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pH d'environ 4, 0 à environ 8, 4, une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à 55OC.
il développe, à cette température d'environ 55 C et dans une gamme de pH d'environ 4, 2 à environ 8, 0, une activité enzymatique d'au moins 70 % de l'activité maximum mesurée à 55 C. H développe, à cette température et dans une gamme de pH d'environ 4,5 à environ 7,8, une activité enzymatique d'au moins 80 % de l'activité maximum mesurée à 55 C. Il
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développe, à environ 55 C et dans une gamme de pH d'environ 4, 7 à environ 7, 2, une activité enzymatique d'au moins 90 % de l'activité maximum mesurée à 55 C.
L'évaluation de l'effet de la température sur l'activité de l'enzyme de lévane saccharase a été déterminée en réalisant la réaction enzymatique à un pH de 5,5
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après incubation pendant une heure à différentes températures, c'est-à-dire à 40 C, 50 C, 55 C, 60 C, 70 c et 80 C.
Le mélange réactionnel était constitué de 7, 5 ml d'une solution de saccharose à 60 % (poids/volume) dans un tampon de citrate-phosphate 0, 01 M à un pH de 5, 5 et de 1,0 ml de biomasse lavée contenant 30 LSU/ml d'activité enzymatique.
A pH de 5,5, l'activité maximum s'est développée à une température d'environ 60 C.
L'effet de la température sur l'activité de l'enzyme de lévane saccharase est représentée dans la figure 2. Dans cette figure, les abscisses représentent la
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température réactionnelle en C et les ordonnées l'activité exprimée en pourcentage de l'activité maximum développée à 60 C et à un pH de 5, 5. Le symbole 0 représente les données de l'enzyme selon l'invention et, à titre de comparaison, le symbole # représente les données de la demande de brevet japonaise JP-A-52-82781.
La figure 2 montre que l'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention a une stabilité thermique appréciable en présence de saccharose.
H développe dans une gamme de température d'environ 55 C à environ 64 C une activité enzymatique maximum mesurée à un pH d'environ 5,5.
Plus précisément, il développe, à un pH d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 35 C à environ 75OC, une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à un pH de 5,5. H développe, à ce pH d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 450C à environ 68OC,
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une activité enzymatique d'au moins 80 % de l'activité maximum mesurée à un pH de 5,5. Il développe à ce pH d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 50 C à environ 67 C une activité enzymatique d'au moins 90 % de l'activité maximum mesurée à un pH de 5,5.
Exemple 2
L'effet de la concentration de l'enzyme de lévane saccharase (LSU/g de saccharose) sur la composition des produits réactionnels à différents intervalles de temps a été mesuré à une température de 550C et à pH de 5,5.
Dans un essai typique, 4,5 g de saccharose dans 9,5 ml d'eau ont été incubés avec une quantité aliquote de 0,5 ml de biomasse contenant différentes quantités d'enzyme de lévane saccharase, c'est-à-dire 4,5, 9,0 et 22,5 LSU à une température
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de 50 C. Des échantillons ont été prélevés à différents intervalles de temps et la réaction a été terminée en chauffant à 90 C pendant 10 minutes.
La composition des produits a été déterminée par chromatographie en phase liquide de haute performance (Tableau 1).
TABLEAU 1
Effet de la concentration de l'enzyme de lévane saccharase (LSU/g de saccharose) sur la composition des produits réactionnels
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> Composition <SEP> des <SEP> produits
<tb> de <SEP> l'enzyme <SEP> Temps <SEP> réactionnels <SEP> en <SEP> %
<tb> en <SEP> LSU/g <SEP> de <SEP> (hr.)
