"Alpha-amylases , enzymes stables à chaud et en milieu acide,
leur procédé d'obtention et leur application" <EMI ID=1.1>
amylases qui sont des enzymes stables à la chaleur et aux acides, ainsi que des procédés pour la production de ces enzymes.
<EMI ID=2.1>
ces nouvelles alpha-amylases comme enzymes pour l'hydrolyse,
la liquéfaction et/ou la transformation de matières amylacées en des hydrolysats de l'amidon.(ou de la fécule).
Des préparations d'enzymes du type de l'alpha-amylase ont servi à hydrolyser, à liquéfier et/ou à transformer des matières amylacées en des hydrolysats de l'amidon ; elles ont également servi dans des formulations détergentes. Lorsqu'on utilise des alpha-amylases comme enzymes de traitement de matières amylacées, on les utilise comme stade initial pour la pro-
<EMI ID=3.1>
par hydrolyse de l'amidon comme des malto-dextrines, des sirops de glucose, du dextrose, du lévulose, du maltose etc. L'enzyme du type alpha-amylase hydrolyse les molécules de l'amidon pour les décomposer en divers fragments à masse moléculaire interné-
<EMI ID=4.1>
afin de pouvoir obtenir le produit final voulu. En variante,
<EMI ID=5.1>
<EMI ID=6.1>
produire directement le produit voulu dthydrolyse de l'amidon.
<EMI ID=7.1>
nir à partir de sources très diverses. La plupart des alphaamylases sont des enzymes produites à partir de sources bactériennes comme Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus etc, qui sont cultivés dans un milieu de culture approprié ; puis les cellules ainsi obtenues sont détruites et la préparation de l'enzyme est ensuite séparée du bouillon et purifiée.
De nombreuses alpha-amylases disponibles à l'échelle commerciale sont des enzymes actuellement produites à partir
des micro-organismes de Bacillus subtilis. Lorsque ces enzymes servent à transformer l'amidon en des hydrolysats d'amidon, elles auront généralement une température optimale se situant entre 7
<EMI ID=8.1>
tions de température et de pH nécessaires pour une utilisation efficace de l'enzyme présentent deux inconvénients. En premier lieu, si l'amidon est transformé avec l'enzyme à un pH d'envii ron 6 et à une température d'environ 80[deg.] à environ 85 [deg.]C, il y a isomérisation d'une partie des groupes terminaux réducteurs de l'amidon et, dans le processus subséquent de transformation, il y a production de maltulose qui diminue le degré d'obtention du produit voulu, par exemple du dextrose, du levulose ou du
<EMI ID=9.1>
que l'on utilise pour le processus de transformation et de saccharification est généralement d'environ 4,5 dans le cas des enzymes provenant de micro-organismes du type Aspergillus
<EMI ID=10.1>
nant de micro-organismes de type Rhizopus. Donc, après l'achèvement du stade de la liquéfaction à l'aide de l'enzyme alphaamylase, il a été nécessaire d'ajuster le pH et de le faire
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
et, par conséquente il augmente la charge et, par suite, les frais de purification et de raffinage lorsqu'on utilise les résines d'échanges d'ions servant à la purification lu produit final.
Au cours des récentes années, on a mis au point diverses alpha-amylases qui sont des enzymes stables à chaud. Des exemples de telles alpha-amylases stables à chaud comprennent les enzymes produites à partir de micro-organismes provenant de Bacillus stearothermophilis, comme décrit par Ogasawera et
<EMI ID=13.1>
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
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bonne stabilité thermique dans des solutions neutres ou faiblement alcalines ont été rendues disponibles. Ces alpha-amylases stables à la chaleur et en milieu alcalin sont des enzymes qui ont été vendues sous la marque "Thermamyl". On les produit en cultivant des micro-organismes de l'espèce Bacillus licheni-
<EMI ID=17.1>
par Madsen et ses collaborateurs, Die Starke, 2�, 304, 305 et <EMI ID=18.1>
que les alpha-amylases produites à partir de Bacillus licheniformis ont une stabilité à chaud relativement bonne dans des solutions neutres et faiblement alcalines, ces enzymes n'ont pas, dans des conditions acides, une stabilité qui peut rendre leur utilisation économique d'un point de vue industriel.
Donc, un but principal de la présente invention consiste à produire des alpha-amylases qui sont des enzymes ayant une bonne stabilité à chaud ainsi qu'une bonne stabilité dans des conditions acides, en particulier à des valeurs du pH permettant de rendre leur utilisation possible dans des conditions compatibles avec celles nécessaires pour d'autres amylases comme la gluco-amylase.
La présente invention vise de nouvelles alpha-amylases qui sont des enzymes stables à chaud et en milieu acide et qui se caractérisent par le fait que : (1) elles sont capables de
<EMI ID=19.1>
initiale lorsqu'on les maintient à 90[deg.]C et à un pH de 6,0
- durant 10 minutes sans addition de l'ion calcium ; (2) elles <EMI ID=20.1>
<EMI ID=21.1>
<EMI ID=22.1>
et (3) elles sont capables de conserver au moins 50 % environ
<EMI ID=23.1>
<EMI ID=24.1>
durant 10 minutes. Les enzymes de l'invention peuvent également conserver au moins 50 % environ de leur activité initiale à une température de 85[deg.]C et à un pH de 4,55 en présence de 5 mmoles de l'ion calcium et de 22,5 % en poids d'amidon (sur base sèche). Les enzymes de la présente invention se caractérisent en outre
<EMI ID=25.1>
environ de leur- activité initiale d'alpha-amylase à la tempéra-
<EMI ID=26.1>
Ces enzymes proviennent de préférence d'un micro-organisme du
<EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1> 7 et elles se caractérisent par le fait qu'elles ne présentent essentiellement pas d'activité de protéase. ; par exemple, elles ont généralement un rapport entre leur activité de protéase et leur activité d'alpha-amylase inférieur à 3 et de préférence un rapport inférieur à 1.
