JPH0783706B2

JPH0783706B2 - 酒類の品質改良法

Info

Publication number: JPH0783706B2
Application number: JP25885587A
Authority: JP
Inventors: 茂八柿本; 靖弘隅野; 秀明山田; 聰今安; 英治市川; 哲義水津
Original assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-10-14
Filing date: 1987-10-13
Publication date: 1995-09-13
Anticipated expiration: 2010-09-13
Also published as: JPH01104155A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は酒類の品質改良法に関する。

従来の技術清酒、ビール、ぶどう酒、老酒などのすべての醸造酒中
及びウイスキー、ブランデー、焼酎等の蒸留前の醪中に
はカルバミドが含まれており、このために酒類に異味を
与え、また加熱殺菌、長期間貯蔵により酒類の香味の劣
化を引き起こすなど品質劣化の大きな原因となってい
る。このカルバミドを除去する方法として、ウレアーゼ
酵素剤を酒類または酒類発酵もろみに添加して、10〜20
℃の低温で反応させる方法（特公昭56−20830）が知ら
れている。

ウレアーゼ（E.C.3.5.1.5.）はカルバミドをアンモニア
と炭酸ガスとに分解する酵素であり、植物、動物、微生
物等広く天然界に分布、存在しているが、従来よりナタ
マメのウレアーゼやバチルス・パストウリのウレアーゼ
が、工業的に製造され、実用に供されている。

発明が解決しようとする問題点上記のウレアーゼは、反応の至適pHが中性ないしアルカ
リ性に存在し、酸性側では反応がきわめて進行しにくい
ばかりでなく、一般的に酵素が失活しやすく、とくに反
応温度が室温以上の場合や、アルコールなどの有機溶媒
を含む反応液中で失活が著しい。そのため、例えば特公
昭56−20830の方法では、pH約4.3、アルコール濃度約20
％の清酒に含まれるカルバミドを除去するのに、きわめ
て多量のナタマメや細菌由来のウレアーゼ（至適pH6〜
８）の添加を必要とし、しかも長時間、10〜20℃という
低温のみでしか反応を実施できないなどの欠点を有して
おり、酒類製造の工業的見地からは、必ずしも満足な方
法とはいえない。

問題点を解決するための手段本発明者らは、品質のよい酒類を製造する上で、酸性で
かつアルコールを含有する酒類中においても、安定に作
用するウレアーゼが、必須であることを痛感し、鋭意、
研究を進めた結果、至適pHが２〜５の酸性域にある乳酸
菌由来のウレアーゼで酒類を処理することにより、少量
のウレアーゼの添加で、高温でもきわめて短時間に、酒
類中のカルバミドを分解除去しうるとの知見を得、さら
に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、酒類を、至適pH域が２ないし５で、
かつ、酸性ウレアーゼを産生する能力を有するストレプ
トコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック
属、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に
属する微生物由来の酸性ウレアーゼで処理し、酒類中の
カルバミドを分解除去で処理することを特徴とする酒類
の品質改良法である。

本発明に用いられる酸性ウレアーゼは、カルバミド１モ
ルと水１モルから、アンモニア２モルと炭酸ガス１モル
を生成し、その活性の至適pH域がpH2乃至５にあるもの
をいい、とりわけpH2乃至4.5にあるものが望ましく、酵
素のその他の一般的性質をあらわすpH安定性、至適温
度、温度安定性、基質特異性、阻害剤の種類、Km値、分
子量等によっては、とくに制限をうけない。

