KR0175496B1

KR0175496B1 - 디시마 속YCH-37 (Dicyma sp. YCH-37) KFCC-10851 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용한 효모엑기스의 제조방법

Info

Publication number: KR0175496B1
Application number: KR1019960013556A
Authority: KR
Inventors: 함병권; 정희철; 배동훈; 유주현
Original assignee: 유주현
Priority date: 1996-04-30
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 1999-02-01
Also published as: KR970068883A

Abstract

디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC-10851 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용하여 10% (v/v) 농도의 기질효모부터의 효모엑기스의 제조를 행하였다. 대수증식기의 기질효모를 반응 전 60-80℃에서 2-4시간 동안 열처리를 행한 후, 40-60단위(Units)의 효소를 사용하셔 20-50℃, pH 5.0-9.0에서 100-150분 동안 반응하였다. 기질효모의 오토라이시스는 반응촉진제로서 5.0% (v/v) 에틸아세트산을 첨가하여 40-70℃, pH 5.0-7.0에서 20-30시간 동안 반응하였다. 효소반응에 의해 얻어진 효모엑기스와 오토라이시스로부터 얻어진 효모엑기스의 양을 비교한 결과, 효소반응에 의해 최종적으로 얻어진 효모엑기스의 상대수율은 62.1%였으며, 오토라이시스로부터 얻어진 효모엑기스보다 수율상으로는 약 3배의 증가, 시간상으로는 약 60배의 단축효과를 얻었다.

Description

디시마 속 YCH-37 (Dicyma sp. YCH-37) KFCC-10851 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용한 효모엑기스의 제조방법

제1도는 본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용한 효모엑기스의 생산시 기질효모의 전처리 효과 및 반응시 에틸아세트산(ethyl acetetate)의 효과를 오토라이시스(autolysis)와 비교한 도면이다.

제2도는 본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용한 효모엑기스의 생산시 기질효모의 배양시간에 따른 효모엑기스 생산을 비교한 도면이다.

제3도는 본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용한 효모엑기스의 생산시 효소량에 따른 효모엑기스 생산량을 비교한 도면이다.

제4도는 본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 효모엑기스의 생산시 반응온도에 따른 효모엑기스의 생산량을 각 온도에서의 오토라이시스(autolysis)와 비교한 도면이다.

제5도는 본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용한 효모엑기스의 생산시 반응 pH에 따른 효모엑기스의 생산량을 각 pH에서의 오토라이시스(autolysis)와 비교한 도면이다.

제6도는 본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용한 효모엑기스의 생산시 반응시간에 따른 효모엑기스 생산량을 비교한 도면이다.

제7도는 본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소를 이용한 효모엑기스의 생산시 반응최적조건으로부터 얻어진 효모엑기스의 양과 오토라이시스(autolysis)의 최적조건으로부터 얻어진 효모엑기스의 양을 비교한 도면이다.

본 발명은 효모의 세포벽에 작용하여 세포벽을 용해시키는 효모세포벽 용해효소를 이용하여 효모엑기스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

효모를 응용미생물학상 매우 중요한 미싱물군이고, 발효능력이 강한 종류가 많아 옛날부터 주류의 양조, 빵의 제조 등에 이용되어 인류역사와 함께 오랫동안 사용되어 왔다. 효모는 균체내에 많은 비타민, 보효소류, 여러 생리활성물질 및 미량의 무기성분 등을 함유하고 있으며, 핵산, 아미노산, 단백질 등의 함량도 다른 미생물에 비해 현저히 놓은 것으로 밝혀져 있다. 따라서 효모로부터 얻어진 효모엑기스는 미생물 생육배지성분으로만 아니라 천연조미료, 또는 영양제 등의 건강 식품으로서 사용되어지고 있다. 또한, 맥주제조공정 후의 폐효모를 이용한 효모엑기스 생산도 이루어지고 있으며, 이들 맥주효모로부터의 효모엑기스는 건강과 질병에 대하여 유효하다고 알려저 있다. 효모로부터 효모엑기스를 얻기 위한 방법으로는 크게 기계적으로 마쇄하는 방법과 효모자체의 자기소화효소를 이용한 오토라이시스법, 그리고 다른 미생물로부터 생산되는 효소를 이용한 효소분해법으로 나눌 수 있다. 기계적 마쇄법의 경우 상업적으로 많이 사용되기는 하나 작업중의 마찰력에 의해 분해산물에 손상을 일으키게 되며, 발생되는 마찰열에 대한 냉각장치를 수반해야 하는 비용부담이 있는 방법이다. 오토라이시스법에 의해 추출된 효모엑기스는 글루탐산의 함량이 높고 품질이 우수하기는 하나, 장시간이 요구되고 낮은 수율의 단점을 갖는다. 이에 반해 효모세포벽을 다른 미생물 유래의 효소를 이용하여 분해 및 용해시켜 효모엑기스를 제조하는 효소분해법은 첨가된 효소들 그 자체가 단백질원으로서 작용할 수 있고, 이들 효소들이 효모세포벽 이외의 효모세포내 물질들에는 그다지 영향을 주지 않기 때문에 최근 가장 활발히 연구되고 있는 방법이다. 현재까지 효모세포벽 용해효소를 생산하는 규주로는 라이조퍼스 속(Rhizopus sp.), 아르스로박터 루테우스(Arthrobacter luteus), 아크로모박터 루나티스(Achromobacter lunatis), 오에르스코비아 속(Oerskovia sp.), 바시디오마이세테 속(Basidiomycete sp.), 리족토니아 속(Rhizoctonia sp.), 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.), 코르티시움 속(Corticium sp.), 페니시리움 속(Penicillium sp.), 펀자이 임퍼펙타이(Fungi imperfecti), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 브레비박테리움 리티품(Brevibacterium lyticum), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 사이토파가(Cytophaga) NCIB9497 등이 있으며, 효모세포벽 내에 존재하는 만난(mannan)층, 단백질층, 글루칸(glucan)층 중 일부에 작용하여 효모세포벽을 분해시킨다. 이들 효소들은 효모엑기스 제조 이외에도 효모세포벽의 구성을 밝히거나 유전공학, 효모의 세포내 유용성분 추출, 병원성 효모의 생육억제, 그리고 식품의 저장 등에 사용될 수 있다.