On produit les nouvelles alpha-amylases de la présente invention en cultivant dans un milieu convenable un micro-
<EMI ID=29.1>
cultivant une souche choisie parmi le groupe consistant en Bacillus stearaothermophilus ATCC N[deg.] 31 195, N[deg.] 31 196,
N[deg.] 31 197, N[deg.] 31 198, N[deg.] 31 199, leurs variants, leurs mutants et leurs sous-mutants, et en extrayant ensuite l'enzyme alphaamylase produite.
L'invention sera décrite plus en détail dans la suite du présent exposé, en regard des figures annexées où :
La figure 1 (abscisses : pH ; ordonnées : % d'activité résiduelle) illustre la relation entre le pH optimal de deux <EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
amylase "Thermamyl" (courbe C) ; La figure 2 (abscisses : température, en degré C ; or- <EMI ID=32.1>
température optimale de deux des enzymes de l'invention (A :
enzyme provenant de Bacillus stearothermophilus ATCC N[deg.] 31 195 ;
<EMI ID=33.1>
N[deg.] 31 199) avec la température optimale pour l'alpha-amylase "Thermamyl" (C) ; La figure 3 (abscisses durée de l'incubation, en minutes ; ordonnées : % dtactivité résiduelle) illustre la relation entre la thermostabilité de deux des enzymes de l'invention
(A : enzyme provenant de ATCC N[deg.] 31 195 ; B : enzyme provenant <EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1> La figure 4 (abscisses : durée de l'incubation, en <EMI ID=36.1>
tion entre la thermostabilité de deux des enzymes de la présente
<EMI ID=37.1> indique la thermostabilité de l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus citée par Ogazawara et ses collaborateurs) ; La figure 5 (abscisses : temps d'incubation en minutes ; ordonnées : % d'activité résiduelle) compare la thermostabilité <EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
la thermostabilité de l'alpha-amylase "Thermamyl" (C) à 90[deg.]C
<EMI ID=40.1> La figure 6 (abscisses : temps d'incubation en minutes ordonnées : % d'activité résiduelle) illustre la relation entre la thermostabilité de deux des enzymes de la présente invention
(A : enzyme provenant de ATCC N[deg.] 31 195 ; B : enzyme provenant de ATCC N[deg.] 31 199) avec la thermostabilité de "Thermamyl" (C) <EMI ID=41.1>
base sèche) ; <EMI ID=42.1>
tes ordonnées : % d'activité résiduelle) illustre la relation
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1> <EMI ID=46.1> La figure 8 (abscisses : mobilité de 0 à 1 ,0 ; or- <EMI ID=47.1>
la détermination de la masse moléculaire de deux enzymes de
<EMI ID=48.1>
<EMI ID=49.1>
on indique les résultats obtenus pour une albumine (K), de
<EMI ID=50.1>
(N).
La figure 9 (abscisses : pH ; ordonnées : % d'activité relative) illustre la relation entre le pH et l'activité d'enzymes pour l'une des enzymes de l'invention (A") et pour des alphaamylases de ltart antérieur provenant de Bacillus stearothermophilus (D : alpha-amylase citée par Ogazawera dans J. Bio. Chem.
<EMI ID=51.1>
collaborateurs dans J. Biol. Chem. 236, 2952 (1961)) ; <EMI ID=52.1> <EMI ID=53.1> température pour une enzyme de la présente invention (AU) avec une alpha-amylase de l'art antérieur provenant de Bacillus stearothermophilus (D, citée par Ogazawera et ses collaborateurs) ; La figure 11 (abscisses : temps d'incubation, en minutes ; ordonnées : % d'activité relative) montre les courbes de désactivation d'une alpha-amylase de la présente invention
(A") et d'alpha-amylases de l'art antérieur provenant de Bacillus licheniformis ("Thermamyl" ;
C) et provenant de Bacillus subtilis (E) lorsqu'on opère à 80[deg.]C et à un pH de 4,5 en présen- <EMI ID=54.1> La figure 12 (abscisses : temps d'incubation en minutes ; ordonnées : % d'activité relative) montre les courbes de désactivation d'une enzyme de la présente invention (A") et d'alpha-amylases de l'art antérieur provenant de Bacillus licheniformis ("Thermamyl" ; C) et de Bacillus stearothermo- <EMI ID=55.1>
qu'on opère à 90[deg.]C et à un pH de 6,0 sans ion calcium.
La production et la stabilité thermique de 1' alphaamylase provenant de divers genres de micro-organismes ont été étudiées dans diverses conditions comme la température de croissance (37[deg.]C ; 45[deg.]C ; 55[deg.]C et 70[deg.]C), le pH (5,0 et 7,0) et les milieux de culture. Il a été trouvé que des champignons thermo-
<EMI ID=56.1>
produisent avec des rendements élevés de l'alpha-amylase thermolabile, alors que des bactéries thermophiles produisent à 70[deg.]0 avec de faibles rendements en' 'alpha-amylase thermostable. En
se fondant sur ces études initiales, le dépistage des microorganismes capables de produire de l'alpha-amylase stable aux acides et présentant de la stabilité thermique a été conduit par culture à 55[deg.]C et à 70[deg.]C.
