KR100523528B1 - 키티나아제를 생산하는 신규한 셀룰로모나스 gm13 속 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키티나아제를 생산하는 신규한 셀룰로모나스 속 GM13 균주와 이 균주가 생산하는 키티나아제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명 신규한 셀룰로모나스 속 GM13 균주가 생산하는 키티나아제는 키틴으로부터 N-아세틸-β-D-글루코사민(NAG) 2당체 뿐만 아니라 고중합도의 올리고당을 매우 효율적으로 생성하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

키티나아제를 생산하는 신규한 셀룰로모나스 GM13 속 균주{Novel Cellulomonas sp. GM13 strain producing chitinase}

본 발명은 키티나아제를 생산하는 신규한 셀룰로모나스 GM13 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상기 균주가 생산하는 키틴분해효소인 키티나아제 및 이를 이용한 키틴 올리고당 및 N-아세틸-β-D-글루코사민(NAG)의 제조방법에 관한 것이다.

지구 상에 섬유소 다음으로 풍부한 생물질(biomass)인 키틴은 N-아세틸-β-D-글루코사민(NAG)을 기본 단위로 하여 β-1, 4 결합으로 연결된 다당류로서 분자량은 약 1×10⁶ 정도이다. 키틴은 게, 크릴새우, 보리새우 등과 같은 바다 갑각류들과 거미, 개미, 메뚜기 등과 같은 곤충의 외피를 구성하는 주성분이며, 미생물에서는 녹조류, 효모, 사상균 등의 세포벽 성분으로 발견된다.

이러한 키틴은 중요한 천연자원으로서 그 응용성이 점차 증가되고 있다. 특히 최근에는 키틴의 분해산물인 키틴 올리고당에서 항균작용, 항암작용, 면역강화작용, 병원성 진균에 대한 식물의 저항성 유도작용, 유산균 증식 촉진작용 등이 발견되었고 또한 키틴의 단량체인 NAG는 퇴행성 관절염 치료에 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 항염증, 심장보호, 간장보호, 물질동화 촉진에도 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

이러한 키틴 올리고당과 NAG는 산분해법(acid hydrolysis)으로 키틴으로부터 생산되고 있다. 그러나 산분해법에 의한 키틴 올리고당 제조의 경우에는 올리고당 수율이 낮을 뿐만 아니라 단당을 포함한 저중합도의 올리고당이 많이 생기는 문제점이 있다. 또한 반응 후 잔류염을 제거하기 위해서 용매를 사용하거나, 비교적 고중합도의 올리고당을 얻기 위해서 키토산 분해물을 분획해야 하는 어려움이 있는데, 이때 많은 양의 용매가 사용되기 때문에 환경적인 문제를 일으킬 수 있으며 의약품 등에 사용될 수 있는 고순도의 올리고당을 생산하기가 힘든 단점이 있다. 한편, 산분해법에 의한 NAG 제조의 경우에는 키틴의 산 분해 과정에서 키틴이 단당으로 분해되고 동시에 탈아세틸화가 일어나 D-glucosamine(DGA)과 NAG가 같이 생성되는데, 탈아세틸화를 줄이기 위해서 산의 농도와 온도를 낮추게 되면 키틴으로부터 얻어지는 NAG의 효율이 낮아지는 문제점이 있다. 게다가 이러한 기존의 NAG 제조공정은 고농도 산을 사용하기 때문에 장치의 부식, 작업의 위험, 불순물 제거를 위한 복잡한 정제공정을 필요로 하는 단점이 있다. 이런 이유로 최근에는 키틴 올리고당과 NAG 제조를 위해서 기존의 산분해법을 대체하기 위한 효소적 방법이 모색되고 있다.

효소적 방법에 의한 키틴 올리고당 제조는 온화한 반응조건을 사용하고, 2당 이상의 올리고당 수율이 높으며, 사용 효소에 따라서는 비교적 고중합도의 올리고당을 만들 수 있는 장점이 있다. 또한 효소적 방법에 의한 키틴 분해의 경우에는 최종 분해산물인 NAG의 탈아세틸화가 일어나지 않기 때문에 불순물이 생기지 않아 정제 공정이 매우 단순하고 높은 수율로 NAG를 생산할 수 있는 장점이 있다.

