CN116790696B - 利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N‑乙酰化壳二糖的方法，属于功能酶技术领域。以裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A和甲壳素水解酶联合酶解α‑甲壳素，制备得到N‑乙酰化壳二糖；所述裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述甲壳素水解酶选自甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C中的任意一种或两种以上的组合。本发明的方法以裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A和甲壳素水解酶联合酶解α‑甲壳素，可以大幅度提高N‑乙酰化壳二糖的产量。本发明在酶法预处理甲壳素和制备甲壳寡糖中具有重要的工业应用价值及经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法，属于功能酶技术领域。
背景技术
甲壳素（Chitin），又称甲壳质、几丁质，是氮乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的一种线性高分子，是仅次于纤维素的第二大天然多糖，主要存在于海洋无脊椎动物、昆虫外壳、真菌细胞壁以及鱿鱼顶骨中。在自然界中，甲壳素主要有α和β两种晶型，α-甲壳素在自然界中储量丰富，分子链呈反向平行排列，存在大量的分子内和分子间氢键，结构相较β-甲壳素更为紧密；β-甲壳素在自然界中的储量较少，分子链则是同向平行排列，存在丰富的分子内氢键。
利用生物法将甲壳素加工为具有多种生物活性的壳寡糖以及甲壳寡糖，是实现甲壳素高值化利用的重要途经。但甲壳素大量的分子内和分子间氢键，以及高聚合度和高度有序的晶体结构，使得大多数糖苷水解酶很难接近聚集在晶格中的多糖链。目前的处理手段主要是浓盐酸处理破坏其结晶结构，制备可供其水解的底物，但又会面临对环境不友好的难题。裂解性多糖单加氧酶（LPMO）是替代盐酸处理甲壳素的理想生物催化工具，它是一种铜离子依赖性的氧化还原酶，主要是通过氧化作用裂解多糖糖苷键，氧化多糖的C1或C4位点，断裂多糖的β-1，4糖苷键，产生新的可供糖苷水解酶处理的链端，同时使底物结构变得更加松散，提高糖苷水解酶的水解效率。
LPMO氧化裂解的多糖底物主要包括甲壳素、纤维素、淀粉等，不同的LPMO具有不同的底物特异性，其可能具有一种或多种底物的氧化裂解活性。现有的研究主要集中在纤维素和淀粉活性LPMO方面，在甲壳素活性LPMO的相关研究中主要集中于相对结晶度低的β-甲壳素，如CN 116042549 A公开了一种裂解性多糖单加氧酶 Eb LPMO10A及其应用，该来源于肠杆菌的裂解性多糖单加氧酶EbLPMO10A可以辅助甲壳素酶降解β-甲壳素生成甲壳寡糖。关于α-甲壳素活性LPMO、制备N-乙酰化壳二糖的研究报道较为少见。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法，属于功能酶技术领域。本发明挖掘到了具有α-甲壳素活性的裂解性多糖单加氧酶，其在协同反应共生产甲壳寡糖方面具有很大的潜力和价值。
本发明是通过以下技术方案实现的：
利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法：以裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A和甲壳素水解酶联合酶解α-甲壳素，制备得到N-乙酰化壳二糖。所述裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述甲壳素水解酶选自甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C中的任意一种或两种以上的组合。
进一步地，所述利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法具体为：向α-甲壳素溶液中添加裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A和甲壳素水解酶，酶解，得到N-乙酰化壳二糖。
进一步地，所述α-甲壳素溶液的浓度为5～20 mg/mL，优选10 mg/mL。
进一步地，所述α-甲壳素溶液是通过以下方法制备得到的：向磷酸盐缓冲液中加入α-甲壳素和抗坏血酸，混匀即得；所述抗坏血酸的浓度为1 mM；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10 mM，pH为6.0。
进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的终浓度为0.6～9μM，优选6μM。
进一步地，所述甲壳素水解酶的终浓度为0.6～3μM，优选3μM。
进一步地，所述甲壳素水解酶选自甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C的组合，甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C的摩尔比为1:1:1。
更进一步地，所述酶解的温度为45℃。
更进一步地，所述酶解的pH条件为6.0（综合考虑了甲壳素水解酶的最适pH和裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的最适pH）。
更进一步地，所述酶解的时间为24小时。