On a collecté de divers endroits 550 échantillons au total de sources microbiennes comprenant du sol, de l'eau de sour-
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
calcium.
<EMI ID=60.1>
amylase :
On a préparé chaque semaine comme suit une solution à 0,2 % d'amidon soluble : on a chauffé 200 mg d'amidon soluble dans 50 ml environ d'un tampon à 0,2 M d'acétate (pH 4,5) conte-
<EMI ID=61.1>
et l'on'a complété la solution résultante à 100 ml en lui ajoutant le même tampon. On a fait incuber durant 5 minutes à 60[deg.]0 le
tube contenant 0,1 ml de la solution d'enzyme et 0,3 ml de la solution à 0,2 % dtamidon soluble. On a arrêté la réaction en ajoutant 1,0 ml d'acide acétique 0,5 N. Après avoir ajouté
3,0 ml d'une solution à 0,015 % d'iode et avoir agité, on a lu
<EMI ID=62.1>
enzyme a servi de témoin à blanc et l'on a désigné sa densité
<EMI ID=63.1>
quantité qui catalyse une diminution de 10 % de la valeur du bleu par minute dans les conditions décrites ci-dessus :
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
On détermine par le mode opératoire suivant les unités CPC d'activité de l'alpha-amylase :
On ajoute 1 ml d'une solution d'enzyme diluée de façon
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
tue la réaction durant 10 minutes à 60[deg.]C. On met 1 ml de la solution de réaction dans un ballon gradué de 100 ml contenant
50 ml d'acide chlorhydrique 0,02 N et, après avoir ajouté 3 ml d'une solution à 0,05 � d'iode, on complète le volume total à
100 ml par addition dteau. On mesure la couleur 'bleue.qui se développe pour déterminer le coefficient d'absorption à 620 millimicrons. La quantité d'enzyme nécessaire pour décomposer 10 mg d'amidon en une minute se définit comme étant une unité CPC :
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
te de l'eau au lieu de la solution de l'enzyme) ;
D : coefficient d'absorption de la solution de réaction.
Le tableau I résume les conditions et les milieux que l'on utilise pour la culture dans ltessai de dépistage ou de sélection.
Le tableau II indique les résultats de la première et de la seconde étude de dépistage et de sélection.
<EMI ID=72.1>
Conditions et milieux de culture
Conditions
Culture sur plaque(1) Culture inclinée(2) Culture en flacons
(3)
<EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
Environ 25 des champignons actinomycètes thermo-
<EMI ID=76.1>
usitée d'alpha-amylases par ml de bouillon de culture, mais il n'est resté aucune activité après le traitement thermique
<EMI ID=77.1>
Un total de 35 souches sur 1 061 souches bactériennes
<EMI ID=78.1>
100 à 1 000 unités d'alpha-amylase, et 10 de ces souches ont produit de l'alpha-amylase thermostable. Presque toutes les alpha-amylases provenant de bactéries thermophiles isolées
<EMI ID=79.1>
thermique. On a obtenu les plus forts producteurs parmi des
<EMI ID=80.1>
On a examiné la relation entre l'activité et la dimension de la sone nette dans les 219 dernières souches isolées
<EMI ID=81.1>
Relations antre ?.* activité et la dimension de
<EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
<EMI ID=84.1> lente méthode pour choisir des micro-organismes capables de produire avec des rendements élevés des alpha-amylases qui sont des enzymes stables aux acides et thermostables.
Par suite de ce dépistage de sélection, on a choisi 5 souches constituant les plus forts producteurs dtune alphaamylase qui soit une enzyme stable aux acides et thermostablés,
Sous la forme purifiée comme décrit ci-après, chacune des 5 souches a été déposée à la collection permanente dite "the. American Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 (Etats-Unis d'Amérique). ATCC entretient ces souches selon un contrat passé entre ATCC
<EMI ID=85.1> Le contrat entre ATCC et CPC International, Inc., prévoit la disponibilité permanente des cultures ou des sous-cultures pour le public, sans restriction après la publication ou la mise à l'Inspection Publique de n'importe quelle demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique ou d'un pays autre que les Etats-Unis d'Amérique, décrivant et identifiant les dépôts en cause et indiquant les numéros ATCC qui leur ont été attribués. CPC International Inc. a donné son accord pour que, si l'une quelconque de ces cultures en dépôt mourait ou était détruite au cours de la durée du brevet, cette culture soit remplacée par une culture vivante du même micro-organisme.