<tb> saccharose <SEP> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Saccharose <SEP> Lévane
<tb> 1 <SEP> LSU/g <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 48 <SEP> 4,93 <SEP> 86,82 <SEP> 5,77
<tb> 4 <SEP> 4,13 <SEP> 9,63 <SEP> 76,24 <SEP> 10,00
<tb> 6 <SEP> 5,50 <SEP> 41, <SEP> 06 <SEP> 66,74 <SEP> 13,70
<tb> 8 <SEP> 6,94 <SEP> 18,41 <SEP> 58, <SEP> 54 <SEP> 16, <SEP> 56
<tb> 12 <SEP> 7,49 <SEP> 23,60 <SEP> 47, <SEP> 30 <SEP> 21,61
<tb> 16 <SEP> 8,60 <SEP> 28,95 <SEP> 37,90 <SEP> 24,55
<tb> 24 <SEP> 9,79 <SEP> 36,35 <SEP> 23,14 <SEP> 30,71
<tb> 36 <SEP> 10,
90 <SEP> 41,57 <SEP> 13,40 <SEP> 34,14
<tb> 44 <SEP> 11, <SEP> 24 <SEP> 42,91 <SEP> 10, <SEP> 55 <SEP> 35,29
<tb> 2 <SEP> LSU/g <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 99 <SEP> 10,10 <SEP> 76, <SEP> 55 <SEP> 9,36
<tb> 4 <SEP> 6,41 <SEP> 18, <SEP> 59 <SEP> 58,28 <SEP> 16, <SEP> 72
<tb> 6 <SEP> 7, <SEP> 87 <SEP> 26,09 <SEP> 43,09 <SEP> 22,95
<tb> 8 <SEP> 9,03 <SEP> 32, <SEP> 33 <SEP> 31,59 <SEP> 27,08
<tb> 12 <SEP> 10, <SEP> 22 <SEP> 39,27 <SEP> 17, <SEP> 74 <SEP> 32,77
<tb> 16 <SEP> 10,93 <SEP> 42,93 <SEP> 11, <SEP> 11 <SEP> 35,02
<tb> 24 <SEP> 11,76 <SEP> 45,25 <SEP> 6,90 <SEP> 36,08
<tb> 5 <SEP> LSU/g <SEP> 2 <SEP> 7, <SEP> 19 <SEP> 23,94 <SEP> 48, <SEP> 02 <SEP> 20,35
<tb> 4 <SEP> 9,76 <SEP> 38,61 <SEP> 19,23 <SEP> 32,39
<tb> 6 <SEP> 10,98 <SEP> 44, <SEP> 28 <SEP> 8,71 <SEP> 36,02
<tb> 8 <SEP> 11,41 <SEP> 45,65 <SEP> 6, <SEP> 48 <SEP> 36, <SEP> 46
<tb> 12 <SEP> 12, <SEP> 34 <SEP> 45,32 <SEP> 6,
43 <SEP> 35,91
<tb> 16 <SEP> 13,01 <SEP> 45,46 <SEP> 6, <SEP> 06 <SEP> 35,47
<tb>
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fr-T- (Hr.) représente le nombre d'heures.
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Le taux de formation de glucose à partir de saccharose par l'enzyme de lévane saccharase augmentait avec l'augmentation de la concentration de l'enzyme. Une quantité de 35 % de lévane a été produite dans tous les cas. Une quantité de 45 % de glucose a été produite dans tous les cas.
Exemple 3
La stabilité thermique de l'enzyme en présence de substrat est très importante pour une large application commerciale de l'enzyme. L'effet de la température sur la composition des produits réactionnels a été déterminée à des températures de 40 C, 500C et 60 C. Le mélange réactionnel était constitué de 7,5 ml d'une solution de saccharose à 60 % (poids/poids) dans un tampon de citrate-phosphate 0,01 M à pH de 5,5 et de 2,5 ml d ; une solution d'enzyme contenant 40 unités LSU.
Des échantillons ont été prélevés à différents intervalles de temps et la réaction a été terminée en chauffant à 90 C pendant 10 minutes.
La composition des produits a été déterminée par chromatographie en phase liquide de haute performance (Tableau 2).
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TABLEAU 2 Effet de la température sur la composition des produits réactionnels
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<tb>
<tb> Composition <SEP> des <SEP> produits
<tb> Température <SEP> Temps <SEP> réactionnels <SEP> en <SEP> %
<tb> réactionnelle <SEP> (ha.)
<tb> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Saccharose <SEP> Lévane
<tb> 50 <SEP> C <SEP> 4 <SEP> 7, <SEP> 50 <SEP> 23, <SEP> 31 <SEP> 47,33 <SEP> 21,86
<tb> 8 <SEP> 9, <SEP> 15 <SEP> 35, <SEP> 54 <SEP> 24, <SEP> 16 <SEP> 31, <SEP> 15
<tb> 14 <SEP> 11, <SEP> 28 <SEP> 47,30 <SEP> 7, <SEP> 27 <SEP> 34, <SEP> 15
<tb> 24 <SEP> 11,09 <SEP> 43,32 <SEP> 10,58 <SEP> 35,01
<tb> 55 <SEP> C <SEP> 4 <SEP> 7,92 <SEP> 24, <SEP> 32 <SEP> 45,26 <SEP> 22,50
<tb> 8 <SEP> 10263 <SEP> 35,58 <SEP> 23, <SEP> 39 <SEP> 30,41
<tb> 14 <SEP> 13,80 <SEP> 46,07 <SEP> 9,07 <SEP> 30,93
<tb> 24 <SEP> 14,43 <SEP> 46,77 <SEP> 6,20 <SEP> 32, <SEP> 61
<tb> 60 <SEP> C <SEP> 4 <SEP> 8,
65 <SEP> 23,66 <SEP> 46, <SEP> 35 <SEP> 21,34
<tb> 8 <SEP> 11,51 <SEP> 32,14 <SEP> 29,98 <SEP> 26, <SEP> 36
<tb> 14 <SEP> 15, <SEP> 11 <SEP> 42,87 <SEP> 18,09 <SEP> 23, <SEP> 93
<tb> 24 <SEP> 14,55 <SEP> 40,36 <SEP> 14, <SEP> 74 <SEP> 30,36
<tb>
EMI14.2
Les données du tableau 2 montrent que l'enzyme de la présente invention a une bonne stabilité thermique en présence d'un substrat entre 50 et 650C à pH de 5, 5.