酸性ウレアーゼは、通常、酸性ウレアーゼを産出する能
力を有する微生物菌株を培養して生産される。微生物菌
株としては、いわゆる「乳酸菌」と呼ばれる種類の細菌
がよく、例えば、ストレプトコッカス属、ペディオコッ
カス属、ロイコノストック属、ラクトバチルス属、ビフ
ィドバクテリウム属の細菌があげられる。その代表例と
して、ストレプトコッカス・フエシウム（Streptococcu
s faecium），ストレプトコッカス・ミチス（Streptoco
ccus mitis），ラクトバチルス・カゼイ・バル・カゼイ
（Lactobacillus casei var.casei），ストレプトコッ
カス・ミティオール（Streptococcus mitior）、ストレ
プトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ラク
トバチルス・フアーメンタム（Lactobacillus fermentu
m）、ビフィドバクテリウム・ケリナム（Bifidobacteri
um choerinum）などが好んで用いられるが、菌株はとく
に限定されるものではなく、新たに、乳製品、土壌、酸
敗食品、動物の臓器や排泄物等から分離した株であって
も、酸性ウレアーゼを産生する能力を有するものであれ
ば差しつかえない。またそれらの菌株に紫外線照射や変
異剤処理を施して、人為的に変異を誘起させた株や、当
該酸性ウレアーゼ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為
的にとり出し、それを組み入れた他の微生物菌体であっ
ても、本発明の方法に使用できる。

酸性ウレアーゼを産生する菌株の具体例としては、ラク
トバチルス・フアーメンタムJCM5867（IFO 14511,FERM
P−8990），ラクトバチルス・フアーメンタムJCM 5868
（IFO 14512,FERM P−8991）、ラクトバチルス・フアー
メンタムJCM 5869（IFO 14513,FERM P−8992）、ストレ
プトコッカス・ミティオールPG−154（IFO 14633,FERM
P−9460）、ストレプトコッカス・ボビスPG−186（IFO
14634,FERM P−9461）あるいはビフィドバクテリウム・
ケリナムPG−196（IFO 14635,FERM P−9462）などが挙
げられる。

上記のIFO番号は、財団法人発酵研究所における受託番
号を、またFERM P番号は通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所（FRI）における受託番号をそれぞれ示
す。上記のラクトバチルス・フアーメンタムJCM 5867、
ラクトバチルス・フアーメンタムJCM 5868およびラクト
バチルス・フアーメンタムJCM 5869は財団法人発酵研究
所発行の「リサーチ・コミュニィケーション（RESERCH
COMMUNICATION）No.13,第94頁,1987」に掲載されてい
る。

上記菌株のFRIへの寄託はブタペスト条約に基づく寄託
に切換えられて下記のFERM BP番号で同研究所に保管さ
れている。

ラクトバチルス・ファーメンタムJCM 5867（FERM BP−1
454）ラクトバチルス・ファーメンタムJCM 5868（FERM BP−1
445）ラクトバチルス・ファーメンタムJCM 5869（FERM BP−1
446）ストレプトコッカス・ミティオールPG−154（FERM BP−
1448）ストレプトコッカス・ボビスPG−186（FERM BP−1449）ビフィドバクテリウム・ケリナムPG−196（FERM BP−14
50）上記のラクトバチルス・フアーメンタムJCM 5867（IFO
14511,FERM BP−1454）、ラクトバチルス・フアーメン
タムJCM 5868（IFO 14512,FERM BP−1445）およびラク
トバチルス・フアーメンタムJCM 5869（IFO 14513,FERM
BP−1446）は以下の菌学的性質を有する。

また、ビフィドバクテリウム・ケリナムPG−196,ストレ
プトコッカス・ミティオールPG−154およびストレプト
コッカス・ボビスPG−186はそれぞれ以下の菌学的性質
を示す。

上表中、NDは実験を実施していないことを示し、Lys、A
sp、Ala、Glu、Orn、Ser、ｍ−DAPはそれぞれリジン、
アスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、オルニチ
ン、セリン、メソジアミノピメリン酸を表わす。上記の
菌学的諸性質をもとに、バージェイズ・マニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジィ・ボタューム
２（1986）によって、その分類学的位置を調べるとPG−
196株はアラビノース、セロビオーズ、リボース、ザイ
ロースからの酸の生成が陽性である点が異なるもののBi
fidobacterium choerinumとするのが適切であり、PG−1
54株はα−ヘモリシスが陰性である点が異なるもののSt
oreptococcus mitiorとするのが適切であり、PG−186株
はエスクリンの加水分解が陰性である点が異なるもの
の、Storeptococcus bovisとするのが適切である。