.7 Micro-organismes déposés
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
déposées à l'Institut de Recherches sur les fermentations,
<EMI ID=88.1>
Voici les caractéristiques bactériologiques des cinq souches choisies et qui ont été déposées à ATCC :
(1) Caractéristiques morphologiques :
<EMI ID=89.1>
bâtonnets individuels rarement en chaînes (toutes les souches)
<EMI ID=90.1>
sporange en forme de raquette (toutes souches)
<EMI ID=91.1>
?. Résistance l'acide : négative (toutes les souches)
(2) Croissance sur divers milieux :
<EMI ID=92.1>
s'étalent avec une surface grossière et un bord rugueux (toutes les souches)
Culture inclinée sur gélose nutritive : bonne croissance, blanc opaque, étalement actif, excroissances en forme de peignes (toutes les souches)
C. Culture en bouillon.nutritif liquide : brun transparent ; surface blanche mate (toutes les souches) D. Culture en profondeur dans de la gélatine nutritive :
liquéfaction (toutes les souches)
E. Plaque de gélose et de gélatine nutritive : grande
zone nette (toutes les souches)
F. culture en milieu liquide nutritif avec des sels :
<EMI ID=93.1> sel (toutes les souches)
<EMI ID=94.1>
muqueuse par hydrolyse de la caséine (toutes les souches)
<EMI ID=95.1>
croissance ; colonies semblables à celles obtenues sur de la gélose nutritive (toutes les souches)
I. Culture inclinée sur gélose avec protéose-peptone :
pas de croissance (toutes les souches)
(3) Caractéristiques physiologiques :
A. Réduction des nitrates : essai positif (toutes
<EMI ID=96.1>
Essai à la catalase : positif (toutes les souches)
<EMI ID=97.1>
les souches)
Do Utilisation de l'acide citrique : essai positif
(toutes les souches) <EMI ID=98.1>
souches)
<EMI ID=99.1>
l'acide mais pas de formation de gaz à partir du
<EMI ID=100.1>
(toutes les souches)
I. Température et pH pour la croissance :
<EMI ID=101.1>
Les essais ci-dessus ont été effectués selon "Laboratory Methods in Microbiology" (Méthodes de laboratoire en micro-biologie) de W.F. Harrigan et ses collaborateurs et selon
<EMI ID=102.1>
micro-biologiques) publié par American Bacteriological Association (Association bactériologique américaine)..
D'après les caractéristiques ci-dessus, les cinq souches choisies ont été identifiées selon la Sème édition
du "Manual of Determinative Bacteriology" (Manuel de détermina-
<EMI ID=103.1>
Bacillus stearothermophiluso
Ces cinq souches ont été encore purifiées par la métho-
<EMI ID=104.1>
des conditions d'isolement, de culture et de purification concernant les cinq souches choisies sont résumés au tableau 17,
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
<EMI ID=108.1>
Pour la production des alpha-amylases constituant les enzymes de la présente invention, on cultive dans un milieu nutritif connu pour la culture des bactéries thermophiles une souche d'un micro-organisme capable de produire une alpha-
<EMI ID=109.1>
che réussissant les essais du tableau III (par exemple les souches de Bacillus stearothermophilus N[deg.] ATCC 31 195,
<EMI ID=110.1>
de culture doit contenir une source de carbone et d'azote assimilables avec d'autres matières nutritives essentielles.
<EMI ID=111.1>
nent des hydrates de carbone comme des amidons ou fécules, des
<EMI ID=112.1>
<EMI ID=113.1>
La source de l'azote dans le milieu nutritif peut être de nature minérale et/ou organique. Des sources minérales
<EMI ID=114.1>
nitrates minéraux, etc. Des sources organiques convenables de l'azote comprennent de la peptone, de l'extrait de viande, de l'extrait d'enzyme, de la caséine, de la liqueur d'infusion de mais (extrait soluble de mais), de l'extrait de malt de la farine de soja, du lait écrémé, etc.
En outre, le milieu nutritif doit contenir les traces de substances usuelles fournissant des oligo-éléments comme les sels minéraux qui comprennent le chlorure de calcium, le sulfate de magnésium, les phosphates, le chlorure de sodium, le chlorure de potasium, etc.
Ces sources de carbone,ces sources d'azote et ces sels minéraux peuvent servir isolément ou en des combinaisons appropriées. En outre, on peut utiliser une faible quantité de sels métalliques, de vitamines, d'amino-acides, etc, pour favoriser <EMI ID=115.1>
la croissance et la productivité des 'bactéries.
Les conditions de culture servant à produire les alphaamylases constituant les enzymes de la présente invention sont les mêmes que les conditions servant normalement pour la culture des bactéries thermophiles. De préférence, on cultive la souche dans un milieu liquide profond de culture sous agitation et
<EMI ID=116.1>
I)* enzyme staccumule dans le milieu de culture.
<EMI ID=117.1>
invention, on sépare les cellules microbiennes par des moyens
<EMI ID=118.1>
Telles le filtrat à un relargage par addition de sels minéraux comme la sulfate d'ammonium, le sulfate de sodium ou le sulfate
<EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
double du volume du filtrat afin de précipiter l'enzyme. On dis-
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
(diéthylamino-éthyl-cellulose) qui a été mise en équilibre avec
<EMI ID=126.1>
pigments etc,, qui ne sont pas de l'alpha-amylase, ! sont adsor-
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1>
amylase est désigné ici comme étant "l'enzyme partiellement
<EMI ID=129.1>
encore être purifiée par dialyse .contre une solution tampon
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1> <EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
Après sa concentration, on fait passer l'enzyme partiellement purifiée ainsi obtenue dans une colonne de "Sephadex
<EMI ID=134.1>
en élue la fraction ayant une masse moléculaire inférieure à
10 000. L'activité de l'enzyme purifiée ou raffinée que l'on obtient de cette façon est augmentée de 100 fois par rapport au
<EMI ID=135.1>
on observe aussi des bandes de quelques autres protéines en plus de celles de l'enzyme alpha-amylase, et la cristallisation
<EMI ID=136.1>
Les exemples suivants servent à décrire plus complètement l'invention ainsi que les meilleurs modes de mise en oeuvre des divers aspects de cette invention On doit comprendre que ces exemples ne servent nullement à limiter le cadre de mais qu'ils sont plutôt présentés à titre illustra-
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
Exemole 1
On a ajusté à pH 7?0 un milieu de culture contenant- <EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
minutes à 120[deg.]C. Au milieu stérilisé, on inocule la souche
<EMI ID=141.1>
<EMI ID=142.1>
culture, on enlève par centrifugation les cellules microbiennes. 1* activité enzymatique du filtrat (déterminée par la
<EMI ID=143.1>
<EMI ID=144.1>
peur précipiter 1? enzyme que l'on a ensuite dissoute dans un
<EMI ID=145.1>
<EMI ID=146.1> et ont ainsi été enlevés. On a ainsi obtenu une enzyme partiel-. lement purifiée que l'on a tout d'abord concentrée et que l'on
a ensuite fait passer dans une colonne de "Sephadex G-150".