本发明首次表达并研究了裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A，该酶属于辅酶10家族（AA10），在30℃和pH 6条件下其比酶活为11.28 U/g。裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A能通过C1氧化将甲壳素裂解为聚合度2～8的醛酸产物。本发明构建了α-甲壳素、裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A和甲壳素水解酶的协同酶解体系，可以高效地制备N-乙酰化壳二糖。本发明的制备N-乙酰化壳二糖的方法，以裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A和甲壳素水解酶联合酶解α-甲壳素，可以大幅度提高N-乙酰化壳二糖的产量。本发明在酶法预处理甲壳素和制备甲壳寡糖中具有重要的工业应用价值及经济价值。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker，泳道1为粗酶液，泳道2为纯化后酶液。
图2：酶活测定结果示意图。
图3：温度变化对相对酶活的影响示意图。
图4：pH变化对相对酶活的影响示意图。
图5：α-甲壳素的酶解产物的基质辅助飞行时间质谱图，其中，氧化低聚糖的聚合度用“ox”标记；每个聚合度检测到两种主要加合物：[M+Na+]+，[M-H++2Na+]+。
图6：β-甲壳素的酶解产物的基质辅助飞行时间质谱图，其中，氧化低聚糖的聚合度用“ox”标记；每个聚合度检测到两种主要加合物：[M+Na+]+，[M-H++2Na+]+。
图7：胶质甲壳素的酶解产物的基质辅助飞行时间质谱图，其中，氧化低聚糖的聚合度用“ox”标记；每个聚合度检测到两种主要加合物：[M+Na+]+，[M-H++2Na+]+。
图8：各实验组和对照组的N-乙酰化壳二糖产量对比示意图，其中，Os表示裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A；ChiA、ChiB、ChiC分别表示甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B、甲壳素酶SmChi C；ChiAB、ChiAC、ChiBC分别表示甲壳素酶SmChi A和甲壳素酶SmChi B、、甲壳素酶SmChi A和甲壳素酶SmChi C、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C；ChiABC表示甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C；(GlcNAc)2表示N-乙酰化壳二糖。
图9：不同温度条件下N-乙酰化壳二糖产量对比示意图。
图10：不同pH条件下N-乙酰化壳二糖产量对比示意图。
图11：不同甲壳素酶和裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A添加量时N-乙酰化壳二糖产量对比示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1 裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的编码基因的克隆
本申请的发明人从NCBI数据库中挖掘到海洋芽孢杆菌Oceanobacillus sp.J11TS1来源的裂解性多糖单加氧酶片段（GenBank：WP_212925765.1），根据进化树分析和多序列比对，发现该基因片段所表达的裂解性多糖单加氧酶属于辅酶10家族甲壳素活性分支。发明人根据宿主大肠杆菌的密码子偏好性对该基因片段的序列进行了密码子优化，用于在大肠杆菌中进行高效表达。优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示，其所表达的裂解性多糖单加氧酶命名为裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的氨基酸序列如下所示（如SEQ ID NO.1所示）：
HGYIEQPKSRGLLCKEQVNTNCGAIQWEPQSLEAPKGFPGASIPDGKIASAGGAFPELDVQTADRWAKVNLNSGINTFTWHLTAKHATTKWHYYITKPDWNPNQPLTRDQFELVPFYEVYDGGARPGEKVTHQVTIPERTGYHVILGVWDVDDTANAFYNVIDANFGGEGTEPGPEEPDLGIPAYPEWDANLVYLGGDKVTYNGKTYQAKWWTKGETPGSSGVWELVK。
裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的编码基因的核苷酸序列如下所示（方向5’-3’）（如SEQ ID NO.2所示）：