효소적 방법에 의해 키틴을 완전분해하기 위해서는 키틴 사슬의 내부를 무작위로 절단하는 엔도키티나아제(endochitinase)와 이 엔도키티나아제에 의해 생성된 키틴 올리고당을 비환원말단에서 순차적으로 절단하여 키틴 단량체인 NAG로 완전 가수분해시키는 엑소키티나아제(exochitinase)가 필요하다. 키티나아제(chitinase)는 이러한 키틴 가수분해 효소의 총칭이다. 그런데 키틴으로부터 효소적 방법에 의해 키틴 올리고당을 제조하기 위해서는 엔도키티나아제가 필요하고, 키틴을 완전 분해하여 NAG를 제조하기 위해서는 엔도키티나아제와 아울러 엑소키티나아제가 필요하다.

그러나 결정상태의 딱딱한 키틴을 올리고당으로 효과적으로 분해하여 키틴으로부터 직접 비교적 고중합도의 키틴 올리고당을 만들 수 있는 효소는 아직 개발되지 않고 있을 뿐만 아니라 고중합도의 키틴 올리고당을 키틴 단량체인 NAG로 효율적으로 분해할 수 있는 엑소키티나아제의 개발 또한 부진한 실정이다.

특히, 지금까지 보고된 키티나아제들은 난분해성인 키틴을 효과적으로 분해하지 못하는 문제점이 있다. 따라서 아직까지 효소적 방법에 의해 효율적으로 키틴 올리고당과 NAG를 생산하기 위한 공정이 개발되지 않고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 키틴 분해를 위한 효소공정에 사용될 수 있는 높은 활성을 지닌 키티나아제를 획득하기 위해서 신규한 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속 균주를 토양에서 분리하여 이를 동정하였으며, 상기 균주의 배양액으로부터 키티나아제를 정제하여 반응특성을 조사함으로써 키틴 분해능이 뛰어나며 고중합도의 올리고당을 생성하는 등 기존에 보고된 키티나아제들과는 다른 신규한 효소임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 키티나아제를 생산하는 신규의 셀룰로모나스 속 GM13 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 셀룰로모나스 속 GM13 균주가 생산하는 키티나아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용한 키티나아제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 키티나제를 이용한 효소적 분해방법에 의해 키틴으로부터 키틴 올리고당과 NAG을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 반응혼합물, 즉 키틴 올리고당과 NAG 혼합물을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 키틴 분해활성을 갖는 미생물 및 이로부터 분리한 키틴분해효소에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양으로부터 분리한 신규한 셀룰로모나스 속 G13 균주가 생산하는 엑도키티나아제 및 엔소키티나아제를 이용하여 생리활성이 높은 고중합도의 키틴 올리고당을 생산하는 방법에 관한 것이다.

키티나아제의 분리정제는 기존에 밝혀진 키티나아제의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용가능하다. 크로마토그래피 방법에 의해 순수 분리한 본 발명 키티나아제의 순도 검정은 전기영동법을 이용하여 증명하였으며. 표준분자량 물질과 함께 이동시켜 이동거리를 비교함으로써 키티나아제 분자량을 결정하였다.

본 발명에서 키틴분해효소를 분리하기 위하여 사용된 셀룰로모나스 속 G13균주는 토양에서 분리한 신규한 균주로, 토양에서 수집한 시료를 멸균 증류수에 현탁시킨 후 4℃에서 하룻밤 정치시키고 상등액을 적절히 희석하여 MCG 평판배지(1 리터당 콜로이달 키틴 5 g; 효모 추출물 6.7 g; Na₂HPO₄ 12.8 g; KH₂PO₄ 5 g; NaCl 0.5 g; (NH₄)₂SO₄ 1 g; 포도당 10 g)에 도말한 후, 30℃에서 정치배양하면서 MCG 평판배지위에서 분해환을 비교적 빨리 형성시키는 것과 분해환의 크기가 상대적으로 큰 균주를 1차적으로 선발하고, 상기 선발된 1차 분리균주를 MCG 액체배지에서 5일간 진탕배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고 배양상등액의 키티나아제 활성을 측정한 결과 키티나아제 활성이 가장 높은 것으로 나타난 균주를 셀룰로모나스 속 GM13(Cellulomonas sp. GM13)으로 명명하고 생명공학연구원 내 유전자 은행에 2001년 2월 5일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 18073P).

본 발명 셀룰로모나스 GM13 균주의 키티나아제는 기질인 키틴에 의해서 생산이 유도되나, 포도당에 의해서는 그 생산이 억제되는 것으로 나타났으며, 이 중 엔도키티나아제는 다른 엑소키티나아제에 비해서 키틴 분해초기에 다량 생산되는 것으로 나타났다.

