"Alpha-amylases , enzymes stables à chaud et en milieu acide,
leur procédé d'obtention et leur application" <EMI ID=1.1>
amylases qui sont des enzymes stables à la chaleur et aux acides, ainsi que des procédés pour la production de ces enzymes.
<EMI ID=2.1>
ces nouvelles alpha-amylases comme enzymes pour l'hydrolyse,
la liquéfaction et/ou la transformation de matières amylacées en des hydrolysats de l'amidon.(ou de la fécule).
Des préparations d'enzymes du type de l'alpha-amylase ont servi à hydrolyser, à liquéfier et/ou à transformer des matières amylacées en des hydrolysats de l'amidon ; elles ont également servi dans des formulations détergentes. Lorsqu'on utilise des alpha-amylases comme enzymes de traitement de matières amylacées, on les utilise comme stade initial pour la pro-
<EMI ID=3.1>
par hydrolyse de l'amidon comme des malto-dextrines, des sirops de glucose, du dextrose, du lévulose, du maltose etc. L'enzyme du type alpha-amylase hydrolyse les molécules de l'amidon pour les décomposer en divers fragments à masse moléculaire interné-
<EMI ID=4.1>
afin de pouvoir obtenir le produit final voulu. En variante,
<EMI ID=5.1>
<EMI ID=6.1>
produire directement le produit voulu dthydrolyse de l'amidon.
<EMI ID=7.1>
nir à partir de sources très diverses. La plupart des alphaamylases sont des enzymes produites à partir de sources bactériennes comme Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus etc, qui sont cultivés dans un milieu de culture approprié ; puis les cellules ainsi obtenues sont détruites et la préparation de l'enzyme est ensuite séparée du bouillon et purifiée.
De nombreuses alpha-amylases disponibles à l'échelle commerciale sont des enzymes actuellement produites à partir
des micro-organismes de Bacillus subtilis. Lorsque ces enzymes servent à transformer l'amidon en des hydrolysats d'amidon, elles auront généralement une température optimale se situant entre 7
<EMI ID=8.1>
tions de température et de pH nécessaires pour une utilisation efficace de l'enzyme présentent deux inconvénients. En premier lieu, si l'amidon est transformé avec l'enzyme à un pH d'envii ron 6 et à une température d'environ 80[deg.] à environ 85 [deg.]C, il y a isomérisation d'une partie des groupes terminaux réducteurs de l'amidon et, dans le processus subséquent de transformation, il y a production de maltulose qui diminue le degré d'obtention du produit voulu, par exemple du dextrose, du levulose ou du
<EMI ID=9.1>
que l'on utilise pour le processus de transformation et de saccharification est généralement d'environ 4,5 dans le cas des enzymes provenant de micro-organismes du type Aspergillus
<EMI ID=10.1>
nant de micro-organismes de type Rhizopus. Donc, après l'achèvement du stade de la liquéfaction à l'aide de l'enzyme alphaamylase, il a été nécessaire d'ajuster le pH et de le faire
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
et, par conséquente il augmente la charge et, par suite, les frais de purification et de raffinage lorsqu'on utilise les résines d'échanges d'ions servant à la purification lu produit final.
Au cours des récentes années, on a mis au point diverses alpha-amylases qui sont des enzymes stables à chaud. Des exemples de telles alpha-amylases stables à chaud comprennent les enzymes produites à partir de micro-organismes provenant de Bacillus stearothermophilis, comme décrit par Ogasawera et
<EMI ID=13.1>
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
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bonne stabilité thermique dans des solutions neutres ou faiblement alcalines ont été rendues disponibles. Ces alpha-amylases stables à la chaleur et en milieu alcalin sont des enzymes qui ont été vendues sous la marque "Thermamyl". On les produit en cultivant des micro-organismes de l'espèce Bacillus licheni-
<EMI ID=17.1>
par Madsen et ses collaborateurs, Die Starke, 2�, 304, 305 et <EMI ID=18.1>
que les alpha-amylases produites à partir de Bacillus licheniformis ont une stabilité à chaud relativement bonne dans des solutions neutres et faiblement alcalines, ces enzymes n'ont pas, dans des conditions acides, une stabilité qui peut rendre leur utilisation économique d'un point de vue industriel.
Donc, un but principal de la présente invention consiste à produire des alpha-amylases qui sont des enzymes ayant une bonne stabilité à chaud ainsi qu'une bonne stabilité dans des conditions acides, en particulier à des valeurs du pH permettant de rendre leur utilisation possible dans des conditions compatibles avec celles nécessaires pour d'autres amylases comme la gluco-amylase.
La présente invention vise de nouvelles alpha-amylases qui sont des enzymes stables à chaud et en milieu acide et qui se caractérisent par le fait que : (1) elles sont capables de
<EMI ID=19.1>
initiale lorsqu'on les maintient à 90[deg.]C et à un pH de 6,0
- durant 10 minutes sans addition de l'ion calcium ; (2) elles <EMI ID=20.1>
<EMI ID=21.1>
<EMI ID=22.1>
et (3) elles sont capables de conserver au moins 50 % environ
<EMI ID=23.1>
<EMI ID=24.1>
durant 10 minutes. Les enzymes de l'invention peuvent également conserver au moins 50 % environ de leur activité initiale à une température de 85[deg.]C et à un pH de 4,55 en présence de 5 mmoles de l'ion calcium et de 22,5 % en poids d'amidon (sur base sèche). Les enzymes de la présente invention se caractérisent en outre
<EMI ID=25.1>
environ de leur- activité initiale d'alpha-amylase à la tempéra-
<EMI ID=26.1>
Ces enzymes proviennent de préférence d'un micro-organisme du
<EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1> 7 et elles se caractérisent par le fait qu'elles ne présentent essentiellement pas d'activité de protéase. ; par exemple, elles ont généralement un rapport entre leur activité de protéase et leur activité d'alpha-amylase inférieur à 3 et de préférence un rapport inférieur à 1.
On produit les nouvelles alpha-amylases de la présente invention en cultivant dans un milieu convenable un micro-
<EMI ID=29.1>
cultivant une souche choisie parmi le groupe consistant en Bacillus stearaothermophilus ATCC N[deg.] 31 195, N[deg.] 31 196,
N[deg.] 31 197, N[deg.] 31 198, N[deg.] 31 199, leurs variants, leurs mutants et leurs sous-mutants, et en extrayant ensuite l'enzyme alphaamylase produite.
L'invention sera décrite plus en détail dans la suite du présent exposé, en regard des figures annexées où :
La figure 1 (abscisses : pH ; ordonnées : % d'activité résiduelle) illustre la relation entre le pH optimal de deux <EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
amylase "Thermamyl" (courbe C) ; La figure 2 (abscisses : température, en degré C ; or- <EMI ID=32.1>
température optimale de deux des enzymes de l'invention (A :
enzyme provenant de Bacillus stearothermophilus ATCC N[deg.] 31 195 ;
<EMI ID=33.1>
N[deg.] 31 199) avec la température optimale pour l'alpha-amylase "Thermamyl" (C) ; La figure 3 (abscisses durée de l'incubation, en minutes ; ordonnées : % dtactivité résiduelle) illustre la relation entre la thermostabilité de deux des enzymes de l'invention
(A : enzyme provenant de ATCC N[deg.] 31 195 ; B : enzyme provenant <EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1> La figure 4 (abscisses : durée de l'incubation, en <EMI ID=36.1>
tion entre la thermostabilité de deux des enzymes de la présente
<EMI ID=37.1> indique la thermostabilité de l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus citée par Ogazawara et ses collaborateurs) ; La figure 5 (abscisses : temps d'incubation en minutes ; ordonnées : % d'activité résiduelle) compare la thermostabilité <EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
la thermostabilité de l'alpha-amylase "Thermamyl" (C) à 90[deg.]C
<EMI ID=40.1> La figure 6 (abscisses : temps d'incubation en minutes ordonnées : % d'activité résiduelle) illustre la relation entre la thermostabilité de deux des enzymes de la présente invention
(A : enzyme provenant de ATCC N[deg.] 31 195 ; B : enzyme provenant de ATCC N[deg.] 31 199) avec la thermostabilité de "Thermamyl" (C) <EMI ID=41.1>
base sèche) ; <EMI ID=42.1>
tes ordonnées : % d'activité résiduelle) illustre la relation
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1> <EMI ID=46.1> La figure 8 (abscisses : mobilité de 0 à 1 ,0 ; or- <EMI ID=47.1>
la détermination de la masse moléculaire de deux enzymes de
<EMI ID=48.1>
<EMI ID=49.1>
on indique les résultats obtenus pour une albumine (K), de
<EMI ID=50.1>
(N).
La figure 9 (abscisses : pH ; ordonnées : % d'activité relative) illustre la relation entre le pH et l'activité d'enzymes pour l'une des enzymes de l'invention (A") et pour des alphaamylases de ltart antérieur provenant de Bacillus stearothermophilus (D : alpha-amylase citée par Ogazawera dans J. Bio. Chem.
<EMI ID=51.1>
collaborateurs dans J. Biol. Chem. 236, 2952 (1961)) ; <EMI ID=52.1> <EMI ID=53.1> température pour une enzyme de la présente invention (AU) avec une alpha-amylase de l'art antérieur provenant de Bacillus stearothermophilus (D, citée par Ogazawera et ses collaborateurs) ; La figure 11 (abscisses : temps d'incubation, en minutes ; ordonnées : % d'activité relative) montre les courbes de désactivation d'une alpha-amylase de la présente invention
(A") et d'alpha-amylases de l'art antérieur provenant de Bacillus licheniformis ("Thermamyl" ;
C) et provenant de Bacillus subtilis (E) lorsqu'on opère à 80[deg.]C et à un pH de 4,5 en présen- <EMI ID=54.1> La figure 12 (abscisses : temps d'incubation en minutes ; ordonnées : % d'activité relative) montre les courbes de désactivation d'une enzyme de la présente invention (A") et d'alpha-amylases de l'art antérieur provenant de Bacillus licheniformis ("Thermamyl" ; C) et de Bacillus stearothermo- <EMI ID=55.1>
qu'on opère à 90[deg.]C et à un pH de 6,0 sans ion calcium.