CATGGTTATATCGAGCAACCGAAATCAAGAGGGTTATTGTGTAAGGAACAGGTGAATACAAATTGCGGTGCCATTCAATGGGAGCCGCAAAGTCTCGAAGCGCCAAAAGGATTTCCGGGAGCAAGTATTCCAGATGGAAAAATAGCTTCTGCTGGAGGGGCATTTCCAGAATTGGATGTACAGACGGCAGATCGATGGGCAAAGGTGAATTTGAATTCGGGAATAAACACATTTACTTGGCACTTAACAGCAAAGCATGCAACAACAAAATGGCATTATTATATCACCAAGCCTGATTGGAATCCAAATCAACCGCTAACAAGAGATCAATTTGAGCTCGTTCCGTTTTATGAAGTATATGATGGGGGAGCAAGACCAGGGGAGAAAGTAACACATCAAGTGACAATTCCAGAGCGCACAGGTTATCATGTTATTTTAGGAGTCTGGGATGTTGATGATACTGCGAATGCTTTCTATAATGTCATTGATGCTAATTTTGGTGGGGAAGGAACGGAGCCGGGACCGGAAGAGCCTGATCTAGGAATTCCAGCTTATCCAGAATGGGATGCTAATCTTGTTTATCTTGGAGGAGACAAGGTAACGTATAATGGAAAGACTTATCAAGCAAAATGGTGGACAAAAGGTGAAACACCGGGAAGTTCCGGGGTATGGGAGCTTGTAAAA。
人工合成SEQ ID NO.2所示的基因片段。以人工合成的基因片段为模板，进行PCR扩增。PCR所用的特异性引物如下所示：
上游引物：5’-GCCGGCGATGGCCCATGGTTATATCGAG-3’，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物：5’-GGTGGTGCTCGAGTTTTACAAGCTCCCA-3’，如SEQ ID NO.4所示。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μL，dNTP 10μL，无菌水9μL，上下游引物各1.5μL，模板2μL，KOD Fx酶1μL，总体系50μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5 min，98℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，反应30个循环，72℃后延伸40 s。
琼脂糖凝胶电泳后回收大小正确的PCR产物片段。
实施例2 重组表达载体的构建
实施例1扩增得到的基因片段，与pET-22b线性化质粒采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于LB培养基固体平板（含有100μg/mL氨苄霉素）上，37℃温箱中培养12小时，选取形态大小正确的单菌落进行阳性克隆验证。对验证正确的菌落，接种到LB液体培养基（含有100μg/mL氨苄霉素）中， 37℃、220 rpm摇床培养12小时。吸取少量菌液进行测序，随后对测序正确的菌液进行重组质粒的提取。将提取的质粒保存在-20℃中，备用。
实施例3 重组工程菌的构建
将实施例2中提取的质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中，涂布于LB培养基固体平板（含有100μg/mL氨苄霉素）上，37℃温箱中培养12小时，得到重组工程菌株。
实施例4 裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的制备
将实施例3的重组工程菌株接入LB液体培养基（含有100μg/mL氨苄霉素）中进行活化，然后将活化菌液按1%的接种量接入LB液体培养基（含有100μg/mL氨苄霉素）中，37℃、220 rpm摇床培养至OD600为0.6～0.8。添加终浓度为0.1 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，20℃、200 rpm摇床培养20小时，表达裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A。
培养结束后，发酵液8000 g离心15分钟，收集菌体，用50 mM pH 8.0 的Tirs-HCl缓冲液重悬，然后于冰水浴中超声破碎20 分钟（250 W），8000 g离心15 分钟，收集上清液，即为粗酶液。
在进行重组质粒的构建时，在蛋白的C端添加了His标签，利用此进行粗酶纯化。首先，使用10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM pH 8.0 Tris-HCl）平衡柱子，然后用40 mM咪唑溶液（40 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM pH 8.0 Tris-HCl）洗脱结合力弱的杂蛋白，再用80 mM咪唑溶液（80 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM pH 8.0 Tris-HCl）洗脱目的蛋白，收集得到纯化后酶液。SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量（结果如图1所示），使用Bradford法测定蛋白浓度。结果所得蛋白的分子量大小约为28 KD，符合预测结果。纯化后酶液中蛋白浓度为180 mg/L。用超纯水通过超滤置换酶液中的咪唑，随后添加终浓度为0.1mM的CuSO4，4℃孵育4小时，以激活裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A，再次通过超滤置换多余的Cu2+，冷冻干燥，得到纯酶粉。
实施例5 裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的比酶活的测定
裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A活性的标准测定方法为：向200μL的磷酸盐缓冲液（pH 6.0，100 mM）中加入终浓度为0.1 mM的H2O2、1.0 mM的2，6-DMP，然后加入终浓度为2μM的纯酶粉（实施例4制备），测定30℃条件下，300 s内469 nm 处的吸光度变化。以牛血清蛋白（BSA）为对照。
