CN116042549A - 裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A及其应用 - Google Patents
裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A及其应用 Download PDFInfo
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- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
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Abstract
本发明公开了一种裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A在裂解甲壳素中的应用，裂解甲壳素可得到聚合度4～10的几丁质醛酸。本发明还公开了裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A在制备N‑乙酰化壳二糖中的应用，具体应用时，协同甲壳素酶SmChi B处理甲壳素，制备得到N‑乙酰化壳二糖。本发明还公开了一种降解甲壳素或制备N‑乙酰化壳二糖的方法。本发明的裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A具有优良的酶学性质和高效解聚β‑甲壳素活性，在酶法预处理甲壳素和制备甲壳寡糖中具有重要的工业应用价值及经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A及其应用，属于功能酶技术领域。
背景技术
甲壳素是仅次于纤维素的第二大天然多糖，主要存在于海洋无脊椎动物、昆虫外壳、真菌细胞壁以及鱿鱼顶骨中。甲壳素的酶解产物甲壳寡糖及其衍生物具有抗菌、降压、抗肿瘤、神经保护等特殊的生物活性和营养功能，具有更高的利用价值，在食品工业应用广泛，其工业化生产具有重要意义。
由于甲壳素结构的复杂性和自身的难溶性，极大地阻碍了对甲壳素类生物质的开发利用。目前，工业生产中最常用的甲壳素预处理方法为强酸预处理法，存在着环境不友好、危废处理困难的问题。因此，寻找更加清洁、经济、高效的甲壳素预处理方法尤为重要。
近年来研究发现了一类可以通过氧化作用破坏抗性多糖底物结构的裂解性多糖单加氧酶（LPMO），主要通过断裂
β-1,4糖苷键，使底物结构变得松散、结晶区域更加无定形，促进难解多糖的解聚。基于氧化性多糖的特性，LPMO在解聚抗性多糖方面具有巨大的优势，为甲壳素底物的酶法降解提供了新思路。
众所周知，糖苷水解酶和LPMO之间的作用模式和作用效果取决于所选择的LPMO和底物。不同种类的酶、不同的底物、不同协同方式都会产生不同的协同作用。目前的研究还局限于验证LPMO与水解酶的协同作用，且多集中于纤维素、木质素等生物质的降解，如CN109929855 A公开了一种来源于嗜热毁丝霉菌的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的编码基因及其酶，可以降解PASC（用磷酸处理过的微晶纤维素）生成纤维寡糖和纤维寡糖酸；如CN112553266 A公开了酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法；而对功能性甲壳寡糖的制备研究较少。因此，挖掘具有较高甲壳素裂解活性的LPMO，构建高效制备寡糖体系尤为重要。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种酶促氧化裂解甲壳素的新型裂解性多糖单加氧酶——裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A，并在研究酶学特性，表征裂解甲壳素效果的基础上，构建了高效制备甲壳二糖的体系，从而弥补现有技术的不足。
本发明是通过以下技术方案实现的：
裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A在裂解甲壳素中的应用。
进一步地，利用裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A裂解甲壳素，得到聚合度4～10的几丁质醛酸，即几丁质四醛酸（DP4ox）到几丁质十醛酸（DP10ox）。使用SEM表征
EbLPMO10A的甲壳素裂解效果，可见甲壳素表面变得粗糙、疏松、多孔，颗粒度高，层状结构被破坏，表明裂解效果良好。
进一步地，具体应用时，将裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A加入到甲壳素溶液中，在30～80℃、pH 6～8的条件下反应1～3天。
进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的浓度为0.5～7.5μM，优选5μM。
进一步地，所述甲壳素溶液中甲壳素的浓度为1.0～5.0 mg/mL，优选2.5 mg/mL。
进一步地，所述甲壳素溶液是通过以下方法配制得到的：向磷酸盐缓冲液中加入
β-甲壳素、抗坏血酸，混匀即得，其中，
β-甲壳素的浓度为2.5 mg/mL，抗坏血酸的浓度为1mM；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10 mM，pH为6.0。
进一步地，所述温度优选37℃，pH 优选6，时间优选2天。
所述裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A在制备N-乙酰化壳二糖中的应用。
进一步地，利用裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A和甲壳素酶