La production et la stabilité thermique de 1' alphaamylase provenant de divers genres de micro-organismes ont été étudiées dans diverses conditions comme la température de croissance (37[deg.]C ; 45[deg.]C ; 55[deg.]C et 70[deg.]C), le pH (5,0 et 7,0) et les milieux de culture. Il a été trouvé que des champignons thermo-
<EMI ID=56.1>
produisent avec des rendements élevés de l'alpha-amylase thermolabile, alors que des bactéries thermophiles produisent à 70[deg.]0 avec de faibles rendements en' 'alpha-amylase thermostable. En
se fondant sur ces études initiales, le dépistage des microorganismes capables de produire de l'alpha-amylase stable aux acides et présentant de la stabilité thermique a été conduit par culture à 55[deg.]C et à 70[deg.]C.
On a collecté de divers endroits 550 échantillons au total de sources microbiennes comprenant du sol, de l'eau de sour-
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
calcium.
<EMI ID=60.1>
amylase :
On a préparé chaque semaine comme suit une solution à 0,2 % d'amidon soluble : on a chauffé 200 mg d'amidon soluble dans 50 ml environ d'un tampon à 0,2 M d'acétate (pH 4,5) conte-
<EMI ID=61.1>
et l'on'a complété la solution résultante à 100 ml en lui ajoutant le même tampon. On a fait incuber durant 5 minutes à 60[deg.]0 le
tube contenant 0,1 ml de la solution d'enzyme et 0,3 ml de la solution à 0,2 % dtamidon soluble. On a arrêté la réaction en ajoutant 1,0 ml d'acide acétique 0,5 N. Après avoir ajouté
3,0 ml d'une solution à 0,015 % d'iode et avoir agité, on a lu
<EMI ID=62.1>
enzyme a servi de témoin à blanc et l'on a désigné sa densité
<EMI ID=63.1>
quantité qui catalyse une diminution de 10 % de la valeur du bleu par minute dans les conditions décrites ci-dessus :
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
On détermine par le mode opératoire suivant les unités CPC d'activité de l'alpha-amylase :
On ajoute 1 ml d'une solution d'enzyme diluée de façon
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
tue la réaction durant 10 minutes à 60[deg.]C. On met 1 ml de la solution de réaction dans un ballon gradué de 100 ml contenant
50 ml d'acide chlorhydrique 0,02 N et, après avoir ajouté 3 ml d'une solution à 0,05 � d'iode, on complète le volume total à
100 ml par addition dteau. On mesure la couleur 'bleue.qui se développe pour déterminer le coefficient d'absorption à 620 millimicrons. La quantité d'enzyme nécessaire pour décomposer 10 mg d'amidon en une minute se définit comme étant une unité CPC :
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
te de l'eau au lieu de la solution de l'enzyme) ;
D : coefficient d'absorption de la solution de réaction.
Le tableau I résume les conditions et les milieux que l'on utilise pour la culture dans ltessai de dépistage ou de sélection.
Le tableau II indique les résultats de la première et de la seconde étude de dépistage et de sélection.
<EMI ID=72.1>
Conditions et milieux de culture
Conditions
Culture sur plaque(1) Culture inclinée(2) Culture en flacons
(3)
<EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
Environ 25 des champignons actinomycètes thermo-
<EMI ID=76.1>
usitée d'alpha-amylases par ml de bouillon de culture, mais il n'est resté aucune activité après le traitement thermique
<EMI ID=77.1>
Un total de 35 souches sur 1 061 souches bactériennes
<EMI ID=78.1>
100 à 1 000 unités d'alpha-amylase, et 10 de ces souches ont produit de l'alpha-amylase thermostable. Presque toutes les alpha-amylases provenant de bactéries thermophiles isolées
<EMI ID=79.1>
thermique. On a obtenu les plus forts producteurs parmi des
<EMI ID=80.1>
On a examiné la relation entre l'activité et la dimension de la sone nette dans les 219 dernières souches isolées
<EMI ID=81.1>
Relations antre ?.* activité et la dimension de
<EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
<EMI ID=84.1> lente méthode pour choisir des micro-organismes capables de produire avec des rendements élevés des alpha-amylases qui sont des enzymes stables aux acides et thermostables.
Par suite de ce dépistage de sélection, on a choisi 5 souches constituant les plus forts producteurs dtune alphaamylase qui soit une enzyme stable aux acides et thermostablés,
Sous la forme purifiée comme décrit ci-après, chacune des 5 souches a été déposée à la collection permanente dite "the. American Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 (Etats-Unis d'Amérique). ATCC entretient ces souches selon un contrat passé entre ATCC
<EMI ID=85.1> Le contrat entre ATCC et CPC International, Inc., prévoit la disponibilité permanente des cultures ou des sous-cultures pour le public, sans restriction après la publication ou la mise à l'Inspection Publique de n'importe quelle demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique ou d'un pays autre que les Etats-Unis d'Amérique, décrivant et identifiant les dépôts en cause et indiquant les numéros ATCC qui leur ont été attribués. CPC International Inc. a donné son accord pour que, si l'une quelconque de ces cultures en dépôt mourait ou était détruite au cours de la durée du brevet, cette culture soit remplacée par une culture vivante du même micro-organisme.
.7 Micro-organismes déposés
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
déposées à l'Institut de Recherches sur les fermentations,
<EMI ID=88.1>
Voici les caractéristiques bactériologiques des cinq souches choisies et qui ont été déposées à ATCC :
(1) Caractéristiques morphologiques :
<EMI ID=89.1>
bâtonnets individuels rarement en chaînes (toutes les souches)
<EMI ID=90.1>
sporange en forme de raquette (toutes souches)
<EMI ID=91.1>
?. Résistance l'acide : négative (toutes les souches)
(2) Croissance sur divers milieux :
<EMI ID=92.1>
s'étalent avec une surface grossière et un bord rugueux (toutes les souches)
Culture inclinée sur gélose nutritive : bonne croissance, blanc opaque, étalement actif, excroissances en forme de peignes (toutes les souches)
C. Culture en bouillon.nutritif liquide : brun transparent ; surface blanche mate (toutes les souches) D. Culture en profondeur dans de la gélatine nutritive :
liquéfaction (toutes les souches)
E. Plaque de gélose et de gélatine nutritive : grande
zone nette (toutes les souches)
F. culture en milieu liquide nutritif avec des sels :
<EMI ID=93.1> sel (toutes les souches)
<EMI ID=94.1>
muqueuse par hydrolyse de la caséine (toutes les souches)
<EMI ID=95.1>
croissance ; colonies semblables à celles obtenues sur de la gélose nutritive (toutes les souches)
I. Culture inclinée sur gélose avec protéose-peptone :
pas de croissance (toutes les souches)
(3) Caractéristiques physiologiques :
A. Réduction des nitrates : essai positif (toutes
<EMI ID=96.1>
Essai à la catalase : positif (toutes les souches)
<EMI ID=97.1>
les souches)
Do Utilisation de l'acide citrique : essai positif
(toutes les souches) <EMI ID=98.1>
souches)
<EMI ID=99.1>
l'acide mais pas de formation de gaz à partir du
<EMI ID=100.1>
(toutes les souches)
I. Température et pH pour la croissance :
<EMI ID=101.1>
Les essais ci-dessus ont été effectués selon "Laboratory Methods in Microbiology" (Méthodes de laboratoire en micro-biologie) de W.F. Harrigan et ses collaborateurs et selon
<EMI ID=102.1>
micro-biologiques) publié par American Bacteriological Association (Association bactériologique américaine)..
D'après les caractéristiques ci-dessus, les cinq souches choisies ont été identifiées selon la Sème édition
du "Manual of Determinative Bacteriology" (Manuel de détermina-
<EMI ID=103.1>
Bacillus stearothermophiluso
Ces cinq souches ont été encore purifiées par la métho-
<EMI ID=104.1>
des conditions d'isolement, de culture et de purification concernant les cinq souches choisies sont résumés au tableau 17,
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
<EMI ID=108.1>
Pour la production des alpha-amylases constituant les enzymes de la présente invention, on cultive dans un milieu nutritif connu pour la culture des bactéries thermophiles une souche d'un micro-organisme capable de produire une alpha-
<EMI ID=109.1>
che réussissant les essais du tableau III (par exemple les souches de Bacillus stearothermophilus N[deg.] ATCC 31 195,
<EMI ID=110.1>
de culture doit contenir une source de carbone et d'azote assimilables avec d'autres matières nutritives essentielles.
<EMI ID=111.1>
nent des hydrates de carbone comme des amidons ou fécules, des
<EMI ID=112.1>
<EMI ID=113.1>
La source de l'azote dans le milieu nutritif peut être de nature minérale et/ou organique. Des sources minérales
<EMI ID=114.1>
nitrates minéraux, etc. Des sources organiques convenables de l'azote comprennent de la peptone, de l'extrait de viande, de l'extrait d'enzyme, de la caséine, de la liqueur d'infusion de mais (extrait soluble de mais), de l'extrait de malt de la farine de soja, du lait écrémé, etc.
En outre, le milieu nutritif doit contenir les traces de substances usuelles fournissant des oligo-éléments comme les sels minéraux qui comprennent le chlorure de calcium, le sulfate de magnésium, les phosphates, le chlorure de sodium, le chlorure de potasium, etc.
Ces sources de carbone,ces sources d'azote et ces sels minéraux peuvent servir isolément ou en des combinaisons appropriées. En outre, on peut utiliser une faible quantité de sels métalliques, de vitamines, d'amino-acides, etc, pour favoriser <EMI ID=115.1>
la croissance et la productivité des 'bactéries.
Les conditions de culture servant à produire les alphaamylases constituant les enzymes de la présente invention sont les mêmes que les conditions servant normalement pour la culture des bactéries thermophiles. De préférence, on cultive la souche dans un milieu liquide profond de culture sous agitation et
<EMI ID=116.1>
I)* enzyme staccumule dans le milieu de culture.
