KR20050079035A

KR20050079035A - 신규 해양성 미생물 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3이 분비하는 저분자량 알파-아가레이즈와 활용

Info

Publication number: KR20050079035A
Application number: KR1020040007121A
Authority: KR
Inventors: 이용현; 전상은; 신현동
Original assignee: 이엔지바이오 주식회사
Priority date: 2004-02-04
Filing date: 2004-02-04
Publication date: 2005-08-09

Abstract

본 발명은 천연 다당류인 아가 (한천, agar) 및 아가로스 (agarose)의 α- 1,3-글리코사이드 결합 (α-1,3-glycosidic bond)을 특이적으로 절단하는 α-아가레이즈 (α-agarase)를 생산하는 신규 호염성 해양 미생물 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3 (Pseudoalteromons sp. BL-3), 이 균주가 분비?생산하는 저분자량 α-아가레이즈, 이를 암호화하는 유전자의 염기 및 아미노산 서열, 그리고 α-아가레이즈를 항산화 및 세포사멸유도효과 등 생리적 활성을 나타내는 아가로올리고당 (agarooligosacchrodes)의 제조와 전기영동 아가로스 겔 상의 디엔에이 (DNA) 단편을 효소 처리하여 추출, 분리하는 목적으로 활용하는 것이다.

Description

신규 해양성 미생물 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3이 분비하는 저분자량 알파-아가레이즈와 활용 {A low molecular weight agarose-specific α-agarase from an agarolytic marine bacterium Pseudoalteromonas sp. BL-3 and its utilization}

우리나라 연안은 천연 다당류인 한천 즉 아가(agar)의 보고로서, 50여 종의 남조류, 80여 종의 녹조류, 130여 종의 갈조류, 355종의 홍조류 등 약 620여 종의 아가를 다량 포함하고 있는 각종 해조류가 다양하게 서식하고 있다(한국생물공학회지 (1999), 14(1): 96-102). 국내에 풍부하게 존재하는 아가는 오래 전부터 식품, 의약품, 그리고 미생물 및 식물배양을 위한 배지 고형제 등 중요한 산업 원료로 사용되고 있다.

아가는 약 70%의 아가로스 (agarsose)와 30%의 아가로펙틴 (agaropectin) 으로 이루어져 있는데, 그 중 아가로스는 단당류인 D-갈락토스 (D-galactose)와 3,6-안하이드로-L-갈락토스 (3,6-anhydro-L-galactose)가 α-1,3-글리코사이드 결합(α-1,3-glycosidic bond)과 β-1,4-글리코사이드 결합(β-1,4- glycosidic bond)이 교대로 연결되어 있는 점질성 다당류이다. 아가로펙틴은 아가로스와 같은 기본구조를 가지고 있으나 부분적으로 황산기, 피루빅산(pyruvic acid), 글루쿠로닉산(glucuronic acid) 등의 치환기를 가지는 것으로 보고 되어 있다 (Carbohydrate Research (1971) 16:435-445)

아가 또는 아가로스의 가수분해로 얻어지는 아가로올리고당(agaro- oligosaccharides)은 항산화, 항염증, 항암효과 및 세포사멸유도 등 과 같은 생리적 활성을 갖고 있다. 이와 같은 산업적으로 유용한 아가로올리고당을 생산하기 위해서는 아가 또는 아가로스를 좀 더 작은 분자로 가수분해하여야 하며, 화학적 가수분해법(대한민국특허출원 제10-1999-0056777)과 효소적 가수분해법(대한민국특허 제10-0250068, 대한민국특허출원 제1994-0013228, 미국특허 제5,834,257호, 미국특허 제6,599,729호)이 공지되어 있다.

염산 등을 이용한 화학적 가수분해법을 활용할 경우에는 아가 또는 아가로스 분자의 α-1,3-글리코사이드 결합이 절단되어 아가로올리고당이 주로 생성된다. 그러나 이 방법은 유독한 화학약품을 다량 사용하여야 하는 문제점이 있고, 또한 화학적으로 아가 또는 아가로스를 분해하기 때문에 생리활성이 높은 저중합도의 활성형 아가로올리고당을 선택적으로 생산하는 것이 매우 어렵다(Bioscience and Industry (1991), 49:734). 따라서 아가 또는 아가로스를 선택적으로 저중합도의 활성형 아가로올리고당으로 분해하는 기질 특이적 효소인 각종 아가레이즈(agarase)를 사용하는 효소적 가수분해방법이 유리하다고 판단되어진다.