これらの微生物菌株を培養して酸性ウレアーゼを生成さ
せるには、通常の静置培養、振盪培養、通気攪拌培養あ
るいは固体培養などにより、連続的あるいは間歇的に行
なうことができる。用いる培地は、使用される微生物の
生育しうる通常の組成のものでよく、炭素源としては、
炭水化物，油脂，脂肪酸，あるいはアルコール類などの
中から資化しうるものを適宜選択し、単独または混合し
て使用される。また窒素源としては、例えば、ペプト
ン，大豆粉，綿実粉，コーンスチープリカー，酵母エキ
ス，肉エキス，麦芽エキス，ホエー等の有機窒素源のほ
か、硫安，塩安，硝安，燐安等の無機窒素源が、必要に
応じて、適宜混合して、または単独で用いられる。培地
には炭素源、窒素源のほか、生育に必要なミネラル、ア
ミノ酸あるいはビタミンなどの生育必須因子や生育促進
物質を添加するのがよい。さらに酸性ウレアーゼの生成
を誘導するためにカルバミド，チオ尿素等を添加するこ
ともある。培養中のpHおよび泡の管理の目的で苛性アル
カリ液，炭酸ナトリウム液，カルシウム塩類を適宜補添
したり、消泡剤の添加も有効である。

培養の温度は、用いる微生物の生育に適した温度を選択
すればよく、通常15℃乃至50℃、好ましくは25℃乃至40
℃で培養するのが有利である。また培養の時間は、該菌
の生育および酸性ウレアーゼの生成に十分な時間続行さ
れるが、通常５乃至50時間を要する。

このようにして培養後、酸性ウレアーゼは、通常、微生
物菌体に含有されている。そこで、培養液から遠心分
離、沈降分離、凝集分離、多孔性膜やセラミックによる
ろ過などの方法によって集菌された生菌体を、そのま
ま、もしくは凍結乾燥、噴霧乾燥、アセトン乾燥などの
手段を用いて乾燥菌体にして、酸性ウレアーゼ粗酵素と
して本発明の方法に用いることができる。さらには菌体
を凍結融解処理、磨砕処理、超音波処理、浸透圧処理、
リゾチーム処理、界面活性剤処理などの方法を単独もし
くは組合わせて行なうことによって、該酵素を可溶化
し、プロタミン処理、塩析、有機溶媒処理、等電点沈
澱、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ
過，アフィニティークロマトグラフィー、晶出などの通
常の酵素の精製手段を適宜組合わせることによって、生
菌体よりも比活性の向上した粗酵素乃至精製酵素を得
て、本発明の方法に用いることも可能である。

次に、酒類を酸性ウレアーゼで処理する方法について説
明する。

当該酵素で酒類を処理する場合の酵素の形態としては、
該酵素を含有する微生物菌体のまま、あるいは通常の方
法で酸性ウレアーゼを抽出精製した粗酵素乃至精製酵素
でよく、さらにはそれらを寒天やカラギーナンなどの天
然高分子、ポリアクリルアミドやウレタン樹脂などの合
成高分子に包括固定化したもの、あるいは活性炭、セラ
ミック、デキストラン、アガロース系物質、多孔性ガラ
ス等の担体に結合固定化したものを用いてもよい。

本発明の対象とする酒類としては、清酒、ビール、ぶと
う酒、フルーツワイン、老酒等の醸造酒をはじめ、ウィ
スキー醪、焼酎醪、ブランデー醪などカルバミドを含有
するものであればよく、それらを製造する中間工程品で
もさしつかえない。例えば清酒の場合、発酵醪、醪を圧
濾圧搾した後の上槽酒、生酒、火入れ後の貯蔵酒、ビン
詰め前の清酒等であっても該酵素の処理の対象とするこ
とができるが、火入れ前に該酵素を添加して処理してお
くのが、最も好ましい。

これらの酒類を酸性ウレアーゼで処理する場合、添加す
る酸性ウレアーゼの量は、0.00001ユニット/ml乃至１ユ
ニット/ml、とりわけ0.0001ユニット乃至0.1ユニット/m
lが実用的で、有利に用いられる。ただし、１ユニット
は単位時間（分）当りに、カルバミドを分解して１マイ
クロモルのアンモニアを放出する酵素量をいう。以下、
１ユニットはIUと表示する。