<EMI ID=117.1>
invention, on sépare les cellules microbiennes par des moyens
<EMI ID=118.1>
Telles le filtrat à un relargage par addition de sels minéraux comme la sulfate d'ammonium, le sulfate de sodium ou le sulfate
<EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
double du volume du filtrat afin de précipiter l'enzyme. On dis-
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
(diéthylamino-éthyl-cellulose) qui a été mise en équilibre avec
<EMI ID=126.1>
pigments etc,, qui ne sont pas de l'alpha-amylase, ! sont adsor-
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1>
amylase est désigné ici comme étant "l'enzyme partiellement
<EMI ID=129.1>
encore être purifiée par dialyse .contre une solution tampon
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1> <EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
Après sa concentration, on fait passer l'enzyme partiellement purifiée ainsi obtenue dans une colonne de "Sephadex
<EMI ID=134.1>
en élue la fraction ayant une masse moléculaire inférieure à
10 000. L'activité de l'enzyme purifiée ou raffinée que l'on obtient de cette façon est augmentée de 100 fois par rapport au
<EMI ID=135.1>
on observe aussi des bandes de quelques autres protéines en plus de celles de l'enzyme alpha-amylase, et la cristallisation
<EMI ID=136.1>
Les exemples suivants servent à décrire plus complètement l'invention ainsi que les meilleurs modes de mise en oeuvre des divers aspects de cette invention On doit comprendre que ces exemples ne servent nullement à limiter le cadre de mais qu'ils sont plutôt présentés à titre illustra-
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
Exemole 1
On a ajusté à pH 7?0 un milieu de culture contenant- <EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
minutes à 120[deg.]C. Au milieu stérilisé, on inocule la souche
<EMI ID=141.1>
<EMI ID=142.1>
culture, on enlève par centrifugation les cellules microbiennes. 1* activité enzymatique du filtrat (déterminée par la
<EMI ID=143.1>
<EMI ID=144.1>
peur précipiter 1? enzyme que l'on a ensuite dissoute dans un
<EMI ID=145.1>
<EMI ID=146.1> et ont ainsi été enlevés. On a ainsi obtenu une enzyme partiel-. lement purifiée que l'on a tout d'abord concentrée et que l'on
a ensuite fait passer dans une colonne de "Sephadex G-150".
L'enzyme s'est faiblement fixée par sorption sur le "Sephadex" et on !la éluée dans la fraction correspondant à une masse moléculaire inférieure à 10 000. Par lyophilisation, on a transformé l'enzyme purifiée ainsi obtenue en une enzyme purifiée et
en poudre, et son activité relative était d'environ 200 unités
<EMI ID=147.1>
Exemple 2
On a ajusté à pH 7, 5 un milieu de culture contenant
<EMI ID=148.1>
re de potassium. On a placé une partie aliquote (50 ml) de ce
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1> <EMI ID=151.1> <EMI ID=152.1>
de 2-propanol représentant le double du volume du filtrat. Par
<EMI ID=153.1>
sèche" Inactivité de la poudre de l'enzyme brute a été de
<EMI ID=154.1>
brute, on a obtenu par purification effectuée par le mode opératoire de l'exemple 1 une enzyme en poudre purifiée ayant une activité de 230 unités par milligramme. -
On a soumis les cinq souches choisies et isolées (c'est-
<EMI ID=155.1>
la valeur moyenne de l'activité de crête dans le cas d'expériences effectuées en triple dans des ballons* La composition du milieu utilisé pour la pré-culture et pour la culture princi-
<EMI ID=156.1>
<EMI ID=157.1>
TABLEAU V
Effet de la température et du pH sur la production
de l'alpha-amylase
Activité (U/ml) (Temps de culture)
<EMI ID=158.1>
Il ressort du tableau V que les conditions optimal es
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
nais cette culture à température élevée n'a pas convenu pour produire une bonne activité d'alpha-amylase pour les autres
<EMI ID=163.1>
du milieu est de 8,0 pour la production de l'alpha-amylase par
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
<EMI ID=166.1>
utilisant des transferts répétés sur milieux inclinés (chaque souche a été transférée de façon répétée(9-11 fois) sur deux
<EMI ID=167.1> <EMI ID=168.1> chaque souche),
TABLEAU VI
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1>
<EMI ID=171.1>
Effet du volume moyen sur la production d'amylase
<EMI ID=172.1>
Par le mode opératoire décrit ci-après, on a purifié
<EMI ID=173.1>
<EMI ID=174.1>
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
On a précipité l'enzyme alpha-amylase des filtrais de
<EMI ID=177.1>
amylase "Thermamyl" (diluée 2 fois) en ajoutant deux volumes d'acétone froide. On a recueilli par centrifugation le préci-
<EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
à obtenir une suspension à 20 % d'amidon. On a chauffé cette
<EMI ID=180.1>
cipité par centrifugation. Puis l'on a dialyse la solution contre
<EMI ID=181.1>
<EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1> <EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
<EMI ID=186.1>
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
On a détermine la stabilité à l'acide et la thermostabilité des préparations- partiellement purifiées d'alpha-
<EMI ID=189.1>
60 minutes d'incubation dans les conditions suivantes :
<EMI ID=190.1>
<EMI ID=191.1>
<EMI ID=192.1>
de calcium (pH 4,5-6,0) contenant 0 à 5 moles d'acétate de calcium en 3 heures à 4[deg.]0, en changeant 2 fois le tampon. Puis l'on a mis 4 ml des produits de dialyse dans de petits tubes à essai et lion a fait incuber à la température désignée dans un bain-marie. On a rapidement refroidi les tubes dans un bain d'eau glacée et l'on a déterminé l'activité d'alpha-amylase résiduelle.
<EMI ID=193.1>
<EMI ID=194.1>
<EMI ID=195.1>
<EMI ID=196.1>
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
On a déterminé les activités d'alpha-amylase résiduelle
<EMI ID=199.1>
<EMI ID=200.1>
<EMI ID=201.1>
tes ci-dessus (sauf que l'on a fait varier le pH ou la tempéra-
<EMI ID=202.1>
pour les alpha-amylases provenant des souches ATCC
<EMI ID=203.1>
Les résultats des essais sont présentés aux figures 1 et 2
(figure 1 : abscisses : pH ; ordonnées : % d'activité résiduelle; <EMI ID=204.1> vité relative) pour l'alpha-amylase provenant de.la souche ATCC
<EMI ID=205.1>
<EMI ID=206.1>
<EMI ID=207.1> <EMI ID=208.1>
<EMI ID=209.1>
de 80[deg.]C pour l'alpha-amylase provenant de la souche ATCC
<EMI ID=210.1>
(courbe C). La relation entre l'activité enzymatique et la température de réaction est très semblable pour les alpha-amylases
<EMI ID=211.1>
<EMI ID=212.1>
On a trouvé que l'activité d'alpha-amylase de l'alpha-amylase "Thermamyl" a augmenté de 20 à 30 % lorsqu'on a fait incuber à
<EMI ID=213.1>
peut expliquer la différence de la relation entre l'activité enzymatique et la température de réaction entre les alpha-
<EMI ID=214.1>
<EMI ID=215.1>
<EMI ID=216.1>
<EMI ID=217.1>
<EMI ID=218.1>
<EMI ID=219.1>
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1>
<EMI ID=222.1>
provenant des souches ATCC N[deg.] 31 195 et ATCC N[deg.] 31 199.
La figure 4 (abscisses : temps d'incubation en minutes ; ordonnées : % d'activité résiduelle) montre les courbes d'inactivation des alpha-amylases provenant de la souche ATCC N[deg.] 31 195
(courbe A) et provenant de la souche ATCC N[deg.] 31 199 (courbe B), de l'alpha-amylase "Thermamyl" (courbe C) et de l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus décrites par Ogasawara et ses <EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
ditions d'incubation décrites Ogazawara et ses collaborateurs ont été les mêmes que celles utilisées dans le présent essai).
<EMI ID=225.1>
de la présente invention ont montré une thermostabilité bien plus <EMI ID=226.1>
te par Ogasawara (bien que les alpha-amylases de la présente invention qui ont été essayées appartiennent également à Bacillus stearothermophilus).
La figure 5 (abscisses ; temps d incubation, en minutes ; ordonnées : % d'activité résiduelle) montre les courbes d'inactivation des alpha-amylases de la souche ATCC N[deg.]31 195
(courbe A) , de la souche ATCC N[deg.] 31 199 (courbe B) et de l'alpha-amylase "Thermamyl" (courbe C) dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus pour la figure 4 (ctest-à-dire <EMI ID=227.1>
Les alpha-amylases de la présente invention ont encore montré une plus grande thermostabilité que l'alpha-amylase "Thermamyl", mais la différence n'a pas été aussi grande que dans le- cas où
<EMI ID=228.1>
<EMI ID=229.1>
<EMI ID=230.1>
<EMI ID=231.1>
<EMI ID=232.1>
<EMI ID=233.1>
courbes d'inactivation des alpha-amylases de la souche ATCC
<EMI ID=234.1>
<EMI ID=235.1>
incubation à 85[deg.]C et à un pH de 4,55 en présence de 22,5 % (en
<EMI ID=236.1>
<EMI ID=237.1>
<EMI ID=238.1>
ont montré une plus grande thermostabilité que l'alpha-amylase "Thermamyl" dans les conditions des figures 6 et 7. Puisque les
<EMI ID=239.1>
sont semblables à de nombreuses conditions industrielles de liquéfaction, on doit s'attendre à ce que les alpha-amylases de la présente invention montrent une plus grande thermostabilité
pour des valeurs acides du pH dans la liquéfaction industrielle
<EMI ID=240.1>
Des mesures effectuées par la méthode de Weber et
<EMI ID=241.1> phorèse sur disque SDS ont déterminé que les masses moléculaires
<EMI ID=242.1>
<EMI ID=243.1>
<EMI ID=244.1>
<EMI ID=245.1>
et du cytochrome C (N ; masse moléculaire 12 500). On a déterminé la position des alpha-amylases de la présente invention
<EMI ID=246.1>
que de gélose à l'amylose-azur et en faisant incuber à 37[deg.]C.
Les résultats de cet essai sont montrés à la figure 8 (abscisses : mobilité ; ordonnées : masse moléculaire (x 10 )).