본 발명 G13 균주의 온도에 따른 키티나아제 생산성을 조사한 결과 30℃ 배양에서 가장 높은 키티나아제 생산성을 나타냈으며, 25℃, 37℃, 40℃에서 배양했을 때는 각각 30℃ 배양에서의 키티나아제 생산성과 비교하여 약 91%, 43%, 0% 생산성을 나타내었다.

본 발명 G13 균주의 pH에 따른 키티나아제 생산성을 조사한 결과 배지의 초기 pH가 7.0인 경우가 가장 높은 키티나아제 생산성을 나타냈으며, pH 5.0, 6.0, 8.0, 9.0에서 배양했을 때는 각각 pH 7.0 배양에서의 키티나아제 생산성과 비교하여 약 0%, 88%, 82%, 65% 생산성을 나타내었다.

한편, 공지된 대부분의 키티나아제 생산균주들은 콜로이달 상태로 팽창화시키지 않은 결정성 키틴인 게껍질 키틴과 powder 키틴을 이용하지 못한다고 알려져 있으나 본 발명의 GM13 균주는 상기와 같은 결정성 키틴을 탄소원으로 이용할 수 있는 특성을 보였으며, powder 키틴을 탄소원으로 사용했을 때가 콜로이달 키틴을 탄소원으로 사용했을 때 보다 더 높은 키티나아제 생산성을 나타내었다.

또한 powder 키틴의 농도를 달리하여 키티나아제 생산성을 조사해 보았더니 powder 키틴의 농도가 1.5%(w/v)일 때가 최고의 키티나아제 생산성을 나타내었다.

본 발명 G13 균주의 질소원에 따른 키티나아제 생산성을 조사한 결과 시험한 질소원 중 pharmamedia를 질소원으로 첨가하였을 때가 가장 높은 키티나아제 생산성을 나타내었다.

본 발명 G13 균주가 생산하는 키티나아제의 종류를 전기영동한 결과 63 kDa, 50 kDa, 37 kDa, 33 kDa, 20 kDa 크기의 5 종류의 키티나아제 활성 밴드를 나타내기 때문에 적어도 5종의 키티나아제를 생산한다는 것을 알 수 있었으며, 토요-펄 크로마토그래피를 수행하여 분획한 첫 번째 분획(Set Ⅰ)의 경우에는 엔도키티나아제 활성은 전혀 없고 키티나아제 활성만을 나타내었으며, 두 번째 분획(Set Ⅱ)의 경우에는 낮은 엔도키티나아제 활성을 보였으나, 세번째 분획(Set Ⅲ)의 경우는 키티나아제 활성뿐만 아니라 매우 높은 엔도키티나아제 활성을 보여 콜로이달 키틴의 탁도를 현저히 감소시켰다. 상기 정제된 분자량 63 kDa의 세번째 분획(Set Ⅲ) 키티나아제를 엔도키티나아제로 분류하고 반응 최적 온도와 최적 pH를 조사한 결과, 최적 반응온도는 60℃였으며, 최적 pH는 7.0이었다. 기질 특이성을 조사한 결과 콜로이달 키틴과 3당 이상의 N-아세틸-키토올리고당들에 대해서 높은 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

TLC 방법에 의해 본 발명 G13 균주가 생산하는 키티나아제들에 의한 콜로이달 키틴의 반응산물을 분석해 보았을 때, 콜로이달 키틴을 분해하여 NAG 2당체를 가장 많이 생성하였을 뿐만 아니라, 소량의 NAG 3당체, 4당체, 5당체, 6당체도 생성함을 알 수 있었다. 공지의 키티나아제들은 키틴을 분해하여 NAG 3당체 이상의 고중합도 올리고당을 생성하는 예가 극히 드물기 때문에 본 발명의 키티나아제는 생리활성이 높은 고중합도의 키틴 올리고당 생산에 유용할 것으로 판단되었다.

한편, GM13 균주를 0.5%(w/v) 콜로이달 키틴이 첨가된 MC배지에서 배양을 한후에 배양 상등액과 세포 추출물의 엑소키티나아제 활성을 측정해본 결과 배양 상등액에서는 엑소키티나아제 활성이 검출되지 않은 반면에 세포 추출물에서 엑소키티나아제 활성이 검출되었으며, 특히 키틴 무첨가 LB배지(1 리터 당; 박토 트립톤, 10 g; 효모 추출물, 5 g; NaCl, 5 g)에서 배양한 세포 추출물이 높은 엑소키티나아제 생산성을 나타내어, 지금까지 보고된 키틴 첨가에 의해 그 생산성이 높아지는 유도성 엑소키티나아제들과는 다름을 알 수 있어 본 발명의 세포 내 엑소키티나아제는 지금까지 보고된 적이 없는 신규한 키티나아제로 판단되었다.