L'enzyme s'est faiblement fixée par sorption sur le "Sephadex" et on !la éluée dans la fraction correspondant à une masse moléculaire inférieure à 10 000. Par lyophilisation, on a transformé l'enzyme purifiée ainsi obtenue en une enzyme purifiée et
en poudre, et son activité relative était d'environ 200 unités
<EMI ID=147.1>
Exemple 2
On a ajusté à pH 7, 5 un milieu de culture contenant
<EMI ID=148.1>
re de potassium. On a placé une partie aliquote (50 ml) de ce
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1> <EMI ID=151.1> <EMI ID=152.1>
de 2-propanol représentant le double du volume du filtrat. Par
<EMI ID=153.1>
sèche" Inactivité de la poudre de l'enzyme brute a été de
<EMI ID=154.1>
brute, on a obtenu par purification effectuée par le mode opératoire de l'exemple 1 une enzyme en poudre purifiée ayant une activité de 230 unités par milligramme. -
On a soumis les cinq souches choisies et isolées (c'est-
<EMI ID=155.1>
la valeur moyenne de l'activité de crête dans le cas d'expériences effectuées en triple dans des ballons* La composition du milieu utilisé pour la pré-culture et pour la culture princi-
<EMI ID=156.1>
<EMI ID=157.1>
TABLEAU V
Effet de la température et du pH sur la production
de l'alpha-amylase
Activité (U/ml) (Temps de culture)
<EMI ID=158.1>
Il ressort du tableau V que les conditions optimal es
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
nais cette culture à température élevée n'a pas convenu pour produire une bonne activité d'alpha-amylase pour les autres
<EMI ID=163.1>
du milieu est de 8,0 pour la production de l'alpha-amylase par
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
<EMI ID=166.1>
utilisant des transferts répétés sur milieux inclinés (chaque souche a été transférée de façon répétée(9-11 fois) sur deux
<EMI ID=167.1> <EMI ID=168.1> chaque souche),
TABLEAU VI
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1>
<EMI ID=171.1>
Effet du volume moyen sur la production d'amylase
<EMI ID=172.1>
Par le mode opératoire décrit ci-après, on a purifié
<EMI ID=173.1>
<EMI ID=174.1>
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
On a précipité l'enzyme alpha-amylase des filtrais de
<EMI ID=177.1>
amylase "Thermamyl" (diluée 2 fois) en ajoutant deux volumes d'acétone froide. On a recueilli par centrifugation le préci-
<EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
à obtenir une suspension à 20 % d'amidon. On a chauffé cette
<EMI ID=180.1>
cipité par centrifugation. Puis l'on a dialyse la solution contre
<EMI ID=181.1>
<EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1> <EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
<EMI ID=186.1>
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
On a détermine la stabilité à l'acide et la thermostabilité des préparations- partiellement purifiées d'alpha-
<EMI ID=189.1>
60 minutes d'incubation dans les conditions suivantes :
<EMI ID=190.1>
<EMI ID=191.1>
<EMI ID=192.1>
de calcium (pH 4,5-6,0) contenant 0 à 5 moles d'acétate de calcium en 3 heures à 4[deg.]0, en changeant 2 fois le tampon. Puis l'on a mis 4 ml des produits de dialyse dans de petits tubes à essai et lion a fait incuber à la température désignée dans un bain-marie. On a rapidement refroidi les tubes dans un bain d'eau glacée et l'on a déterminé l'activité d'alpha-amylase résiduelle.
<EMI ID=193.1>
<EMI ID=194.1>
<EMI ID=195.1>
<EMI ID=196.1>
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
On a déterminé les activités d'alpha-amylase résiduelle
<EMI ID=199.1>
<EMI ID=200.1>
<EMI ID=201.1>
tes ci-dessus (sauf que l'on a fait varier le pH ou la tempéra-
<EMI ID=202.1>
pour les alpha-amylases provenant des souches ATCC
<EMI ID=203.1>
Les résultats des essais sont présentés aux figures 1 et 2
(figure 1 : abscisses : pH ; ordonnées : % d'activité résiduelle; <EMI ID=204.1> vité relative) pour l'alpha-amylase provenant de.la souche ATCC
<EMI ID=205.1>
<EMI ID=206.1>
<EMI ID=207.1> <EMI ID=208.1>
<EMI ID=209.1>
de 80[deg.]C pour l'alpha-amylase provenant de la souche ATCC
<EMI ID=210.1>
(courbe C). La relation entre l'activité enzymatique et la température de réaction est très semblable pour les alpha-amylases
<EMI ID=211.1>
<EMI ID=212.1>
On a trouvé que l'activité d'alpha-amylase de l'alpha-amylase "Thermamyl" a augmenté de 20 à 30 % lorsqu'on a fait incuber à
<EMI ID=213.1>
peut expliquer la différence de la relation entre l'activité enzymatique et la température de réaction entre les alpha-
<EMI ID=214.1>
<EMI ID=215.1>
<EMI ID=216.1>
<EMI ID=217.1>
<EMI ID=218.1>
<EMI ID=219.1>
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1>
<EMI ID=222.1>
provenant des souches ATCC N[deg.] 31 195 et ATCC N[deg.] 31 199.