酒類を処理する温度は、通常０℃乃至80℃、とりわけ10
℃乃至60℃が好んで用いられる。pHは２乃至７、とりわ
けpH3乃至５がよい。処理の時間は、酒類中のカルバミ
ドが消失するのに十分な時間があればよいが、通常20分
乃至200日間、とりわけ５時間乃至120日間実施される。

酸性ウレアーゼで酒類を処理する別法として酒類を製造
するのに際し、アルコール発酵工程中、酸性ウレアーゼ
を産出する能力を有する微生物の生菌体を共存させるこ
とによってもまた実施できる。

この場合、酸性ウレアーゼ生産菌はアルコール発酵終了
前の任意の時期において共存せしめることができる。た
とえば▲もと▼立時あるいは糖化液製造時に酸性ウレア
ーゼ生産菌を植菌して増殖せしめ、これを用いて常法に
より本発酵（アルコール発酵）を行なわしめる方法が好
ましく適用できる。また本発酵中の適宜の時期、好まし
くは全発酵期間の中期までに酸性ウレアーゼ生産菌を植
菌し培養してもよい。

酒類の▲もと▼に酸性ウレアーゼ生産菌を生育させる場
合、酸性ウレアーゼの植菌時期は特に限定されないが、
好ましくは酵母添加前の状態のものに植菌し、酸性ウレ
アーゼ生産菌が充分に増殖したのちに酵母を植菌して、
以後は通常の操作で▲もと▼を製造し、仕込に使用す
る。また、原料又は原料糖化液に酸性ウレアーゼ生産菌
を生育させる場合は、原料（例、蒸米，麹米，麦芽，麦
汁，ぶどう果汁，でんぷん）又は原料糖化液に酸性ウレ
アーゼ生産菌を植菌し、充分増殖させたのちに仕込に使
用する。

酸性ウレアーゼ生産菌の培養温度は特に限定しないが、
好ましくは28〜40℃である。また酸性ウレアーゼ生産菌
の増殖数は特に限定されないが、好ましくは10⁸/ml以上
である。酸性ウレアーゼ生産菌の増殖した▲もと▼ある
いは原料又は原料糖化液の使用時期は、酒類の仕込時及
びアルコール発酵終了するまでの醪のいずれの時期に使
用しても良い。例えば清酒の場合、初添、仲添、留添の
仕込時又は発酵仲の醪の全期間いずれの時期に使用して
も良い。更に酸性ウレアーゼ生産菌を生育せしめた▲も
と▼あるいは原料または糖化液の使用量は特に限定され
ないが、好ましくは３〜15％である。

又▲もと▼に用いる場合、酸性ウレアーゼ生産菌が乳酸
などの酸産生菌であれば、酵母添加時に酸を添加する必
要はないが、酸を生産しない菌の場合には、酵母添加前
に乳酸などの酸を通常の▲もと▼に使用するのと同量程
度を添加すればよい。

本発明において、アルコール発酵の温度、時間等の培養
条件は常法に準じて実施すればよく、またその後の製造
条件たとえばろ過、滓引、火入れ、貯蔵、熟成なども特
に変更する必要はない。

実施例以下に実施例をもって、本発明の内容をより具体的に示
す。これらはいずれも本発明の内容を例示するものにす
ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

なお、培養物の酸性ウレアーゼ活性は、適宜希釈した培
養液から遠心分離によって集菌し、無菌脱イオン水に懸
濁したのち、尿素を含む0.2Mクエン酸バッファー（pH4.
0）と等量混合し、37℃で30分間反応させて生成したア
ンモニアを、ルトロプルシッド法で比色定量する方法で
測定し、単位時間（分）当りに１マイクロモルのアンモ
ニアを生成する酵素量を１ユニット（IU）として表示し
た。