酶活力定义为：在标准条件下，1分钟转化生成1μM产物的酶量。
结果如图2所示，经测定，纯化后的裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的酶活力为11.28 U/g。
实施例6 最适反应条件的测定
将实施例4中得到的纯酶粉在不同温度和pH下反应，测定温度和pH对酶活力的影响。
选取10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的温度，按照实施例5的测定方法进行测定，测定最适温度。
在30℃下，选用pH为3.0～10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，按照实施例5的测定方法进行测定，测定最适pH。
以最高酶活力为100%，计算在不同条件下的相对酶活力，结果如图3、图4所示，裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的最适反应温度为50℃，最适pH为8.0（磷酸盐缓冲液）。
实施例7 测定裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的降解产物
分别以α-甲壳素、β-甲壳素和胶质甲壳素为底物，以10 mM pH 6.0磷酸盐缓冲溶液为溶剂，制备三种底物溶液（底物浓度为10 mg/mL），并添加1 mM 抗坏血酸作为电子供体。然后添加纯酶粉（实施例4制备），终浓度为6μM，在37℃下反应24小时。
使用基质辅助飞行时间质谱，2，5-DHB作为基质，正离子模式下检测氧化产物，结果如图5、图6、图7所示。裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的氧化作用方式为C1氧化，α-甲壳素、β-甲壳素和胶质甲壳素的酶解产物分别为聚合度2～6、2～8和2～8的几丁质醛酸，生成的产物对偶数碳的氧化寡糖具有明显的偏好。该结果表明裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A对多种甲壳素底物具有活性。
本发明所用的α-甲壳素，购买自上海源叶生物科技有限公司。
本发明所用的β-甲壳素是从鱿鱼顶骨中提取得到的，提取方法如下：取鱿鱼顶骨，用蒸馏水反复清洗以去除表面粘连的杂质；清洗后，60℃烘箱烘干10小时，使用粉碎机粉碎，加入盐酸（浓度1 M）中，每10 ml盐酸中添加1 mg的粉末，搅拌12小时，以去除矿物质；过滤得沉淀，蒸馏水清洗沉淀至中性，然后将其添加到NaOH溶液（浓度2 M）中进行脱蛋白处理，每10 ml NaOH溶液中添加1 mg的沉淀，80℃搅拌2小时；过滤得沉淀，用蒸馏水反复洗涤至中性，冻干，即得β-甲壳素粉末。
本发明所用的胶质甲壳素是通过酸处理α-甲壳素制备得到的，制备方法如下：将α-甲壳素粉末添加到浓盐酸（浓度38%）中，每20 ml浓盐酸中添加1 mg的α-甲壳素粉末，搅拌均匀，4℃冷藏24小时，然后添加足量的乙醇沉淀胶质甲壳素，用蒸馏水反复洗涤沉淀至中性，冻干，即得胶质甲壳素粉末。
实施例8 考察裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A与不同甲壳素水解酶的协同作用
向α-甲壳素溶液中添加裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A，以及不同的甲壳素水解酶或其组合，以不添加裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A为对照，考察裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A与不同甲壳素水解酶的协同作用。具体操作如下：
取若干份α-甲壳素溶液（实施例7制备，浓度为10 mg/mL），每份400μL，分为实验组（7个实验组）和对照组（7个对照组），每组进行三次平行实验。实验组中均添加裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A（实施例4制备的纯酶粉，终浓度为3μM），具体为：实验组1添加甲壳素酶SmChi A，实验组2添加甲壳素酶SmChi B，实验组3添加甲壳素酶SmChi C，实验组4添加甲壳素酶SmChi A和甲壳素酶SmChi B（二者摩尔比为1:1），实验组5添加甲壳素酶SmChi A和甲壳素酶SmChi C（二者摩尔比为1:1），实验组6添加甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C（二者摩尔比为1:1），实验组7添加甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C（三者摩尔比为1:1:1），终浓度均为0.6μM（甲壳素水解酶的总浓度）。相对应地，各对照组中不添加裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A。在45℃下反应24小时。使用高效液相色谱法检测产物组成，并对产物N-乙酰化壳二糖进行定量分析。