아가 또는 아가로스의 효소 가수분해에는 α-아가레이즈와 β-아가레이즈 2 종류의 효소가 이용될 수 있다. 아가 또는 아가로스의 β-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 β-아가레이즈로는 다음과 같은 다수의 효소가 보고 되어 있다(대한민국특허 제10-0250068호, 대한민국특허출원 제1994- 0013228호, 미국특허 제6,511,838호, 미국특허 제5,869,310호, 미국특허 제5,814,487호, European Journal of Biochemistry (1990) 187(2): 461-465, Applied and Environmental Microbiology (1992) 58:4060- 4063, Applied and Environmental Microbiology (1993) 59(5):1549- 1554, Jounal of Fermentation and Bioengineering (1995) 79(6):549- 554, Korean Journal of Biotechnology and Bioengineering (1996) 11(1): 37-45, Korean Journal of Biotechnology and Bioengineering (1997) 12(2):228-235, Korean Journal of Biotechnology and Bioengineering (1998) 13(3):320-324, Canadian Journal of Microbiology (1998) 44(7): 637-645, Canadian Journal of Microbiology (1998) 44(7):637-645, Applied and Environmental Microbiology (1998) 64(11):4378-4383, Jounal of Marine Biotechnology (1998) 6(4):260-265, Journal of Bioscience and Bioengineering (1999) 87(4):436-441).

반면 아가 또는 아가로스의 α-1,3-글리코사이드 결합을 절단하는 α-아가레이즈는 지금까지 소수가 공지되어 있을 뿐이다(PCT국제특허출원 JP2000- 00966, European Journal of Biochemistry (1993) 214(2):590-607, Journal of Bacteriology (1994) 176(22):6812-6818).

β-아가레이즈를 활용할 경우에는 아가 또는 아가로스의 분해산물로 네오아가로올리고당 (neoagarooligosaccharides)이 생성되는 반면, α-아가레이즈의 경우에는 아가로올리고당(agarooligosaccharide)이 생성된다. 아가로올리고당은 환원 말단에 3,6-안하이드로-L-갈락토스를 가지며, 네오아가로올리고당은 D-갈락토스를 갖는 차이를 보이지만, 두 경우 중합도는 모두 짝수로 표현된다.

아가로스의 분자 구조

특히 환원 말단으로 3,6-안하이드로-L-갈락토스를 갖는 아가로올리고당은 세포소멸(apoptosis)을 유도하고 종양세포의 증식을 저해하는 효과가 있어 항암 및 항염치료에 유용하다고 최근 알려져 있고, 또한 세포의 산화를 촉진하는 나이트로젠 모노옥사이드(NO)의 과잉생산을 막는 항산화 효과 (Korean Journal of Biotechnology and Bioengineering (1998) 13(5):524-529), 그리고 소장내의 점막에서 다당류의 탄수화물을 분해하여 포도당의 흡수를 도움으로써 α-글리코시데이즈 (α-glycosidase) 활성 저해와 같은 유용한 생리적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Food Industry Nutrition (1997) 2(1):10-15, Takara Bio Inc. News 2000-02-07). 이와 같은 생리적 활성을 감안하면, 아가로올리고당은 약제학적 조성물과 기능성 식품 또는 음료 등으로의 활용분야에 광범위하게 제공될 수 있을 것으로 예상된다.

활성형 아가로올리고당을 고효율로 다량 생산하기 위해서는 아가 또는 아가로스를 고효율로 분해할 수 있는 기질 특이적 α-아가레이즈를 분비하는 생산균주의 확보가 선결되어야 한다. 현재 α-아가레이즈 생산균주로서는 해양성 그람-음성 박테리아 알테로모나스 아가릴티쿠스 지제이1비(Alteromonas agarylticus GJ1B) (Europian Journal of Biochemistry (1993), 214: 599-607), 비브리오 에스피 제이티 0107 (Vibrio sp. JT0107) (미국특허 제5,834,257호; Journal of Bacteriology (1994), 176(22):6812- 6818), 그리고 코웰리아 유사 박테리아 에프이알엠 비피-6990(Colwellia like bacteria FERM BP-6990)와 해양성 사이크로필 아이씨오79 에프이알엠 비피-6991(Marine Psychrophile ICO79 FERM BP-6991) (PCT 국제특허출원 제JP2000-00966) 등 4 종류가 알려져 있다.

알테로모나스 아가릴티쿠스 지제이1비 균주가 분비하는 아가레이즈는 문헌상에 나타난 최초의 α-아가레이즈로서 360,000달톤(Dalton)의 고분자량을 가지는 단백질로써 아가 또는 아가로스 분자로부터 아가로헥사오스 (agarohexaose)와 아가로테트라오스 (agarotetraose)를 주로 생성하며, 저분자의 아가로비오스 (agarobiose)를 생산하지 못하는 특징이 있었으며 특허로는 공지되지 않았다. 특허로 최초 공지된 α-아가레이즈는 비브리오 에스피 제이티0107가 분비하는 α-아가레이즈(미국특허 제5,834,257호)는 네오아가로비오스 하이드롤레이즈 (neoagarobiose hydrolase)로서, β-아가레이즈가 아가 또는 아가로스를 분해하여 얻은 네오아가로비오스 (neoagarobiose)에만 작용하여 D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토스로 분해하는 특성을 갖고 있어 원료 물질로서 아가 또는 아가로스를 사용하여 아가로올리고당을 제조하는 목적으로 사용하기 어렵다.