実施例１グルコース0.5％，ポリペプトン1.0％，酵母エキス1.0
％，肉エキス0.5％，食塩0.5％，炭酸カルシウム1.0
％，寒天1.5％からなる培地中に穿刺、生育したLactoba
cillus fermentumJCM5867（IFO 14511,FERM BP−1454）
を、グルコース2.0％，無水酢酸ナトリウム2.0％、ポリ
ペプトン1.0％、肉エキス1.0％、酵母エキス0.2％、食
塩0.5％、硫酸マンガン（約４水塩）0.005％、pH7.0（3
0％苛性ソーダにて中和）からなる滅菌培地50mlを含む2
00ml容三角フラスコ２本に接種して、37℃で24時間、静
置培養した。このシード培養物をそれぞれ、同じ組成か
らなる滅菌培地１を含む2l容三角フラスコ２本に移植
し、37℃で24時間、静置培養した。この培養物のウレア
ーゼ活性を測定したところ、0.1U/mlであった。

この培養液を遠心分離して菌体を集め、0.05M燐酸緩衝
液（pH7.2）で２回洗滌後、30mlの0.05M燐酸緩衝液（pH
7.2）、0.02MのEDTAおよび0.01Mのジチオスレイトール
を含む液に懸濁して、超音波処理を行ない、その上清液
を硫安分画して、40％から70％飽和の画分の沈澱物を集
め、10mlの0.05M燐酸緩衝液に溶解したのち、一晩透析
し、凍結乾燥することによって、260.4mgの酸性ウレア
ーゼ粗酵素粉末を得た。ウレアーゼ活性は0.5U/mgであ
り、精製収率は76.7％であった。

本粗酵素粉末の一般的性質は以下のようであった。

至適pH pH2〜4.5 至適温度 60℃〜70℃ pH安定性 37℃,2時間処理でpH2〜10で安定温度安定性 pH4,2時間処理で60℃迄、安定次に、この粗酵素粉末を0.02U/mlおよび0.1U/mlになる
ように清酒（アルコール20％，カルバミド30ppm,pH4.
3）に溶解し、30℃に保持して、清酒中のカルバミドの
分解反応を行なわせたところ、表１に示す結果が得られ
た。なお対照として、市販のナタマメのウレアーゼを10
U/mlの濃度で使用して比較した。すなわちナタマメのウ
レアーゼでは10U/mlの濃度で５日間処理しても、清酒中
のカルバミドは約半分に迄しか減少しないのに対し、酸
性ウレアーゼは、0.1U/mlの微量で、わずか１日で完全
にカルバミドを分解していた。

なお、酸性ウレアーゼ活性はpH4.0で、またナタマメウ
レアーゼ活性はpH7.0で、生成したアンモニアをニトロ
プルシッド法で比色定量して測定し、清酒中のカルバミ
ドは、ウレアーゼで分解後、生成したアンモニアをNADP
⁺依存グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる酵素法で
測定した。

以下の実施例でも同様に測定した。

実施例２生酒（アルコール20％，カルバミド30ppm.pH4.3）に実
施例１で取得した酸性ウレアーゼ粗酵素粉末を0.01U/ml
または0.003U/mlになるように添加し、10℃と15℃に保
存してカルバミドの分解を行った。その結果、表２に示
すように生酒中のカルバミドは、酸性ウレアーゼ0.003U
/ml、10℃で８日間処理すると完全に分解した。なお、
これらの清酒を対照（酸性ウレアーゼ粗酵素粉末の無添
加品）の清酒と比較して、官能検査を行ったところ、異
味が少なく品質的により好ましいものであった。

実施例3. 実施例１と同様に培養して得られたLactobacillus ferm
entumJCM5867（IFO 14511,FERM BP−1454）の培養液4l
を遠心分離機で集菌し、凍結乾燥して2.0gの乾燥菌体を
得た。この乾燥菌体の酸性ウレアーゼ活性は、0.35U/mg
であった。

一方、生酒（アルコール20％，カルバミド30ppm.pH4.
3）を75℃で１分間加熱殺菌した後、急速に30℃まで冷
却し、これに上記乾燥菌体を酸性ウレアーゼ活性として
0.01U/mlまたは0.003U/mlになるように添加し、そのま
ま30℃に保持した。その結果、清酒中に含まれるカルバ
ミド濃度の経過変化は、表３のようであった。