본 발명 키티나아제 단백질들의 키틴분해 활성을 이용한 다양한 산업적 응용이 가능하다. 본 발명 키나아제를 이용하여 제조한 수용성 저분자 키토산, 키틴 및 이들의 올리고당은 식품, 화장품, 의약품, 농업분야 등의 분야에 광범위하게 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명 키티나아제를 택일적 또는 조합적으로 선택하여 실제 NAG 단량체 및/또는 키틴올리고당을 제조함으로써 건강음료 및 식품개발 등에 이용할 수도 있으며, 키틴분해 활성을 이용하여 작물에 병을 유발하는 곰팡이나 선충 등을 방제하기 위한 생물농약이나 키티나아제 유전자로 형질전환된 키틴 내성 형질전환 식물 개발, 의약품 등에 이용될 수도 있다.

본 발명은 토양으로부터 셀룰로모나스 속 GM13 균주의 분리 및 동정 단계; 배지와 배양조건에 따른 GM13 균주의 키티나아제 생산성 조사 단계; GM13 균주의 배양액으로부터 정제된 키티나아제의 특성 조사 단계; GM13 균주가 생산하는 엑소키티나아제의 생산성 조사 단계로 이루어진다.

이하, 본 발명의 균주, 키틴분해 활성을 갖는 키티나아제 효소의 정제 및 효소의 특성 등을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐, 본 발명의 권리범위는 하기 실시에에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 셀룰로모나스 속 GM13 균주의 분리 및 동정

경남 남해안 일대의 토양에서 수집한 시료 1 g 정도를 30 ㎖ 멸균증류수에 현탁시킨 후 4℃에서 하룻밤 정치시키고 상등액을 적절히 희석하여 MCG 평판배지(1리터 당 콜로이달 키틴 5 g; 효모 추출물 6.7 g; Na₂HPO₄ 12.8 g; KH₂PO ₄ 5 g; NaCl 0.5 g; (NH₄)₂SO₄ 1 g; 포도당 10 g)에 도말하였다. 30℃에서 정치배양하면서 MCG 평판배지위에서 분해환을 비교적 빨리 형성시키는 것과 분해환의 크기가 상대적으로 큰 균주를 1차적으로 선발하였다. 1차 분리균주를 MCG 액체배지에서 5일간 진탕배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고 배양상등액의 키티나아제 활성을 측정하여 활성이 제일 높게 나타나는 GM13 균주를 최종 선발하였다.

이때, 키티나아제 활성은 1%(w/v) 콜로이달 키틴에 적당량의 효소를 첨가하여 50℃에서 30분간 반응시킨 후에 반응산물의 환원당을 디니트로 살리실릭산(dinitrosalicylic acid: DNS) 방법 (참조: G. L. Miller, Analytical Chemistry, 31: 426-428(1959))으로 측정하여 결정하였다. 본 방법에 의한 키티나아제 활성 단위(unit, U)는 시간당 1 μmole의 NAG를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 그리고 엔도키티나아제 활성은 0.05%(w/v) 콜로이달 키틴에 적당량의 효소를 첨가하여 50℃에서 반응시킨 후에 510 nm에서 흡광도를 측정하여 반응액의 탁도가 감소되는 정도로 활성을 결정하였으며, 활성단위는 분당 반응액의 탁도를 0.1 감소시키는 효소의 양으로 정의하였다.

토양으로부터 분리한 GM13 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사해 본 결과는 하기 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같았으며 버기의 방법(참조: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, Springer-Verlag Co. (1974))에 따라 셀룰로모나스 속(Cellulomonas sp.) 세균으로 동정하였다. 또한 더욱 정확한 동정을 위하여 분리균주의 16S rDNA를 클로닝한 후에 염기서열을 분석하고 계통도를 작성하였다(도 1 및 도 2). 이들 결과를 토대로 본 발명의 키티나아제 생산 균주는 공지의 키티나아제 생산 균주들과는 다른 미생물학적 특성을 가진 신규한 균주이며, 셀룰로모나스 속에 속하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명의 신규한 토양분리 균주를 셀룰로모나스 속 GM13(Cellulomonas sp. GM13)으로 명명하고 생명공학연구원 내 유전자 은행에 2001년 2월 5일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 18073P).