본 발명자들은 지금까지 알려진 효모세포벽 용해효소 생산균주와는 다른 새로운 효모세포벽 용해효소 생산미생물을 토양으로부터 분리하여 디시마 속(Dicyma sp.) 균주로 동정하고, 본 균주의 성질 및 효소의 특성을 검토한 결과 기존의 생산균주와 다른 특성을 갖고 있음을 발견하여 이러한 발견을 기초로 본 발명을 완성하게 되었다. 본 균주는 한국종균협회에 1994년 12월 3일자로 KFCC-10851의 수탁번호로 기탁되어 있으며, 1995년 1월 12일 자로 특허출원되어 있다. 따라서 본 발명의 목적은 본 균주가 생산하는 효모세포벽을 분해하는 효모세포벽 용해효소를 이용하여 효모균체로부터의 효모엑기스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

[실시예 1]

본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소의 작용범위를 알아보기 위해 여러종류의 효모를 기질로 하여 그 용해정도를 알아보았다. 각 균주를 24시간 배양한 후 pH 8.0 완충액에 660nm에 서의 흡광도가 1.0 부근이 현탁한 후 효소를 첨가하여 40℃에서 최대로 용해될 때까지 반응시켰다. 용해정도는 표1에 나타내었다.

[실시예 2]

현재 공업적으로 많이 사용되고 있는 효모엑기스의 제조방법은 세포내의 자기소화효소를 이용한 오토라이시스(autolysis)법이다. 오토라이시스에 의한 효모엑기스의 제조시 효모엑기스의 고미를 제거하고 용해가 잘 일어나게 하기 위하여 반응전 기질효모를 1% NaOH로 수세하거나, 반응 촉진제로서 5% 에틸아세트산(ethyl acetate)을 첨가하여 pH 5.5-6.5, 50-60℃, 10-30시간의 조건으로 반응시키고 있다. 이로부터 오토라이시스의 최적조건에서 생성된 효모엑기스와 본 효소를 이용하여 생성된 효모엑기스의 양을 비교·검토하기 위해 여러 가지 조건에서 기질효모를 용해하였다. 기질효모로를 반응에 들어가기 전의 전처리단계로 60-80℃에서 2-4시간동안 가열처리한 것, 1% NaOH로 수세한 것, 반응시 반응액 내에 5% 에틸아세트산을 반응촉진제로 첨가한 것 등의 조건에서 오토라이시스 본효소에 의한 반응을 비교하였다. 그 결과 기질효모를 반응전 60-80℃에서 2-4시간 동안 열처리를 가한 것이 아무런 처리도 하지 않은 경우보다 약 4.8배 정도의 흡광도의 감소가 나타나는 것을 알 수 있었다. 또한, 오토라이시스가 가장 잘 일어나는 조건일 때와 비교해 보았을 때, 효소반응에 의하여 약 5.5배 정도의 흡광도의 감소를 나타내었다.