実施例4. 清酒（アルコール20％，カルバミド30ppm.pH4.3）を62
℃,15分間加熱殺菌したのち、55℃まで急冷した時点
で、実施例１で取得した酸性ウレアーゼ粗酵素粉末を、
0.003U/mlになるように無菌的に添加溶解し、室温まで
急冷した後、通常の清酒の貯蔵を行った。その結果、貯
蔵中のカルバミド濃度の経過変化は表４のようになっ
た。

実施例5. 醗酵の完了した清酒醪（アルコール18％，カルバミド30
ppm.pH4.2）に実施例１で取得した酸性ウレアーゼ粗酵
素粉末を、0.01U/mlになるように添加し、以後13℃に保
持し３日後に上槽した。その結果、表５に示すように醪
中のカルバミドは、３日間で完全に分解された。また、
この醪を圧濾圧搾した後の上槽酒中にも、カルバミドは
検出されなかった。

実施例６ビール（アルコール4.2％、カルバミド5.1ppm、pH4.2）
に、実施例１で取得した酸性ウレアーゼ粗酵素粉末を、
0.003U/mlの濃度に溶解した。このビールを10℃で３日
間保持したところ、ビール中のカルバミド濃度の経日変
化は表６のようであった。すなわち、３日間でカルバミ
ドを完全に分解できた。このビールを、酸性ウレアーゼ
を加えないものと比較して官能検査を行なったところ、
異味が少なくより好ましいものであった。

実施例７実施例１と同様に培養して得られたLactobacillus ferm
entumJCM5867（IFO 14511,FERM BP−1454）の培養液4l
を遠心分離機で集菌し、凍結乾燥して2.0gの乾燥菌体を
得た。この乾燥菌体の酸性ウレアーゼ活性は、0.35U/mg
であった。この乾燥菌体を清酒（アルコール20％、カル
バミド30ppm、pH4.3）に0.5mg/mlの濃度で懸濁し、50℃
で６時間保持したところ、カルバミドは完全に消失し
た。

実施例８ぶどう酒（アルコール12.1％、カルバミド6.2ppm、pH3.
7）に、実施例７で取得した酸性ウレアーゼを含有する
乾燥菌体を、0.03U/mlとなるように添加し、15℃で５日
間保持したところ、ぶどう酒中のカルバミドは完全に消
失した。

また、このぶどう酒をろ過して菌体を除き、菌体を加え
ないぶどう酒と官能的に比較したところ、異味が少なく
より好ましいものであった。

実施例９ウィスキー醪（アルコール5.3％、カルバミド5.0ppm、p
H4.3）に、実施例１で取得した酸性ウレアーゼ粗酵素粉
末を0.01U/mlの濃度で添加し、22℃で24時間保持したと
ころ、醪中のカルバミドは完全に分解された。

この酸性ウレアーゼを添加した醪と、無添加の醪をガラ
ス製蒸溜装置でそれぞれ２回蒸溜して、アルコール分50
％のウィスキーを得た。この両者を官能検査で比較した
ところ、本処理品の方が異味が少なくより好ましいもの
であった。

実施例10 米焼酎醪（アルコール17.5％、カルバミド30ppm、pH3.
8）に、実施例７で取得した酸性ウレアーゼを含有する
乾燥菌体を、0.03U/mlになるように添加して、15℃で２
日間保持したところ、醪中のカルバミドは完全に分解さ
れていた。

この菌体添加醪と、無添加醪を減圧蒸溜して、アルコー
ル分40％の焼酎を得た。これらを官能検査で比較したと
ころ、本処理の方が異味が少なくより好ましいものであ
った。

実施例11 グルコース0.5％，ポリペプトン1.0％，酵母エキス1.0
％，肉エキス0.5％，食塩0.5％，炭酸カルシウム1.0
％，寒天1.5％からなる培地中に穿刺、生育したLactoba
cillus fermentumJCM5867（IFO 14511,FERM BP−1454）
を、グルコース2.0％，無水酢酸ナトリウム2.0％、ポリ
ペプトン1.0％、肉エキス1.0％、酵母エキス0.2％、食
塩0.5％、硫酸マンガン（約４水塩）0.005％、pH7.0（3
0苛性ソーダにて中和）からなる滅菌培地500mlを含む１
容三角フラスコ２本に接種して、37℃で24時間、静置
培養し、生菌数を2.4×10⁸mlとした。このシード培養物
を10000rpmで10分間遠心分離し、得られた菌体を500ml
の滅菌水で洗浄し、再度遠心分離した。得られた洗浄菌
体を滅菌水10mlに懸濁した。