SmChi B协同处理甲壳素，制备得到N-乙酰化壳二糖。
更进一步地，具体应用时，将裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A和甲壳素酶
SmChi B同时或先后加入到甲壳素溶液中，在30～80℃、pH 6～8的降解条件下反应2～48小时，制备得到N-乙酰化壳二糖。
一种降解甲壳素或制备N-乙酰化壳二糖的方法：将裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A和甲壳素酶
SmChi B同时或先后加入到甲壳素溶液中，在30～80℃、pH 6～8的降解条件下反应2～48小时，制备得到N-乙酰化壳二糖。
进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的浓度为0.5～7.5μM，优选5μM。
进一步地，所述甲壳素酶
SmChi B的浓度为0.5～2.0μM，优选1μM。
进一步地，所述甲壳素溶液中甲壳素的浓度为1.0～5.0 mg/mL，优选2.5 mg/mL。
进一步地，所述甲壳素溶液是通过以下方法配制得到的：向磷酸盐缓冲液中加入
β-甲壳素、抗坏血酸，混匀即得，其中，
β-甲壳素的浓度为2.5 mg/mL，抗坏血酸的浓度为1mM；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10 mM，pH为6.0。
进一步地，所述降解温度优选37℃，pH 优选6，时间优选24小时。
本发明首次表达并研究裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A，该酶是AA10家族的LPMO，2,6-DMP法测定在60℃和pH 6条件下其比酶活高达356.36 U/g。MALDI-TOF-MS结果显示
EbLPMO10A能通过C1氧化将
β-甲壳素裂解为聚合度4～10的醛酸产物，SEM结果显示
EbLPMO10A可以破坏
β-甲壳素致密有序的结构。将
EbLPMO10A和甲壳素酶
SmChi B协同处理
β-甲壳素，显示出了明显的增溶效果，即可以使不溶性
β-甲壳素完全溶解并完全透明。同时，本发明还评估了一步协同反应的关键因素，构建了
β-甲壳素与
EbLPMO10A和
SmChi B协同降解体系，用于高效制备N-乙酰化壳二糖。在最优条件下，N-乙酰化壳二糖的得率是80.44%,是
SmChi B单独降解的5.49倍。本发明的裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A具有优良的酶学性质和高效解聚
β-甲壳素活性，在酶法预处理甲壳素和制备甲壳寡糖中具有重要的工业应用价值及经济价值。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker，泳道1为pET26b空载发酵液，泳道2为粗酶液，泳道3为纯酶
EbLPMO10A。
图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。
图3：pH变化对相对酶活的影响示意图。
图4：酶解产物的基质辅助飞行时间质谱图，氧化低聚糖的聚合度用“ox”标记，脱乙酰产物用DPox-Ac表示。 每个聚合度检测到三种主要加合物:[M+H+]+， [M+Na+]+， [M-H++2Na+]+。
图5：
β-甲壳素经
EbLPMO10A处理前后的扫描电镜图，其中，上侧两图为原始
β-甲壳素的形态，下侧两图为
EbLPMO10A预处理后
β-甲壳素的形态。
图6：添加或不添加
EbLPMO10A时产(GlcNAc)2的产量，其中，
EbLPMO10A和
SmChi B两步水解制得(GlcNAc)2(红线)，一步反应制得(蓝线)，
SmChi B单独制得(GlcNAc)2(黑线)。误差条表示三次重复的标准偏差。
图7：N-乙酰化壳二糖标准品以及
EbLPMO10A和
SmChi B酶解产物的HPLC色谱图。
图8：
EbLPMO10A加酶量和反应时间对协同法制备双N-乙酰化壳二糖的影响示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1 裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的编码基因的克隆
本申请的发明人挖掘到北京研究院生命科学学院测序肠杆菌
Enterobacteriaceae bacterium BIT-l23（GenBank: NUU69193.1）的裂解性多糖单加氧酶片段，根据进化树比对，发现该裂解性多糖单加氧酶属于辅助活性第10家族（AA10）。发明人根据宿主大肠杆菌的密码子偏好性对该基因序列进行了密码子优化，用于在大肠杆菌中进行高效表达。优化后的裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的编码基因包含有510个碱基，如SEQID NO.2所示，编码170个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
HGYVSTPESRAFLCKKGQNIDCGTIKYEPQSVEGPKNFPAEGPANGTIASGGNSRFPELDAQSPNRWAKVNLHTGNNSFIWTLTQAHKTTNWRYFITRQGWDSSKKLERNSFDLIPFCQINGNDAVPVSPVQHTCSIPSDRSGYHVILATWDIADTGNAFYQVIDANIIQ。
SEQ ID NO.2：