실시예 2 : 배지와 배양조건에 따른 셀룰로모나스 속 GM13 균주의 키티나아제 생산성 조사

실시예 2-1. 콜로이달 키틴 첨가에 의한 키티나아제 생산성 변화 조사

현재까지 보고된 모든 키티나아제들은 기질로서 사용되는 키틴이 배지 내에 존재해야 대량 생산되는 유도성 효소(inducible enzyme)로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 GM13 균주에서도 키티나아제 생산이 키틴에 의해 유도되는지 여부를 알아보기 위해서 GM13 균주를 MCG배지, MC배지(MCG 배지에서 포도당이 1% 대신에 0.05% 첨가된 배지), MG배지(MCG배지에서 키틴이 제외된 배지)에 각각 접종하고 30℃에서 진탕배양하면서 12시간 간격으로 시료를 분취하였다. 그 후에 균체를 제거하고 배양 상등액의 키티나아제 활성과 엔도키티나아제 활성을 측정하였다.

실험 결과 MC배지에서는 키티나아제 활성과 엔도키티나아제 활성이 배양시간이 지남에 따라 점차적으로 증가하여 36시간 배양시 각각 13 U/㎖과 2.2 U/㎖을 보였다.

반면에 MG배지의 경우 36시간 배양 후 4.4 U/㎖과 0.0 U/㎖로 나타났고, MCG배지의 경우에는 각각 12 U/㎖과 1.28 U/㎖으로 나타났다. 이 결과로부터 GM13 균주의 키티나아제 생산은 기질인 키틴에 의해서 유도되며, 포도당에 의해서 키티나아제 생산이 억제된다는 것을 알 수 있었다.

한편, GM13 균주를 MC배지에서 배양했을 때 도 3에 도시된 바와 같이 키티나아제 활성은 54시간째 최대를 보였으며 엔도키티나아제 활성은 48시간째에 최대를 보였다. 세포외 단백질의 경우에는 36시간부터 42시간 사이에 급격한 증가를 보였고 그 이후로는 큰 변화가 없었다. 키티나아제 활성에 대한 엔도키티나아제 활성의 비를 조사하면 42시간째에 최고가 됨을 알 수 있어 엔도키티나아제는 다른 엑소키티나아제에 비해서 키틴 분해초기에 다량 생산된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2-2. 배양온도와 배양 pH에 따른 키티나아제 생산성 조사

GM13 균주를 MC배지에 접종하여 25℃, 30℃, 37℃, 40℃의 4가지 배양온도에서 5일간 진탕배양한 후에 키티나아제 생산성을 조사하였다. 그 결과, 30℃에서 배양한 경우가 가장 높은 키티나아제 생산성을 나타냈으며, 25℃, 37℃, 40℃에서 배양했을 때는 각각 30℃ 배양에서의 키티나아제 생산성과 비교하여 약 91%, 43%, 0% 생산성을 나타냈다.

또한 MC배지의 초기 pH를 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0의 5가지로 조정한 후에 GM13 균주를 접종하고 30℃에서 3일간 배양하여 키티나아제 생산성을 조사한 결과, 배지의 초기 pH가 7.0인 경우가 가장 높은 키티나아제 생산성을 나타냈으며, pH 5.0, 6.0, 8.0, 9.0에서 배양했을 때는 각각 pH 7.0 배양에서의 키티나아제 생산성과 비교하여 약 0%, 88%, 82%, 65% 생산성을 나타냈다.

실시예 2-3. 탄소원에 따른 키티나아제 생산성 조사

키티나아제 생산 유도물질(inducer)로써 MC배지 내에 첨가되는 0.5%(w/v) 콜로이달 키틴 대신에 게껍질에서 추출한 덩어리 형태의 게껍질 키틴(crab shell chitin)과 이것을 미세하게 분말화시킨 powder 키틴(powder chitin)을 각각 0.5%(w/v)되게 첨가한 후에 GM13 균주의 키티나아제 생산성을 조사하였다.

그 결과, 기존의 공지된 대부분의 키티나아제 생산균주들은 콜로이달 상태로 팽창화시키지 않은 결정성 키틴인 게껍질 키틴과 powder 키틴을 이용하지 못한다고 알려져 있으나 본 발명의 GM13 균주는 상기와 같은 결정성 키틴을 탄소원으로 이용할 수 있는 특성을 보였으며, powder 키틴을 탄소원으로 사용했을 때가 콜로이달 키틴을 탄소원으로 사용했을 때 보다 더 높은 키티나아제 생산성을 나타냈다. 특히, powder 키틴의 농도를 달리하여 키티나아제 생산성을 조사해 보았더니 하기 표3에 나타낸 바와 같이 powder 키틴의 농도가 1.5%(w/v)일 때가 최고의 키티나아제 생산성을 나타냈다.