코웰리아 유사 박테리아 에프이알엠 비피-6990과 해양성 사이크로필 아이씨오79 에프이알엠 비피-6991가 분비하는 α-아가레이즈는 아가, 아가로스, 그리고 고중합도의 아가올리고당을 분해하여 중합도가 2, 4, 그리고 6인 아가로올리고당을 생산하는 특징을 보였다. 그러나 생성물의 조성을 보면 아가로비오스와 아가로테트라오스 외에 아가로헥사오스도 다량 생산되었다. 또한 효소의 분자량이 각각 95,000달톤과 85,000달톤의 비교적 고분자량을 갖는 효소로, 유전자의 클로닝을 통한 재조합 단백질의 제조 및 생산에 있어서 저분자량보다 다소 불리하리라 예상된다.

따라서 아가로올리고당 중 생리적 활성이 높다고 알려져 있는 아가로비오스와 아가로테트라오스의 생산에 보다 적합한 α-아가레이즈, 또한 고순도 아가올리고당 생산에 유용한 아가로스에 대한 기질특이성이 높은 α-아가레이즈, 또한 유전자 조작을 통한 재조합 균주를 이용한 효소단백질 생산에 보다 유리한 저분자량의 α-아가레이즈를 확보함이 요망된다.

본 발명의 기술적 과제는 위와 같은 아가 또는 아가로스로부터 생리활성이 높다고 알려진 아가로비오스와 아가로테트라오스를 주로 생산하고, 아가로스에 대한 기질특이성이 높고, 또한 유전자 재조합기술을 이용한 효소단백질 생산에 유리한 저분자량의 α-아가레이즈를 확보함에 있다. 이를 위하여 α-아가레이즈를 다량 분비하는 새로운 해양 미생물을 분리 동정하고 이 미생물이 분비하는 α-아가레이즈의 효소적 특성을 규명하며, 신규 α-아가레이즈를 암호화하는 유전자를 분리하여 염기서열 및 아미노산 서열을 결정하고, 또한 얻어진 α-아가레이즈를 고부가치성 아가로올리고당의 제조 또는 전기영동 겔로부터 디엔에이 단편을 분리 회수하는 목적으로 이용하는 등 활용기술을 개발함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 아가가 다량 분포되어있는 국내 해양 환경으로부터 아가 분해능을 가진 미생물만을 검색하여 비엘-3으로 번호를 붙인 신규 해양 미생물을 분리하였다. 선별된 신규 해양 미생물 비엘-3의 형태적, 생리적, 그리고 생화학적 특성과 16S 라이보좀 디엔에이(16S ribosmomal DNA) 유전자의 뉴클레오티드 서열을 분석한 결과를 바탕으로 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3 (Pseudoalteromonas sp. BL-3)으로 분류?동정하였다. 상기 균주를 부다페스트조약에 의거, 한국농용미생물보존센타(KACC)에 기탁번호 KACC91088로 2003년12월16일 기탁하였다 (최초기탁일).

신규 미생물 비엘-3은 아가레이즈를 세포 밖으로 분비?생산하였으며, DEAE Sephadex 음이온 교환 수지 크로마토그래피와 Phenyl Sepharose CL-4B 소수성 크로마토그래피를 이용하여 효소를 분리, 정제하였다. 신규 α-아가레이즈의 효소적, 물리적, 그리고 화학적 특성을 검토하였으며, 분자량과 등전점은 2차원 폴리아크릴아마이드 겔과 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 측정하였다. 분리 정제된 아가레이즈는 pH 6.0과 40℃에서 최적 반응을 보였으며, 분자량은 31,000달톤으로 등전점은 pH 7.2로 나타났다.

또한 비엘-3에 의해 생산된 아가레이즈의 아가로스분자 가수분해 작용기작을 검토하기 위해 아가로스 분해산물의 환원말단을 형광물질인 2-아미노피리딘(2-aminopyridine)으로 표시하여 고압액체크로마토그래피로 분석한 결과, 본 아가레이즈를 이용한 아가로스 분해로부터 생성된 올리고당의 환원말단이 3,6-안하이드로-L-갈락토스였다. 이로써 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3으로부터 생산되는 아가레이즈가 아가로스분자의 α-1,3-글리코사이드 결합을 절단하는 α-아가레이즈임을 확인하였다.

그리고 이 균주가 생산하는 α-아가레이즈를 암호화하는 유전자를 분리하고 이 유전자의 염기 및 아미노산 서열을 분석하여 미국생명공학정보센터인 엔씨비아이(NCBI)의 젠뱅크(GenBank)에 2004년 1월 7일 에세션 넘버(Accession number) AY488029와 AAR87712로 각각 등록하였다. 그리고 얻어진 α-아가레이즈를 이용한 항산화 및 면역증강 등 다양한 생리적 활성을 갖는 아가로올리고당의 제조 및 아가로스 전기영동 겔로부터 디엔에이 단편을 추출 분리에 적용하는 등 활용법을 검토하였다.