(제1도 참조)

[실시예 3]

기질효모를 배양하며 각 시간별로 균체를 수거한 후, 오토라이시스와 효소반응에 의한 효모엑기스의 생성을 기질효모의 생육곡선에 따라 비교하였다. 그 결과 정지기의 효모보다는 대수증식기의 효모를 기질로 사용하였을 때 가장 많은 양의 효모엑기스를 얻을 수 있었다.(제2도 참조) 이는 배양초기의 효모 및 대수증식기의 효모세포벽에는 제일 바깥층에 존재하는 만난층이 완전히 형성되지 않아 효소의 기질로서 접근이 용이하기 때문인 것으로 생각된다.

[실시예4]

실시예2 및 실시예3에서 검토한 반응조건을 바탕으로 효모엑기스의 제조를 위한 조건을 설정하기 위한 실험을 실시하였다. 기질효모는 10% (v/v)의 농도로 제조하여 사용하였다. 효소량에 따른 효모엑기스의 생성을 비교하기 위하여 각 효소농도별로 실험을 실시하였다. 그 결과 40-60단위 (Unit) 이상의 효소농도에서는 효소량이 증가하여도 더 이상의 효모엑기스의 증가는 이루어지지 않았으며, 이 결과로 부터 효소농도는 40-60단위로 결정하였다.(제3도 참조) 효소의 단위는 다음과 같이 정하였다. 기질효모를 진탕배양한 후 원심분리하여 균체를 모은 다음, 생리식염수로 2회 세척하고 -20℃에 보관하여 사용하였다. 또한, 상기의 보관균체를 100℃에서 30분간 방치한 후 가열처리된 기질효모로써 사용하였다. 가열처리된 기질효모를 pH 8.0의 완충액에 660nm에서의 흡광도의 값이 1.0이 되도록 현탁시킨 후, 이 균체현탁액 2ml에 효소액 0.2ml를 가하여 40℃에서 1시간 반응시킨 다음, 660nm에서의 흡광도 감소를 측정하였다. 이 때, 효소활성의 1단위(Unit)는 주어진 조건에서 1분 동안 660nm에서의 흡광도를 0.001감소시키는 효소의 양으로 정하였다.

효모엑기스 제조시의 반응온도의 영향을 알아보았다. 각 온도별로 실험을 실시한 결과 20-50℃의 범위에서 반응하였을 때 많은 양의 효모엑기스를 얻을 수 있었으며, 오토라이시스의 경우 40-70℃의 범위에서 가장 좋은 효과가 나타났다.(제4도 참조)

각 반응 pH에 따른 효모엑기스의 생산량을 알아보았다. 그 결과 pH 5.0-9.0의 범위에서 반응하였을 때 가장 좋은 효과를 얻었으며, pH 10.0이상의 알칼리 조건에서는 오토라이시스와 큰 차이를 보이지 않았다.(제5도 참조)

효소와의 반응시간에 따른 효모엑기스의 생성을 알아보았다. 그 결과 반응시간이 100-150분에 이를 때까지는 점차적으로 효모엑기스의 생성이 증가하여, 반응이 100-150분만에 종결됨을 나타내었다.(제6도 참조)

[실시예 5]

이상에서 검토한 본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소에 의한 효모엑기스 제조의 최적반응 조건은 기질효모를 40-60단위(Unit)의 효소로 40-70℃, pH 5.0-9.0의 조건에서 100-150분 동안 반응하였을 때였으며, 오토라이시스는 반응촉진제로서 5.0% 에틸아세트산을 첨가하여 40-70℃, pH 5.0-7.0에서 20-30시간 동안 반응하였을 때 가장 좋은 효과를 얻을 수 있었다. 효소반응의 최적조건과 오토라이시스의 최적조건으로 각각 반응하여 최종적으로 생산된 효모엑기스의 양을 비교한 결과를 제7도에 나타내었다. 그 결과 효소반응에 의해 얻어진 효모엑기스의 상대수율은 62.1%로 오토라이시스의 23.1%보다 약 3배 증가효과를 나타냈다.(표2참조) 또한, 오토라이시스에 의해 얻어진 34.6mg의 효모엑기스 양은 효소반응에 의해 30분 만에 얻을 수 있었으므로, 시간상으로는 약 60배의 단축효과를 얻을 수 있었다.

Claims

디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC-10851 균주가 생산하는 새로운 효모세포벽 용해효소(특허 제136229호)를 이용한 효모엑기스의 제조방법.
디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC-10851 균주가 생산하는 새로운 효모세포벽 용해효소(특허 제136229호)를 이용하여 효모로부터 20-50℃, pH 5-9에서 100-150분 동안 반응하여 최대 효모엑기스의 제조의 방법.
디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC-10851 균주가 생산하는 새로운 효모세포벽 용해효소(특허제136229호)는 새로운 효모로서 효모엑기스의 제조에 있어 대수증식기의 기질효모를 열처리한 후 효소(특허제136229호)를 반응하여 주는 새로운 효소의 사용 방법.