白米30kgと麹米30kgに相当する蒸米と麹に水120lを加
え、55℃で５時間糖化し、得られた糖化液を70℃に昇温
させ５分間保持して加熱殺菌後、35℃に冷却した。これ
に、上記のLactobacillus fermentumJCM5867の生菌体懸
濁液10mlを添加し植菌した。次いで、35℃で２日間培養
した。培養後の上記乳酸菌数を２×10⁸mlとした。次に
品温を28℃まで下げ、酒酵母協会−７を２×10⁷mlとな
るように植菌し、４日間培養後初添を行ない、１日踊り
とし、仲添、留添を行なったのち通常の温度経過で発酵
を行なわせ、19日目に四段及びアルコールを添加したの
ち上槽した。本実施例の仕込配合表を表７に、又▲もと
▼の経過を表８に、更に上槽時の清酒の分析結果を表９
に示した。この結果から明らかなように、対照に比べ酸
性ウレアーゼ生産乳酸菌を使用した▲もと▼で仕込んだ
醪では、生成したカルバミドは酸性ウレアーゼによって
分解されて、上槽酒中にはカルバミドはほとんど検出さ
れなかった。また酒質についても対照に比べ濃醇な酒質
であり、良好であった。

実施例12 白米60kgと麹米40kgに相当する蒸米と麹を混合し、これ
に水を180l加えて、55℃で５時間糖化した。得られた糖
化液を直ちに70℃まで昇温させ５分間保持し、加熱殺菌
後35℃に冷却した。冷却した糖化液に実施例11と同様に
して得たLactobacillus fermentumJCM5867の生菌体懸濁
液40mlを植菌し、35℃で２日間培養後、本微生物の菌数
を２×10⁸/mlとした。この糖化液（四段Ａ）を全量を12
日目醪に添加し、18日目に四段Ｂとアルコールを添加し
て上槽した。本実施例の仕込配合表を表10に、又醪中の
カルバミドの経時変化を表11に示した。この表より、酸
性ウレアーゼ生産乳酸菌を使用した四段（四段Ａ）を添
加した醪のカルバミドは添加後減少し、上槽時では０に
なり酸性ウレアーゼにより、カルバミドが分解されてい
ることが明らかである。又上槽酒にもカルバミドは検出
されなかった。更に、上槽酒の酒質については官能検査
の結果、濃醇でかつさわやかな良い酒であった。

実施例13 市販GAM半流動培地（日水製薬）に生育した、Streptoco
ccus mitior PG−154（IFO 14633、FERM BP−1448）を
グルコース３％、ポリペプトン1.5％、肉エキス１％、
酵母エキス0.8％、食塩0.5％、無水酢酸ナトリウム0.2
％、硫酸マンガン（約４水塩）0.005％、硫酸コバルト
（７水塩）0.001％、pH7.0（30％苛性アルカリにて中
和）からなる滅菌シード培地50mlを含む200ml容三角フ
ラスコに接種して、34℃で24時間、静置培養した。この
シード培養物5mlを同じ組成からなる滅菌培地100mlを含
む200ml容三角フラスコに移植し32℃で２日間静置培養
した。この培養物の酸性ウレアーゼ活性を定量したとこ
ろ、酵素力価は0.6U/mlであった。

上記の方法で得られた培養液5mlを、3000rpm、10分間遠
心分離して菌体を集め、水洗・遠心分離後、1mlの滅菌
水に懸濁したのち、イソブタノールを50μｌ添加し、50
℃で15分間処理したものを酵素液とし、0.2Mクエン酸バ
ッファーを用いて至適pHを調べた。その結果を表12に示
す。この表から明らかなように、本発明の菌体はいずれ
も、酸性域で強い尿素分解活性を示した。

