KR0136299B1 - 미생물세포벽 용해효소와 그의 생산 미생물 - Google Patents

미생물세포벽 용해효소와 그의 생산 미생물

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Abstract

미생물 중 특히 효모의 세포벽에 작용하여 효모를 용해시키는 미생물세포벽 용해효소를 토양으로부터 분리하여 디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851로 동정하였다. 본 균주의 배양 상등액으로부터 흡착법, 디이에이이(DEAE) 셀룰로오스 크로마토그래피를 거쳐 본 효소를 순수분리하였다. 본 효소는 반응 최적 pH 8.0, 최적온도 50℃, 분자량 25,000 달톤의 특징을 지니고 있으며, 효모세포벽 중의 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)을 분해하여 효모를 용해시키는 것으로 확인하였다. 본 효소는 효모를 열, 유기용매 등으로 전처리하거나 반응액 중에 에스 디 에스(SDS), 트라이톤 X-100(Triton X-100), 베타-멀캡토에탄올(β-merca pto eth anol), KCl, Na2SO3등의 시약을 첨가하면 더욱 쉽게 효모를 용해시킬 수 있었다.

Description

미생물세포벽 용해효소와 그의 생산 미생물
제 1도는 본 균주를 기질효모가 현탁된 플레이트에 스트리킹(streaking)하여 용균여부를 나타낸 사진이다.
제 2도는 효모세포벽 용해효소를 생산하는 미생물의 광학 현미경사진이다.
제 3도는 효모세포벽 용해효소를 생산하는 미생물의 전자 현미경사진이다.
제 4도는 본 균주의 배양시간에 따른 효소생산을 나타낸 도면이다.
제 5도는 정제된 효소단백질의 에스 디 에스 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis)사진이다.
제 6도는 정제된 효소단백질의 반응 pH를 나타내는 도면이다.
제 7도는 정제된 효소단백질의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.
제 8도는 정제된 효소단백질의 반응 온도를 나타내는 도면이다.
제 9도는 정제된 효소단백질의 온도안정성을 나타내는 도면이다.
제 10도는 실리카 젤 씬 레이어 크로마토그래피(Silica gel thin layer chromatography)사진으로 본 효소의 작용기작을 밝힌 사진 도해이다.
본 발명은 미생물의 세포벽에 작용하여 미생물, 특히 효모를 용해시키는 미생물 세포벽 용해효소와 그의 생산 미생물에 관한 것이다. 미생물 중 특히 효모는 균체내 성분으로 비타민(vitamin) B균류, 보효소류와 여러 가지 생리활성물질을 갖고 있으며 아미노산(amino acids), 펍타이드(peptide), 단백질 등의 함량도 다른 미생물에 비해 현저히 높으며 이들이 글루타민산을 포함하는 유리아미노산 등의 핵산물질로 분해되어 구수한 맛의 정미성분을 형성하기도 하여 천연조미료, 영양제 등의 건강식품으로서 사용되고 있다. 따라서 분해된 효소의 효소엑기스 효모분해법으로는 크게 기계적으로 마쇄하는 방법과 다른 미생물로부터 생산되는 효소를 이용한 효소분해법으로 나눌 수 있는데 현재까지 효모세포벽 용해효소를 생산하는 균주로는 라이조퍼스 속(Rhizopus sp.), 아르쓰로 박터 루테우스(Arthrobacter luteus), 아크로모박터 루나티스(Achromobacter lunatis), 오에르스코비아 속(Oerskovia sp.), 바시디오마이세테 속(Basidiomycete sp.), 리족토니아 속(Rhizoctonia sp.), 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.), 코르티시움 속(Corticium sp.), 페니시리움 속(Penicillium sp.), 펀자이 임퍼펙타이(Fungi imperfecti), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 브리비박테리움 리티쿰(Brevibacterium lyticum), 바실러스 설쿠란스(Bacillus circulans), 시토파가(Cytophaga) NCIB9497 등이 있으며, 효모세포벽 내에 존재하는 만난(mannan)층, 단백질층, 글루칸(glucan)층 중 일부에 작용하여 효모세포벽을 분해시킨다. 