아래 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 아래 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> α-아가레이즈 생산 신규 해양 미생물 비엘-3의 선별, 분류 및 동정

한반도의 동해와 남해안의 바닷물, 갯벌, 그리고 해조류로부터 채집한 시료를 100 ml의 해수 (Sigma Co. Missouri, USA)에 효모 추출물 0.1%와 펩톤 0.5%, 그리고 아가 1.5%를 첨가하여 만든 고체배지에 도말하여 25℃에서 3일 간 배양한 후 아가레이즈 생산에 의해 배지 표면이 함몰되는 부위의 집락에서 균을 순수 분리하였다.

위에서 분리한 해양 미생물 100여 종을 0.3% 아가를 포함한 동일 액체배지에서 3일 간 현탁배양하여 배양 상등액의 α-아가레이즈 활성을 측정하여 α-아가레이즈 활성이 가장 높은 해양 미생물 비엘-3을 최종적으로 선별하였다.

선별된 해양 미생물 비엘-3을 주사형 전자현미경으로 세균의 형태를 관찰하였으며 그 결과는 도1에 나타내었다. 해양 미생물 비엘-3은 막대형으로 측면에 편모를 갖고 있었으며 크기는 길이가 1.5㎛, 너비가 0.7㎛였다. 또한 비엘-3의 분류동정을 목적으로 형태, 생화학 및 생리적 특징을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 제시된 방법에 따라 조사하여 그 결과를 표1에 나타내었다.

해양 미생물 비엘-3은 그람 음성, 통성 혐기성 세균으로 균체 생육을 위하여 해수와 염화나트륨을 요구하는 해양 호염성 미생물이었다. 그리고 에너지 저장 물질로 폴리하이드록시부틸레이트 (polyhydroxybutylate)를 축적하고 인돌(indole), 메틸레드(methyl red) 시험에 양성반응을 보였으며 Voges- Prokauer 시험에서 음성 반응을 보였다. 상기 균주 비엘-3은 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae)과에 속하는 것으로 판단된다.

[표 1] 아가 분해능을 가진 새로운 해양 미생물 비엘-3의 형태, 생화학, 그리고 생리적 특징

조 사 항 목	결 과	조 사 항 목	결 과
Gram staining	-	Oxidase	+
Form	rod	Urease	+
Size	0.7㎛×1.5㎛	Oxidation/Fermentation test	O
Motility	motile	Voges-Prokauer test	-
Nutrient broth	＋	Acid production by glucose	+
Glucose nutrient broth	＋	Indole formation	+
Anaerobic growth	＋	PHB accumulation	+
Catalase	＋	KCN test	+
Repuired artificial sea water for growth			+
Hydrolysis of casein, gelatin, agar, agarose, amylose, carragenan, dextrin, and starch			+
Utilization of citrate, cellobiose, galactose, glucose, lactose, maltose, raffinose, ribose, and sucrose.			+

보다 명확한 분류, 동정을 위하여 16S 라이보좀 디엔에이 단편을 중합효소 증폭법 (Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 비엘-3의 염색체 디엔에이로부터 증폭한 후, 증폭된 16S 라이보좀 디엔에이 단편의 염기서열을 결정하여 엔씨비아이의 젠뱅크에 어세션 번호 AY164641로 등재하였다. 결정된 염기서열을 엔제이 네이버 조이닝 프로그램(NJ neighber joining program)으로 분석하여 16S 라이보좀 디엔에이의 계통 분류 분석을 실시하여 그 결과를 도2에 나타내었다. 도2에서 보는 바와 같이 신규 해양 미생물 비엘-3는 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas) 속에 속하는 새로운 종의 미생물로 동정되었으며 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3로 최종 명명하였다. 상기 균주를 한국농용미생물보존센타에 기탁번호 KACC91088로 2003년12월16일 기탁하였다 (최초기탁일).

<실시예 2> 신규 해양 미생물 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3으로부터 α-아가레이즈생산 및 분리 정제

신규 해양 미생물 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3 균주를 100 ml의 해수 에 0.7 g 효모 추출물, 0.5 g 아가를 첨가한 액체배지에서 30℃에서 24시간 동안 현탁 배양하여 아가레이즈를 분비, 생산하였으며 미생물 균체를 원심분리로 제거한 상등액을 아가레이즈 조효소액으로 사용하였다.

α-아가레이즈 조효소액을 20 mM 트리스 (Tris)-염산 (pH 6.0) 완충액으로 평형화한 DEAE Shephadex A-50 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켰다. α-아가레이즈를 포함하는, 비흡착 분획을 20 mM 트리스-염산 (pH 6.0) 완충액으로 평형화한 Phenyl Sepharose CL-4B 소수성 크로마토그래피 컬럼에 흡착시킨 후 50% 에틸렌글리콜 (ethylene glycol)을 사용하여 용출함으로써 α-아가레이즈를 분리 정제하였다.