La valeur de 96 000 pour la masse moléculaire des alpha-amylases de la présente invention est bien plus grande que les valeurs indiquées par Ogasawara et ses collaborateurs,
<EMI ID=247.1>
<EMI ID=248.1>
<EMI ID=249.1>
<EMI ID=250.1>
<EMI ID=251.1>
<EMI ID=252.1>
<EMI ID=253.1>
avec diverses matières protéiques présentes dans de nombreuses
<EMI ID=254.1>
de protéines comme des amino-acides. C'est pourquoi la présence de la protéase , comme enzyme constituant une impureté dans les enzymes du type alpha-amylase,nuit à l'hydrolyse efficace des matières amylacées. On a déterminé les activités de protéase des enzymes alpha-amylases produites à partir des cinq souches isolées en partant des produits de précipitation à l'acétone des filtrats de culture au stade du maximum de production
<EMI ID=255.1>
modifiée.
Les résultats obtenus ont été comparés avec ceux des préparations des enzymes alpha-amylase "Thermamyl" et une alphaamylase bactérienne CPC. Comme montré ci-après, "Thermamyl"
et les filtrats de culture dtactinomycètes thermophiles isolés ont contenu de grandes quantités de protéase.. Au contraire,
les souches de la présente invention, productrices d'une alpha-amylase thermostable, n'ont pas produit de quantité! importante de protéase.
Activité de protéase de l'alpha-amylase
<EMI ID=256.1>
<EMI ID=257.1>
L'exemple suivant illustre des alphaamylases^ enzymes de la présente invention, pour liquéfier de l'amidon lors de la production d'hydrolysats de l'amidon grande équivalence en dextrose.
On a mis 30 g de fécule de pomme de terre en suspension dans 60 ml d'eau, on a ajouté 75 mg de chlorure de calcium hydraté et l'on a ajusté le pH à 4,5. A cette suspension, on a ajouté 50 unités CPC de l'enzyme en poudre purifiée obtenue
à l'exemple 2 afin de liquéfier la fécule à 85[deg.]C durant 30 minutes. L'équivalence en dextrose de la solution liquéfiée a été d'environ 21 et le pH a été de 4,3. Lorsque la température a
<EMI ID=258.1>
de Aspergillus niger, et l'on\a soumis la solution à une saccharification et une conversion à 60[deg.]C durant 48 heures. L'équivalence en dextrose de la solution saccharifiée et convertie a
<EMI ID=259.1>
Comme l'exemple précédent (exemple 3) le montre, l'alpha-amylase, 'enzyme selon la présente invention, hydrolyse et liquéfie l'amidon ou la fécule. On peut utiliser ces enzymes pour transformer de l'amidon soluble, de l'amylase, de l'amylopectine, du glycogène, etc, afin de diminuer de beaucoup la viscosité de ces substrats. Lorsque les enzymes de la présente invention réagissent avec de l'amidon soluble à pH 4,5 et à
60[deg.]C, la réaction de l'iodure d'amidon disparait à un taux d'hydrolyse (équivalence en dextrose) d'environ 15, et le taux final correspond à une équivalence en dextrose de 32 à 36. L'analyse des sucres du produit d'hydrolyse a montré la présence
<EMI ID=260.1>
oligo-saccharides ainsi que d'une faible quantité de glucose. On a trouvé que la mutarotation du produit sucré résultant était négative. Donc, les enzymes de la présente invention sent; des alpha-amylases, enzymes du type produisant une liquéfaction et qui hydrolysent librement les liaisons alpha-1,4 de l'amidon ou de la fécule
<EMI ID=261.1> invention ne perdent pas leur activité même si on les laisse durant 24 heures à la température ambiante à des pH compris entre 3 et 11.
<EMI ID=262.1>
<EMI ID=263.1>
<EMI ID=264.1>
2952 (1961)).
La relation entre la liquéfaction (en valeur relative) opérée par les enzymes de la présente invention (courbe A") et la température opératoire est montrée à la figure 10, et elle contraste avec celle de l'alpha-amylase provenant de Bacillus stearothermophilus qui a été décrite par Ogasawara et ses collaborateurs (courbe D). Comme montré à la figure 10 (abscisses :
température en [deg.]C ; ordonnées : % d'activité relative), la température opératoire préférée pour les enzymes de la présente in-vention est voisine de 80[deg.]C.
Ainsi qu'il ressort de ce qui précède, les alphaamylases de la présente invention peuvent servir d'enzymes pour la liquéfaction et la transformation de conversion de l'amidon dans l'industrie de saccharification de l'amidon et de la fécule, dans un processus d'élimination de l'apprêt dans l'industrie textile et comme additifs dans des formulations détergentes, de façon semblable aux utilisations classiques des alphaamylases (enzymes bactériennes).
Les alpha-amylases de la présente invention sont des enzymes convenant particulièrement bien pour la liquéfaction
et la conversion de transformation de l'amidon et de la fécule pour la production des malto-dextrines, la production subséquente du dextrose utilisant de la gluco-amylase puisque l'iso� mérisation du groupe terminal des molécules peut être évitée car l'on peut efficacement utiliser l'enzyme 8. un pH acide
<EMI ID=265.1>
l'aide de l'enzyme gluco-amylase.
<EMI ID=266.1>
constituant les enzymes de la présente invention, on utilise l'enzyme pour transformer l'amidon ou la fécule en un hydrolysat d'amidon ou de férule dans lequel l'amidon résiduel non transformé ou la fécule résiduelle non transformée reste sous forme granulaire., Ces procédés sont décrits dans les brevets des Etats-
<EMI ID=267.1>
<EMI ID=268.1>
ratoires appliqués à de l'amidon granulaire, on effectue au moins la solubilisation initiale de la matière amylacée en opérant à des températures relativement basses, c'est-à-dire audessous de la température de gélatinisation initiale de l'amidon ou de la fécule jusqu'à la température de gélatinisation initiale de l'amidon ou de la fécule. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de ces procédés, on utilise la gluco-amylase comme enzyme avec l'enzyme alpha-amylase dans le stade de la solubilisation initiale. Les enzymes de la présente invention conviennent par-ticulièrement bien pour ce procédé, car leur intervalle de pH optimal est compatible avec celui de la gluco-amylase.
Dans un autre mode préféré d'utilisation des alphaamylases., enzymes de la présente invention, on peut utiliser les procédés décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique
<EMI ID=269.1>
Dans un autre mode préféré encore d'utilisation des alpha-amylases, enzymes de la présente invention, on peut appliquer le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique
<EMI ID=270.1>
de la présente invention, dans le procédé décrit dans le brevet
<EMI ID=271.1>
d'amidon, comme de l'amidon de mais comportant au moins 25 % en poids de matières amylacées, par l'enzyme alpha-amylase à une
<EMI ID=272.1>
<EMI ID=273.1>
minutes et de préférence durant 5 à 10 minutes, pour liquéfier
<EMI ID=274.1>
<EMI ID=275.1>
remarquable de l'application de ce programme de température avec les alpha-amylases, enzymes de la présente invention, rési-
<EMI ID=276.1>
<EMI ID=277.1>
<EMI ID=278.1>
L'utilisation des alpha-amylases, enzymes de la présente invention, que l'on préfère le plus pour transformer la fécule ou l'amidon consiste à soumettre une suspension d'amidon
<EMI ID=279.1>
<EMI ID=280.1>
<EMI ID=281.1>
<EMI ID=282.1>
<EMI ID=283.1>
qu'à une température se situant entre environ 85[deg.]0 et environ
<EMI ID=284.1>
l'amidon. Après la soluoilisation initiale (comme dans l'hydrolyse de l'amidon granulaire) ou après la liquéfaction, on soumet de préférence la suspension à un traitement de "choc thermique" à une température supérieure à 100[deg.]C et se situant de préférence entre environ 110[deg.]C et environ 150[deg.]C pour liquéfier les granules de l'amidon ou de la fécule restant éventuellement. On refroidit ensuite la suspension de l'amidon liquéfié et l'on traite de préférence par un supplément d'alpha-amylase, isolément ou en combinaison avec d'autres enzymes comme de la glucoamylase, de la bêta-amylase, de la pulluanase, de la glucoseisomérase, successivement ou en combinaison. Si l'on utilise
de l'alpha-amylase seule dans le second stade d'application d'une enzyme la température se situera de préférence entre en-
<EMI ID=285.1>
qui est la température optimale pour les enzymes de la présente invention-. Si d'autres enzymes sont présentes, comme de la gluco-
<EMI ID=286.1>
<EMI ID=287.1>
<EMI ID=288.1>
On peut indiquer en conclusion que les alpha-amylases, enzymes de la présente invention, peuvent nettement se différencier des alpha-amylases de l'art antérieur obtenues à partir d'animaux, de plantes, de levures, de champignons imparfaits
et de moisissures, du fait que ces enzymes de l'art antérieur ont une stabilité thermique si faible qu'elles perdent complè-
<EMI ID=289.1>
pH 6,0. Lorsqu'on compare la stabilité thermique des alpha-
<EMI ID=290.1>
<EMI ID=291.1> vention, ont une stabilité à l'acide et une stabilité thermique bien supérieure à celles des alpha-amylases de l'art antérieur, Il ressort également de la figure 12 que les alpha-amylases, enzymes de la présente invention, se caractérisent comme pouvant
<EMI ID=292.1>
environ de leur activité initiale lorsqu'on les maintient durant
<EMI ID=293.1>
d'ions calcium, et que ces enzymes peuvent conserver au moins
<EMI ID=294.1>
<EMI ID=295.1>
Il ressort de la figure 11 (abscisses : temps d'incubation,
en minutes ; ordonnées : % d'activité relative) que les alphaamylases de la présente invention (courbe A") se caractérisent encore par le fait qu'elles sont capables de conserver au moins
<EMI ID=296.1>
<EMI ID=297.1>
<EMI ID=298.1>
<EMI ID=299.1>
<EMI ID=300.1>
Le tableau IX montre la relation entre les alphaamylases) enzymes de la présente invention, *. les alphaamylases, enzymes provenant de Bacillus subtilus et de Bacillus
<EMI ID=301.1>
les enzymes provenant de Bacillus stearothermophilus et qui
ont été décrites dans la littérature. La comparaison porte sur le pH opératoire optimal, la température opératoire appropriée et la masse moléculaire. Les figures 11 et 12 permettent de comparer la stabilité thermique et la stabilité à l'acide.