이들 효소들은 효모엑기스 제조 이외에도 효모세포벽의 구성을 밝히거나 유전공학, 효모의 세포 내 유용성분 추출, 병원성 효모의 생육억제, 그리고 식품의 저장 등에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 지금까지 알려진 효모세포벽 용해효소와는 물리 화학적인 면에서 다른 새로운 효모세포벽 용해효소를 생산하는 미생물을 토양으로부터 분리하여 디시마 속(Dicyma sp.) 미생물로 동정하고 균주의 성질 및 효소의 특성을 검토한 결과 기존의 생산균주와 다른 특성을 갖고 있음을 발견하고 이러한 발견을 기초로 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 효모세포벽에 작용하여 효모를 용해시키는 효모세포벽 용해효소 및 이 효소를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
효소활성을 갖는 균주의 분리
본 발명의 미생물 균주는 토양으로부터 효모세포벽 용해활성이 있는 균주를 선택하기 위해서 기질효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KFCC 11290이 첨가된 한천평판배지에 분리한 미생물의 배양상징액을 스포팅하여 자라난 콜로니(conoly) 부위에 투명환(clear zone)이 생기는 균주를 세포벽 용해활
성을 갖는 균주로 선정하였다.(제 1도 참조)
균주의 동정
본 발명의 균주는 형태상 곰팡이(fungi)의 일종으로 배양상 콜로니(colony)의 색깔은 암흑색 혹은 희녹색이
었고 콜로니 표면은 벨벳옷감(velvety)의 질감을 지니고 있으며 경계는 분산되지 않고 명료하였고 균사체의 색깔은 흰색 또는 무색을 띄었다(표 1 참조).
[표 1]
배양상 특징(MEA, PDA배지에서 생육)
현미경 관찰결과 유성생식기관은 형성하지 않았고 무성생식기관 중 분생자(conidia)를 형성하여 생장하였고 분생자의 형태는 구형 또는 타원형이었고 크기는 4.5 ㎛ - 5.5 ㎛이었으며 균사는 격벽이 존재하였으며 분생자병은 직립하는 형태로 성장하였다.(제 2도, 제 3도 참조) 이러한 균주의 형태적 특징을 무성생식을 하는 듀트로마이세데스(Deutromycetes) 중에서도 디시마 속(Dicyma sp.) 미생물의 일반적 특징과 가장 흡사하므로 디시마 속 미생물로 동정하였다. 효모세포벽 용해효소를 생산하는 균주들 중 곰팡이로 알려진 리족토니아, 펀자이 임퍼펙타이, 리조퍼스, 바시디오마이세데, 페니실륨 등의 미생물의 특성과 본 균주의 형태적 특성을 비교해 본 바, 본 발명의 균주는 이들 효모세포벽 용해효소 생산균주와는 다른 형태적 특성을 갖고 있는 미생물로서 본 발명자들은 이 균주를 신규의 균주로 단정하고 디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851 이라고 명명하였다. 이 균주는 한국종균협회에 1994년 12월 13일 자로 KFCC 10851의 수탁번호로 기탁되어있다. 상기의 균주 디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851을 배양하기 위한 탄소원으로는 포도당, 옥수수 전분, 말토오스, 프럭토오스, 덱스트린, 솔비톨, 만노오스, 셀로비오스 등이 사용될 수 있으며, 유기질소원으로는 효소추출물, 박토소이톤, 트립톤, 폴리펩톤, 대두분 등이 사용될 수 있다. 