由图8可见，对于N-乙酰化壳二糖的产量，各实验组与其对应的对照组相比均有显著提升，裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A与甲壳素水解酶协同降解α-甲壳素，可大幅度提升N-乙酰化壳二糖的产量。OsLPMO10A对单一甲壳素酶水解效率提升更高，分别为520%（SmChiA），327%（SmChi B），709%（SmChi C）。而对混合甲壳素酶（SmChi A+SmChi B+SmChi C），水解效率提升了100%，但与甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C协同时N-乙酰化壳二糖的产量最高，为1.13 mg/mL。以来自粘滞沙雷氏菌的裂解性多糖单加氧酶CBP21(DOI:10.1021/jf402743e)作为对照，在相同甲壳素酶（SmChi A+SmChi B+SmChi C）加酶量的条件下，其N-乙酰化壳二糖的产量不足0.2 mg/mL。
所述甲壳素酶SmChi A（GenBank: AAA26551.1）、甲壳素酶SmChi B（GenBank:CAA85292.1）、甲壳素酶SmChi C（GenBank: CAF74787.1）均为现有技术中已经报道过的甲壳素水解酶，均来自粘质沙雷氏菌S.marcescens，氨基酸序列如下所示。
甲壳素酶SmChi A的氨基酸序列（如SEQ ID NO.5所示）：
MRKFNKPLLALLIGSTLCSAAQAAAPGKPTIAWGNTKFAIVEVDQAATAYNNLVKVKNAADVSVSWNLWNGDAGTTAKILLNGKEAWSGPSTGSSGTANFKVNKGGRYQMQVALCNADGCTASDATEIVVADTDGSHLAPLKEPLLEKNKPYKQNSGKVVGSYFVEWGVYGRNFTVDKIPAQNLTHLLYGFIPICGGNGINDSLKEIEGSFQALQRSCQGREDFKVSIHDPFAALQKAQKGVTAWDDPYKGNFGQLMALKQAHPDLKILPSIGGWTLSDPFFFMGDKVKRDRFVGSVKEFLQTWKFFDGVDIDWEFPGGKGANPNLGSPQDGETYVLLMKELRAMLDQLSAETGRKYELTSAISAGKDKIDKVAYNVAQNSMDHIFLMSYDFYGAFDLKNLGHQTALNARPGSRHRLHHGERRQCAAGQGVKPGKVVVGTAMYGRGWTGVNGYQNNIPFTGTATGPVKGTWKNGIVDYRQIAGQFMSGEWQYTYDATAEAPYVFKPSTGDLITFDDARSVQAKGKYVLDKQLGGLFSWEIDADNGDILNSMNASLGNSAGVQ。
甲壳素酶SmChi B的氨基酸序列（如SEQ ID NO.6所示）：
MSTRKAVIGYYFIPTNQINNYTETDTSVVPFPVSNITPAKAKQLTHINFSFLDINSNLECAWDPATNDAKARDVVNRLTALKAHNPSLRIMFSIGGWYYSNDLGVSHANYVNAVKTPASRAKFAQSCVRIMKDYGFDGVDIDWEYPQAAEVDGFIAALQEIRTLLNQQTITDGRQALPYQLTIAGAGGAFFLSRYYSKLAQIVAPLDYINLMTYDLAGPWEKVTNHQAALFGDAAGPTFYNALREANLGWSWEELTRAFPSPFSLTVDAAVQQHLMMEGVPSAKIVMGVPFYGRAFKGVSGGNGGQYSSHSTPGEDPYPSTDYWLVGCEECVRDKDPRIASYRQLEQMLQGNYGYQRLWNDKTKTPYLYHAQNGLFVTYDDAESFKYKAKYIKQQQLGGVMFWHLGQDNRNGDLLAALDRYFNAADYDDSQLDMGTGLRYTGVGPGNLPIMTAPAYVPGTTYAQGALVSYQGYVWQTKWGYITSAPGSDSAWLKVGRVA。
甲壳素酶SmChi C的氨基酸序列（如SEQ ID NO.7所示）：
MSTNNTINAVAADDAAIMPSIANKKILMGFWHNWAAGASDGYQQGQFANMNLTDIPTEYNVVAVAFMKGQGIPTFKPYNLSDTEFRRQVGVLNSQGRAVLISLGGADAHIELKTGDEDKLKDEIIRLVEVYGFDGLDIDLEQAAIGAANNKTVLPAALKKVKDHYAAQGKNFIISMAPEFPYLRTNGTYLDYINALEGYYDFIAPQYYNQGGDGIWVDELNAWITQNNDAMKEDFLYYLTESLVTGTRGYAKIPAAKFVIGLPSNNDAAATGYVVNKQAVYNAFSRLDAKNLSIKGLMTWSINWDNGKSKAGVAYNWEFKTRYAPLIQGGVTPPPGKPNAPTALTVAELGATSLKLSWAAATGAFPIASYTVYRNGNPIGQTAGLSLADGGLTPATQYSYFVTATDSQGNTSLPSSALAVKTANDGTPPDPGAPEWQNNHSYKAGDVVSYKGKKYTCIQAHTSNAGWTPDAAFTLWQLIA。
按照下述文献（1）中的基因工程方法制备得到甲壳素酶SmChi A。按照下述文献（2）中的基因工程方法制备得到甲壳素酶SmChi B。按照下述文献（3）中的基因工程方法制备得到甲壳素酶SmChi C。
文献（1）Brurberg M B,Eijsink V G,Nes I F. Characterization of achitinase gene (chiA) from Serratia marcescens BJL200 and one‐steppurification of the gene product[J]. FEMS microbiology letters,1994,124(3).