TABLEAU IX
<EMI ID=302.1>
<EMI ID=303.1>
<EMI ID=304.1>
<EMI ID=305.1>
<EMI ID=306.1>
(5) le brevet britannique indique que la masse moléculaire de
<EMI ID=307.1>
et la masse moléculaire de l'alpha-amylase de B.subtilis est de 96 000,
Lorsqu'on compare les alpha-amylases, enzymes de la
<EMI ID=308.1>
de Bacillus subtilisa on voit que ces deux enzymes sont remarquablement différentes, ainsi qu'il ressort nettement des figures 9 et 11, par leur pH opératoire optimal., leur température opératoire appropriée, leur masse moléculaire et leur stabilité à chaud et en présence des acides. Cela indique que l'enzyme de la présente invention est tout-à-fait différent de l'alphaamylase provenant de Bacillus subtilis.
Lorsqu'on compare les alpha-amylases, enzymes de la présente invention, et les alpha-amylases.. enzymes provenant de Bacillus licheniformis, elles sont remarquablement différentes par leur pH opératoire optimal, leur masse moléculaire, leur stabilité à chaud et leur stabilité à l'acide, comme on le voit
<EMI ID=309.1>
<EMI ID=310.1>
<EMI ID=311.1> amylases, enzymes de la présente invention, à l'action d'agents mutagènes connus en utilisant les techniques connues, comme la lumière ultra-violette, un traitement chimique etc. Donc, la présente invention envisage des alpha-amylases, enzymes produi-
<EMI ID=312.1>
<EMI ID=313.1>
et des sous-mutants de ces variants et mutants.
Comme certaines des autres alpha-amylases connues, les enzymes de la présente invention sont inhibées par le mercure et par EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) . mais
<EMI ID=314.1>
<EMI ID=315.1>
titre illustratif, mais non limitatif, et qu'elle est sucepti-
<EMI ID=316.1>
dans son esprit.
REVENDICATIONS
<EMI ID=317.1>
cette enzyme étant caractérisée en ce que (a) elle est capable de conserver au moins 70 % environ de son activité dtalphaamylase initiale lorsqu'on la maintient durant 10 minutes à
90[deg.]C et à un pH de 6,0 sans addition de l'ion calcium ; (b)
<EMI ID=318.1>
vité d'alpha-amylase initiale lorsqu'on la maintient durant
60 minutes à 90[deg.]C à un pH de 6,0 sans addition de l'ion calcium;
et (c) elle peut conserver au moins 50 % environ de son activité d'alpha-amylase initiale lorsqu'on la maintient durant 10
<EMI ID=319.1>
<EMI ID=320.1>
"Alpha-amylases, enzymes stable in heat and in an acidic environment,
their method of obtaining and their application "<EMI ID = 1.1>
amylases which are heat and acid stable enzymes, as well as processes for the production of these enzymes.
<EMI ID = 2.1>
these new alpha-amylases as enzymes for hydrolysis,
the liquefaction and / or transformation of starchy materials into starch hydrolysates (or starch).
Alpha-amylase-type enzyme preparations have been used to hydrolyze, liquefy and / or transform starchy materials to starch hydrolysates; they have also been used in detergent formulations. When alpha-amylases are used as enzymes for processing starchy materials, they are used as the initial stage for the production.
<EMI ID = 3.1>
by hydrolysis of starch such as maltodextrins, glucose syrups, dextrose, levulose, maltose etc. The alpha-amylase enzyme hydrolyzes molecules in starch to break them down into various fragments with internal molecular mass.
<EMI ID = 4.1>
in order to be able to obtain the desired end product. Alternatively,
<EMI ID = 5.1>
<EMI ID = 6.1>
to directly produce the desired product of starch hydrolysis.
<EMI ID = 7.1>
nir from a wide variety of sources. Most alphaamylases are enzymes produced from bacterial sources like Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus etc, which are grown in a suitable culture medium; then the cells thus obtained are destroyed and the preparation of the enzyme is then separated from the broth and purified.
Many commercially available alpha-amylases are enzymes currently produced from
microorganisms of Bacillus subtilis. When these enzymes are used to transform starch into starch hydrolysates, they will usually have an optimum temperature of between 7
<EMI ID = 8.1>
The temperature and pH levels required for efficient use of the enzyme have two drawbacks. First, if the starch is transformed with the enzyme at a pH of about 6 and a temperature of about 80 [deg.] To about 85 [deg.] C, there is isomerization of a part of the reducing end groups of starch and in the subsequent transformation process there is production of maltulose which decreases the degree to which the desired product is obtained, for example dextrose, levulose or
<EMI ID = 9.1>
that is used for the transformation and saccharification process is generally about 4.5 in the case of enzymes from microorganisms of the Aspergillus type
<EMI ID = 10.1>
nant of Rhizopus-type microorganisms. So after the completion of the liquefaction stage with the help of alphaamylase enzyme, it was necessary to adjust the pH and make it
<EMI ID = 11.1>
<EMI ID = 12.1>
and, therefore, it increases the load and hence the cost of purification and refining when using ion exchange resins for purification of the final product.
In recent years, various alpha-amylases have been developed which are heat stable enzymes. Examples of such heat stable alpha-amylases include enzymes produced from microorganisms from Bacillus stearothermophilis, as described by Ogasawera et al.
<EMI ID = 13.1>
<EMI ID = 14.1>
<EMI ID = 15.1>
<EMI ID = 16.1>
good thermal stability in neutral or weakly alkaline solutions have been made available. These alpha-amylases which are stable in heat and in an alkaline medium are enzymes which have been sold under the brand name "Thermamyl". They are produced by culturing microorganisms of the species Bacillus licheni-
<EMI ID = 17.1>
by Madsen et al, Die Starke, 2 �, 304, 305 and <EMI ID = 18.1>
that the alpha-amylases produced from Bacillus licheniformis have relatively good heat stability in neutral and weakly alkaline solutions, these enzymes do not have, under acidic conditions, a stability which can make their use economic in a point industrial perspective.
Therefore, a main object of the present invention is to produce alpha-amylases which are enzymes having good heat stability as well as good stability under acidic conditions, in particular at pH values which make their use possible. under conditions compatible with those necessary for other amylases such as gluco-amylase.
The present invention relates to novel alpha-amylases which are enzymes which are stable in heat and in an acidic medium and which are characterized by the fact that: (1) they are capable of
<EMI ID = 19.1>
initial when maintained at 90 [deg.] C and pH 6.0
- for 10 minutes without adding the calcium ion; (2) they <EMI ID = 20.1>
<EMI ID = 21.1>
<EMI ID = 22.1>
and (3) they are able to retain at least about 50%
<EMI ID = 23.1>
<EMI ID = 24.1>
for 10 minutes. The enzymes of the invention can also retain at least approximately 50% of their initial activity at a temperature of 85 [deg.] C and at a pH of 4.55 in the presence of 5 mmol of the calcium ion and of 22, 5% by weight of starch (on a dry basis). The enzymes of the present invention are further characterized
<EMI ID = 25.1>
approximately their initial alpha-amylase activity at temperature
<EMI ID = 26.1>
These enzymes are preferably obtained from a microorganism of the
<EMI ID = 27.1>
<EMI ID = 28.1> 7 and they are characterized by having essentially no protease activity. ; for example, they generally have a ratio between their protease activity and their alpha-amylase activity of less than 3 and preferably a ratio of less than 1.
The novel alpha-amylases of the present invention are produced by culturing in a suitable medium a micro-
<EMI ID = 29.1>
cultivating a strain selected from the group consisting of Bacillus stearaothermophilus ATCC N [deg.] 31 195, N [deg.] 31 196,
N [deg.] 31,197, N [deg.] 31,198, N [deg.] 31,199, their variants, their mutants and their sub-mutants, and then extracting the alphaamylase enzyme produced.
The invention will be described in more detail in the remainder of this presentation, with reference to the appended figures in which:
Figure 1 (abscissa: pH; ordinate:% residual activity) illustrates the relationship between the optimal pH of two <EMI ID = 30.1>
<EMI ID = 31.1>
"Thermamyl" amylase (curve C); Figure 2 (abscissa: temperature, in degrees C; or- <EMI ID = 32.1>
optimum temperature of two of the enzymes of the invention (A:
enzyme from Bacillus stearothermophilus ATCC N [deg.] 31,195;
<EMI ID = 33.1>
N [deg.] 31 199) with the optimum temperature for the alpha-amylase "Thermamyl" (C); Figure 3 (abscissa, incubation time, in minutes; ordinate:% residual activity) illustrates the relationship between the thermostability of two of the enzymes of the invention
(A: enzyme from ATCC N [deg.] 31 195; B: enzyme from <EMI ID = 34.1>
<EMI ID = 35.1> Figure 4 (abscissa: duration of incubation, in <EMI ID = 36.1>
tion between the thermostability of two of the enzymes of this
<EMI ID = 37.1> indicates the thermostability of Bacillus stearothermophilus alpha-amylase cited by Ogazawara et al); Figure 5 (abscissa: incubation time in minutes; ordinate:% residual activity) compares the thermostability <EMI ID = 38.1>
<EMI ID = 39.1>
the thermostability of the alpha-amylase "Thermamyl" (C) at 90 [deg.] C
<EMI ID = 40.1> Figure 6 (abscissa: incubation time in ordered minutes:% residual activity) illustrates the relationship between the thermostability of two of the enzymes of the present invention
(A: enzyme from ATCC N [deg.] 31 195; B: enzyme from ATCC N [deg.] 31 199) with the thermostability of "Thermamyl" (C) <EMI ID = 41.1>
dry base); <EMI ID = 42.1>
your ordinates:% of residual activity) illustrates the relation
<EMI ID = 43.1>
<EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1> <EMI ID = 46.1> Figure 8 (abscissa: mobility from 0 to 1, 0; or- <EMI ID = 47.1>
determination of the molecular mass of two enzymes of
<EMI ID = 48.1>
<EMI ID = 49.1>
we indicate the results obtained for an albumin (K), of
<EMI ID = 50.1>
(NOT).