그 밖에도 무기염으로는 인산염, 황산염 등이 사용될 수 있다. 배지의 pH는 6-9가 바람직하며 배양 온도는 20-30℃에서 배양가능하다. 본 발명의 디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851이 생산한 효모세포벽 용해효소는 하기 실시예 3 및 4에서 나타낸 바와 같이 분자량이 25,000달톤 정도의 단일 서브유니트를 갖는 효소로서 최적반응 pH와 온도는 pH 8.0, 50℃인 효소이다. 이는 리족토니아로부터 생산되는 효모세포벽 용해효소의 최적 반응 pH와 온도가 6.0, 40℃, 펀자이 임퍼펙타이로부터 생산되는 효소의 최적 반응 pH와 온도가 4.8, 60℃, 바시디오 마이세데로부터 생산되는 효소의 최적 반응 pH와 온도가 5.8, 55℃ 등과 비교했을 때 기존의 다른 곰팡이로부터의 효모세포벽 용해효소의 최적반응 pH, 최적 반응온도와 다르며, 또한 대부분 알려진 효모세포벽 용해효소들은 그 생산균주를 배양할 때 기질효모를 첨가해야만 효소가 다량 생산되는 유도효소들인 데 반해 본 효소는 기질효모를 첨가하지 않은 배지에 균주를 배양하였을때도 다량생산되는 효소로서 기존의 효모세포벽 용해효소들과는 물리 화학적 성질이 다른 신규의 효소로 생각된다. 본 발명의 균주 및 이 균주에 의해 생산된 효소세포벽 용해효소에 대해 하기의 실시예를 참고로 더욱 상세히 설명한다.
[실시예 1]
본 발명의 균주를 옥수수 전분, 당류와 같은 탄소원, 대두분, 효소추출물과 같은 유기질소원 및 인산염 등의 무기염으로 구성된 배지에서 20-35℃의 배양온도, 초기 pH6-9 정도의 배양조건으로 배양함으로써 특히, 본 효소는 포도당 1.0% 혹은 셀로비오스(cellobiose) 1.0%, 대두분(soybean meal) 0.6%, 인산칼륨(K2HPO4) 0.15%, 초기 pH 8.0으로부터 배지조건에서 배양온도를 30℃로 하여 5일간 배양하였을 때 배양액으로부터 다량 얻을 수 있었다. 효소활성을 측정하기 위하여 먼저 기질효모를 조제하였다. 기질효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KFCC 11290을 포도당 1%, 박토펩톤 0.5%, 효모추출물 0.3%, 맥아추출물 0.3%, pH 6.2의 배지조건에서 30℃에서 24시간 진탕배양한 후 원심분리하여 균체를 모은 다음 생리식염수로 2회 세척하고 -20℃에 보관하여 기질효모로서 사용하였다. 또한, 상기의 보관균체를 100℃에서 30분간 방치한 후 가열처리된 기질효모로써 사용하였다. 가열처리된 기질효모를 pH 8.0의 완충액에 OD660nm의 값이 1.0이 되도록 현탁시킨 후 이 균체현탁액 2㎖에 효소액 0.2 ㎖를 가하여 40℃에서 1시간 반응시킨 다음 660 ㎚에서의 습광도 감소를 측정하였다. 이때, 효소활성의 1단위(Unit)는 주어진 조건에서 1분동안 660 ㎚에서의 흡광도를 0.001 감소시키는 효소의 양으로 정하였다.
[실시예 2]
상기의 최적 효소생산 배양조건으로 본 발명의 디시마 속 YCH-37(Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851을 배양하였다. 균주의 생육과 효소생산 및 pH변화를 경시적으로 관찰한 결과를 제 4도에 나타내었다. 제 4도에서 볼 수 있는 바와 같이 균의 생육은 접종 후 120시간까지 증가하다가 정지기에 들어갔으며 배지의 pH는 최초 8.0으로부터 점차 감소하여 60시간에서 pH 6.2까지 떨어진 후 60시간이 지나면서 다시 증가하여 7.6까지 증가하였다. 효소의 생산은 약 80시간 배양이후부터 다시 증가하기 시작하여 120시간 배양할 때 최대활성(15U/㎖)을 보였으나 이후 활성이 감소되는 현상을 보였다.