La figure 4 (abscisses : temps d'incubation en minutes ; ordonnées : % d'activité résiduelle) montre les courbes d'inactivation des alpha-amylases provenant de la souche ATCC N[deg.] 31 195
(courbe A) et provenant de la souche ATCC N[deg.] 31 199 (courbe B), de l'alpha-amylase "Thermamyl" (courbe C) et de l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus décrites par Ogasawara et ses <EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
ditions d'incubation décrites Ogazawara et ses collaborateurs ont été les mêmes que celles utilisées dans le présent essai).
<EMI ID=225.1>
de la présente invention ont montré une thermostabilité bien plus <EMI ID=226.1>
te par Ogasawara (bien que les alpha-amylases de la présente invention qui ont été essayées appartiennent également à Bacillus stearothermophilus).
La figure 5 (abscisses ; temps d incubation, en minutes ; ordonnées : % d'activité résiduelle) montre les courbes d'inactivation des alpha-amylases de la souche ATCC N[deg.]31 195
(courbe A) , de la souche ATCC N[deg.] 31 199 (courbe B) et de l'alpha-amylase "Thermamyl" (courbe C) dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus pour la figure 4 (ctest-à-dire <EMI ID=227.1>
Les alpha-amylases de la présente invention ont encore montré une plus grande thermostabilité que l'alpha-amylase "Thermamyl", mais la différence n'a pas été aussi grande que dans le- cas où
<EMI ID=228.1>
<EMI ID=229.1>
<EMI ID=230.1>
<EMI ID=231.1>
<EMI ID=232.1>
<EMI ID=233.1>
courbes d'inactivation des alpha-amylases de la souche ATCC
<EMI ID=234.1>
<EMI ID=235.1>
incubation à 85[deg.]C et à un pH de 4,55 en présence de 22,5 % (en
<EMI ID=236.1>
<EMI ID=237.1>
<EMI ID=238.1>
ont montré une plus grande thermostabilité que l'alpha-amylase "Thermamyl" dans les conditions des figures 6 et 7. Puisque les
<EMI ID=239.1>
sont semblables à de nombreuses conditions industrielles de liquéfaction, on doit s'attendre à ce que les alpha-amylases de la présente invention montrent une plus grande thermostabilité
pour des valeurs acides du pH dans la liquéfaction industrielle
<EMI ID=240.1>
Des mesures effectuées par la méthode de Weber et
<EMI ID=241.1> phorèse sur disque SDS ont déterminé que les masses moléculaires
<EMI ID=242.1>
<EMI ID=243.1>
<EMI ID=244.1>
<EMI ID=245.1>
et du cytochrome C (N ; masse moléculaire 12 500). On a déterminé la position des alpha-amylases de la présente invention
<EMI ID=246.1>
que de gélose à l'amylose-azur et en faisant incuber à 37[deg.]C.
Les résultats de cet essai sont montrés à la figure 8 (abscisses : mobilité ; ordonnées : masse moléculaire (x 10 )).
La valeur de 96 000 pour la masse moléculaire des alpha-amylases de la présente invention est bien plus grande que les valeurs indiquées par Ogasawara et ses collaborateurs,
<EMI ID=247.1>
<EMI ID=248.1>
<EMI ID=249.1>
<EMI ID=250.1>
<EMI ID=251.1>
<EMI ID=252.1>
<EMI ID=253.1>
avec diverses matières protéiques présentes dans de nombreuses
<EMI ID=254.1>
de protéines comme des amino-acides. C'est pourquoi la présence de la protéase , comme enzyme constituant une impureté dans les enzymes du type alpha-amylase,nuit à l'hydrolyse efficace des matières amylacées. On a déterminé les activités de protéase des enzymes alpha-amylases produites à partir des cinq souches isolées en partant des produits de précipitation à l'acétone des filtrats de culture au stade du maximum de production
<EMI ID=255.1>
modifiée.
Les résultats obtenus ont été comparés avec ceux des préparations des enzymes alpha-amylase "Thermamyl" et une alphaamylase bactérienne CPC. Comme montré ci-après, "Thermamyl"
et les filtrats de culture dtactinomycètes thermophiles isolés ont contenu de grandes quantités de protéase.. Au contraire,
les souches de la présente invention, productrices d'une alpha-amylase thermostable, n'ont pas produit de quantité! importante de protéase.
Activité de protéase de l'alpha-amylase
<EMI ID=256.1>
<EMI ID=257.1>
L'exemple suivant illustre des alphaamylases^ enzymes de la présente invention, pour liquéfier de l'amidon lors de la production d'hydrolysats de l'amidon grande équivalence en dextrose.