FIG. 9 (abscissa: pH; ordinate:% relative activity) illustrates the relationship between the pH and the activity of enzymes for one of the enzymes of the invention (A ") and for alphaamylases of the prior art from Bacillus stearothermophilus (D: alpha-amylase cited by Ogazawera in J. Bio. Chem.
<EMI ID = 51.1>
collaborators in J. Biol. Chem. 236, 2952 (1961)); <EMI ID = 52.1> <EMI ID = 53.1> temperature for an enzyme of the present invention (AU) with a prior art alpha-amylase from Bacillus stearothermophilus (D, cited by Ogazawera et al); Figure 11 (abscissa: incubation time, in minutes; ordinate:% relative activity) shows the deactivation curves of an alpha-amylase of the present invention
(A ") and prior art alpha-amylases from Bacillus licheniformis (" Thermamyl ";
C) and originating from Bacillus subtilis (E) when the operation is carried out at 80 [deg.] C and at a pH of 4.5 in present <EMI ID = 54.1> Figure 12 (abscissa: incubation time in minutes ; ordinate:% relative activity) shows the curves of deactivation of an enzyme of the present invention (A ") and of alpha-amylases of the prior art from Bacillus licheniformis (" Thermamyl "; C) and of Bacillus stearothermo- <EMI ID = 55.1>
that is carried out at 90 [deg.] C and at a pH of 6.0 without calcium ion.
The production and thermal stability of alphaamylase from various kinds of microorganisms have been studied under various conditions such as growth temperature (37 [deg.] C; 45 [deg.] C; 55 [deg.] C and 70 [deg.] C), pH (5.0 and 7.0) and culture media. It has been found that thermo-
<EMI ID = 56.1>
produce heat-labile alpha-amylase in high yields, while thermophilic bacteria produce at 70 [deg.] 0 with low yields of thermostable alpha-amylase. In
Based on these initial studies, detection of microorganisms capable of producing acid-stable alpha-amylase exhibiting thermal stability was carried out by culturing at 55 [deg.] C and 70 [deg.] C.
A total of 550 samples were collected from various locations of microbial sources including soil, spring water,
<EMI ID = 57.1>
<EMI ID = 58.1>
<EMI ID = 59.1>
calcium.
<EMI ID = 60.1>
amylase:
A 0.2% soluble starch solution was prepared weekly as follows: 200 mg of soluble starch was heated in about 50 ml of 0.2 M acetate buffer (pH 4.5) tale-
<EMI ID = 61.1>
and the resulting solution was made up to 100 ml by adding the same buffer thereto. Incubated for 5 minutes at 60 [deg.] 0.
tube containing 0.1 ml of the enzyme solution and 0.3 ml of the 0.2% solution of soluble starch. The reaction was stopped by adding 1.0 ml of 0.5N acetic acid. After adding
3.0 ml of a 0.015% iodine solution and having stirred, it was read
<EMI ID = 62.1>
enzyme was used as a blank control and its density was designated
<EMI ID = 63.1>
amount which catalyzes a 10% decrease in the blue value per minute under the conditions described above:
<EMI ID = 64.1>
<EMI ID = 65.1>
<EMI ID = 66.1>
<EMI ID = 67.1>
The procedure according to the CPC units of alpha-amylase activity is determined by the procedure:
1 ml of an enzyme solution diluted so
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
kills reaction for 10 minutes at 60 [deg.] C. 1 ml of the reaction solution is placed in a 100 ml graduated flask containing
50 ml of 0.02 N hydrochloric acid and, after adding 3 ml of a 0.05 solution of iodine, the total volume is made up to
100 ml by addition of water. The developing blue color is measured to determine the absorption coefficient at 620 millimicrons. The amount of enzyme required to break down 10 mg of starch in one minute is defined as a CPC unit:
<EMI ID = 70.1>
<EMI ID = 71.1>
te water instead of the enzyme solution);
D: absorption coefficient of the reaction solution.
Table I summarizes the conditions and media used for cultivation in the screening or selection assay.
Table II shows the results of the first and second screening and selection studies.
<EMI ID = 72.1>
Culture conditions and media
Conditions
Plate culture (1) Slant culture (2) Culture in flasks
(3)
<EMI ID = 73.1>
<EMI ID = 74.1>
<EMI ID = 75.1>
About 25 of the thermo- actinomycete fungi
<EMI ID = 76.1>
used alpha-amylases per ml of culture broth, but no activity remained after heat treatment
<EMI ID = 77.1>
A total of 35 strains out of 1061 bacterial strains
<EMI ID = 78.1>
100 to 1000 units of alpha-amylase, and 10 of these strains produced thermostable alpha-amylase. Almost all alpha-amylases from isolated thermophilic bacteria
<EMI ID = 79.1>
thermal. We obtained the strongest producers among
<EMI ID = 80.1>
The relationship between activity and net sone size was examined in the last 219 strains isolated.
<EMI ID = 81.1>
Relationship between?. * Activity and dimension of
<EMI ID = 82.1>
<EMI ID = 83.1>
<EMI ID = 84.1> slow method for selecting microorganisms capable of producing in high yields alpha-amylases which are acid-stable and thermostable enzymes.
As a result of this selective screening, we chose 5 strains constituting the strongest producers of an alphaamylase which is an enzyme stable to acids and heat-stable,
In the form purified as described below, each of the 5 strains was deposited in the permanent collection known as "the. American Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 (United States of America. ). ATCC maintains these strains under a contract between ATCC
<EMI ID = 85.1> The contract between ATCC and CPC International, Inc., provides for the permanent availability of crops or subcultures to the public, without restriction after publication or release for Public Inspection of any patent application from the United States of America or a country other than the United States of America, describing and identifying the deposits in question and indicating the ATCC numbers which have been assigned to them. CPC International Inc. has agreed that if any of these cultures on deposit die or are destroyed during the term of the patent, that culture be replaced with a living culture of the same microorganism.
.7 Deposited microorganisms
<EMI ID = 86.1>
<EMI ID = 87.1>
deposited at the Institute for Research on Fermentations,
<EMI ID = 88.1>
Here are the bacteriological characteristics of the five strains chosen and which were deposited at ATCC:
(1) Morphological characteristics:
<EMI ID = 89.1>
individual rods rarely in chains (all strains)
<EMI ID = 90.1>
racket-shaped sporangium (all strains)
<EMI ID = 91.1>
?. Acid resistance: negative (all strains)
(2) Growth in various media:
<EMI ID = 92.1>
spread out with a coarse surface and rough edge (all stumps)
Slant culture on nutrient agar: good growth, opaque white, active spread, comb-shaped growths (all strains)
C. Culture in liquid nutrient broth: transparent brown; matt white surface (all strains) D. Deep culture in nutrient gelatin:
liquefaction (all strains)
E. Nutrient Agar and Gelatin Plate: Large
net area (all strains)
F. culture in liquid nutrient medium with salts:
<EMI ID = 93.1> salt (all strains)
<EMI ID = 94.1>
mucosa by hydrolysis of casein (all strains)
<EMI ID = 95.1>
growth; colonies similar to those obtained on nutrient agar (all strains)
I. Slant culture on agar with proteose-peptone:
no growth (all strains)
(3) Physiological characteristics:
A. Reduction of nitrates: positive test (all
<EMI ID = 96.1>
Catalase test: positive (all strains)
<EMI ID = 97.1>
strains)
Do Use of citric acid: positive test
(all strains) <EMI ID = 98.1>
strains)
<EMI ID = 99.1>
acid but no gas formation from the
<EMI ID = 100.1>
(all strains)
I. Temperature and pH for growth:
<EMI ID = 101.1>
The above tests were carried out according to "Laboratory Methods in Microbiology" by W.F. Harrigan et al. And according to
<EMI ID = 102.1>
micro-biologicals) published by the American Bacteriological Association.
From the above characteristics, the five selected strains were identified according to the 5th edition
of the "Manual of Determinative Bacteriology"
<EMI ID = 103.1>
Bacillus stearothermophiluso
These five strains were further purified by the method
<EMI ID = 104.1>
isolation, culture and purification conditions for the five selected strains are summarized in Table 17,
<EMI ID = 105.1>
<EMI ID = 106.1>
<EMI ID = 107.1>
<EMI ID = 108.1>
For the production of the alpha-amylases constituting the enzymes of the present invention, a strain of a microorganism capable of producing an alpha- is cultivated in a nutrient medium known for the culture of thermophilic bacteria.
<EMI ID = 109.1>
che passing the tests in Table III (for example the strains of Bacillus stearothermophilus N [deg.] ATCC 31 195,
<EMI ID = 110.1>
crop must contain a source of carbon and nitrogen that can be assimilated with other essential nutrients.
<EMI ID = 111.1>
nent carbohydrates such as starches, starches,
<EMI ID = 112.1>
<EMI ID = 113.1>
The source of nitrogen in the nutrient medium can be mineral and / or organic in nature. Mineral springs
<EMI ID = 114.1>
mineral nitrates, etc. Suitable organic sources of nitrogen include peptone, meat extract, enzyme extract, casein, corn infusion liquor (soluble corn extract), corn infusion liquor. malt extract from soy flour, skim milk, etc.
In addition, the nutrient medium must contain traces of usual substances providing trace elements such as mineral salts which include calcium chloride, magnesium sulfate, phosphates, sodium chloride, potassium chloride, etc.
These carbon sources, nitrogen sources and mineral salts can be used singly or in suitable combinations. In addition, a small amount of metal salts, vitamins, amino acids, etc. can be used to promote <EMI ID = 115.1>
the growth and productivity of bacteria.
The culture conditions used to produce the alphaamylases constituting the enzymes of the present invention are the same as the conditions normally used for the culture of thermophilic bacteria. Preferably, the strain is cultivated in a deep liquid culture medium with shaking and
<EMI ID = 116.1>
I) * enzyme accumulates in the culture medium.