정제된 α-아가레이즈 분획은 20 mM 트리스-염산 (pH 6.0) 완충액에 투석한 후 효소활성측정, 단백질정량, 그리고 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하여 회수율과 정제도를 확인한 결과, 정제도는 142배였으며 회수율은 46%였다.

<실시예 3> 정제된 저분자량 α-아가레이즈의 효소적 특성

(1) 분자량과 등전점

정제된 α-아가레이즈의 분자량과 등전점을 2-차원 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법으로 측정하였다. 정제된 α-아가레이즈를 pH 3~10 범위를 가지는 IPG Ready strip (Biorad, California, USA)을 이용하여 등전점을 결정하였고, 다시 10% 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 분자량을 측정하였다. 그 결과 도 3과 같이 α-아가레이즈의 분자량은 약 31,000 달톤이며 등전점은 약 pH 7.2로 나타났다.

이는 기존의 공시된 알테로모나스 아가릴티쿠스 지제이1비 또는 코웰리아 유사 박테리아 에프이알엠 비피-6990과 해양성 사이크로필 아이씨오79 에프이알엠 비피-6991 균주가 분비하는 α-아가레이즈의 360,000달톤과 95,000달톤, 85,000달톤에 비해 보다 상당히 작은 분자량을 갖기 때문에 효소가 기질에 쉽게 결합할 수 있고 단백질을 암호화하는 디엔에이의 크기가 작아서 유전자의 클로닝과 재조합 단백질의 제조 등의 분자생물학적 연구가 용이하여 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3 유래의 α-아가레이즈가 아가로올리고당의 생산을 위해 위 α-아가레이즈들 보다 유리하다.

(2) 최적 반응 pH 및 온도

최적 반응 pH를 관찰하기 위해 적정 pH의 완충용액에 동일한 농도의 아가로스와 정제된 동일 활성의 α-아가레이즈를 첨가하여 40℃에서 30분 간 반응시켜 α-아가레이즈의 활성을 측정한 결과는 도 4(A)와 같다. 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3가 분비하는 α-아가레이즈는 pH 6.0에서 가장 높은 반응성을 나타내었다.

20 mM 트리스-염산 (pH 6.0) 완충액에 동일 활성의 α-아가레이즈와 아가로스를 혼합하여 30℃에서 60℃까지 5℃ 간격을 두고 30분 간 반응하여 α-아가레이즈의 최적 반응 온도를 알아보았다. 도 4(B)에서처럼 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3의 α-아가레이즈는 40℃에서 가장 높은 활성을 나타내었다.

(3) 저분자량 α-아가레이즈의 기질 특이성

다양한 다당류 탄수화물에 대한 기질 특이성을 조사하기 위해 다당류를 동일 농도로 제조한 후, 동일 활성의 효소로 40℃에서 30분 반응시킨 후 DNS 측정법에 따라 다당류의 분해정도를 측정하였다. 그 결과는 표 2에서 나타난 것과 같이 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3의 α-아가레이즈는 아가와 상당히 유사한 구조를 가지는 카라지난 (carrageenan)에 대해서 거의 활성을 나타내지 않았으며, 아가와 아가로스에 대해서만 분해능을 보였다. 특히, 아가보다는 아가로스에 대해 더 높은 활성을 보였다.

아가 또는 아가로스를 분해하는 것으로 보고된 바실러스 세레우스 에이에스케이202 (Bacillus cereus ASK202)유래의 β-아가레이즈 (Korean Journal of Biotechnology and Bioengineering (1999) 14(1):96-102)를 포함한 β-아가레이즈와 기질 특이성을 확인한 모든 α-아가레이즈 (PCT국제특허출원 JP2000-00966)가 아가로스보다는 아가에 더 높은 기질 특이성을 갖는 것과는 달리 본 발명의 α-아가레이즈는 아가로스에 대해 더 높은 분해능을 갖기 때문에 아가로스 전기영동 겔로부터의 디엔에이 단편 회수에 더 높은 효율을 가질 것으로 판단된다.

[표 2] α-아가레이즈의 기질 특이성

기 질	정제된 α-아가레이즈의 상대 활성
기 질	환원당
아가	71.0
아가로스	100.0
알지네이트	0.0
셀룰로스	0.0
카파-카라지난	0.0
키친	0.0
펙틴	0.0
수용성 전분	0.0
자일란	0.0