On a mis 30 g de fécule de pomme de terre en suspension dans 60 ml d'eau, on a ajouté 75 mg de chlorure de calcium hydraté et l'on a ajusté le pH à 4,5. A cette suspension, on a ajouté 50 unités CPC de l'enzyme en poudre purifiée obtenue
à l'exemple 2 afin de liquéfier la fécule à 85[deg.]C durant 30 minutes. L'équivalence en dextrose de la solution liquéfiée a été d'environ 21 et le pH a été de 4,3. Lorsque la température a
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de Aspergillus niger, et l'on\a soumis la solution à une saccharification et une conversion à 60[deg.]C durant 48 heures. L'équivalence en dextrose de la solution saccharifiée et convertie a
<EMI ID=259.1>
Comme l'exemple précédent (exemple 3) le montre, l'alpha-amylase, 'enzyme selon la présente invention, hydrolyse et liquéfie l'amidon ou la fécule. On peut utiliser ces enzymes pour transformer de l'amidon soluble, de l'amylase, de l'amylopectine, du glycogène, etc, afin de diminuer de beaucoup la viscosité de ces substrats. Lorsque les enzymes de la présente invention réagissent avec de l'amidon soluble à pH 4,5 et à
60[deg.]C, la réaction de l'iodure d'amidon disparait à un taux d'hydrolyse (équivalence en dextrose) d'environ 15, et le taux final correspond à une équivalence en dextrose de 32 à 36. L'analyse des sucres du produit d'hydrolyse a montré la présence
<EMI ID=260.1>
oligo-saccharides ainsi que d'une faible quantité de glucose. On a trouvé que la mutarotation du produit sucré résultant était négative. Donc, les enzymes de la présente invention sent; des alpha-amylases, enzymes du type produisant une liquéfaction et qui hydrolysent librement les liaisons alpha-1,4 de l'amidon ou de la fécule
<EMI ID=261.1> invention ne perdent pas leur activité même si on les laisse durant 24 heures à la température ambiante à des pH compris entre 3 et 11.
<EMI ID=262.1>
<EMI ID=263.1>
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2952 (1961)).
La relation entre la liquéfaction (en valeur relative) opérée par les enzymes de la présente invention (courbe A") et la température opératoire est montrée à la figure 10, et elle contraste avec celle de l'alpha-amylase provenant de Bacillus stearothermophilus qui a été décrite par Ogasawara et ses collaborateurs (courbe D). Comme montré à la figure 10 (abscisses :
température en [deg.]C ; ordonnées : % d'activité relative), la température opératoire préférée pour les enzymes de la présente in-vention est voisine de 80[deg.]C.
Ainsi qu'il ressort de ce qui précède, les alphaamylases de la présente invention peuvent servir d'enzymes pour la liquéfaction et la transformation de conversion de l'amidon dans l'industrie de saccharification de l'amidon et de la fécule, dans un processus d'élimination de l'apprêt dans l'industrie textile et comme additifs dans des formulations détergentes, de façon semblable aux utilisations classiques des alphaamylases (enzymes bactériennes).
Les alpha-amylases de la présente invention sont des enzymes convenant particulièrement bien pour la liquéfaction
et la conversion de transformation de l'amidon et de la fécule pour la production des malto-dextrines, la production subséquente du dextrose utilisant de la gluco-amylase puisque l'iso� mérisation du groupe terminal des molécules peut être évitée car l'on peut efficacement utiliser l'enzyme 8. un pH acide
<EMI ID=265.1>
l'aide de l'enzyme gluco-amylase.
<EMI ID=266.1>
constituant les enzymes de la présente invention, on utilise l'enzyme pour transformer l'amidon ou la fécule en un hydrolysat d'amidon ou de férule dans lequel l'amidon résiduel non transformé ou la fécule résiduelle non transformée reste sous forme granulaire., Ces procédés sont décrits dans les brevets des Etats-
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<EMI ID=268.1>
ratoires appliqués à de l'amidon granulaire, on effectue au moins la solubilisation initiale de la matière amylacée en opérant à des températures relativement basses, c'est-à-dire audessous de la température de gélatinisation initiale de l'amidon ou de la fécule jusqu'à la température de gélatinisation initiale de l'amidon ou de la fécule. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de ces procédés, on utilise la gluco-amylase comme enzyme avec l'enzyme alpha-amylase dans le stade de la solubilisation initiale. Les enzymes de la présente invention conviennent par-ticulièrement bien pour ce procédé, car leur intervalle de pH optimal est compatible avec celui de la gluco-amylase.