文献（2）Brurberg M B,Eijsink V G,Haandrikman A J,Venema G,Nes I F.Chitinase B from Serratia marcescens BJL200 is exported to the periplasmwithout processing.[J]. Microbiology (Reading, England),1995,141 ( Pt 1).
文献（3）Bjørnar SYNSTAD,Gustav VAAJE-KOLSTAD,F. Henning CEDERKVIST,Silje F. SAUA,Svein J. HORN,Vincent G. H. EIJSINK,Morten SØRLIE. Expressionand Characterization of Endochitinase C from Serratia marcescens BJL200 andIts Purification by a One-Step General Chitinase Purification Method[J].Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry,2008,72(3).
实施例9 反应温度对N-乙酰化壳二糖产量的影响
取若干份α-甲壳素溶液（实施例7制备，浓度为10 mg/mL），每份400μL，均加入0.6μM的甲壳素酶组合（甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C，三者摩尔比为1:1:1）和3 μM OsLPMO10A。分为5个实验组，每组进行三次平行实验，分别在30℃、37℃、45℃、50℃、60℃下反应24小时。使用高效液相色谱法检测产物组成，并对产物N-乙酰化壳二糖进行定量分析。
结果如图9所示，可见，当反应温度为45℃时，N-乙酰化壳二糖的产量最高。
实施例10 反应pH对N-乙酰化壳二糖产量的影响
取若干份α-甲壳素溶液（实施例7制备，浓度为10 mg/mL），每份400μL，均加入0.6μM的甲壳素酶组合（甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C，三者摩尔比为1:1:1）和3 μM OsLPMO10A。分为4个实验组，每组进行三次平行实验，分别在pH 6、7、8、9条件下反应24小时（反应温度为45℃）。使用高效液相色谱法检测产物组成，并对产物N-乙酰化壳二糖进行定量分析。
结果如图10所示，可见，当pH为6时，N-乙酰化壳二糖的产量最高。
实施例11 甲壳素酶和裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的添加量对N-乙酰化壳二糖产量的影响
取若干份α-甲壳素溶液（实施例7制备，浓度为10 mg/mL），每份400μL，分为4个实验组（每组5份），分别加入0.3μM、0.6μM、1.2μM、3μM的甲壳素酶组合（甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C，三者摩尔比为1:1:1）。然后每组各份中加入终浓度分别为0.6μM、1.2μM、3μM、6μM、9μM的裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A，每组各份进行三次平行实验，以不添加裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A为对照。在45℃下反应24小时。使用高效液相色谱法检测产物组成，并对产物N-乙酰化壳二糖进行定量分析。
结果如图11所示，当甲壳素酶添加量为3μM，裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的添加量为6μM时，N-乙酰化壳二糖的产量最高，为2.39 mg/mL，是仅添加甲壳素酶组合的产量（0.95 mg/mL）的2.52倍。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (2)
1.一种利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法，其特征在于：向α-甲壳素溶液中添加裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A和甲壳素水解酶，酶解，得到N-乙酰化壳二糖，酶解的条件为：温度45℃、pH 6.0条件下酶解24小时；
所述裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述α-甲壳素溶液的浓度为10 mg/mL；所述裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A的终浓度为6μM；所述甲壳素水解酶的终浓度为3μM；
所述甲壳素水解酶选自甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C的组合，甲壳素酶SmChi A、甲壳素酶SmChi B和甲壳素酶SmChi C的摩尔比为1:1:1。
2.根据权利要求1所述的利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法，其特征在于，所述α-甲壳素溶液是通过以下方法制备得到的：向磷酸盐缓冲液中加入α-甲壳素和抗坏血酸，混匀即得；所述抗坏血酸的浓度为1 mM；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10 mM，pH为6.0。
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