<EMI ID = 117.1>
invention, the microbial cells are separated by means
<EMI ID = 118.1>
Such as the filtrate to a salting out by addition of mineral salts such as ammonium sulphate, sodium sulphate or sulphate
<EMI ID = 119.1>
<EMI ID = 120.1>
<EMI ID = 121.1>
<EMI ID = 122.1>
double the volume of the filtrate in order to precipitate the enzyme. We say-
<EMI ID = 123.1>
<EMI ID = 124.1>
<EMI ID = 125.1>
(diethylamino-ethyl-cellulose) which has been brought into equilibrium with
<EMI ID = 126.1>
pigments etc ,, which are not alpha-amylase,! are adsor-
<EMI ID = 127.1>
<EMI ID = 128.1>
amylase is referred to herein as "the enzyme partially
<EMI ID = 129.1>
further be purified by dialysis against a buffer solution
<EMI ID = 130.1>
<EMI ID = 131.1> <EMI ID = 132.1>
<EMI ID = 133.1>
After its concentration, the partially purified enzyme thus obtained is passed through a column of "Sephadex
<EMI ID = 134.1>
the fraction having a molecular mass less than
10,000. The activity of the purified or refined enzyme obtained in this way is increased by 100-fold over the
<EMI ID = 135.1>
there are also bands of a few other proteins in addition to those of the alpha-amylase enzyme, and crystallization
<EMI ID = 136.1>
The following examples serve to more fully describe the invention as well as the best modes for carrying out the various aspects of this invention. It should be understood that these examples are not intended to limit the scope of, but rather are presented for illustrative purposes. -
<EMI ID = 137.1>
<EMI ID = 138.1>
Exemole 1
A culture medium containing- <EMI ID = 139.1> was adjusted to pH 7.0
<EMI ID = 140.1>
minutes at 120 [deg.] C. In the sterilized medium, the strain is inoculated
<EMI ID = 141.1>
<EMI ID = 142.1>
culture, the microbial cells are removed by centrifugation. 1 * enzymatic activity of the filtrate (determined by the
<EMI ID = 143.1>
<EMI ID = 144.1>
afraid to rush 1? enzyme which was then dissolved in a
<EMI ID = 145.1>
<EMI ID = 146.1> and have thus been removed. There was thus obtained a partial enzyme. purified that we first concentrated and that we
then passed through a column of "Sephadex G-150".
The enzyme was weakly sorbed on "Sephadex" and eluted in the fraction corresponding to a molecular weight less than 10,000. By lyophilization, the purified enzyme thus obtained was transformed into a purified enzyme and
powder, and its relative activity was about 200 units
<EMI ID = 147.1>
Example 2
A culture medium containing
<EMI ID = 148.1>
potassium re. An aliquot (50 ml) of this was placed
<EMI ID = 149.1>
<EMI ID = 150.1> <EMI ID = 151.1> <EMI ID = 152.1>
of 2-propanol representing twice the volume of the filtrate. By
<EMI ID = 153.1>
dry "Inactivity of the crude enzyme powder was
<EMI ID = 154.1>
crude, a purified powdered enzyme having an activity of 230 units per milligram was obtained by purification carried out by the procedure of Example 1. -
The five strains selected and isolated were submitted (i.e.
<EMI ID = 155.1>
the mean value of the peak activity in the case of experiments carried out in triplicate in flasks * The composition of the medium used for the pre-culture and for the main culture
<EMI ID = 156.1>
<EMI ID = 157.1>
TABLE V
Effect of temperature and pH on production
alpha-amylase
Activity (U / ml) (Culture time)
<EMI ID = 158.1>
It appears from Table V that the optimal conditions are
<EMI ID = 159.1>
<EMI ID = 160.1>
<EMI ID = 161.1>
<EMI ID = 162.1>
but this culture at high temperature was not suitable to produce good alpha-amylase activity for other
<EMI ID = 163.1>
of the medium is 8.0 for the production of alpha-amylase by
<EMI ID = 164.1>
<EMI ID = 165.1>
<EMI ID = 166.1>
using repeated transfers on slanted media (each strain was transferred repeatedly (9-11 times) out of two
<EMI ID = 167.1> <EMI ID = 168.1> each strain),
TABLE VI
<EMI ID = 169.1>
<EMI ID = 170.1>
<EMI ID = 171.1>
Effect of mean volume on amylase production
<EMI ID = 172.1>
By the procedure described below, it was purified
<EMI ID = 173.1>
<EMI ID = 174.1>
<EMI ID = 175.1>
<EMI ID = 176.1>
The alpha-amylase enzyme was precipitated from the
<EMI ID = 177.1>
"Thermamyl" amylase (diluted 2 times) by adding two volumes of cold acetone. Precision was collected by centrifugation.
<EMI ID = 178.1>
<EMI ID = 179.1>
to obtain a 20% starch suspension. We heated this
<EMI ID = 180.1>
cipitated by centrifugation. Then the solution was dialyzed against
<EMI ID = 181.1>
<EMI ID = 182.1>
<EMI ID = 183.1> <EMI ID = 184.1>
<EMI ID = 185.1>
<EMI ID = 186.1>
<EMI ID = 187.1>
<EMI ID = 188.1>
The acid stability and thermostability of the partially purified preparations of alpha-.
<EMI ID = 189.1>
60 minutes of incubation under the following conditions:
<EMI ID = 190.1>
<EMI ID = 191.1>
<EMI ID = 192.1>
of calcium (pH 4.5-6.0) containing 0 to 5 moles of calcium acetate in 3 hours at 4 [deg.] 0, changing the buffer twice. Then 4 ml of the dialysis products were placed in small test tubes and incubated at the designated temperature in a water bath. The tubes were quickly cooled in an ice-water bath and the residual alpha-amylase activity was determined.
<EMI ID = 193.1>
<EMI ID = 194.1>
<EMI ID = 195.1>
<EMI ID = 196.1>
<EMI ID = 197.1>
<EMI ID = 198.1>
Residual alpha-amylase activities were determined
<EMI ID = 199.1>
<EMI ID = 200.1>
<EMI ID = 201.1>
above (except that the pH or the temperature was varied
<EMI ID = 202.1>
for alpha-amylases from ATCC strains
<EMI ID = 203.1>
The test results are shown in Figures 1 and 2
(figure 1: abscissa: pH; ordinate:% residual activity; <EMI ID = 204.1> relative speed) for the alpha-amylase originating from the strain ATCC
<EMI ID = 205.1>
<EMI ID = 206.1>
<EMI ID = 207.1> <EMI ID = 208.1>
<EMI ID = 209.1>
of 80 [deg.] C for the alpha-amylase from the strain ATCC
<EMI ID = 210.1>
(curve C). The relationship between enzymatic activity and reaction temperature is very similar for alpha-amylases
<EMI ID = 211.1>
<EMI ID = 212.1>
It was found that the alpha-amylase activity of alpha-amylase "Thermamyl" increased by 20-30% when incubated at.
<EMI ID = 213.1>
can explain the difference in the relationship between enzyme activity and reaction temperature between alpha-
<EMI ID = 214.1>
<EMI ID = 215.1>
<EMI ID = 216.1>
<EMI ID = 217.1>
<EMI ID = 218.1>
<EMI ID = 219.1>
<EMI ID = 220.1>
<EMI ID = 221.1>
<EMI ID = 222.1>
from strains ATCC N [deg.] 31 195 and ATCC N [deg.] 31 199.
FIG. 4 (abscissa: incubation time in minutes; ordinate:% residual activity) shows the curves of inactivation of alpha-amylases originating from the strain ATCC N [deg.] 31 195
(curve A) and originating from the strain ATCC N [deg.] 31 199 (curve B), from alpha-amylase "Thermamyl" (curve C) and alpha-amylase from Bacillus stearothermophilus described by Ogasawara and his <EMI ID = 223.1>
<EMI ID = 224.1>
The incubation conditions described by Ogazawara et al were the same as those used in this trial).
<EMI ID = 225.1>
of the present invention have shown much more thermostability <EMI ID = 226.1>
te by Ogasawara (although the alpha-amylases of the present invention which have been tested also belong to Bacillus stearothermophilus).
Figure 5 (abscissa; incubation time, in minutes; ordinate:% residual activity) shows the inactivation curves of the alpha-amylases of the strain ATCC N [deg.] 31 195
(curve A), of the strain ATCC N [deg.] 31 199 (curve B) and of the alpha-amylase “Thermamyl” (curve C) under the same conditions as those described above for FIG. 4 (ctest i.e. <EMI ID = 227.1>
The alpha-amylases of the present invention still showed greater thermostability than the alpha-amylase "Thermamyl", but the difference was not as great as in the case where
<EMI ID = 228.1>
<EMI ID = 229.1>
<EMI ID = 230.1>
<EMI ID = 231.1>
<EMI ID = 232.1>
<EMI ID = 233.1>
ATCC strain alpha-amylase inactivation curves
<EMI ID = 234.1>
<EMI ID = 235.1>
incubation at 85 [deg.] C and at a pH of 4.55 in the presence of 22.5% (in
<EMI ID = 236.1>
<EMI ID = 237.1>
<EMI ID = 238.1>
showed greater thermostability than the alpha-amylase "Thermamyl" under the conditions of Figures 6 and 7. Since the
<EMI ID = 239.1>
are similar to many industrial liquefaction conditions, the alpha-amylases of the present invention should be expected to show greater thermostability
for acidic pH values in industrial liquefaction
<EMI ID = 240.1>
Measurements made by the Weber method and
<EMI ID = 241.1> SDS disk phoresis determined that the molecular weights
<EMI ID = 242.1>
<EMI ID = 243.1>
<EMI ID = 244.1>
<EMI ID = 245.1>
and cytochrome C (N; molecular weight 12,500). The position of the alpha-amylases of the present invention was determined
<EMI ID = 246.1>
than amylose-azure agar and incubating at 37 [deg.] C.
The results of this test are shown in figure 8 (abscissa: mobility; ordinate: molecular mass (x 10)).
The value of 96,000 for the molecular weight of the alpha-amylases of the present invention is much greater than the values reported by Ogasawara et al.