次に、上記の培養液80mlを遠心分離して菌体を集め、50
％エタノール溶液に４時間浸漬して殺菌し、遠心分離後
凍結乾燥した。得られた乾燥菌体量は16.9mgであり、酸
性ウレアーゼ活性は1.44U/mgであった。

この乾燥菌体を清酒（アルコール20％、カルバミド30pp
m、pH4.3）に、酸性ウレアーゼ活性として、0.01U/mlに
なるように添加し、30℃に保持して、清酒中のカルバミ
ドの分解反応を行なわせたところ、表13に示す結果が得
られた。

実施例14 市販GAM半流動培地（日水製薬）に生育した、表14に揚
げる各菌株を、滅菌した市販GAMブイヨン培地（日水製
薬）50mlを含む200ml容三角フラスコに接種して、34℃
で24時間、静置培養した。このシード培養物5mlを同じ
市販GAMブイヨン培地に硫酸マンガン（約４水塩）0.005
％を添加して滅菌した培地100mlを含む200ml容三角フラ
スコに移植し、32℃で３日間静置培養した。この培養物
の酸性ウレアーゼ活性を定量したところ、表14に示すよ
うな酵素力価であった。

上記の方法で得られた各菌株の培養液5mlを、3000rpm、
10分間遠心分離して菌体を集め、水洗・遠心分離後、1m
lの滅菌水に懸濁したのち、イソブタノールを50μｌ添
加し、50℃で15分間処理したものを酵素液とし、0.2Mク
エン酸バッファーを用いて至適pHを調べた。その結果を
表15に示す。表より明らかなように、本発明の菌株はい
ずれも、酸性域で強い尿素分解活性を示した。

次に、上記の方法で得られたPG−186株およびPG−196株
の培養液各80mlを遠心分離して菌体を集め、50％エタノ
ール溶液に４時間浸漬して殺菌し、遠心分離後凍結乾燥
した。各菌株の乾燥菌体量はそれぞれ30.2mg、64.0mgで
あり、酸性ウレアーゼ活性はそれぞれ0.38U/mg、0.6U/m
gであった。

次に、これらの乾燥菌体を清酒（アルコール20％、カル
バミド30ppm、pH4.3）に、酸性ウレアーゼ活性として、
0.01U/mlになるように添加し、30℃に保持して、清酒中
のカルバミドの分解反応を行なわせたところ、表16に示
す結果がられた。

発明の効果本発明により酒類を酸性ウレアーゼで処理する方法は、
従来知られているナタマメ等の中性乃至アルカリ性ウレ
アーゼを用いて処理する方法に比べて、ウレアーゼの使
用量がきわめて少量ですみ経済的である。たとえば、本
発明方法によると、ウレアーゼの使用量は従来法にくら
べて酵素単位量で約1/100〜1/10000,添加重量で約1/10
〜1/100あるいはそれ以下でカルバミドを完全に分解除
去することが可能である。このために、処理後、酒類中
の残存ウレアーゼに起因する品質の低下は、実質上、殆
ど無視でき、従来法にくらべると極めて有利である。

また、本発明によると、酒類が有する通常のpH、すなわ
ち、３〜５という酸性下であっても高温で短時間にカル
バミドを分解することが可能であり、作業性がよく、工
業的に有利にカルバミドを分解除去できる。また、酸性
ウレアーゼ生産菌を酒類の発酵終了前の適宜の工程で共
存せしめる方法を採用することもでき、簡易にカルバミ
ドを除去できる。

フロントページの続き微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１４４６微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１４４８微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１４４９微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１４５０ (72)発明者今安聰京都府京都市伏見区桃山筑前台町６番地 (72)発明者市川英治京都府京都市伏見区南浜町248番地の１ (72)発明者水津哲義京都府京都市伏見区向島二の丸町68番地の 133 (56)参考文献特公昭56−20830（ＪＰ，Ｂ２) Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．37，Ｎｏ．３，Ｐ. 379−382（1979)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酒類を、至適pH域が２ないし５で、かつ、
酸性ウレアーゼを産生する能力を有するストレプトコッ
カス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ラ
クトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する
微生物由来の酸性ウレアーゼで処理し、酒類中のカルバ
ミドを分解除去することを特徴とする酒類の品質改良
法。