실시예 2-4. 질소원에 따른 키티나아제 생산성 조사

0.5%(w/v) powder 키틴을 탄소원으로 하는 MC배지에 0.5%(w/v) 효모 추출물 대신에 여러 종류의 질소원을 0.5%(w/v)가 되게 첨가하여 각 질소원에 따른 키티나아제의 생산성을 조사하였다.

하기 표 4에 나타낸 바와 같이 pharmamedia를 질소원으로 첨가하였을 때가 가장 높은 키티나아제 생산성을 나타냈다.

실시예 3 : 셀룰로모나스 속 GM13 균주 배양액으로부터 키티나아제의 분리 정제

GM13 균주 배양액으로부터 하기 표 4에 나타낸 과정에 의하여 키티나아제를 정제하였다. 특히, 1 M 황산암모늄이 첨가된 10 mM 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate, pH 6.8)에 녹아 있는 키티나아제 시료를 동일한 완충용액으로 평형화된 페닐-토요펄 칼럼에 흡착시킨 후에 1 M에서 0 M까지의 황산암노늄 직선농도구배에 의해 흡착된 효소를 용출하였을 때, 0.2 M과 0 M 황산암모늄 농도범위에서 키티나아제 활성을 가지는 세 종류의 분획을 얻을 수 있었다(도 4).

그런데 상기 표 5와 도 5에서 보는 바와 같이 첫 번째 분획(Set Ⅰ)의 경우에는 엔도키티나아제 활성(즉, 키틴의 탁도 감소능)은 전혀 없고 키티나아제 활성만을 나타내었으며, 두 번째 분획(Set Ⅱ)의 경우에는 낮은 엔도키티나아제 활성을 보였다. 그러나 세번째 분획(Set Ⅲ)의 경우는 키티나아제 활성뿐만 아니라 매우 높은 엔도키티나아제 활성을 보여 콜로이달 키틴의 탁도를 현저히 감소시켰다.

GM13 균주의 배양 상등액을 전기영동한 후 코마시 블루 염색과 글리콜 키틴 활성염색을 하였을 때, 63 kDa, 50 kDa, 37 kDa, 33 kDa, 20 kDa 크기의 5 종류의 키티나아제 활성 밴드를 나타내기 때문에 GM13 균주는 적어도 5종의 키티나아제를 생산한다는 것을 알 수 있었다(도 6).

그런데, 엔도키티나아제 활성이 높았던 Set Ⅲ 키티나아제의 경우에 코마시 블루 염색과 활성염색을 수행하였을 때, 63 kDa 크기의 키티나아제 밴드만 나타나므로 키티나아제가 순수분리되었음을 알 수 있었다. 반면에 엔도키티나아제 활성이 전혀 없었던 Set Ⅰ 키티나아제의 경우 63 kDa 키티나아제를 제외한 50 kDa, 37 kDa, 33 kDa, 20 kDa 등 4종류의 키티나아제를 포함하고 있었다. 이들 결과로 미루어보아 Set Ⅲ 키티나아제는 엔도키티나아제라고 유추된다. 또한 Set Ⅲ 효소를 이용하여 4-methylumbelliferyl(MU)-(NAG)₂와 4-MU-(NAG)₃의 분해력을 비교해 보았을 때, Set Ⅲ 효소는 4-MU-(GlcNAc)₃에 대한 반응성이 4-MU-(GlcNAc)₂에 대한 반응성보다 약 3.5배 높은 것을 알 수 있었다. 이들 결과와 키틴 탁도 감소능 등을 고려하여 Set Ⅲ 키티나아제를 엔도키티나아제로 분류하였다.

실시예 4. GM13 균주 배양액으로부터 순수정제된 엔도키티나아제의 특성 분석

실시예 4-1. 엔도키티나아제의 N-말단 아미노산 서열

63 kDa 분자량을 갖는 Set Ⅲ 키티나아제의 N-말단 아미노산을 조사한 결과, 알라닌-글리신-트레오닌-페닐알라닌-트레오닌-알라닌-트레오닌-페닐알라닌 순으로 나타났다.