<실시예 4> 저분자량 α-아가레이즈의 아가로스분자 가수분해 작용기작

정제된 저분자량 α-아가레이즈의 아가로스분자 가수분해 작용기작을 규명하기 위하여 아가 혹은 아가로스 분해산물인 아가로올리고당의 환원말단의 당을 확인하였다. α-아가레이즈와 아가로스를 20 mM 트리스-염산 (pH 6.0) 완충액에 혼합하여 40℃에서 1일 동안 반응시켰다. 이를 원심분리하여 분해되지 않은 아가로스 성분을 제거한 후 시료에 동일 양의 부탄올 (n-butanol)을 첨가하여 진공압축기로 물과 부탄올을 제거하였다. 건조된 시료를 메탄올 (methanol)과 혼합한 후 여과지로 여과하여 용액 부분만을 회수하였다. 다시 진공 압축기로 메탄올을 제거하여 건조시켜 아가로스 분해 산물인 아가로올리고당 시료를 제조하였다. 얻어진 아가로올리고당을 형광물질인 2-아미노피리딘 (2-aminopyridine)과 반응시켜 아가로올리고당의 환원말단에 2-아미노피리딘을 결합시켰다. 2-아미노피리딘이 결합된 아가로올리고당에 6 N 염산을 넣고 110℃에서 4시간 동안 산 가수분해 반응을 시켜 아가로올리고당을 단당류로 분해하고 6 N 수산화나트륨으로 중화시켰다. 시료를 고압액체크로마토그래피를 이용하여 2-아미노피리딘이 결합된 단당의 종류를 분석하였다.

슈도알테로모나스 에스피 비엘-3의 α-아가레이즈에 의한 아가와 아가로스 분해로부터 생성된 산물의 환원말단은, 도 5에서 나타난 크로마토그램에서 보는 것과 같이 환원말단이 3,6-안하이드로-L-갈락토스인 아가로올리고당이며, 이를 통해 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3의 α-아가레이즈가 D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토스의 α-1,3-글리코사이드 결합을 절단하여 3,6-안하이드로-L-갈락토스를 환원 말단으로 갖는 아가로올리고당을 생성하는 α-아가레이즈임을 확인하였다.

<실시예 5> 저분자량 α-아가레이즈 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석

신규 해양성 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3의 염색체 디엔에이를 분리하여 제한효소 HindⅢ를 이용하여 부분적으로 분해하고 전기영동으로 분리하였다. α-아가레이즈의 N-말단과 단백질 내 일부 아미노산 서열로부터 제조한 탐침을 이용하여 서던 하이브리드화 (southern hybridization)를 통해 양성반응을 나타낸 약 1.5 kb의 디엔에이 단편을 얻었다. 상기의 디엔에이 단편을 pZErOTM-2 벡터 (Invitrogen Co. California, USA)에 삽입하여 대장균으로 옮겼다. 재조합 대장균은 1.5% (w/v) 아가와 50㎕/ml의 카나마이신 (kanamycin)을 포함하는 LB 고체배지에서 37℃에서 1일간 배양하였다. 배양 후 아가의 분해 환이 관찰된 집락을 분리하고, 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 액체배지에서 다시 배양하였다. 재조합 대장균으로부터 제조된 추출물로부터 α-아가레이즈 활성을 측정하여 삽입 유전자가 α-아가레이즈임을 증명하고 염기 서열을 분석하여 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3 유래 α-아가레이즈의 뉴클레오타이드와 아미노산 서열을 결정하였으며 각각의 서열을 염기서열목록 1과 2에 나타내었으며, 엔씨비아이의 젠뱅크에 에세션 넘버 AY488029와 AAR87712로 등록하였다.

<실시예 6> 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3가 분비하는 저분자량 α-아가레이즈를 이용한 아가로비오스 및 아가로테트라오스의 생산

20 mM 트리스-염산 (pH 6.0) 완충액에 아가 또는 아가로스와 동일 활성의 α-아가레이즈를 첨가하여 40℃에서 30분 간 반응시켜 박층크로마토그래피로 다음과 같이 행하여 아가 및 아가로스의 분해산물을 확인하였다. 전개판은 셀룰로스(cellulose)판을 사용하였으며, 전개용매로는 n-부탄올 (n-butanol), 피리딘 (pyridine), 그리고 0.1 M 염산이 5:3:2 (v/v/v)로 섞인 용매를 사용하였다. 전개판을 말리고 그 위에 아세톤 (acetone)에 녹인 4.0% 다이페닐아민 (diphenylamine)과 4.0% 아닐린 (aniline), 황산을 5:5:1의 부피비로 혼합한 발색용매를 도포하여 100℃에서 10분 간 반응하여 생성된 올리고당을 확인하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 신규 해양성 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3으로부터 생산되는 α-아가레이즈의 주생산물이 아가로비오스와 아가로테트라오스의 저중합도 아가로올리고당임을 확인하였다.

기존의 보고된 다양한 미생물 유래의 아가레이즈들 중에서 대부분의 β-아가레이즈가 앞서 서술한 생리활성능을 갖지 않는 네오아가로올리고당을 생산하고 소수의 α-아가레이즈도 상대적으로 낮은 생리활성을 갖는 높은 중합도의 아가로헥사오스와 아가로테트라오스 생산하기 때문에, 본 발명의 신규 해양성 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3유래의 저분자량 α-아가레이즈가 높은 생리활성의 아가로비오스 및 아가로테트라오스의 생산을 위해 가장 적절한 것으로 사료된다.