5’-CATGGTTATGTTAGCACCCCGGAAAGCCGTGCATTTCTGTGTAAAAAAGGTCAGAATATCGACTGCGGCACCATCAAATACGAGCCGCAGAGCGTTGAAGGTCCGAAAAATTTTCCGGCAGAAGGTCCGGCAAATGGTACCATTGCAAGCGGTGGTAATAGCCGTTTTCCGGAACTGGATGCACAGAGCCCGAATCGTTGGGCAAAAGTTAATCTGCATACCGGTAATAATAGCTTCATCTGGACCCTGACCCAGGCACATAAAACCACCAATTGGCGTTATTTTATCACCCGCCAGGGTTGGGATAGCAGCAAAAAACTGGAACGTAATAGCTTTGACCTGATCCCGTTTTGTCAGATTAACGGCAATGATGCCGTTCCGGTTAGCCCGGTTCAGCATACCTGTAGCATTCCGAGCGATCGTAGCGGTTATCATGTTATTCTGGCAACCTGGGATATTGCCGATACCGGTAATGCATTTTATCAGGTGATTGACGCCAACATTATCCAG-3’。
人工合成上述SEQ ID NO.2所示的裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的编码基因。以合成的片段为模板，在裂解性多糖单加氧酶基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增
EbLPMO10A基因片段。
设计的引物如下所示：
上游引物：5’-cagccggcgatggccCATGGTTATGTTAGC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物：5’-CGAATTAATTCCGATATCCATCTGGATAATGTTGGCGTCAATCACCTG-3’， 如SEQ ID NO.4所示。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25 μL，dNTP 10 μL，引物各1.5 μL，模板1 μL，KOD Fx酶1 μL，无菌水10 μL，总体系50 μL。
PCR的反应条件为：94℃预变性5 min，95℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸60s，反应30个循环，72℃后延伸40 s。
琼脂糖凝胶电泳后回收510 Kb的PCR产物片段。
实施例2 重组表达载体的构建
实施例1扩增得到的基因片段，与pET-26b克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于LB培养基固体平板（含有50 μg/mL卡那霉素）上，37℃温箱中培养14小时后，挑取单克隆至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在转速为220 rpm的37℃摇床培养12小时。将单克隆进行阳性验证后测序，并命名为pET26b-
EbLPMO10A。质粒保存在-20℃备用。
实施例3 重组工程菌的构建
将实施例2中抽提的质粒转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出，得到重组表达菌株。
实施例4 裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的制备
大肠杆菌重组表达菌株经在5 mL LB液体培养基（含有50 μg/mL卡那霉素）中活化后，按1%的接种量接入含有50 μg/mL硫酸卡那霉的ZYP-5052自诱导培养基，20℃、200 rpm培养48小时，表达裂解性多糖单加氧酶。
发酵结束后，发酵液8000 g离心10分钟，收集菌体，细胞重悬于50 mM pH 8.0 的Tirs-HCl缓冲液中，然后于冰水浴中超声破碎30 min（200 W，3 s开，3 s关）后8000 g再次离心15 min，收集上清液，即为粗酶液。
基于His标签融合的蛋白，粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，使用低浓度的10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）平衡柱子，然后用20 mM咪唑溶液（20 mM咪唑，500 mM NaCl,50 mM Tris-HCl）洗脱结合力弱的杂蛋白，40 mM咪唑溶液（40mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）洗脱目的蛋白，收集此部分的缓冲液洗脱成分，得到纯化的重组裂解性多糖单加氧酶的溶液。经SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量（结果如图1所示），使用Bradford法测定蛋白浓度。结果显示重组蛋白经亲和柱纯化可得电泳纯蛋白，分子量大小约为21 KDa，与裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A相当。洗脱液中蛋白浓度为42.6mg/L。用pH 7.0 Tris-HCl 缓冲液置换洗脱液中的咪唑，冻干，得纯酶粉。
实施例5 裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的比酶活的测定
裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A活性的标准测定方法为：向200 μL的磷酸盐缓冲液（pH 6）中加入终浓度为0.1 mmol/L的H2O2，1 mmol/L的2，6-DMP，于60℃下孵育15 min，然后加入终浓度为5 μM的纯酶粉（实施例4制备），测定300 s内469 nm 处的吸光度变化。
酶活力定义为在标准条件下2 µmol 2，6-DMP每分钟的转化率。经测定，纯化后的裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的酶活力可达356.36 U/g。