<EMI ID = 247.1>
<EMI ID = 248.1>
<EMI ID = 249.1>
<EMI ID = 250.1>
<EMI ID = 251.1>
<EMI ID = 252.1>
<EMI ID = 253.1>
with various protein materials present in many
<EMI ID = 254.1>
proteins like amino acids. Therefore, the presence of protease, as an enzyme constituting an impurity in enzymes of the alpha-amylase type, impairs the efficient hydrolysis of starchy materials. The protease activities of alpha-amylase enzymes produced from the five strains isolated were determined starting from the acetone precipitation products of the culture filtrates at the peak production stage.
<EMI ID = 255.1>
modified.
The results obtained were compared with those of the preparations of the alpha-amylase enzymes "Thermamyl" and a bacterial alphaamylase CPC. As shown below, "Thermamyl"
and the isolated thermophilic actinomycete culture filtrates contained large amounts of protease. On the contrary,
the strains of the present invention, producing a thermostable alpha-amylase, did not produce an amount! important protease.
Alpha-amylase protease activity
<EMI ID = 256.1>
<EMI ID = 257.1>
The following example illustrates alphaamylase enzymes of the present invention for liquefying starch during the production of high dextrose equivalence starch hydrolysates.
30 g of potato starch was suspended in 60 ml of water, 75 mg of hydrated calcium chloride was added and the pH was adjusted to 4.5. To this suspension were added 50 CPC units of the purified powdered enzyme obtained.
in Example 2 in order to liquefy the starch at 85 [deg.] C for 30 minutes. The dextrose equivalence of the liquefied solution was about 21 and the pH was 4.3. When the temperature has
<EMI ID = 258.1>
of Aspergillus niger, and the solution was subjected to saccharification and conversion at 60 [deg.] C for 48 hours. The dextrose equivalence of the saccharified and converted solution a
<EMI ID = 259.1>
As the previous example (example 3) shows, the alpha-amylase, the enzyme according to the present invention, hydrolyzes and liquefies the starch or starch. These enzymes can be used to transform soluble starch, amylase, amylopectin, glycogen, etc., in order to greatly decrease the viscosity of these substrates. When the enzymes of the present invention react with starch soluble at pH 4.5 and at
60 [deg.] C, the reaction of starch iodide disappears at a hydrolysis rate (dextrose equivalence) of about 15, and the final rate corresponds to a dextrose equivalence of 32 to 36. L ' analysis of the sugars of the hydrolysis product showed the presence
<EMI ID = 260.1>
oligo-saccharides as well as a small amount of glucose. The mutarotation of the resulting sweet product was found to be negative. Therefore, the enzymes of the present invention are; alpha-amylases, enzymes of the liquefaction type which freely hydrolyze alpha-1,4 bonds in starch or starch
<EMI ID = 261.1> invention do not lose their activity even if left for 24 hours at room temperature at pH between 3 and 11.
<EMI ID = 262.1>
<EMI ID = 263.1>
<EMI ID = 264.1>
2952 (1961)).
The relation between the liquefaction (in relative value) carried out by the enzymes of the present invention (curve A ") and the operating temperature is shown in figure 10, and it contrasts with that of alpha-amylase from Bacillus stearothermophilus which has been described by Ogasawara et al (curve D) As shown in figure 10 (abscissa:
temperature in [deg.] C; ordinates:% relative activity), the preferred operating temperature for the enzymes of the present invention is close to 80 [deg.] C.
As is apparent from the above, the alphaamylases of the present invention can serve as enzymes for the liquefaction and converting transformation of starch in the starch and starch saccharification industry, in a primer removal process in the textile industry and as additives in detergent formulations, similar to conventional uses of alphaamylases (bacterial enzymes).
The alpha-amylases of the present invention are enzymes particularly well suited for liquefaction.
and the transformation conversion of starch and starch for the production of malto-dextrins, the subsequent production of dextrose using gluco-amylase since iso � merization of the terminal group of molecules can be avoided because the enzyme 8 can be efficiently used. an acidic pH
<EMI ID = 265.1>
using the enzyme gluco-amylase.
<EMI ID = 266.1>
constituting the enzymes of the present invention, the enzyme is used to transform the starch or starch into a starch or ferrule hydrolyzate in which the untransformed residual starch or untransformed residual starch remains in granular form. These methods are described in US Patents
<EMI ID = 267.1>
<EMI ID = 268.1>
If applied to granular starch, at least the initial solubilization of the starchy material is carried out by operating at relatively low temperatures, that is to say below the initial gelatinization temperature of the starch or starch up to the initial gelatinization temperature of the starch or starch. In a preferred embodiment of these methods, the gluco-amylase is used as an enzyme with the alpha-amylase enzyme in the stage of initial solubilization. The enzymes of the present invention are particularly suitable for this process, since their optimum pH range is compatible with that of the gluco-amylase.
In another preferred mode of using the alphaamylases, enzymes of the present invention, the methods described in the United States patents can be used.
<EMI ID = 269.1>
In yet another preferred mode of use of the alpha-amylases, enzymes of the present invention, the method described in the United States patent may be applied.
<EMI ID = 270.1>
of the present invention, in the process described in the patent
<EMI ID = 271.1>
starch, such as corn starch having at least 25% by weight of starchy material, by the enzyme alpha-amylase at a
<EMI ID = 272.1>
<EMI ID = 273.1>
minutes and preferably 5 to 10 minutes, to liquefy
<EMI ID = 274.1>
<EMI ID = 275.1>
remarkable of the application of this temperature program with the alpha-amylases, enzymes of the present invention, resi-
<EMI ID = 276.1>
<EMI ID = 277.1>
<EMI ID = 278.1>
The use of the most preferred alpha-amylases, enzymes of the present invention to transform starch or starch is to submit a starch suspension
<EMI ID = 279.1>
<EMI ID = 280.1>
<EMI ID = 281.1>
<EMI ID = 282.1>
<EMI ID = 283.1>
that at a temperature between about 85 [deg.] 0 and about
<EMI ID = 284.1>
starch. After the initial soluoilisation (as in the hydrolysis of granular starch) or after the liquefaction, the suspension is preferably subjected to a "thermal shock" treatment at a temperature above 100 [deg.] C and ranging from preferably between about 110 [deg.] C and about 150 [deg.] C to liquefy the starch granules or starch which may remain. The suspension of the liquefied starch is then cooled and preferably treated with an alpha-amylase supplement, alone or in combination with other enzymes such as glucoamylase, beta-amylase, pulluanase, glucoseisomerase, successively or in combination. If we use
alpha-amylase alone in the second stage of application of an enzyme the temperature will preferably be between
<EMI ID = 285.1>
which is the optimum temperature for the enzymes of the present invention. If other enzymes are present, such as gluco-
<EMI ID = 286.1>
<EMI ID = 287.1>
<EMI ID = 288.1>
In conclusion, it can be stated that the alpha-amylases, enzymes of the present invention, can clearly differentiate from the alpha-amylases of the prior art obtained from imperfect animals, plants, yeasts and fungi.
and mold, because these prior art enzymes have such low thermal stability that they completely lose
<EMI ID = 289.1>
pH 6.0. When comparing the thermal stability of alpha-
<EMI ID = 290.1>
<EMI ID = 291.1> vention, have an acid stability and a thermal stability much higher than those of the alpha-amylases of the prior art, It also emerges from Figure 12 that the alpha-amylases, enzymes of the present invention, are characterized as being able to
<EMI ID = 292.1>
about their initial activity when maintained for
<EMI ID = 293.1>
calcium ions, and that these enzymes can retain at least
<EMI ID = 294.1>
<EMI ID = 295.1>
It emerges from figure 11 (abscissa: incubation time,
in minutes; ordinates:% relative activity) that the alphaamylases of the present invention (curve A ") are further characterized by the fact that they are capable of retaining at least
<EMI ID = 296.1>
<EMI ID = 297.1>
<EMI ID = 298.1>
<EMI ID = 299.1>
<EMI ID = 300.1>
Table IX shows the relationship between the alphaamylase) enzymes of the present invention, *. alphaamylases, enzymes from Bacillus subtilus and Bacillus
<EMI ID = 301.1>
enzymes from Bacillus stearothermophilus which
have been described in the literature. The comparison is based on optimum operating pH, appropriate operating temperature and molecular weight. Figures 11 and 12 compare thermal stability and acid stability.
TABLE IX
<EMI ID = 302.1>
<EMI ID = 303.1>
<EMI ID = 304.1>
<EMI ID = 305.1>
<EMI ID = 306.1>
(5) the British patent indicates that the molecular mass of
<EMI ID = 307.1>
and the molecular mass of the alpha-amylase of B. subtilis is 96,000,
When comparing alpha-amylases, enzymes of
<EMI ID = 308.1>
of Bacillus subtilisa it is seen that these two enzymes are remarkably different, as can be seen clearly from Figures 9 and 11, by their optimum operating pH., their appropriate operating temperature, their molecular mass and their stability in the hot and in the presence of acids. . This indicates that the enzyme of the present invention is quite different from alphaamylase from Bacillus subtilis.
When comparing alpha-amylases, enzymes of the present invention, and alpha-amylases .. enzymes from Bacillus licheniformis, they are remarkably different in their optimum operating pH, molecular weight, heat stability and temperature stability. acid, as seen
<EMI ID = 309.1>
<EMI ID = 310.1>
<EMI ID = 311.1> amylases, enzymes of the present invention, with the action of known mutagens using known techniques, such as ultra-violet light, chemical treatment etc. Therefore, the present invention contemplates alpha-amylases, enzymes which produce
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<EMI ID = 313.1>
and sub-mutants of these variants and mutants.
Like some of the other known alpha-amylases, the enzymes of the present invention are inhibited by mercury and by EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). But
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by way of illustration, but not limitation, and that it is sucepti-
<EMI ID = 316.1>
in his mind.
CLAIMS
<EMI ID = 317.1>
this enzyme being characterized in that (a) it is capable of retaining at least approximately 70% of its initial dthalphaamylase activity when maintained for 10 minutes at
90 [deg.] C and at pH 6.0 without addition of calcium ion; (b)
<EMI ID = 318.1>
initial alpha-amylase rate when maintained for
60 minutes at 90 [deg.] C at pH 6.0 without addition of calcium ion;
and (c) it can retain at least about 50% of its initial alpha-amylase activity when maintained for 10
<EMI ID = 319.1>
<EMI ID = 320.1>