<실시예 7> 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3이 분비하는 저분자량 α-아가레이즈를 이용한 아가로스 전기영동 겔로부터 디엔에이 단편의 분리 회수

α-아가레이즈를 이용한 아가로스 겔을 분해와 겔로부터의 디엔에이 회수의 효율을 확인하기 위해 pBHR 벡터(Invitrogen Co. California, USA)를 제한효소를 이용하여 자른 약 1.2, 5.2, 그리고 6.5kb 크기의 디엔에이 단편 시료를 아가로스 겔로 전기영동하여 각각의 밴드를 동일 부피의 20 mM 트리스-염산 (pH 6.0) 완충액과 정제된 2 단위 α-아가레이즈를 첨가하여 40℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 디엔에이 단편을 에탄올로 침전시켜 최종적으로 회수하였다. 도 7에서 보는 바와 같이 약 50% 전후의 회수율을 가짐을 나타내었다. 이로써 신규 해양성 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3이 분비하는 α-아가레이즈가 아가로스 겔로부터 디엔에이 단편을 회수와 같은 생명공학 연구에 활용할 가치가 높음을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 확보한 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3 (Pseudoalteromonas sp. BL-3) (KACC91088) 균주는 지금까지 보고 된 바 없는 새로운 아가분해 해양 미생물로 판단된다. 상기 기탁균주 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3 (KACC91088)이 분비하는 아가레이즈 역시 지금까지 보고된 바 없는 분자량이 31,000달톤인 새로운 저분자량 α-형 아가레이즈로서, 특이적으로 아가 또는 아가로스의 α-1,3-글리코사이드 결합을 가수분해하여 중합도가 2와 4인 아가로비오스와 아가로테트라오스를 주로 생성하였다. 이와 같은 효소적 특성으로 보아 본 발명의 저분자량 α-아가레이즈는 생리적 활성이 높다고 알려진 아가로비오스와 아가로테트라오스의 제조에 매우 적합하다고 판단되며, 생산된 아가로올리고당은 기능성 식품 또는 음료 첨가물로 활용 될 수 있을 것이다. 또한 생명공학 실험에 널리 사용되는 전기영동 아가로스 겔로부터 디엔에이 단편을 추출 분리하는 연구용 시약으로 활용할 수 있다.

도 1은 α-아가레이즈를 분비하는 신규 호염성 해양 미생물 비엘-3을 전자현미경으로 관찰한 사진이며,

도 2는 α-아가레이즈를 분비하는 신규 호염성 해양 미생물 비엘-3의 분류동정을 위하여 16S 라이보좀 디엔에이 염기서열을 분석하여 작성한 16S 라이보좀 디엔에이의 계통분류도이고,

도 3는 α-아가레이즈를 분비하는 호염성 해양 미생물인 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3이 분비, 생산하는 α-아가레이즈를 정제하여 분자량과 등전점을 확인한 단백질 전기영동사진이고,

도 4은 정제된 저분자량 α-아가레이즈의 적정 반응 pH와 온도를 검토한 그래프이며,

도 5는 정제된 저분자량 α-아가레이즈의 분자결합 절단부위를 확인하기 위하여 아가로스의 가수분해 생성물의 환원성 말단에 형광물질인 2-아미노피리딘을 붙여 얻어진 형광 유도체의 종류를 고압액체크로마토그래피로 확인한 크로마토그램이며,

도 6는 천연 다당류인 아가와 아가로스를 정제된 저분자량 α-아가레이즈로 처리하여 얻어진 아가로올리고당 조성을 박층크로마토그래피로 분석한 크로마토그램이고,

도 7은 DNA 단편의 분리를 목적으로 아가로스 겔 전기영동을 실행한 후 정제된 저분자량 α-아가레이즈를 이용하여 전기영동 겔을 분해하여 DNA 단편들을 추출 분리한 후 회수된 디엔에이 절편들을 전기영동으로 확인한 사진이다.