实施例6 最适反应条件的测定
将实施例4中得到的纯酶粉在不同温度和pH下反应，测定温度和pH对酶活力的影响。
选取30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的温度，按照实施例5的测定方法进行测定，测定最适温度。
在30℃下，选用pH为3.0～10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，按照实施例5的测定方法进行测定，测定最适pH。
以最高酶活力为100%，计算在不同条件下的相对酶活力，结果如图2、图3所示，裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的最适反应温度为60℃，最适pH为7的磷酸缓冲液。但因裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A功能的实现是与甲壳素酶
SmChi B协同使用制备N-乙酰化壳二糖，所以总和考虑双酶长时间反应的活性，选择37℃为最终反应温度。
实施例7 测定裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的降解产物
向10 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中加入
β-甲壳素、抗坏血酸，混匀，作为底物溶液，
β-甲壳素的浓度为2.5 mg/mL，抗坏血酸的浓度为1 mM。
将实施例4中得到的纯酶粉加入到200 μL底物溶液（
EbLPMO10A的浓度为5 μM）中，在37℃下孵育2 d，使用2，5-DHB作为基质，使用基质辅助飞行时间质谱检测产物。如图4所示，裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的氧化作用方式为C1氧化，酶解产物为几丁质四醛酸（DP4ox）到几丁质十醛酸（DP10ox），生成的产物对偶数碳的氧化寡糖具有明显的偏好，通过发现去乙酰化的壳寡糖产物，表明
EbLPMO10A还可以作用
β-甲壳素部分乙酰化的区域。
本发明所用的
β-甲壳素是发明人提取自鱿鱼顶骨，具体方法如下：鱿鱼顶骨，去离子水彻底清洗后于50℃烘干12 h，使用粉碎机粉碎后放置于干燥器中备用。称取少量固体粉末，加入1 M 盐酸（w/v=10:1），搅拌12 h以去除矿物质。用蒸馏水清洗固体部分至pH至中性后，再将其转移到2 M NaOH溶液（w/v=10:1）中进行脱蛋白处理，80℃搅拌2 h后，用蒸馏水反复洗涤。重复上述去矿物质和蛋白质的操作两次，冻干后即得
β-甲壳素粉末。
实施例8 表征裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A的裂解效果
将未经处理的
β-甲壳素和经
EbLPMO10A处理的样品（即实施例7中处理得到的产物）干燥后真空镀金。采用J
SM-6390LV低真空扫描电镜观察样品的表面形貌。如图5所示，酶解前后的样品形貌之间有显著的差异。未经预处理的
β-甲壳素呈致密的层状结构，表面相对光滑，质地清晰可见；而
EbLPMO10A解理后
β-甲壳素表面变得粗糙、疏松、多孔，颗粒度高。这表明
β-甲壳素的层状结构被破坏，比表面积的增加也暴露出更多的酶结合位点，更有利于甲壳素生物质的酶解，预处理效果较好。
实施例9 裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A与甲壳素水解酶协同制备甲壳二糖
将实施例4中得到的纯酶粉、甲壳素酶
SmChi B 同时加入到200 μL底物溶液（实施例7制备的底物溶液）（EbLPMO10A的浓度为5 μM，SmChi B的浓度为1μM）中，在37℃下分别反应0、2、4、8、12、24 h，使用高效液相色谱法检测产物组成，并进行定量分析。同时，在相同反应时间和反应条件下，以单独添加SmChi B（1μM）作为参照，与先添加5 μMEbLPMO10A、再添加SmChi B（1μM）进行对比。
甲壳素酶
SmChi B来自
S.marcescens (GenBank No.Z36295.1)，编码612个氨基酸，如下所示：
MSTRKAVIGYYFIPTNQINNYTETDTSVVPFPVSNITPAKAKQLTHINFSFLDINSNLECAWDPATNDAKARDVVNRLTALKAHNPSLRIMFSIGGWYYSNDLGVSHANYVNAVKTPASRAKFAQSCVRIMKDYGFDGVDIDWEYPQAAEVDGFIAALQEIRTLLNQQTITDGRQALPYQLTIAGAGGAFFLSRYYSKLAQIVAPLDYINLMTYDLAGPWEKVTNHQAALFGDAAGPTFYNALREANLGWSWEELTRAFPSPFSLTVDAAVQQHLMMEGVPSAKIVMGVPFYGRAFKGVSGGNGGQYSSHSTPGEDPYPSTDYWLVGCEECVRDKDPRIASYRQLEQMLQGNYGYQRLWNDKTKTPYLYHAQNGLFVTYDDAESFKYKAKYIKQQQLGGVMFWHLGQDNRNGDLLAALDRYFNAADYDDSQLDMGTGLRYTGVGPGNLPIMTAPAYVPGTTYAQGALVSYQGYVWQTKWGYITSAPGSDSAWLKVGRVA。
酶制剂
SmChi B按照文献（The Journal of biological chemistry 2014, 289:17932-17940.）中的基因工程方法制备得到。
图6是添加或不添加
EbLPMO10A时产(GlcNAc)2的HPLC定量结果（分别使用单独加
SmChi B酶解，
EbLPMO10A&
SmChi B分两步酶解、一步法酶解协同进行验证），图7是高效液相色谱法的产物检测结果，图8为