Exemple 4 Une concentration élevée de substrat est toujours préférée pour le succès commercial d'une transformation quelconque du fait du coût énergétique élevé dû à l'évaporation des produits réactionnels.
L'effet de la concentration du saccharose sur la composition des produits réactionnels a été étudié à différents intervalles pendant l'incubation du saccharose à une température de 550C avec l'enzyme à pH de 5, 5.
On a préparé un tampon d'acétate (0, 1 M) à pH de 5, 5 contenant diverses
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quantités de saccharose. Des quantités appropriées d'enzyme ont été ajoutées pour obtenir une concentration finale de 10 LSU/g de saccharose et incubées à 55 C.
Des échantillons ont été prélevés à différents intervalles de temps et la réaction enzymatique a été terminée par chauffage à 90 C pendant 10 minutes.
La composition des produits réactionnels a été ensuite déterminée par HPLC (Tableau 3).
<Desc/Clms Page number 16>
TABLEAU 3 Effet des concentrations de saccharose sur la composition des produits réactionnels
EMI16.1
<tb>
<tb> Concentra-Pourcentage <SEP> de <SEP> composition <SEP> Rapport
<tb> tion <SEP> en <SEP> Temps <SEP> du <SEP> lévane
<tb> saccharose <SEP> (hr.) <SEP> au
<tb> g/100ml <SEP> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Saccharose <SEP> Lévane <SEP> fructose
<tb> libre
<tb> 30 <SEP> 5 <SEP> 9, <SEP> 75 <SEP> 25,69 <SEP> 43, <SEP> 88 <SEP> 21, <SEP> 57 <SEP> 2, <SEP> 21
<tb> 8 <SEP> 12,47 <SEP> 32,78 <SEP> 30,09 <SEP> 24,67 <SEP> 1,98
<tb> 12 <SEP> 16,14 <SEP> 43,04 <SEP> 17,75 <SEP> 23,08 <SEP> 1, <SEP> 43
<tb> 24 <SEP> 17,67 <SEP> 45,35 <SEP> 6, <SEP> 66 <SEP> 30,33 <SEP> 1, <SEP> 73
<tb> 45 <SEP> 5 <SEP> 8,99 <SEP> 29,44 <SEP> 36,84 <SEP> 24,72 <SEP> 2,75
<tb> 8 <SEP> 10,71 <SEP> 36,40 <SEP> 22,75 <SEP> 30,13 <SEP> 2,81
<tb> 12 <SEP> 13, <SEP> 66 <SEP> 44, <SEP> 31 <SEP> 11,
03 <SEP> 31,00 <SEP> 2, <SEP> 27
<tb> 24 <SEP> 13,56 <SEP> 42,75 <SEP> 10,20 <SEP> 33,46 <SEP> 2,46
<tb> 60 <SEP> 5 <SEP> 6,93 <SEP> 29,47 <SEP> 34,12 <SEP> 29,49 <SEP> 4,26
<tb> 8 <SEP> 8,46 <SEP> 39,93 <SEP> 20,55 <SEP> 34,05 <SEP> 4,02
<tb> 12 <SEP> 11,12 <SEP> 44,98 <SEP> 5,37 <SEP> 35,62 <SEP> 3,16
<tb> 24 <SEP> 14,03 <SEP> 44,98 <SEP> 5,37 <SEP> 35, <SEP> 62 <SEP> 2,54
<tb> 75 <SEP> 5 <SEP> 6,25 <SEP> 29,15 <SEP> 33,34 <SEP> 31, <SEP> 27 <SEP> 5,00
<tb> 8 <SEP> 7, <SEP> 57 <SEP> 37,30 <SEP> 19,00 <SEP> 36,12 <SEP> 4,77
<tb> 12 <SEP> 9,45 <SEP> 44, <SEP> 26 <SEP> 8,93 <SEP> 37, <SEP> 34 <SEP> 3,95
<tb> 24 <SEP> 10,76 <SEP> 43,31 <SEP> 4,96 <SEP> 41,12 <SEP> 3,82
<tb>
Les résultats donnés dans le tableau 3 montrent que la transfructosylation a été augmentée en augmentant la concentration de saccharose.
Le rapport de lévane produit au fructose libre à tout intervalle de temps était supérieur pour une concentration supérieure de substrat par comparaison au rapport obtenu pour une
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moindre concentration de substrat. Par exemple, le rapport du lévane au fructose libre se situe entre 1,4 et 2,2 pour une concentration de la saccharose de 30 %, tandis que le rapport est de 4, 5-5, 0 pour une concentration de la saccharose de 75 %. Cela suggère fortement que la faible activité de l'eau favorise la production de lévane.