Dans un autre mode préféré d'utilisation des alphaamylases., enzymes de la présente invention, on peut utiliser les procédés décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique
<EMI ID=269.1>
Dans un autre mode préféré encore d'utilisation des alpha-amylases, enzymes de la présente invention, on peut appliquer le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique
<EMI ID=270.1>
de la présente invention, dans le procédé décrit dans le brevet
<EMI ID=271.1>
d'amidon, comme de l'amidon de mais comportant au moins 25 % en poids de matières amylacées, par l'enzyme alpha-amylase à une
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minutes et de préférence durant 5 à 10 minutes, pour liquéfier
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remarquable de l'application de ce programme de température avec les alpha-amylases, enzymes de la présente invention, rési-
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<EMI ID=278.1>
L'utilisation des alpha-amylases, enzymes de la présente invention, que l'on préfère le plus pour transformer la fécule ou l'amidon consiste à soumettre une suspension d'amidon
<EMI ID=279.1>
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<EMI ID=281.1>
<EMI ID=282.1>
<EMI ID=283.1>
qu'à une température se situant entre environ 85[deg.]0 et environ
<EMI ID=284.1>
l'amidon. Après la soluoilisation initiale (comme dans l'hydrolyse de l'amidon granulaire) ou après la liquéfaction, on soumet de préférence la suspension à un traitement de "choc thermique" à une température supérieure à 100[deg.]C et se situant de préférence entre environ 110[deg.]C et environ 150[deg.]C pour liquéfier les granules de l'amidon ou de la fécule restant éventuellement. On refroidit ensuite la suspension de l'amidon liquéfié et l'on traite de préférence par un supplément d'alpha-amylase, isolément ou en combinaison avec d'autres enzymes comme de la glucoamylase, de la bêta-amylase, de la pulluanase, de la glucoseisomérase, successivement ou en combinaison. Si l'on utilise
de l'alpha-amylase seule dans le second stade d'application d'une enzyme la température se situera de préférence entre en-
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qui est la température optimale pour les enzymes de la présente invention-. Si d'autres enzymes sont présentes, comme de la gluco-
<EMI ID=286.1>
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<EMI ID=288.1>
On peut indiquer en conclusion que les alpha-amylases, enzymes de la présente invention, peuvent nettement se différencier des alpha-amylases de l'art antérieur obtenues à partir d'animaux, de plantes, de levures, de champignons imparfaits
et de moisissures, du fait que ces enzymes de l'art antérieur ont une stabilité thermique si faible qu'elles perdent complè-
<EMI ID=289.1>
pH 6,0. Lorsqu'on compare la stabilité thermique des alpha-
<EMI ID=290.1>
<EMI ID=291.1> vention, ont une stabilité à l'acide et une stabilité thermique bien supérieure à celles des alpha-amylases de l'art antérieur, Il ressort également de la figure 12 que les alpha-amylases, enzymes de la présente invention, se caractérisent comme pouvant
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environ de leur activité initiale lorsqu'on les maintient durant
<EMI ID=293.1>
d'ions calcium, et que ces enzymes peuvent conserver au moins
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<EMI ID=295.1>
Il ressort de la figure 11 (abscisses : temps d'incubation,
en minutes ; ordonnées : % d'activité relative) que les alphaamylases de la présente invention (courbe A") se caractérisent encore par le fait qu'elles sont capables de conserver au moins
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<EMI ID=299.1>
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Le tableau IX montre la relation entre les alphaamylases) enzymes de la présente invention, *. les alphaamylases, enzymes provenant de Bacillus subtilus et de Bacillus
<EMI ID=301.1>
les enzymes provenant de Bacillus stearothermophilus et qui
ont été décrites dans la littérature. La comparaison porte sur le pH opératoire optimal, la température opératoire appropriée et la masse moléculaire. Les figures 11 et 12 permettent de comparer la stabilité thermique et la stabilité à l'acide.
TABLEAU IX
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<EMI ID=304.1>
<EMI ID=305.1>
<EMI ID=306.1>
(5) le brevet britannique indique que la masse moléculaire de
<EMI ID=307.1>
et la masse moléculaire de l'alpha-amylase de B.subtilis est de 96 000,
Lorsqu'on compare les alpha-amylases, enzymes de la
<EMI ID=308.1>
de Bacillus subtilisa on voit que ces deux enzymes sont remarquablement différentes, ainsi qu'il ressort nettement des figures 9 et 11, par leur pH opératoire optimal., leur température opératoire appropriée, leur masse moléculaire et leur stabilité à chaud et en présence des acides. Cela indique que l'enzyme de la présente invention est tout-à-fait différent de l'alphaamylase provenant de Bacillus subtilis.
Lorsqu'on compare les alpha-amylases, enzymes de la présente invention, et les alpha-amylases.. enzymes provenant de Bacillus licheniformis, elles sont remarquablement différentes par leur pH opératoire optimal, leur masse moléculaire, leur stabilité à chaud et leur stabilité à l'acide, comme on le voit
<EMI ID=309.1>
<EMI ID=310.1>
<EMI ID=311.1> amylases, enzymes de la présente invention, à l'action d'agents mutagènes connus en utilisant les techniques connues, comme la lumière ultra-violette, un traitement chimique etc. Donc, la présente invention envisage des alpha-amylases, enzymes produi-
<EMI ID=312.1>
<EMI ID=313.1>
et des sous-mutants de ces variants et mutants.
Comme certaines des autres alpha-amylases connues, les enzymes de la présente invention sont inhibées par le mercure et par EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) . mais
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<EMI ID=315.1>
titre illustratif, mais non limitatif, et qu'elle est sucepti-
<EMI ID=316.1>
dans son esprit.
REVENDICATIONS
<EMI ID=317.1>
cette enzyme étant caractérisée en ce que (a) elle est capable de conserver au moins 70 % environ de son activité dtalphaamylase initiale lorsqu'on la maintient durant 10 minutes à
90[deg.]C et à un pH de 6,0 sans addition de l'ion calcium ; (b)
<EMI ID=318.1>
vité d'alpha-amylase initiale lorsqu'on la maintient durant
60 minutes à 90[deg.]C à un pH de 6,0 sans addition de l'ion calcium;
et (c) elle peut conserver au moins 50 % environ de son activité d'alpha-amylase initiale lorsqu'on la maintient durant 10
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<EMI ID=320.1>