실시예 4-2. 엔도키티나아제의 최적 온도와 최적 pH열 안정성

순수정제된 엔도키티나아제의 최적 반응온도와 최적 pH를 알아보기 위해서 다양한 온도와 pH 조건에서 효소활성을 측정한 결과, 도 7의 (가)에 도시된 바와 같이 정제된 효소의 최적 반응온도는 60℃였으며, 최적 pH는 7.0이었다(도 7(나)).

실시예 4-3. 엔도키티나아제의 기질 특이성

표 6에 나타낸 바와 같이 정제된 엔도키티나아제는 콜로이달 키틴과 3당 이상의 N-아세틸-키토올리고당들에 대해서 높은 활성을 나타냈다. 그리고 글리콜 키틴에 대해서는 낮은 활성을 보였으나, 게껍질 키틴(crab shell chitin)이나 키토산, N-아세틸-키토바이오스에 대해서는 활성을 나타내지 않았다.

실시예 4-4. 콜로이달 키틴의 분해산물 분석

박층 크로마토그래피(TLC) 방법에 의해 실시예 3의 키티나아제들에 의한 콜로이달 키틴의 반응산물을 분석해 보았을 때(도 8), 엔도키티나아제(Set Ⅲ 키티나아제)와 Set Ⅱ 키티나아제는 콜로이달 키틴을 분해하여 NAG 2당체를 가장 많이 생성하였다. 또한 반응산물로써 NAG도 많이 생성되었을 뿐만 아니라 소량의 NAG 3당체, 4당체, 5당체, 6당체도 관찰되었다. 그런데 공지의 키티나아제들은 키틴을 분해하여 NAG 3당체 이상의 고중합도 올리고당을 생성하는 예가 극히 드물기 때문에 본 발명의 키티나아제는 생리활성이 높은 고중합도의 키틴 올리고당 생산에 유용할 것으로 판단되었다.

한편, 엔도키티나아제 활성을 전혀 나타내지 않았던 Set Ⅰ키티나아제는 콜로이달 키틴을 분해하여 반응산물로써 NAG와 NAG 2당체만을 생성하고 3당 이상의 올리고당은 생성하지 못하였다.

실시예 5. GM13 균주가 생산하는 엑소키티나아제의 생산성 조사

GM13 균주를 0.5%(w/v) 콜로이달 키틴이 첨가된 MC배지에서 배양을 한 후에 배양 상등액과 세포 추출물의 엑소키티나아제 활성을 측정해보았다. 이때 엑소키티나아제 활성은 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 엑소키티나아제 활성 측정을 위한 인공기질인 p-nitrophenyl-β-D-N-acetylglucosamine을 2 mM되게 첨가한 것을 기질로 사용하였다. 이 기질용액 0.2 ㎖에 효소용액 0.2 ㎖을 첨가한 후에 50℃에서 15분간 반응시켰다. 그 후에 0.1 M glycine-NaOH 완충용액(pH 10.5) 1 ㎖을 첨가하여 효소반응을 중지시키고 흡광도 420 nm에서 가수분해시 방출되는 p-nitrophenol 양을 측정하였다. 효소단위(unit)는 분당 1 μ mole의 p-nitrophenol을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

상기의 방법으로 엑소키티나아제 활성을 측정한 결과, 배양 상등액에서는 엑소키티나아제 활성이 검출되지 않은 반면에 세포 추출물에서 엑소키티나아제 활성이 검출되었다. 특히, 키틴이 첨가되지 않은 LB배지(1 리터 당; 박토 트립톤, 10 g; 효모 추출물, 5 g; NaCl, 5 g)에서 배양을 하여 얻은 GM13 균주의 세포 추출액의 경우에 1.37 unit/㎖의 높은 엑소키티나아제 생산성을 나타냈다. 그런데 지금까지 보고된 엑소키티나아제들은 대부분 배지 내에 첨가된 키틴에 의해 생산성이 증가되는 유도성 효소이었며, 그람양성세균에서 세포 내에 존재하는 엑소키티나아제가 아직까지 보고된 적이 없었다. 따라서 본 발명의 세포 내 엑소키티나아제는 지금까지 보고된 적이 없는 신규한 키티나아제로 판단되었다. 세포추출물을 Superose 12HR 칼럼을 통과시키고 활성분획을 전기영동하여 순수 분리 정제된 엑소키티나아제를 코마시 염색과 4-MU-GlcNAc(4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosamine) 활성 염색을 한 결과 그 분자량이 약 54,000 달톤임을 알 수 있었다.