[실시예 3]
최적 효소생산 배지 1L의 배양액으로부터 본 효소를 흡착법(affinity chromatography), 디이에이이 셀룰로오스(DEAE cellulose) 컬럼크로마토그래피, 하이드록시 아파타이트(hydroxy apatite) 컬럼크로마토그래피 등에 의하여 정제하였으며, 정제된 효소의 특성을 확인한 결과 본 효소는 분자량 25,000달톤 정도의 효소임을 에스 디 에스-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-poiyacrylamide gel electrophoresis)으로 확인하였다. 이 실험결과는 제 5도에 나타내었다.
[실시예 4]
정제된 상기의 효모세포벽 용해효소의 특성을 검토한 결과 호소반응에 있어서 최적 pH는 8.0이었고 pH 6.0부터 pH 9.0까지는 50%이상의 활성을 나타내었으며 pH 4.0부터 pH 9.0까지 거의 100% 인정하였다. 이 결과는 제 6도 및 제7도에 나타내었다. 또한 최적반응온도는 50℃였으며 40℃까지는 1시간 동안 방치후에도 100%활성을 유지하였고 50℃에서는 1시간 방치후에 50%의 잔존활성을 나타내었다. 이 결과는 제 8도 및 제 9도에 나타내었다.
[실시예 5]
본 효소의 효모세포벽에 대한 용해부위를 검토하기 위하여 효모세포벽 성분인 효모 글루칸(yeast glucan)과 같은 성분으로 구성된 라미나린(laminarin; 베타-1,3-글루칸)을 최적반응조건하에서 12시간 반응시킨 후 실리카 젤 씬 레이어 크로마토그래픽(Silica gel thin layer chromatography)를 행한 결과 본 효모세포벽 용해효소는 라미나린을 절단하여 주로 포도당이 3개 연결된 라미나리트리오스(laminaritriose)를 생성하는 일종의 엔도글루카나제(endoglucanase)로 추정된다. 따라서 본 효소는 역시 엔도글루카나아제의 일종인 기존의 아르쓰로박터 루테우스로부터의 효모세포벽 용해효소인 자이몰라아제(zymolase)가 라미나린을 절단하여 포도당이 5개 연결된 라미나리펜타오스(laminaripenyaose)를 생성하는 것과 비교해 보아 서로 다른 상이한 효소임을 알 수 있었다. 이 결과는 제 10도에 나타내었다.
[실시예 6]
본 균주가 생산하는 효모세포벽 용해효소의 작용범위를 알아보기 위해 여러종류의 효모와 세균 및 곰팡이를 검정균주로 사용하였다. 각 균주를 24시간 배양한 후 pH 8.0 완충액에 OD660㎚가 0.5가 되도록 현탁한 후 15U의 효소를 반응개 3㎖에 첨가하여 40℃에서 최대로 용해될 때까지 반응시켰다. 660 ㎚에서의 흡광도 감소를 용해
도(%)로 측정한 결과는 표 2에 나타내었다.
[표 2]
ND* : not determined
검정효모는 생균과 가열처리된 균을 사용하였다. 실험에 사용한 검정균주들 중 세균은 살모넬라 타이피무리엄(Salmonella typhimurium)만이 35%정도 용해되었고 나머지 세균들은 본 효소에 의해 용해되지 않았다. 또한 곰팡이류는 용해되지 않았고, 가열처리된 검정효모는 거의 대부분 용해되었으며, 생효모의 경우 토룰롭시스 캔디다(Torulopsis candida), 자이고사카로마이시스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii), 사카로마이시스 리폴리티가(Saccharomyces lipolytica), 한세뉼라 아노말라(Hansenular anomala) 등이 잘 용해되었다. 주목할 점은 본 효소가 용해시킬 수 있는 살모넬라 타이피무리엄은 식종독을 일으키는 병원성 세균으로 본 효소를 사용하여 이 균주의 생육을 억제함으로써 식품의 저장성을 높일 수 있으며 효모중 토룰롭시스, 한세뉼라 등은 김치의 장기보존시 상층에 생육하여 김치의 연부에 관여하는 효모균체로서 역시 본 효소를 사용함으로써 이들의 생육을 억제하여 김치의 저장성을 높히는 데도 사용가능하다. 또한 가열처리한 효모들은 특히 본 효소에 대해 쉽게 용해되므로 효모엑기스 추출에도 사용가능성이 높은 것으로 생각된다.