EbLPMO10A的加酶量优化结果。结果显示，当
EbLPMO10A的添加量为5 μM时，0.5 mg
β-甲壳素在24 h内可制得0.4 mg N-乙酰化壳二糖，产率为80.44%，是
SmChi B单独投加的5.49倍。可见，
EbLPMO10A在协同反应共生产甲壳寡糖方面具有很大的潜力。
另外，本发明还以CN 109897859 A中记载的PsLPMO10A作为对照，双方各自在与
SmChi B建立的最优反应条件下比较甲壳二糖的最佳得率，
SmChi B和PsLMPO10A协同反应的甲壳二糖的最终得率为38%，与
SmChi B单独酶解相比二糖得率提高了约一倍，但明显不如
EbLPMO10A与
SmChi B协同降解。
可见，裂解性多糖单加氧酶
EbLPMO10A协同
SmChi B降解
β-甲壳素，甲壳二糖的得率更高，其裂解活性和效率高于一般的LPMO，本发明的
EbLPMO10A在协同甲壳素酶制备甲壳寡糖方面具有更高的应用潜力。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A在裂解甲壳素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：具体应用时，将裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A加入到甲壳素溶液中，在30～80℃、pH 6～8的条件下反应1～3天，得到聚合度4～10的几丁质醛酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A的浓度为0.5～7.5μM；
所述甲壳素溶液中甲壳素的浓度为1.0～5.0 mg/mL；
温度为37℃，pH为6，时间为2天。
5.权利要求1所述的裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A在制备N-乙酰化壳二糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：利用裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A和甲壳素酶SmChi B协同处理甲壳素，制备得到N-乙酰化壳二糖。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：具体应用时，将裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A和甲壳素酶SmChi B同时或先后加入到甲壳素溶液中，在30～80℃、pH 6～8的降解条件下反应2～48小时，制备得到N-乙酰化壳二糖。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A的浓度为0.5～7.5μM；
所述甲壳素酶SmChi B的浓度为0.5～2.0μM；
所述甲壳素溶液中甲壳素的浓度为1.0～5.0 mg/mL；
所述降解温度为37℃，pH 为6，时间为24小时。
9.一种降解甲壳素或制备N-乙酰化壳二糖的方法，其特征在于：将裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A和甲壳素酶SmChi B同时或先后加入到甲壳素溶液中，在30～80℃、pH 6～8的降解条件下反应2～48小时，制备得到N-乙酰化壳二糖；所述裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.根据权利要求9所述的降解甲壳素或制备N-乙酰化壳二糖的方法，其特征在于：所述裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A的浓度为0.5～7.5μM；
所述甲壳素酶SmChi B的浓度为0.5～2.0μM；
所述甲壳素溶液中甲壳素的浓度为1.0～5.0 mg/mL；
所述降解温度为37℃，pH 为6，时间为24小时。
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| CN202211120589.XA CN116042549A (zh) | 2022-09-15 | 2022-09-15 | 裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A及其应用 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116790696A (zh) * | 2023-08-28 | 2023-09-22 | 中国海洋大学 | 利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN114836494A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-08-02 | 中国海洋大学 | 利用甲壳素酶SaChiZg制备高纯度甲壳二糖的方法 |
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-
2022
- 2022-09-15 CN CN202211120589.XA patent/CN116042549A/zh active Pending
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| CN116790696B (zh) * | 2023-08-28 | 2023-11-03 | 中国海洋大学 | 利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法 |
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