이상 상세히 설명한 바와 같이, 토양으로부터 분리한 본 발명 신규한 셀룰로모나스 속 GM13 균주가 생산하는 키티나아제는 키틴 분해능이 뛰어나며 NAG 2당체뿐만 아니라 고중합도의 올리고당도 생성하는 것이 확인되었는 바, GM13 균주가 생산하는 키티나아제는 키틴 올리고당과 NAG 생산에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

도 1은 셀룰로모나스 속 GM13 균주의 16S rDNA 염기서열(서열번호 1)을 나타낸 그림이다.

도 2는 16S rDNA 염기서열 분석에 따른 셀룰로모나스 속 균주들의 계통도를 나타낸 그림이다(아래에 표시한 막대기는 1%의 염기 다양성을 나타낸다).

도 3은 MC 배지에서 배양시간에 따른 GM13 균주의 키티나아제, 엔도키티나아제 및 단백질 생성을 조사한 그래프이다.

도 4는 GM13 균주 배양액에서 키티나아제를 정제하기 위한 페닐-토요펄 칼럼 크로마토그래피를 나타낸 그림이다.

도 5는 페닐-토요펄 칼럼 크로마토그래피를 통하여 분리된 분획들(Set Ⅰ, Set Ⅱ, Set Ⅲ)의 콜로이달 키틴에 대한 탁도 감소능을 나타낸 그림이다.

도 6은 GM13 균주의 배양 상등액과 페닐-토요펄 칼럼 크로마토그래피를 통하여 분획된 단백질들을 전기영동하여 코마시블루 염색(가)과 글리콜 키틴 활성염색(나)을 한 것이다.

도 7은 순수정제된 엔도키티나아제의 최적 온도(가)와 최적 pH(나)를 나타낸 그림이다.

도 8은 본 발명의 페닐-토요펄 칼럼 크로마토그래피를 통하여 분리된 분획들(Set Ⅰ, Set Ⅱ, Set Ⅲ 키티나아제)을 이용하여 콜로이달 키틴으로부터 생성된 반응산물을 나타낸 박층 크로마토그래피(TLC) 그림이다.

<110> AMICOGEN CO., Ltd <120> Novel Cellulomonas GM13 strain producing chitinase <130> s01-10 <160> 1 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 1471 <212> DNA <213> Cellulomonas GM13 <220> <221> rRNA <222> (1)..(1471) <223> 16S rRNA sequence of Cellulomonas GM13 strain <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac ggtgacggcc agcttgctgg 60 tctgatcagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgagcaacc tgcccttcac tctgggataa 120 gccttggaaa cgaggtctaa taccggatac gacgcacctg ggcatctggt gtgcgtggaa 180 agatttttcg gtgggggatg ggctcgcggc ctatcagctt gttggtgggg tgatggccta 240 ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg actgagacac 300 ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat 360 gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttc agcagggaag 420 aagcgcaagt gacggtacct gcagaagaag cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480 taatacgtag ggcgcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtt 540 tgtcgcgtct gctgtgaaaa ctcgaggctc aacctcgggc ttgcagtggg tacgggcaga 600 ctagagtgcg gtaggggtga ctggaattcc tggtgtagcg gtggaatgcg cagatatcag 660 gaggaacacc gatggcgaaa gcaggtcact gggccgcaac tgacgctgag gagcgaaagc 720 atggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgtt gggcactagg 780 tgtggggctc attccacgag ttccgtgccg cagcaaacgc attaagtgcc ccgcctgggg 840 agtacggccg caaggctaaa actcaaagaa attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc 900 atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacata caccggaaaa 960 gtgcagagat gtgctcccct tttggtcggt gtacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020 gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgtccc atgttgccag 1080 cgggttatgc cggggactca tgggagactg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggatg 1140 acgtcaaatc atcatgcccc ttatgtcttg ggcttcacgc atgctacaat ggccggtaca 1200 aagggctgcg ataccgcgag gtggagcgaa tcccaaaaag ccggtctcag ttcggattgg 1260 ggtctgcaac tcgaccccat gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcaacgctgc 1320 ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcaa gtcacgaaag tcggtaacac 1380 ccgaagccgg tggcccaacc cttgtggggg gagccgtcga aggtgggact ggcgattggg 1440 actaagtcgt aacaaggtag ccgtaccgga a 1471

Claims (7)

1. 키틴 분해 활성을 갖는 키티나아제 생성능을 갖는 셀룰로모나스 속 G13 균주(KCTC18073P).
2. 상기 제 1항 균주를 키틴이 함유된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 키티나아제 제조방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 상기 제1항의 GM13균주를 이용하여 키틴으로부터 키틴올리고당 또는 NAG를 제조하는 방법.
7. 삭제