[실시예 7]
본 발명의 효소를 이용한 효모 추출물 제조를 위하여 기질효모가 잘 용해되는 조건을 확립하였다. 먼저 본 효소에 의해 잘 용해가 되지 않는 균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KFCC 11290을 기질효모로 하여 배양조건을 달리함으로써 기질효모의 용해도를 증가시켰다. YM배지 성분으로 각시간별로 배양한 효모를 기질로 하여 OD660㎚값을 0.8부근으로 조절하여 현탁한 후 15U의 효소를 첨가하여 효소반응최적조건에서 4시간 반응시켰을 때 초기 OD값에 대한 OD값 감소를 용해도로 하여 측졍한 결과 표 3에 나타낸 바와 같이 10시간 배양된 기질효모는 약 70%까지 용해되었고 그 이상으로 배양된 기질효모의 용해도는 낮았다. 또한 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)가 첨가된 배지에서 48시간 배양된 효모의 용해도는 60%였고 진탕배양한 효모보다 정치배양한 효모의 용해도가 50%로서 더 잘 용해되는 것으로 나타났다.
[표 3]
본 효소에 의해 잘 용해가 되지 않는 균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KFCC 11290을 전처리함으로써 효모의 용해도를 증가시켰다. 유기용매를 효모에 첨가하여 1시간 동안 방치한 후 세척하여 최적반응 조건에서 효소와 반응시킴으로써 효모의 용해도를 증가시켰다. 마찬가지로 각 온도에서 가열처리함으로써 효모의 용해도를 증가시켰다. 용해도는 80℃에서 전처리 했을 때 가장 높았다(표 4 참조).
[표 4]
또한 기질효모와 본 효소를 반응시킬 때 여러 화학물질을 첨가함으로써 용해도를 증가시켰다. 표 5에 나타낸 바와 같이 기질효모의 현탁액에 각 화학물질을 첨가한 후 효소를 첨가하여 반응시킨 결과 트라이톤 엑스-100(Triton X-100), 소디움 도데실 설페이트(SDS), 소디움 설파이트(Sodium sulfite)등을 첨가하면 효모의 용해도가 증가함을 알 수 있었다.
[표 5]

Claims (4)

  1. 다음 표와 같이 효모 및 살모넬라 티피머리움 (Salmonella typhimurium)의 세포벽 용해효소를 생산하는 다음 그림의 형태를 지닌 디시마 속 YCH-37 (Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851의 미생물
    [표]
    디시마 속 YCH-37 (Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851의 미생물이 생산하는 효소에 의한 각종 균주의 용해도
    ND* : not determinined
    그림. 디시마 속 YCH-37 (Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851의 현미경 사진
  2. 특허청구범위 제 1항 기재의 형태를 지닌 디시마 속 YCH-37 (Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851의 배양액으로부터 효모 및 살모넬라 티피머리움(Salmonella typhimurium)의 세포벽 용해효소를 회수함을 특징으로 하는 효모 및 살모넬라 티피머리움(Salmonella typhimurium)의 세포벽 용해효소의 제조 방법
  3. 특허청구범위 제 1항 기재의 형태를 지닌 디시마 속 YCH-37 (Dicyma sp. YCH-37) KFCC 10851이 생산 하는 분자량 약 25,000달톤, 최적활성 PH 8.0 부근, 20-60℃의 반응온도, 50℃의 최적반응온도, pH 4-10의 안정 pH 등의 특성을 지니는 효모 및 살모넬라 티피머리움 (Salmonella typhimurium)의 세포벽 용해효소
  4. 다음 표와 같이 효모를 가열처리하거나 유기용매로 전처리함으로써 본 효소에 의한 효모세포벽의 용해도를 높이는 방법
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