<110> LEE, YONG-HYUN SHIN, HYUN-DONG JUN, SANG-EUN <120> alpha-agarase <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 873 <212> DNA <213> Pseudoalteromonas sp. <400> 1 atgaaacagc taaagctact aataggtagc actttgttta tgtctatcac ttcagtccag 60 gcagctgatt ggagcccttt tagtattcca gcacaagcag gcgcaggtaa aagctggcag 120 ttacaaagtg tttcagatga gtttaactac attgcacaac ctaataataa accagctgct 180 tttaataatc gttggaacgc atcttatata aatgcttggc taggtcctgg cgatacagaa 240 tttagcgctg gccactcata tacaactggc ggggcgcttg gtctgcaagc aaccgaaaaa 300 gcaggtacga acaaagttct ctcaggtatt atttcttcta aagcaacctt tacttacccc 360 ctatacctag aggcgatggt aaaaccaaca aacaacacta tggcaaatgc tgtatggatg 420 cttagtgctg attctacccc agaaatcgat gctatggagt catatggtag cgaccgaatt 480 ggccaagagt ggtttgacca acgtatgcat gttagtcctc acgtatttat tcgagaccca 540 tttcaagatt accagccaaa ggacgctggc tcttgggttt acaacaacgg agaaacatac 600 cgcaataaat ttcgtagata tggagtacat tggaaggatg cgtggaattt agattactat 660 atagatggtg ttttggttcg aagtgtctct ggcccaaata ttattgatcc tgaaaactat 720 actaacggaa caggcttaaa caagcctatg cacataatac tggatatgga acatcagcca 780 tggcgagacg ttaagcctaa tgcatctgag cttgcagatc ccaataaaag tatattttgg 840 gtagattggt tacgagttta taaagcccag taa 873 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Pseudoalteromonas sp. <400> 2 Met Lys Gln Leu Lys Leu Leu Ile Gly Ser Thr Leu Phe Met Ser Ile 1 5 10 15 Thr Ser Val Gln Ala Ala Asp Trp Ser Pro Phe Ser Ile Pro Ala Gln 20 25 30 Ala Gly Ala Gly Lys Ser Trp Gln Leu Gln Ser Val Ser Asp Glu Phe 35 40 45 Asn Tyr Ile Ala Gln Pro Asn Asn Lys Pro Ala Ala Phe Asn Asn Arg 50 55 60 Trp Asn Ala Ser Tyr Ile Asn Ala Trp Leu Gly Pro Gly Asp Thr Glu 65 70 75 80 Phe Ser Ala Gly His Ser Tyr Thr Thr Gly Gly Ala Leu Gly Leu Gln 85 90 95 Ala Thr Glu Lys Ala Gly Thr Asn Lys Val Leu Ser Gly Ile Ile Ser 100 105 110 Ser Lys Ala Thr Phe Thr Tyr Pro Leu Tyr Leu Glu Ala Met Val Lys 115 120 125 Pro Thr Asn Asn Thr Met Ala Asn Ala Val Trp Met Leu Ser Ala Asp 130 135 140 Ser Thr Pro Glu Ile Asp Ala Met Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Ile 145 150 155 160 Gly Gln Glu Trp Phe Asp Gln Arg Met His Val Ser Pro His Val Phe 165 170 175 Ile Arg Asp Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp 180 185 190 Val Tyr Asn Asn Gly Glu Thr Tyr Arg Asn Lys Phe Arg Arg Tyr Gly 195 200 205 Val His Trp Lys Asp Ala Trp Asn Leu Asp Tyr Tyr Ile Asp Gly Val 210 215 220 Leu Val Arg Ser Val Ser Gly Pro Asn Ile Ile Asp Pro Glu Asn Tyr 225 230 235 240 Thr Asn Gly Thr Gly Leu Asn Lys Pro Met His Ile Ile Leu Asp Met 245 250 255 Glu His Gln Pro Trp Arg Asp Val Lys Pro Asn Ala Ser Glu Leu Ala 260 265 270 Asp Pro Asn Lys Ser Ile Phe Trp Val Asp Trp Leu Arg Val Tyr Lys 275 280 285 Ala Gln 290

Claims

천연 다당류인 아가 또는 아가로스를 가수분해하는 α-아가레이즈를 분비하는 한국농용미생물보존센타에 기탁번호 KACC91088 로 등록된 신규 해양 미생물 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3 (Pseudoalteromonas sp. BL-3).
제 1항에 있어서, 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3이 분비하는 다음과 같은 특징을 갖는 저분자량 α-아가레이즈.

(1) 작용 기작 : 아가 및 아가로스 분자의 α-1,3-글리코사이드 결합을 특이적으로 가수분해하는 α-아가레이즈.

(2) 물리적 특성 : 분자량과 등전점이 각각 31,000달톤과 pH 7.2이며, 아가로스 특이성을 갖는 저분자량 α-아가레이즈.

(3) 주생성물 : 아가 및 아가로스 분자로부터 중합도가 낮은 아가로올리고당인 아가로비오스와 아가로테트라오스를 선택적으로 생산하는 α-아가레이즈
제 1,2항에 있어서, 기탁균주 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3가 분비하는 엔씨비아이의 젠뱅크에 에세션 넘버 AY488029와 AAR87712로 각각 등록되어 있고 본 특허의 염기 서열목록 1과 2에 제시된 뉴클레오타이드와 아미노산 서열을 갖는 α-아가레이즈 유전자.
제 2항에 있어서, 기탁균주 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3이 분비하는 아가로스 특이적 저분자량 α-아가레이즈를 이용한 아가 또는 아가로스를 원료로 하는 아가로올리고당의 제조법.
제 2항에 있어서, 기탁균주 슈도알테로모나스 에스피 비엘-3이 분비하는 저분자량 α-아가레이즈를 유효성분으로 하는 아가로스 전기영동 겔로부터 디엔에이를 분리?회수하는데 사용하는 디엔에이 분리?회수용 시약.